Université du Québec

Institut National de la Recherche Scientifique

Institut Armand—lrappier

PRÉVENTION DU CANCER DE LA PROSTATE PAR LES COMPOSÉS

NATURELS

Par
Jihane Casmi

Thèse présentée pour l’obtention du grade

De Philosophiae doctor (Ph.D.)
en biologie

Jury d’évaluation

Président du jury et Denis Girard

examinateur interne INRS, Institut Armand-Frappier

Examinateur externe Éric Asselin

Université du Québec à Trois-Rivières

Examinateur externe Abdeloualied Khalil

Université de Sherbrooke

Directeur de recherche Thomas Sanderson

INRS, Institut Armand-Frappier

©Droits réservés de (Jihane Gasmi), 2012

 REMERCIEMENTS

Sans vous je ne serais pas là aujourd’hui, vous avez su trouver le mot juste clans les
moments les plus durs. Vous avez toujours cru en moi et cette thèse c’est un peu la votre. Merci
pour tout ce que vous m’avez offert, je mesures la chance d’avoir des parents comme vous.

Je tiens à remercier mon directeur dc recherche pour son soutient indéfectible, sa

patience, son professionalisme et son calme à toute épreuve. Je ne peux qu’exprimer ma
profonde gratitude envers le Dr Thomas Sanderson qui a Fait preuve d’une efficacité incroyable
lorsqu’il sagissait de corriger un article ou d’innombrables posters et autres écrits. Je le remercie
également de m’avoir accordé sa confiance et de m’avoir donné la chance de Faire un doctorat
dans son laboratoire. Ces années ont été riches en enseignements et c’est grâce à lui que j’ai pu
découvrir le monde de la recherche et venir à bout de mon doctorat.

Je tiens également à remercier mes collègues de laboratoire et plus particulièrement

Martin qui m’a acceuilli durant mes premiers jours au laboratoire, Patricia et Alex toujours prêts
à me donner des cellules ainsi que nos voisins de laboratoire Talai pour ses conseils avisés, Dave
toujours prêt à répondre à une question, Cathy, Andréanne, Marc et Joey pour leur bonne
humeur.

Je remercie chaleureusement Mme Anne Philippon pour ses conseils et son efficacité
ainsi que Mr Michel Courcelles pour avoir sauvé ma bibliothèque endnote sans oublier Mmc
Josée Labonne.

Les amis se sont succédés durant ces années tous ont compté pour moi, mais une pensée
particulière pour TalaI, Hayet, Meriem, Nadjet, Hind, Ben, Sihem et Francis.

Ma dernière pensée est pour toi, merci d’être là tous les jours et de me soutenir dans tous
mes projets. Merci de répondre à mes coups de fils même lorsque tu es en pleine manip, merci de
me redonner confiance et d’avoir toujours le mot qu’il faut pour me redonner le moral. Merci
d’être là et de rendre la vie plus belle. Un grand merci à notre fils qui me donne le sourire
quelque soit les circonstances. Un jour tu liras ce manuscrit, saches que tu avais 19 mois et que je
jonglais entre toi et l’ordinateur, mais ce n’est que du bonheur.
 RESUME

Introduction Le cancer de la prostate est la deuxième cause dc mortalité chez les hommes
atteints de cancer clans les pays développés. C’est un cancer initialement hormono-dépendant
dont la prolifération est stimulée par les androgènes et les oestrogènes. Dans la prostate, la 5Œ-
réductase (de type 1 et 2) transforme la testostérone en dihydrotestostérone (DHT), bien plus
puissante, qui se lie au récepteur aux androgènes (AR) cytoplasmique et permet son activation.
Ce dernier joue le rôle de facteur de transcription et active la transcription des gènes cibles
impliqués dans la prolifération des cellules cancéreuses. Il existe différents traitements contre le
cancer de la prostate. En effet, l’hormonothérapie a pour but de bloquer la synthèse des
androgènes responsables de la stimulation des cellules cancéreuses. Cependant, au bout de
quelques années, une résistance aux traitements se développe et le cancer évolue invariablement
vers tin état hormono-indépcndant difficile à traiter. C’est un cancer très fréquent chez les
hommes âgés dc ilus de 50 ans et est caractérisé par un temps de latence prolongé. Des études
épidémiologiques ont mis en évidence l’impact environnemental sur les risques de développer un
cancer de la prostate et de l’importance de sa prévention par l’alimentation. En effet, certains
composés naturels et plus particulièrement les composés présents dans la grenade (punica
granatuin), fruit au riche passé éthnomédical et aux propriétés antioxydantes plis élevées que
celles dti thé ou du vin, retardent sa progression. Nous émettons l’hypothèse que ces composés

sont capables d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses à différents niveaux d’évolution du
cancer. Ojectif : Mes travaux ont pour but d’identifier et de déterminer les mécanismes
d’action des composés capables d’inhiber la croissance du cancer de la prostate. Pour cela, nous
avons déterminé les effets anti-androgéniques mis en jeux dans les cellules androgènes-
dépendantes, les voies de signalisation impliquées dans l’inhibition de la croissance des cellules
androgènes-dépendantes et -indépendantes et enfin la structure chimique du composé le plus
puissant. Dans ce but, nous avons testé différentes classes chimiques de composés provenant de
la grenade comme des anthocyanidines, des catéchines et des flavonoides. Nous avons également
testé des acides gras polyinsaturés naturels connus pour leurs effets protecteurs contre le cancer
de la prostate. Résulats : Les résultats de l’étude ont permi d’identifier quatre composés de la
grenade, l’épigallocatéchine gallate (EGCG), le delphinidine chloride, le kaempférol et l’acide
punicique, ayant des effets anti-androgéniques sur les cellules LNCaP à une concentration? 10

111
tM. En effet, ils induisent une inhibition de l’expression des gènes codant pour la 5-u. réductase
de type 1 (SRD5AI) ainsi qu’une réduction du taux de AR nucléaire et une diminution de
l’expression d’un gène cible du AR l’antigène spécifique de la prostate (PSA). Parmi ces
composés, l’acide punicique, un acide gras conjugué C-18 le plus abondant (70 % à 80 % des
acides gras présents dans les graines) induit une apoptose des cellules LNCaP après 24h de
traitement à une concentration allant de 10 à 100 tM. Nous avons alors décidé de tester quatre de
ses isomères naturels sur les cellules androgènes-dépendantes LNCaP et androgènes
indépendantes PC-3 afin d’identifier la structure chimique la plus efficace. Une analyse 3-D a été
également réalisée afin d’identifier la conformation spaciale spécifique des isomères les plus
cytotoxiques. Nous avons identifié l’acide jacarique qui se distingue par sa capacité à induire
l’apoptose dans les deux lignées cellulaires androgènes-dépendantes et indépendantes sans
avoir d’efTets sur les cellules épithéliales normales de la prostate RWPE-l. Il active la voie de
signalisation apoptotique extrinsèque via le récepteur de mort cellulaire DR5 et intrinsèque via la
voie mitochondriale dans les cellules androgènes-dépendantes et active la voie intrinsèque dans
les cellules androgènes-indépendantes. L’analyse 3-D a permi de mettre en avant l’importance de
la conformation cis, trans, Gis dans l’efficacité des deux acides gras identifiés. Conclusion
L’acide punicique est un acide gras important présent dans la grenade, capable d’inhiber la
croissance des cellules cancéreuses en modulant les voies androgéniques et en activant la voie
apoptotique intrinsèque dans la lignée cellulaire androgène-dépendante. L’acide punicique et son
isomère le plus proche structurellement, selon l’analyse 3-D, l’acide jacarique, inhibent la
prolifération des cellules androgène-dépendantes et -indépendantes sans afFecter les cellules
épithéliales normales. L’acide jacarique induit la voie apoptotique intrinsèque et extrinsèque
dans les cellules androgènes-dépendantes. En revanche, il active la voie intrinsèque seulement
dans les cellules androgènes-indépendantes. L’acide punicique et jacarique sont deux isomères
octadecatriénoiques prometteurs dans la prévention du cancer de la prostate à différents stades de
son évolution.

Mots-clés grenade, acide punicique, apoptose, acide jacarique, récepteur de mort cellulaire,
SRD5A 1, PSA, AR, structure/activité 3-D.

iv
 ABS1RACT

Introduçtj_o: Prostate cancer is the second leading cause oC death among American and
European men. It is a hormone-dependent cancer and its growth is stimulated by androgens and
estrogens. in the pi-ostate, steroid 5a—i-eductase (SRD5A types I and 2) couverts testosterone to
more potent dihydrotestosterone (DHT) whieh binds with great afTinity to the cytoplasmic
androgen receptor (AR) and activates the receptor which dimerizes and transiocates to the
nucleus. Nuclear androgen receptor is a transcription factor that activates transcription in target
genes, some of which are implicated in cancer celi proliferation. Several treatments exist to
inhibit prostate cancer ccli proliferation. Anti—hormone therapy biocks androgen receptor
activation or androgen synthesis anci subsequent cancer ccli stimulation. ilowever, resistance to
treatrnent develops and the cancer will invariably evoive into a hormone-independent state,
which is hard to treat. It is a cancer with a proionged latency that is very common in men over 50
years. Epidemiological studies have highiighted the importance of various environmentai factors
and especialiy of diet in the risk of developing prostate cancer. These studies strongly indicate
that preventive alimentation needs to be developed to protect against prostate cancer. Various
natural compounds found in pomegranate (Punica granatum) may delay prostate cancer
progression. Our hypothesis is that these compounds inhibil prostate cancer ccli growth in vitro
at different levels of cancer progression, Objectives: We intended to identify and determine the
mechanism of action of those compounds Ihat are the mosi Iotent inhibitors of prostate cancer
ccii growth. We determined the anti—androgenic elTecis of naturai compounds in androgen—
dependent prostate cancer ceils and identified signaling pathways involved in growth inhibition
of androgen-dependent and -independent prostate cancer celis. For this purpose, we individually
tested several classes of chemicai compounds commonly Found in the pomegranate like
anthocyanidins, catechins and polyphenols. This fruit has a rich ethnomedical history and
antioxidant properties greater than those of tea or wine. We also tested polyunsaturated fatty
acids purported to have protective effects against prostate cancer. Resuits: We found that four
cornpounds epigallocatechin gailate (EGCG), deiphinidin chloride, kaernpferoi and punicic acid
had antiandrogenic effects in androgen-dependent LNCaP human prostate cancer ceils at
concentrations of 10 tM and above. They inhibited SRD5A1 gene expression, AR nuclear
accumulation and the expression of the AR target gene PSA at concentrations 10 tM. As the
unique C-18 fatty acid, punicic acid, the main constituent of pomegranate seed (70 % à 80 %),

V
was Found to be Ihe mosi potent inhibitor oC LNCaP prostate cancer ccli growlh. It induced DNA
fragmentation after 24h treatment, at concentrations in the 10-100 iM range. We decidcd to
determine the growth inhibi(ory elTecis oC [his Fatty acid and a number oC ils planl—derived and
dietarily relevant geoisomers, in androgen—depenclent LNCaP as well as androgen—independent
PC-3 celis. A 3-D structure-activity analysis was performed to determine the structural
con Fonnational properties that convey potent cytotoxic properties certain geoisomers, but not
others. We find that Jacaric acid induces apoptosis in androgen-dependant and independent ccli
unes but had no effects on normal epithelial ceils. It activates extrinsic apoptotic pathway via
death receptor DR5 and intrinsic ccli death via mitochondrial pathway, in androgen-dependent
ceils. It induces intrinsic apoptosis in androgen independent celis. The cis, trans, cis
conformation of the two mos polent fatty acids scems to be very important in compound
efficiency according to 3-D analysis. Conclusion: Punicic acid an important fatty acid found in
the pomegranate inhibits cancer cdl growth by modulating the ancirogenic signaling pathway and
activating intrinsic apoptosis in androgen-dependant prostate cancer ceils. Punicic acid and its
three-dimensionally most structurally related geostereoisomer, jacaric acid inhibit androgen
dependent and -independent prostate cancer cdl proliferation, whiie not causing cytotoxicity in
normal prostate epithelial ceils. Jacaric acid induces intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in
androgcn—dependent ceils, but activates the intrinsic pathway only, in androgen—independent
ceils. Punicic and jacaric acid are two octadecatrienoic acid geoisomers we identified that are
interesting dietary constituents with beneficial effects in prostate cancer prevention acting at
several levels in the progression of prostate cancer ccli growth.

Keywords: pomegranate, punicic acid, apoptosis, jacaric acid, death receptor, SRD5A1, PSA,
AR, 3-D structure/activity.

vi
 TABLE DES MATI ERES

PREMIERE PARTIE r SYNTHESE 5

1.1 LE CANCER DE LA PROSTAT 7

I 1 1 Gé,,, alités su, le CCIUCL’I de lu pins! ale 7

I. 1.2 Le cancer de la prostate hoiinono—dependaiit 11

I I .2. I [.c rôle du récepteur aux aiidmgèncs (A R) I I
1.1.2.2 La stéroïdogenèse 12

1.1.2.2.1 La P45Oscc 2!

1.1.2.2.2 La 3t-l-1SD 2I

1.1.2.2.3 La CYPI7 23

1.1.2.2.4 La I 7f1-HSI) 23

1.1.2.2.5 La 3u-IISD 24

1.1.2.2.6 La sulfaiasc 24

1.1.2.2.7 L.a CYPI9 24

1.1.2.2.8 La SRD5A 26

1.1.3 Pivgiessioiz vers un cancer hormono—indépendan! 2$

1.1.3.] Sensibilité accrue du AR 29

1.1.3.1.1 Amplification du gène codant pour le AR 29

I .3. I .2 A ugmentat ion de la scnsib lité du AR 30

l.I.3.l.3 Augmcntaiion du taux d’androgènes 30

1.1.3.2 Les moditications génétiques du AR 30

1.1.3.2.1 Mutations du AR 30

1.1.3.2.2 (‘hangements «expression des corégulateurs du AR 32

1.1.3.3 Lactivation du AR par un mécanisme ligand indépendant via 32

1.1.3.3.1 Les Licteurs de croissance 32

1.1.3.3.2 Les cytokines 33

1.1.3.3.3 [es récepteurs tyrosine kinase 33

1.1.3.3.4 La voie de signalisation Wnt 35

1.1.3.4 Les voies AR indépendantes 39

l.l.3.4.l Les facteurs de croissances 39

1.1.3.4.2 La voie de signalisation Akt 39

1.1.3.4.3 Bel-2 40

1.1.3.4.4 Les régulations épigénétiques 40

1.1.3.4.5 Les microRNA 41

1.3.5 La voie des cellules cachées 41

1.1.3.6 Les mécanismes de résistance du cancer androgène-indépendant 41

1.1.4 Généralités sur les métastases 44

1.1.4.] La dissémination 44

1.1.4.2 La survie pendant la migration 45

vii
 • I .4.3 L’ insta liai Ion dans la moelle osseuse . 46
1 .4.4 l’ormation (le métastases isir les ccl hiles tumorales disséminées 47
1.1.4.5 Clones et cellules souches dans la formation des métaslases 47
1.1.4.6 Les différents types de tumeurs métastasiques osseuses 48

1.2 APOPTOSE ET CANCER 1)E LA PROSTATE 49

1.2. 1 (;iéi(i1 Viii les t’oies apoptO/iqiie’S 49
1.2.1.1 La voie intrinsèque 49
1.2.1.2 La voie extrinsèque Si.)

1.2.2 Mc’ea,u.s’mes de resistance Ci / ‘apoptose CICIIIS le cancer de la prostate SI

1.3 LA PRÉVENTION PAR L’ALIMENTATION 55
1.3./ La genistéine 57
1.3.2 Le lvcopene 58
1.3.3 Le delphinidine 5$
1.3.4 La quercéline 59
1.3.5 Les cruciféres 59
1.3.6 Le 1IW 60
1.3.7 La grenade 60
1.3.8 Les eicosanoides 64
1.3.9 Les eXtraits naturels de plantes 64
1.3.10 Les acides gras po/i’insalurés (PU/”As) 65
1.3.10.! L’mhibition de l’acide arachidonique (AA, 20:4n-6) à l’origine (le la synthèse des ejeosanoïdes 66
1.3.10.2 La modulation de l’activité des facteurs de transcription, de l’expression des gènes et des voies dc
signalisation 66
1.3.10.2.1 Le récepteur activé par les prolilérateurs de péroxysomcs (PPAR) 66
1.3.10.2.2 Le facteur de transcription nucléaire kB (N E-kB) 67
1.3.10.2.3 Les radicaux libres et les espèces réactives d’oxygènes (ROS) 67

1.3.1] Les inicronutriments 6$

2 IIYPOTIIESES ET OBJECTIFS 71

3 I)EUXIEMEPARTIE:ARTICLES 77

3.1 ChAPITRE I: LEs EFFETS AN’I’IPROLIFERATIFS, ANTIANDROGENIQUES ET I’ROAPOPTOTIQUES DE

L’ACIDE PUNICIQUE DANS LES CELLULES CANCEREUSES DE LA PROSTATE LNCAP 79

3.1.1 Traduction du résumé de / ‘article 79
3.1.2 Contribution de l’étudiante 80
3.1.3 Growth inhibitorv, antiandrogenic andpro—apoplotic e/Jécts ofpunicic icia’ in LNCaP Inonan prostate
cancer celis 81
3.2 CHAPITRE II: L’ACIDE JACARIQUE ET SES GEOISOMERES OCTADECATRIENOÏQUES INDUISENT
L’APOPTOSE DANS LES CELLULES CANCEREUSES DE LA PROSTATE HUMAINE, UNE ETUDE

MECHANISTIQUE DE LA RELATION STRUCTURE/ACTI VITE EN 3-D 107

viii
 3.2.1 TraductIws à n¼umé titi arlkie . 107
3.2.2 ContrIbution de I êiuclante 108
i2.3 Jacark anti anti 1m ontadecatrlenolc aciiJgeaisanwn Induce apoptoals selective& in casavus
hunvan prostate crus: a mechanistic anti 3-1) strncinre-actlvl(v stuci’ 109

4 DISCUSSION GENERAI.E ... ........................ --- 137

S CONCLUSION ET PERSPECTIVES. ._...... -

-- -151

6 RÉFÉRENCES. ..................... . 157

ix
 LISTE DES TABLEAUX

TAnI,IAu I M R’ANTSMES D’EV( )LL TION VERS lIN (AN(ER DE LA PROS’T AIE ANI)ROGENE—INDEPENF)ANT [IOj .42

TABLEAu 2 SELECIloN DE QUELQUES COMPOSES DE LA (;RENADE ET LEURS ACTIONS (ONNUES (ONIRE LE CANCER

[276j J: Jus, L: FEUILLE, 1 : FLEI RS, S GRAINES, B ECORCE I)E L’ARBRE, R : ECORCE DES RACINES I)I
L’ARBRE 63

xi
‘Ix
 LISTE DES FIGURES

FI,I;Iu I. AçnvAyIoN Dt; AR PAR LA DI IT (ADAPTIF DE FEIDMAN Bi, FILDMAN D., NA1I;Iu: RIvItws CANnR,
2001) 12

FIGLRIi 2. LA REGULAFION LNI)OURINL Dli LA SYNTIIESIi Dli LA [LSTOSTIiRONL (INsI’IRIE DL C’IAYIÏ)N R.N., (AT F

K.J .,END RINE REVIIWS, 1981) 16

FIGURE 3. SYNTIIIiSU ET DEGRADATION DES 5F ROÏDES DANS IFS (IiI.LUIES EPITIIELIALES Dli LA PROSTATE (AD,\PTIiE

DE LABRIIi F. liT AL., JOURNAl. 0F END CRINOLGY 2005) 20

FIGuRE 4. SYNI BiSE DE NOlO DES hORMONES ANDROGENES ET ()LSIROGENIiS 22

FlGUlE 5. Ls PROMOTEURS ET LES VOIES DE SIGNALISATION IMI’LIQUIiIiS DANS LA REGULAFION Db LEXI’RESSION [Mi

LA CYPI9 (ADAPTEE DE BuLUN, SE., TIIE JOURNAL 0F STER0IL) BIocIIEMISTIY AND MoLIiuuLAl BIOLOGY,

2003) 26

FIGURE 6 LEs DIFFERENTES IilAI’ES AVANT L’AI’PARVFION D’UN CANCER [)E LA PROSTAIli ANDROGENR-INDEPENDAN1

(ADAPn± DE TINDALL D.J., ROI MASTER R JouRNAL 0F UIWL0uY, 2008) 28

FIGuRE 7 QUELQUES MUTATIONS SURVENANT SUR LE AR (ADAIrEE DE FFLDMAN B.J, FELUMAN D.. NATURE

RIivI[iwS CANcER, 2001) 31

FIGLRE 8 CREATION D’UNE VOIE D’ACTIVATION Di: AR VIA LES FACTEURS DE CROISSANCE (ADAI’TFE DE FELDMAN

Bi, FELDMAN D., NATURE REVIIiWS CANcrR, 2001) 35

FIGuRE 9 LA VOIE DE SIGNALISATION WNIVB-CAFENINE (ADAVI EE DE KyI’ lA R.M., WAxrvIAN .1., NAl URE REVIEWS

UROLOG\’, 2012) 3$

FIGURE 10 CINQ VOIES POSSIBLES LXPLIQLANT L’EVOI.ETION VERS EN FiFAF ANDROGENE—INDIiPIiNDANT (ADA PTEE DE

FELDMAN B.J, FII.DMAN D., NATuRI REVIEws CANCER, 2001) 43

xiii
xiv
 LiSTE DES ABREV1ATIONS

AIPC A nclrogen inc/ependent prostate cancer

Akt Protéine kinase B

AND Acide désoxyribonucléique

Apa F— I /1pOplolic peptidase activating/1ctor /

Apol ion Baculovira! lA P repeal—conlaining prolein 6

AR Récepteur aux androgènes

Coriiso! and cortisone responsive Androgen I?eceptor

ARE Eiément de réponse aux androgènes

Bel—2 B—ce?! !yinphorna 2

Bel—X L B-ce?! !vtnphoina-exira large

C A Fs Cancer—associatc’c/ hhrohlasts

clAP 1 Cellular inhibitor o/’apoplosis I

cIAP2 Cellular inhihitor of apoptosis 2

CYP lIA Cytochromc P450 ou CYPscc

CYP17A1 Cytochrome P450 ou 17u-hydroxylase

CYP19 Aromatase

CYP2 1 A2 Cytochrome 21 -hydroxyiase

DcR2 Decoy receptor 2

DI IEA Déhydroépiandrostérone

DHT Dihydrotestostérone

DISC Death-inducing signaling coinp!ex

DR5 Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand

receptor 2

xv
F(3 F Epiderina! growth/actor

FAD Flavine adéni ne dinuciéotide

FAD D !‘as—Associated protein wiih Dcciih Dotnwn

FG F Fibroblasi growih,facior

FLIP FLICE-like inhihiiorj’ protein

FMN Flavine mononucléotide

GnRI I Gonadolibérine

I Ier—2/neu Ifuinan Epiderinai Growth Factor Recepfor—2

3f3-I1 SD 3(3 hydroxystéroïde déshydrogénases

HSP Ileai shockproiein

lAPs inhibiior ofapopiosis

IGF 1 Insulin—like growfh/aclor— I

KGF Kerauinoevie growth/ac for

LDL Lipoprotéine de basse densité

LII I Iormone lutéinisante

MAPK Miiogen-activatedprotein kinase

Mci-l Myeloid ccli leukemia sequence /

mTOR Cible de la rapainycine chez les mammifères

NAD N icotinamide adénine dinucléotide

NADP Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

Ncor Nuclear receptor co-repressor

Omi/I itrA2 Mitochondrial serine protease

P13 K Phosphatidylinositol 3-kinase

PSA Antigène prostatique spécifique

RE Réticulum endoplasmique

xvi
RTK Receptor tyrosine kinase

S HBG Sex—hormone b incling gb bulin

Smac/Diablo Second ,nitochondria—derh’ed activa for o/caspases

SRD5A 5 alpha réductase

StAR Steroidogenic A cule Reguiatory peptide

TI F2 Transcriptional rnediators/in/errnediaryjiictor 2

TRAIL Tumor—necrosis—fiicior re/ated apop fosis inducing ligand

Wnt Wingless et ml

XIAP X-linked inhibilor ofapopisosis

xvii
MOLI flGOU1NI
 Les tumeurs qui se développent dans les organes tels que le sein, la prostate, la glande
surrénale et les testicules sont souvent des cancers dits hormono-dépendants dont la progression
dépend initialement des hormones stéroïdiennes. En e!Tet, les androgènes et plus
particulièrement la dihydrotestostérone (DI-IT) jouent Lin rôle essentiel dans le développement du
cancer la prostate [I]. C’est un cancer très fréquent qui présente un taux de mortalité important.
Aux États-Unis, il est classé au premier rang devant le cancer des poumons et des bronches. Le
nombre dc cas diagnostiqués a augmenté considérablement depuis le développement du test
sanguin de l’antigène spécifique de la prostate (PSA). Cependant, les mécanismes d’évolution du
cancer de la prostate restent inconnus et font de cette maladie un problème de santé publique
haut impact socio-économique [2].

Chez les cancers dits hormono-dépendants ou hormono-sensibles tel que le cancer dc la

prostate, la multiplication de certains types de cellules cancéreuses est stimulée par des hormones
naturelles. En effet, le risque (le développer un cancer de la prostate fait intervenir les honriones
stéroïdiennes et leur voie de biotransformation. Le lien existant entre les androgènes et la
prostate saine ou cancéreuse fait intervenir la voie de signalisation des androgènes comme
médiateur de la biologie tissulaire et comme cible thérapeutique pour traiter le cancer de la
prostate. En effet, la voie de signalisation des androgènes peUt être modulée et donc peut être
responsable du comportement anormal des cellules cancéreuses. Le traitement hormonal tente de
réduire le taux d’androgènes circulant u de bloquer la voie de signalisation des androgènes dans
les cellules cancéreuses. Cependant, il présente certaines limites. En effet, les cellules
cancéreuses prostatiques ne restent pas inactives face à la pénurie en androgènes. Au bout d’un
certain temps, variable selon les individus, de quelques mois à quelques années, elles s’adaptent
à cette situation et se remettent à proliférer. Face à cette situation, le traitement hormonal n’est
plus efficace puisque le cancer évolue vers une hormono-résistance, difficile à traiter [3].

La chirurgie, la radiothérapie, l’hormonothérapie ainsi que le blocage androgénique

combinés sont les traitements les plus communément utilisés pour traiter les patients souffrants
du cancer de la prostate. Cependant, ces traitements sont à l’origine de plusieurs effets
secondaires. De plus, le cancer de la prostate est souvent diagnostiqué chez les hommes de plus
de 50 ans, avec une population qui vieilli de plus en plus, leur nombre est en hausse. Il devient
donc nécessaire de développer des moyens préventifs contre cette maladie.
 Le taux de mortalité du cancer de la prostate varie considérablement en Fonction des pays
[4]. 11 est courant aux États-Unis, notamment chez les Afro-américains qui sont particulièrement
touchés par cette tumeur, ainsi qu’en Europe de l’ouest, mais est moins habituel en Europe de
l’est et en Asic. Les Facteurs expliquant cette large variation géographique sont inconnus.
Cependant, le mode de vie ainsi que l’alimentation jouent un rôle déterminant dans son
cléve loppement.

Dès le début des années 1990, plusieurs études épidémiologiques [5, 6] ont souligné
l’influence de l’alimentation dans la prévention des cancei-s. [in eFfet, des travaux menés sur les
propriétés préventives de la grenade ont mis en évidence une activité pharmacologique de
chacune des parties de ce fruit [7, 8], Mehia et Lansky (2004) ont également montré les efFets
chirnioprotecteurs des acides gras provenant des graines de la grenade, sur le cancer du sein,
testé sur des glandes mammaires dc souris [9].

Nos travaux ont pour objectifs de sélectionner les composés naturels capables d’inhiber la
croissance des cellules cancéreuses de la prostate et cela à diFFérents niveaux d’évolution du
cancer et d’analyser la stntcture chimique qui en est responsable. Notre étude s’est intéressée à
trois points principaux

En se basant sur la littérature, nous nous sommes intéressés à des composés naturels
provenant de diFférentes parties de la grenade. Nous avons testé les efFets antiprolifératifs de ces
composés sur différentes lignées du cancer de la prostate androgène-dépendant et indépendant.

Nous avons ensuite sélectionné les composés actifs, capables d’induire un effet
antiprolifératif sur les cellules androgènes-dépendantes et avons déterminé leurs effets
antiandrogéniques. En effet, nous avons quantifié l’accumulation nucléaire du récepteur aux
androgènes suite à une exposition aux composés. De plus, nous avons testé l’expression d’un
gène cible du AR, le PSA et enfin nous avons testé l’expression du gène codant pour l’enzyme
synthétisant l’androgène nécessaire au développement du cancer de la prostate, la SRD5AI.

Nous avons également identifié les voies de signalisations impliqués dans la diminution
de la viabilité cellulaire induite dans les cellules androgènes-dépendantes et -indépendantes suite
à une exposition aux composés.

2
 Ln fin flous avons déterminé la structure chimique des composés les plus actiFs par une
analyse tridimensionelle.

Celle thèse est divisée en trois parties

Dans la première partie, un rappel bibliographique sera composé dc quatres chapitres. Le

premier chapitre sera consacré â la compréhension de l’importance des hormones sexuelles et
des enzymes impliquées dans leur synthèse et par conséquent dc la croissance du cancer de la
prostate. Le deuxième chapitre traitera de l’évolution du cancer vers un état androgène-
indépendant ainsi que des facteurs Favorisant cette évolution. Le troisième chapitre présentera les
modulations de l’apoptose dans le cancer de la prostate. Enfin, le dernier chapitre traitera de
l’effet préventif des différents composés naturels présents dans la littérature et en particulier de la
grenade et des acides gras polyinsaturés.

Les hypothèses et objectifs feront le lien entre la partie bibliographique et la partie

résultats.

Dans la deuxième partie, les résultats des études réalisées seront présentés sous forme de
deux articles publiés. Selon les trois parties évoquées précédemment, le premier article traite des
effets antiprolifératifs et antiandrogéniques des composés de la grenade. Le deuxième traite des
voies de signalisation impliquées dans la mort des cellules cancéreuses androgène-dépendantes
et -indépendantes ainsi que de l’analyse 3-D de la structure chimique des composés les plus
puissants.

Dans la troisième partie, une discussion générale des résultats ainsi qu’une conclusion et
perspectives seront présentées pour cloturer ce manuscrit.

3
4
1 PREMIERE PARTIE : SYNTHÈSE
 1.1 lE CANCER DE LA PROSTATE

1.1.1 Généralités sur le cancer de la prostate

Le cancer de la prostate est la deuxième cause de mortalité chez les hommes atteints de
cancer aux États-Unis et dans les pays développés. Avec plus de 241 000 nouveaux cas et 28 000
morts estimés pour 2012 aux États-Unis seulement [10].

Malgré les pi-ogrès qui ont permis de mieux comprendre les mécanismes de
développement des cancers, les causes du cancer de la prostate ne sont actuellement pas connues.
Néanmoins, certains Facteurs de risque comme l’âge, la génétique et l’origine éthnique
interviennent dans le développement du cancer de la prostate. L’âge est l’un des facteurs de
risque les plus important. En effet, le cancer de la prostate est le plus souvent diagnostiqué après
50 ans. Selon l’histoire familiale un cancer de la prostate peut survenir sous trois formes : une
forme non héréditaire (la plus répandue), la foi-me Familiale, lorsqu’il existe au moins deux cas
de cancers de la prostate chez des apparentés du premier degré (père, frère) ou du second degré
(grand père, oncle) (20 % des cancers de la prostate) et la forme héréditaire, qui se définit par
l’existence d’an moins 3 cas de cancers de la prostate chez des apparentés du premier degré (père
ou frère) ou dii second degré, ou de 2 membres de la famille diagnostiqués avant l’âge de 55 ans
(5 % des cancers de la prostate). L’origine éthnique est aussi un Facteur de risque. En effet, de
nombreuses études ont montré que le nombre de cas de cancers de la prostate est beaucoup plus
important dans les pays d’Europe du nord et d’Amérique du nord que dans les pays d’Asie du
sud-est. De plus, il a été établi que les hommes d’origine Afro-antillaise ont un risque accru de
développer un cancer de la prostate. Il existe d’autres facteurs de risque probables qui font
intervenir le mode de vie des patients (alimentation, activité physique, environnement) plus
difficile à analyser.

La prostate est une glande de l’appareil génital masculin qui produit le liquide
prostatique. Elle est entourée d’une capsule, qui la sépare du reste des autres organes du pelvis.
Elle est constituée de trois types de cellules : les cellules glandulaires qui sécrètent les liquides
pour l’éjaculation, les cellules musculaires qui règlent le jet d’urine et l’éjaculation et les cellules
fibreuses qui maintiennent la structure de la glande.

7
 La prostate se divjse en 3 zones

• une zone périphérique c’est la région de la prostate la plus proche du rectum. La

majorité des tumeurs malignes de la prostate (environ 75 %) surviennent dans cette zone
• une zone transitionnelle (de transition) c’est la zone située au milieu de la prostate en
avant des zones périphérique et centrale, elle entoure l’urètre. Avec le vieillissement,
cette zone augmente en taille et est appelée hypertrophie bénigne de la prostate, elle
survient chez presque tous les hommes de plus de 70 ans.
• une zone centrale c’est la partie de la prostate située à la base entourant les canaux
éjaculateurs. Elle représente 20 (y
0 de la prostate.

Les traitements proposés lors d’un diagnostic du cancer de la prostate dépendent de

plusieurs facteurs comme son étendue au moment du diagnostic et son évolution potentielle.
Pour cela il existe une classification médicale internationale qui prend en compte 3 critères : la
taille de la tumeur, l’atteinte ou non des ganglions lymphatiques par des cellules cancéreuses et
la présence ou non de métastases ailleurs dans le corps. Ces 3 critères permettent de déterminer
ce qu’on appelle le stade dii cancer, c’est-à-dire son degré d’extension. On distingue 4 stades
différents du cancer de la prostate

le cancer de la prostate localisé, qui est limité à la capsule prostatique et est classés en 3
sous-catégories en fonction de son risque d’évolution le cancer de la prostate à faible
risque ; à risque intermédiaire et à risque élevé
> le cancer de la prostate localement avancé, qui s’étend au-delà de la capsule prostatique
ou aux organes adjacents; aucun ganglion n’est atteint; il n’y a pas de métastases à
distance
> le cancer de la prostate avec atteinte ganglionnaire pelvienne
> le cancer de la prostate métastatique, il présente une ou des métastases à distance.

Ces stades sont établis selon une classification internationale dite classification TNM.
Elle permet d’évaluer le stade du cancer de la prostate et prend en compte 3 critères la taille de
la tumeur (T pour tumeur), la présence ou non de cellules cancéreuses dans les ganglions (N pour
ganglions) et la présence ou non de métastases (M pour métastase).

8
T : Tumeur primitive

• TO Absence de tumeur
• T I : Tumeur non palpable ou non visible en imagerie (T la < 5 % du tissu retiré, T lb > 5
% du tissu retiré et Tic : découverte par élévation du PSA et réalisation de biopsies
positives)
• T2 : Tumeur limitée à la prostate (apex et capsule compris) (T2a : Atteinte de la moitié
d’un lobe ou moins, T2b : Atteinte de plus de la moitié d’un lobe sans atteinte de l’autre
lobe, T2c : Atteinte des deux lobes)
• T3 : Extension au—delà de la capsule (T3a : Extension extra—capsulaire, T3b : Extension
aux vésicules séminales)
• T4 : Extension aux organes adjacents (col vésical, sphincter urétral, rectum, paroi
pelvienne) ou tumeur fixée à la paroi pelvienne

N : Ganglions régionaux

• NO : Absence de mélastase ganglionnaire

• Ni : Atteinte ganglionnaire régionale

M : Métastases à distance

• MO : Absence de métastases à distance

• Ml Métastases à distance (Mia : Ganglions non régionaux, Mlb : Os, Mie : Autres
sites)

Les formes localisées du cancer de la prostate sont classées en fonction de leur risque
évolutif à i’aide d’une classification appelée la classification de d’Amico. Cette classification a
établi 3 sous-groupes de cancers de la prostate localisés selon le risque de rechute, c’est-à-dire 3
niveaux de risque de progression du cancer: un risque faible, un risque intermédiaire et un risque
élevé. Chaque niveau de risque est défini en fonction de son TNM, son score de Gleason
(déterminé grâce à une étude microscopique des cellules cancéreuses et permet de classer la
tumeur selon son degré d’agressivité ; plus il est élevé, plus la tumeur est agressive) et la valeur
du PSA.

9
Les principaux traitements médicaux contre le cancer de la prostate sont les suivants

• La prostatectomie radicale consiste en une ablation de la glande prostatique et des

vésicules séminales par voie chirurgicale. C’est la première méthode utilisée pour traiter
le cancer de la prostate conçue par Huggins en 1941 [111. Elle est proposée lorsque le
cancer est localisé.
• La radiothérapie externe consiste à exposer la prostate à des irradiations qui créent des
lésions dans l’ADN des cellules cancéreuses. Elle est proposée aux patients atteints d’un
cancer loealisé, mais qui ne peuvent pas subir d’opération chirurgicale.
• Le traitement hormonal ou hormonothérapie consiste à inhiber la synthèse des hormones
pour qu’elles cessent de stimuler le cancer. Elle est le plus souvent réservée à des cancers
qui ne sont plus limités à la prostate. Ce traitement est, en général, prescrit en association
avec des traitements locaux (prostatectomie, radiothérapie). L’objectif essentiel de
l’hormonothérapie est de ralentir la progression du cancer et d’accroître la survie dii
patient tout en lui conférant une qualité de vie décente. L’hormonothérapie peut être de
différents types:
— Castration chirurgicale : consiste en une ablation des testicules afin de prévenir la
fabrication de la testostérone. Elle assure une diminution d’environ 95 % du taux
d’androgènes dans le sang
— Castration médicale ou chimique : consiste en l’utilisation de médicaments
hormonaux actifs afin de diminuer le niveau de testostérone dans le sang
- Le blocage androgénique consiste à bloquer les androgènes dans leur accès au AR
par un anti-androgène pur de la classe des Ilutamides ou des bicalutamides [12].

Les traitements médicaux actuellement disponibles comportent des effets indésirables

comme l’impuissance sexuel le et l’incontinence urinaire.

La prostate est divisée en deux compartiments cellulaires : un compartiment

mésenchymateux et un compartiment épithélial. Le compartiment mésenchymateux comporte
des cellules musculaires lisses et des fibroblastes [13], tandis que le compartiment épithélial est
composé de cellules épithéliales glandulaires, de cellules basales et de cellules neuroendocrines
[14]. La synthèse des androgènes a lieu dans le compartiment épithélial qui est subdivisé en trois

10
compartiments : un premier compartiment de cellules souches indifférenciées, un deuxième
compartiment de cellules prolifératives indifférenciées et un troisième compartiment de cellules
différenciées [I 5].

Chez les cancers dits hormono-dépenclants ou hormono-sensibles tel que le cancer de la

prostate, la croissance et la différenciation des cellules cancéreuses dépendent essentiellement
des androgènes dont la synthèse est assurée par les dilTéi-enles enzymes de la stéroïdogenèse.

1.1.2 Le cancer de la prostate: hormono-dépendant

Les androgènes sont indispensables au développement de la prostate i sa croissance ainsi

qu’à sa progression. De plus, la DHT est l’androgène responsable de la croissance et de la survie
des cellules cancéreuses de la prostate. En effet, la testostérone est convertie en DHT dans la
prostate par la SRDSA1 et 2. Deux raisons expliquent cette conversion, tout d’abord la DuT se
dissocie plus lentement du AR, de plus elle confère au AR une plus grande résistance à la
dégradation en comparaison avec la testostérone [I 6]. De plus, la DHT a une gi-ande amnité pour
le AR qui est un régulateur clé assurant la survie et le maintient d’une prostate saine. Il joue aussi
un rôle important dans la progression du cancer (le la prostate puisqu’il induit une prolifération
incontrôlée des cellules.

1. 1.2. I Le rôle du récepteur aux androgènes (AI?)

Le AR appartient à la superfamille des récepteurs nucLéaires [17] et comporte 4 régions

fonctionnelles un domaine de régulation N terminal, un domaine de liaison à l’ADN, une région
contenant un signal de localisation nucléaire et une région C terminale qui se lie au ligand. Le
AR agit comme un facteur de transcription [17-20]. Il est principalement localisé dans le
cytoplasme et est maintenue inactif grâce à des protéines HeatShock (HSP9O et HSP7O).
Lorsqu’il se lie à son ligand, une série de changements conformationnels induit la libération des
protéines HeatShock. Le récepteur dimérise, se phosphoryle et transioque dans le noyau pour se
lier à l’ADN sous forme d’homodimère sur la région cible de l’ADN, appelée élément de
réponse aux androgènes (AREs), localisée dans la région «enhancer» des gènes cibles [20-22].
Des corégulateurs sont alors recrutés (coactivateurs et corépresseurs) [23]. Ils assurent, en
association avec la machinerie de la transcription [23], l’expression des gènes régulés par le AR.
Il induit par exemple l’expression des gènes codant pour le PSA (Prostate Specific Antigen) et

11
pour les Facteurs de croissance qui agissent sur le développement, la croissance et les Fonctions
de la prostate [23-27] (Figure 1).

w..

. :..

J ‘: ;‘x t ;\4•(\

7\ )\

Figure 1. Activation du AR par la DHT (Adaptée (le Feldman B.J, Feldinan D., Nature Reviews Cancer,
2001).

La testostérone est présente dans le sang et est liée à l’albumine ou à la SHBC. Elle est sous forme libre en
faible quantité. Cette dernière entre dans les cellules de la prostate pour être convertie en DHT par la 5 a
réductase. Elle se lie au AR pour permettre l’activation de l’expression des gènes cibles (HSP: Heat Slwck
Protein ; SHBG: sex-liorinone binding globrilln; GTA : G-Protein Activation Transcr4itioii ç ARA 70:
A ndrogen Receptor Associaled Protein 70).

1.1.2.2 La stéroïdogenèse

Le risque de développer un cancer de la prostate fait intervenir les hormones stéroïdieimes et

leur voie de biotransformation.

12
 Les enzymes siéroïdiennes sont responsables de la hiosynthèse i partir du cholestérol de

plusieurs hormones tels que les glucocorticoïdes (métabolisme, système immunitaire,

inflammation) les minéralocorticoïdes (homéostasie hydrique), ainsi que les hormones sexuelles

(caractères sexuels, reproduction, développement osseux). Plusieurs organes sont capables de

synthétiser des stéroïdes biologiquement actifs tels que la glande surrénale, les testicules, les
ovaires, le cerveau, le pliceita et le tissu adipeux. Seul trois organes endocriniens sont
spécialisés dans la synthèse de izovo des stéroïdes : la glande surrénale, les testicules et les
ovaires.

La glande surrénale est composée d’un cortex et d’une zone médullaire. Le cortex est
composé de trois zones de l’extérieur vers l’intérieur la zone glomérulée peiinel la synthèse de
l’aldostérone, la zone fasciculée synthétise le cortisol et la zone réticulée synthétise le précurseur
des androgènes le déhydroépiandrostérone (DIIEA). La synthèse de itovo de toutes les hoi-inones
stéroïdiennes commence par la conversion du cholestérol en prégnénolone (par la CYP1 lA) qui
u son tour est convertie en progestérone (par la 313-HSD). La prégnénolone et la progestérone
sont les précurseurs de toutes les autres hormones stéroïdes [28].

La stéroïdogenèse des hormones androgènes et oestrogènes a lieu dans les gonades, dans les
glandes surrénales, et par conversion d’autres stéroïdes sexuels dans d’autres tissus comme la
prostate ou le tissu adipeux. Elle fait intervenir

• Les hydroxystéroïdes déshydrogénases (IISDs) qui sont des oxydoréductases à

NAD+/NADP+ (plusieurs isoformes) et les réductases (5 a-réductase) [29].

• Les enzymes de la famille des cytochromes P450 (dont le gène codant porte l’abréviation
CYP) qui sont des hérnoprotéines constituées d’une porphyrine complexée à un atome de
. L’hème, sous forme réduite, peut lier l’oxygène. Elles agissent comme des
3
fer
monooxygénases à NADPH (hydroxylases) et sont classées en deux groupes: un groupe
non-spécifique qui traite les molécules exogènes comme les médicaments et un deuxième
groupe qui a un rôle spécifique dans le métabolisme des molécules endogènes comme les
hormones [30, 31].

13
 Les réactions qui ont lieu pendant la stéroïdogenèse sont imidjrectionnelles parce que la
plupart sont irréversibles. Les enzymes du cytochrome P450 ont une activité limitée ii trois types
de réactions chimiques I ‘hydroxylation et occasionnellement le clivage d’une liaison carbone—
carbone et une activité d’arornatisation spécifique è CYP 19. Toutes les réactions è cytochrome
P450 utilisent de l’oxygène, des électrons provenant de la NADPII et une flavoprotéine à FMN
et/ou lAD (une adrénodoxine réductase dans la mitochondrie ou une cytochrome P450 réductase
dans le réticulum endoplasmique) pour effectuer une réaction de type

R-H+O
+
2 NADPH+H R OH+H
O
2 +NADP

Les enzymes du cytochrome P450 responsables de la synthèse des hormones sexuelles

sont localisées dans le réticulum endoplasmiquc lisse. Elles sont présentes dans des zones
spécifiques des gonades et de la corticosulTénale et catalysent des réactions spécifiques des
précurseurs des stéroïdes. Elles comprennent les CYP17A1, les CYP21A2 et les CYPI9AI
(aromatase) [32].

Les hormones sexuelles comprennent les androgènes et les oestrogènes. Les androgènes
comprennent la testostérone, la DHEA, l’androstènedione, l’androstènediol, l’androstérone et la
DuT. Les oestrogènes sont composés de l’estrone, de l’œstradiol et de l’oestriol (produit durant la
grossesse seulement).

Origine des androgènes plasmatiques chez / ‘homme

- La testostérone est sécrétée à 95 % par les testicules (cellules de Leydig) et à 5 % par les
glandes surrénales. La synthèse de la testostérone par les testicules a deux grands niveaux
de régulation, endocrine et locale. La régulation endocrine met en jeux l’axe
hypothalamo-hypophyso-testiculaire. En effet l’hormone lutéinisante LH (luteinizing
honrione), produite par les cellules gonadotropes de l’antéhypophyse et contrôlée par la
gonado-libérine (GnRH), est le principal facteur de contrôle de la production de la
testostérone (Figure 2). La LH contrôle la croissance et la différenciation Leydigienne

14
 ainsi que toutes les étapes de la stéroïdogenèse. La sécrétion de LH et de (JnRH est
également régulée, par la testostérone elle-même, au niveau de l’hypophyse et de
l’hypothalamus respectivement. Un rétrocontrôle négatif direct est assuré après
conversion de la testostérone en oestradiol. La régulation locale endocrine et paracrine
module aussi l’activité de la LII.
- La DI-IEA est une hormone stéroïde inactive synthétisée à partir du cholestérol dans le
cortex surrénal (100 %) et convertie en androgènes actifs dans différents tissus comme la
prostate.
- L’androstènedione est un stéroïde produit par les testicules (50 %) et le cortex surrénal
(50 %).
- Soixante-quinze pour cent de la DuT est synthétisée dans le foie et les 25 % restant sont
synthétisés dans la peau.

Origine des androgènes plasmatiques chez lafemme

- La testostérone provient à 70 % de la conversion des androgènes surrénaliens dans les

organes péiiphériques 25 % des ovaires et le reste est directement produit par les
surrénales
- L’androstènedione provient à 70 % des ovaires, 25 % des surrénales et le reste provient
des organes périphériques
- La DHEA provient à environ 100 % des surrénales.

15
 I
4

/
Cellules de Leydig
I Cellules de Sertoli

I
T s t o s t é ro n e nliibne
est r d io I

Figure 2. La régulation endocrine de la synthèse de la testostérone (Inspirée de Clavton R.N., Catt K.J.
Endocrine Reviews, 1981).

La synthèse dc la testostérone a lieu dans le tissu interstitiel des testicules, elle est continue de la puberté à la
mort. Sa régulation fait intervenir les hormones hypophysaires LII et FS1L. [a FSH permet la synthèse (les
spermatozoïdes tandis que la LH permet la synthèse de la testostérone en agissant sur les cellules de Leydig.
L’hypophyse est sous le contrôle de l’hypothalamus qui secrète de la GnRH de façon pulsatile. Cette
neurohormone agit sur les cellules hypophysaire et stimule la sécrétion des gonadostimulines. Un rétrocontôle
négatif est assuré par la testostérone pour activer ou inhiber l’axe hypothalamo-hypophysaire pour maintenir
le taux de testostérone stable.

Le processus de synthèse des stéroïdes, leurs actions ainsi que leur métabolisme peuvent
être divisés en 5 parties. (1) la conversion du cholestérol en prégnénolone, (2) sa conversion en
différents intermédiaires et en stéroïdes actifs (3) le métabolisme des précurseurs et des

16
hormones dans les organes périphériques (4) leurs effets métaboliques spécifiques clans les tissus
cibles (5) leurs dégradation.

(I) La conversion du cholestérol en prégnénolone : le cholestérol provient de la

synthèse endogène (dans le RIZ à partie de l’acétylCoA), de l’apport exogène
(LDL) ou des stocks cellulaires (cytosol). Le cholestérol circulant est associé
aux LDL. Il entre dans la cellule par fixation aux récepteurs LDL
membranaires où il est soit utilisé soit stocké dans des vacuoles
cytoplasmiqties sous forme d’estei-s de cholestérol. Ces vacuoles sont situées
au niveau de la membrane externe de la mitochondrie. Lorsque la cellule reçoit
un stimulus, le cholestérol est mobilisé pour la stéroïdogenèse. Il est alors
transféré de la membrane externe dc la mitochondrie à la membrane interne
grâce à un complexe protéique qui comprend la protéine StAR (Steroidogenic
Acute Regulatory pepticle) présente dans les gonades et les corticosurrénales.
La stéroïdogenèse débute alors avec la conversion dii cholestérol (C27) en
prégnénolone (C2l) dans la face interne de la mitochondrie grâce à une
enzyme clii cytochrome P450 sec (side chain cleavage) codée par le gène
CYP I I A I La prégnénolone est le premier stéroïde comniun à la synthèse de
.

tous les stéroïdes.

(2) La conversion du prégnénolone en intermédiaires et en stéroïdes actifs : les
enzymes présentent dans les cellules stéroïdogéniques déterminent le stéroïde
qui sera synthétisé à partir du prégnénolone. Par exemple, le prégnénolone est
converti en aldostérone dans la zone glomérulée de la glande surrénale. En
revanche, il est converti en androstènedione dans les cellules de la thèque dans
les ovaires puisqu’elles n’ont pas les enzymes nécessaires pour synthétiser de
l’aldostérone.
(3) Le métabolisme des précurseurs et des hormones dans les organes
périphériques : seuls quelques organes sont capables de synthétiser des
stéroïdes à partir du cholestérol ; par contre plusieurs organes sont capables de
transformer les stéroïdes circulant provenant d’autres sources. Par exemple le
DHEA de la glande surrénale est converti en testostérone dans les tissus
périphériques et cette voie est la principale source de testostérone chez les

17
 jeunes Femmes. La peau, le cerveau et le Foie ont aussi la capacité de
synthétiser des stéroïdes.
(4) Les effets métaboliques spéciflques dans les tissus cibles les hormones
peuvent être activées ou devenir plus effectives dans les cellules cibles comme
l’exemple de la testostérone qui est convertie en DuT dans la prostate.
(5) L’inactivation des stéroïdes le catabolisme des stéroïdes a lieu dans les tissus
cibles et dans le foie. Les stéroïdes sont hydrophobes, ils sont transformés en
stéroïdes hydrosolubles excrétés dans les urines. Pour cela ils subissent deux
transformations la conjugaison (qui comprend la sulfonation et la
glucuroniclation) et I ‘hydroxylation.

La conjugaison

Les enzymes de la conjugaison comprennent les sulfotransférases et les UDP

glucuronosyltransférases (UGT). Elles jouent un rôle important dans le contrôle de l’activité des
stéroïdes sexuels. En effet, elles augmentent leur polarité en ajoutant des groupements qui
augmentent leur solubilité dans le sang et facilitent ainsi leur excrétion dans les urines ou la bile.
Il existe cependant une différence majeure entre ces deux groupes d’enzymes. La sulfotransférase
inactive le stéroïde actif grâce à un groupement sulfate qui pourrait être réactivé ultérieurement
par une sulfatase présente dans le tissu. En revanche, la formation d’un dérivé glucuronicle par
une UGT est irréversible et provoque l’élimination définitive du stéroïde.

La sulfotransférase

La sulfonation a lieu dans le foie grâce â l’hydroxystéroïde sulfotransférase (HSST,

SULT 2A1), présente dans le cytosol et dans la membrane de l’appareil de Golgi. C’est un
procédé de désactivation et de détoxification, catalysée par un groupe d’enzymes cytosoliques du
nom de sulfotransférases (SULT). Ces dernières ajoutent de manière unidirectioimelle un
groupement sulfate, provenant du coenzyrne PAPS, aux groupements hydroxyles présents sur les
stéroïdes actifs.

18
 Les U DP-glucuronosyltransférases (UG1’)

Les UGT catalysent un processus biochimique appelé glucuronidation, ils sont présents
dans le réliculum endoplasmique et permettent le transfert irréversible d’acides glucuroniques sur
différentes molécules endogènes et exogènes [33]. L’ajout d’un groupement glucuronicle
provoque un encombrement stérique qui empêche la liaison du stéroïde à son récepteur et aboutit
à son excrétion de la cellule. La famille des UGT est divisée en deux sous-groupes: les UGTI et
les UGT2. Les enzymes du premier sous-groupe sont principalement actives sur les phénols, la
bilirubine et les estrogènes (UGTIA). Le second sous-groupe se divise en deux sous-familles, les
UGT2A et les UGT2B; celles-ci sont impliquées dans la glucuronidation des androgènes en
position 3Œ— ou I 7f3—hydroxy plus particulièrement au niveau du foie, mais aussi dans les tissus
périphériques (Figure 3). Dans la prostate humaine, ce sont les UGT2B15 et UGT2BI7 qui sont
responsables de la glucuroniclation du DHT et de ses métabolites [34].

L’hydroxylation

L’hydroxylation est effectuée par des hyciroxylases du cytochrome P450 qui transforment
les stéroïdes en produits polaires pour faciliter leur excrétion dans l’urine [35].

19
 ( ‘ps sufr
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1
il

Figure 3. Synthèse et dégradation des stéroïdes dans les cellules épithéliales de la prostate (Adaptée de Labrie
F. et al., Journal of Endocrinolgy 2005).

Le catabolisme des androgènes débute par la conversion des androgènes actifs en androgènes inactifs DIIEA,
3 alpha-diol et ADT suivi par leur glucuronidation par trois enzymes UGT2BI7, UGT2BI5 et UGT2B7,
responsables de la glucuronidation de tous les androgènes et leurs métabolites chez l’humain. DHEA,
déhydroépiandrostérone; 4-Dione, androstènédione; A-Dione, 5-alpha-androstane-3,17-dione ; ADT,
androstérone; 5-Diol, androst-5-ène-3-alpha,17 béta-diol; UGT2BI7, uridine glucuronosyl transférase
2B17; FISD, hydroxystéroide déshydrogénase.

Les enzymes intervenant dans la synthèse de novo des stéroïdes sexuels sont la P45Oscc,
la 3f3-IISD, la CYP17, la 17f3-HSD, la 3u-HSD, la sulfatase, la CYPI9 et la SRD5A. Cependant,
les principales enzymes intervenant dans la synthèse des hormones sexuelles et qui jouent un rôle
important dans l’évolution du cancer de la prostate sont la CYP19 et la SRD5A.

20
1.1.2.2.1 LaP45Oscc

La P4SOscc, aussi connue sous le nom de P450Cl lAi (du gène CYPI lAI), est localisée
dans la membrane interne de la mitochondrie. Elle catalyse la conversion du cholestérol en
prégnénolone, première étape de la synthèse de toute hormone stéroldienne. Cette réaction
implique trois monooxygénations consécutives, nécessitant chacune une molécule de NADPH:
une 20-hydroxylation, une 22-hydroxylation et finalement une coupure de la chaîne latérale au
niveau des carbones 20 et 22 [36]. Cette enzyme est préférentiellement exprimée dans la
corticosurrénale [37], les testicules [38], les ovaires [39], le placenta [37] et plus faiblement dans
le cerveau [40] et la peau [41] (Figure 4).

1.1.2.22 La 3frHSD

La prégnénolone synthétisée à partir du cholestérol peut être convertie en 17-OH-PREO

par la CYP17 ou servir de substrat à la 3p-HSD et générer, entre autres, la progestérone, le
premier stérolde biologiquement important. Cette enzyme microsomale de la famille des
déshydrogénases à courte chaîne est nécessaire à la formation de toutes les classes d’hormones
stérordiennes. Elle convertie, entre autres, la prégnénolone en progestérone, la 17-OH-
prégnénolone en 17-OH-progestérone et la DHEA en androsténédione. 11 existe deux types de
3fr-HSD chez l’homme avec 93 % d’homologie, la HSD3BI présente dans les tissus
périphériques, le placenta [42], le fbie [43], la peau [44] et la prostate [45], et la HSD3B2
présente uniquement dans les gonades et la surrénale [46] (Figure 4).

21
HO
Choleslerol

CYPIIA

b
015
CYPlTayase)

HOC’
Dehydroepianclroslorone
Pregrioriolone 1 7-HydroxypregnenoIone
(DHEA)

HS03B2 HSD3B2 HSD3fl2

CYPI7(Iyase)
jjj
Progrrslerone 1 7s-Hydroxyprogesterone Androslenedione Estrono

HSDI7B5 HSOI7BI,7

OH

Estradiol
Testosterone

Anorostenedione

HSDI7B3.5

OH

RD5AI.2 CYPI
1
HO
DhydrotesIoslerone Testosterone Estradiol

prostate, skin, hair tollicles, etc testicular Leydig cells Leydig and Sertoli ceils

Figure 4. Synthèse de novo des hormones androgènes et oestrogènes

22
1.1.2.2.3 LaCYPI7

Elle est responsable de la synthèse (les androgènes de la glande surrénale. Les glandes
surrénales sont deux glandes endocrines triangulaires situées au—dessus des reins. Elles
comprennent deux structures distinctes : la médullosurrénale et la corticosurrénale.

La corticosurrénale est divisée en trois zones, de l’extérieur vers l’intérieur la zone

glomérulée, la zone fasciculée et la zone réticulée [47]. La zone réticulée : synthétise la DIIEA et
l’androstènedione, elle représente 10% de la corticosulTénale.

CYP17 est capable de catalyser trois activités une 17u-hydroxylase qui produit les
précurseurs dii cortisol, une 17, 20 lyases qui produit les précurseurs des hormones sexuelles et
une faible activité 16Œ-hydroxylase qui hydroxyle la progestérone et la DIIEA [48]. CYPI7 est
aussi présente au niveau des ovaires, des testicules et de la prostate. Elle n’est cependant pas
présente dans le placenta humain [38].

CYP1 7 est une enzyme importante qui hydroxyle la prégnénolone et la progestérone clans
la zone fasciculée et clive la 17-hydroxyprégnénolone en D1IEA dans la zone réticulée. Le taux
de DHEA augmente continuellement à partir de 6 ou 7 ans pour atteindre son maximum à l’âge
de 20 ans puis commence à décroître jusqu’à 15 % à 90 ans [49]. CYPI7 convertie aussi la
prégnénolone en DHEA dans les gonades

Les deux activités dc la CYPI7 dans la zone réticulée de la glande surrénale, sont
transitoires durant la vie d’un individu ; ce phénomène s’appelle l’aclrenarche [50]. L’adi-énarche
apparait chez l’homme ou la cemme avant la puberté à environ 8 ans, lorsque la glande surrénale
augmente sa production d’androgènes. Puis de l’enfance à l’âge adulte, le taux d’androgène
augmente avec l’augmentation de l’activité de clivage de CYPI7 (17, 20 lyases). Cette activité
atteint son maximum à l’âge de 25-35 ans puis décroît (Figure 4).

1.1.2.2.4 La 17f3-HSD

Les stéroïdes sexuels actifs (testostérone, DHT) possèdent tous un groupement hydroxylé
en position l73 du noyau stéroïdien. La réduction du groupement 17-céto en groupement 17J3-
hydroxy est catalysée par les 17t3-HSD. À ce jour, 15 isoenzyrnes ont été identifiées chez les
mammifères [5 1, 52], dont au moins 13 se retrouvent chez l’homme. Certaines sont responsables

23
 de l’activation des I Tcétosléroïdes (les types I, 3, 5, 7, 12, 15), alors que d’autres assurent

l’inactivation des 17f3hydroxystéroïdes (les types 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11 et 14), en utilisant

respectivement le NAI)PH et le NAD+ comme coFacteurs [53].

1.12.2.5 La 3Œ-l-ISD

La 3a-HSD catalyse la réduction des 3-cétoséroïdes en 3-hydroxystéroïdes. Ces enzymes

sont principalement en charge de réguler la biodisponibilité du DuT, et secondairement celle de
l’androstèncdione dans les tissus périphériques. Il existe deux types de 3u-JISD : le type 1 (du
gène AKRI C4), qui est exprimé au niveau du l’oie [54] et le type 3 (du gène ARKI C2) qui est
retrouvé, entre autres, dans le foie et la prostate [55].

1.1.2.2.6 La sulfatase

La sulfatase (du gène STS) est une estérase microsomale qui hydrolyse le groupement
sulf’ate de substrats tels que les stéroïdes C19 et les oestrogènes. Elle permet de métaboliser le
DI1EA-S, présent en grande quantité chez l’homme en DHEA. Ce dernier est converti
ultérieurement en androgènes et en oestrogènes actifs [56].

1.1.2.2.7 La CYP19

L’aromatase est l’enzyme qui assure la conversion des androgènes en oestrogènes (Figure
4). Elle est composée d’un cytochrome P450 spécifique: le P45Oarom et une flavoprotéine : la
NADPII-cytochrome-P450 réductase. Laromatisation des androgènes en oestrogènes a lieu dans
le réticulum endoplasmique. Trois moles de NADPH et trois moles d’oxygènes sont nécessaires
pour la formation d’une mole d’oestrogènes [57, 58].

Elle est exprimée au niveau de différents tissus incluant les cellules de la granulosa des
ovaires, le syncytiotrophoblaste du placenta, les cellules de Leydig des testicules ainsi que
certains tissus non stéroïdogéniques tels que le cerveau, le tissu adipeux, le foie, les muscles et la
peau [30, 35, 59]. Chez l’homme, l’aromatase convertie la testostérone provenant des cellules de
Leydig en oestradiol dans les cellules de Sertoli ; c’est une étape importante dans l’initiation de la

24
spermatogenèse [60j. Chez la Femme avant la ménopause, le taux le plus élevé d’aromatase est
localisé dans les cellules de la granulosa des ovaires où elle permet la conversion de la
testostérone en oestradiol et l’androstènedione en oestrone durant la phase ft)liiculaire. Après hi
ménopause, le tissu qui exprime le Plus l’aromatase est le tissu adipeux.

L’expression de l’aromatase est régulée par l’utilisation différentielle de promoteurs

spécifiques à chaque tissu. Le gène de l’aromatase est transcrit du télomère vers le centromère du
chromosome 15q 21.2, et la région qui code pour la protéine CYPI9 est de 30 kb et contient 9
exon (li—X). Le site d’initiation de la traduction est localisé dans l’exon Il. En amont du gène,
une région de 93 kb contient différents promoteurs. Le promoteur (11), (1.3) (exprimé dans le
tissu adipeux et le cancer du sein) et (1.6) (exprimé dans les os) sont localisés à I kb en amont du
site d’initiation de la transcription ATG dans l’exon II. Dans les gonades, l’expression de CYPI9
est régulé par le promoteur 11, dans le placenta les promoteurs sont (1.1 et 2a), dans le cerveau le
promoteur spécifique est le (If), dans les cellules endothéliales (1.7), dans le tissu foetal (1.5) et
dans le tissu adipeux (1.4) (Figure 5).

Dans une prostate saine, CYP19 est uniquement exprimée dans les cellules stromales en
faible quantité.

25
 5’

Figure 5. Les promoteurs et les voies de signalisation impliquées dans la régulation de l’expression de la
CYPI9 (Adaptée de Bulun, S.E., The journal ofSteroid Biochemistry and Molecular Biology, 2003).

Schéma décrivant les promoteurs, spécifiques à chaque tissu, du gène codant pour la CYP19 dans le génome
humain. La région codante et la protéine traduite sont identiques dans tous les tissus.

1.1.2.2.8 La SRD5A

La 5 u-réductase convertie la testostérone en DHT (Figure 4). Cette réaction est faible au
niveau d’un testicule adulte, mais est prédominante dans l’épididyme et la prostate puisque la
DuT joue un rôle important dans le maintien des fonctions sexuelles. La testostérone et la DI-IT
activent le même récepteur aux androgènes mais exercent des fonctions différentes. Au début du
développement embryonnaire, la testostérone est responsable de la différenciation du canal de
Wolff en ses dérivés, qui comprennent l’épididyme, le canal déférent et les vésicules séminales.

26
Q Liant è la Dli’!’, elle intervient dans la différenciation du sinus urogénital (où la prostate se
développe) et des organes génitaux externes. Dc plus, elle permet l’apparition des caractères
sexuels secondaires masculins è la puberté [61].

La différence majeure entre les deux androgènes apparaît è faible concentration. En effet,
l’action de la testostérone sur la prostate n’est possible qu’à partir d’un certain seuil en dessous
duquel elle n’a pas d’effet. Par contre, même è faibles concentrations, la DuT est capable de
stimuler la croissance de la prostate. Le rôle majeur de la 5 a-réductase est clone d’améliorer le
signal aux androgènes en convertissant la testostérone en DHT. Elle assure ainsi les fonctions
normales de la prostate même lorsque la concentration en androgènes circulants est faible [1, 62].

Il existe deux types de 5 Œ-réductase:

> La SRD5AI est présente dans le foie, la peau (à l’exception des organes génitaux), le
cerveau et en faible quantité dans la prostate dans le noyau des cellules épithéliales et
stromales. Elle intervient dans la différenciation des organes sexuels mêles (pénis,
scrotum, urètre) et est surexprimée dans le cancer de la prostate. Elle est codée par le
gène SRD5A1 qui a une structure de 5 exons et de 4 introns, localisée sur le
chromosome 5pl 5, elle est composée de 259 acides aminés.
> La SRD5A2 est fortement exprimée dans la prostate dans le cytoplasme des cellules
épithéliales et stromales, la peau des organes génitaux, l’épididyme, le follicule des
cheveux, les seins, l’utérus, les testicules, la vésicule séminale et le foie. La SRD5A2
est aussi présente dans l’utérus, les ovaires, le placenta et le cerveau, mais en plus
faible quantité. Elle est codée par le gène SRD5A2 (qui a la même structure que le
gène SRD5AI), localisé dans le chromosome 2p23. Elle est composée de 254 acides
aminés.

Les recherches de Huggins et Hodges en 1941 ont montré que la croissance et le

développement de la prostate dépendaient des androgènes. Ils ont été les pionniers du traitement
par hononothérapie des patients atteints du cancer de la prostate à un stade localement avancé
ou métastatique [63]. Cependant, les recherches de Gittes et Laufer ont montré que malgré une
réponse initialement positive des patients traités par blocage androgénique (80 à 90 % des cas),
la tumeur évoluait vers un stade androgène-indépendant [64, 65].

27
 1.1.3 Progression vers un cancer liormono-indépendant

[.es inflammations chroniques, l’alimentation ainsi que les facteurs héréditaires sont,
entre autres, responsables de l’apparition d’un cancer de la prostate et de SOfl évolution. Les
lésions évoluent vers une tumeur qui progresse lentement vers une maladie invasive (Figure 6).
Les androgènes et leurs récepteurs (AR) interviennent à tous les niveaux dc la progression du
cancer. Fn efTet, le récepteur aux androgènes est un régulateur qui maintient la survie et le bon
fonctionnement d’une prostate saine mais induit une prolifération cellulaire incontrôlée dans le
cas d’un cancer.

Prévenir ou ralentir
Prévenir ou ralentir
le développement de la progression de la
la maladie
maladie

/1\ /
Figure 6 Les différentes étapes avant l’apparition d’un cancer de la prostate androgène-indépendant
(Adaptée de Tindall D.J., Rittmaster R.S., Journal of Urology, 2008).

L’évolution du cancer de la prostate vers un état androgène indépendant fait intervenir

essentiellement le AR [66-68]. Pour cette raison, il est important d’identifier son mécanisme
d’action afin de comprendre cette évolution.

Les androgènes et les AR représentent la cible préférentielle dans le traitement du cancer

de la prostate depuis la découverte de la thérapie par la castration il y a 71 ans par 1-luggins et
Hodges [11]. Les premiers traitements consistaient à inhiber l’activité du AR avec des
activateurs du GnRH comme le goserclin ou le leuprolide. L’utilisation d’inhibiteurs directs du
AR est apparue plus tard, comme le bicalutamide qui n deux mécanismes d’action [69, 70], le
premier est un inhibiteur compétitif du DHT, le second recrute des inhibiteurs transcriptionnels

28
des AR[s comme le NcoR [il]. Au niveau cellulaire, l’inhibition du AR induit la mort cellulaire
ou l’arrêt du cycle cellulaire et de ce fait la régression tumorale [72-77]. En effet, 80 % des
patients présentant un cancer à un état avancé, répondent positivement au blocage anclrogénique.

Initialement la croissance et la survie des cellules cancéreuses dépendent des androgènes.

Lorsque le cancer est diagnostiqué à temps, le blocage androgénique par castration chimique ou

p ablation chirurgicale des testicules, organes majeurs de la production des androgènes,

constitue une stratégie thérapeutique efficace. Cependant, malgré un blocage continu des
androgènes, la maladie Fini toujours par progresser après quelques années [78]. La tumeur
récidive invariablement [79-8 1] et cela est précédé d’une augmentation du taux de PSA [20, 80,
82]. Il est certain alors que la progression de la tumeur est reliée à une restauration anormale du
AR. Cette réactivation fait intervenir différents mécanismes: une amplification du gène codant
pour le AR, des mutations du AR, des changements dc concentration des corégulateurs, une
altération des voies de la stéroïdogenèse ou encore une activation du AR par tin mécanisme
ligand indépendant.

1. 1.3. 1 Sensibilité accrue cia AR

1.1.3.1.1 Amplification du gène codant pour le AR

Plusieurs études ont mis en évidence un lien entre la surexpression du AR et l’évolution du

cancer vers un état androgène-indépendant. En effet, 25 % à 30 % des tumeurs androgène-
indépendantes présentent une amplification du gène codant pour le AR [83]. Il est alors
surexprirné au niveau de l’ARNm et des protéines [83-85]. Cependant, cette amplification
n’apparait pas dans le cas de cancers non traités par hormonothérapie. Cela suggère que la
castration hormonale induit l’amplification du gène codant pour le AR et l’évolution vers une
homono-indépendance. La surexpression au niveau protéique du AR permet aux cellules
cancéreuses de survivre et de proliférer même avec un taux très faible d’androgènes, ceci
explique l’évolution du cancer sous castration androgénique [86].

29
 • 1.3. 1.2 Augmentation de la sensibilité du AR

Un autre mécanisme permettant la progression du cancer de la prostate a été identifié chez tin
modèle animal [871. Cette voie comprend une surexprcssion du AR, une stabilité accrue du AR
et une translocation vers le noyau plus efficace. Cela apparait dans plusieurs cellules tumorales
qui deviennent plus sensibles aux effets prolifératifs de la DHT. En effet, la concentration
nécessaire à la croissance dc ces cellules devient 4 fois plus faible que celle nécessaire aux
cellules LNCaP androgène-dépendantes.

• I .3. 1 .3 Augmentation du taux d’androgènes

Des études récentes ont montré que les cellules cancéreuses de la prostate sont capables de
produire de nova des androgènes permettant le maintient de l’activité du AR [88]. En effet, pour
contourner la faible teneur en testostérone dans la circulation, les cellules tumorales augmentent
la production locale en androgènes. De plus, elles augmentent la conversion de la testostérone en
DuT, plus active, en augmentant l’activité de la SRD5A. Il en résulte une augmentation de la
voie de signalisation du AR même lorsque la concentration en testostérone dans le sérum est
faible. Cc mécanisme a été confirmé dans une étude où la thérapie par castration honnonale a
induit une diminution de la testostérone de 95 % contre une diminution de la concentration en
DFIT de 60 % seulement [89] dans le tissu de la prostate. De plus, des études épidémiologiques
ont montré que certains groupes éthniques ayant une activité de la SRD5A élevée, présentent une
incidence du cancer de la prostate plus élevée [90]. En plus des prédispositions génétiques, une
sélection naturelle se met en place durant la castration hormonale. En effet, les cellules tumorales
finissent par acquérir une mutation du gène codant pour la SRD5A ou surexprirnent l’enzyme.

1. 1.3.2 Les modifications génétiques du AR

1.1.3.2.1 Mutations du AR

Les mutations du gène codant pour le AR sont fréquentes lorsque le cancer est à un état
avancé ou récidive [91]. Elles ont été rapportées chez 10 % à 20 % des patients qui présentent
des tumeurs androgène-indépendantes. Cela confirme que ces mutations permettent aux cellules

30
de prolilérer clans un milieu privé d’androgènes [91]. lI existe plusieurs mutations qui ont été

recencées dans une base de données. La première a été identifiée dans les cellules LNCaP. Elle
est apparue dans le domaine de liaison au ligand et induit une diminution de la spécificité du
ligand. Elle permet donc aux cellules de survivre même lorsqu’elles sont privées d’androgènes
puisque le AR peut être activé par d’autres hormones comme les oestrogènes et les anti

androgènes [91] (Figure 7).

Figure 7 Quelques mutations survenant sur le AR (Adaptée de Feidman B.J, Feldman D., Nature Reviews
Cancer, 2001).

La testostérone et la DHT sont des agonisies du AR sauvage contrairement au tiutamide qui est un
antagoniste. Le mutant T877A est activé par des hormones stéroïdes non androgéniques ainsi que par le
ilutamide. Le mutant L7OIH présente une faible affinité pour les corticostéroïdes. Lorsque les deux mutations
T877A et L701 H sont combinées, le AR formé a une grande affinité pour les corticostéroïdes

31
 • I .3.2.2 Changements d’expression des corégulateurs du AR

Le AR est un facteur (le transcription qui interagit avec plusieurs protéines corégulatrices
pour Former un complexe transcriplionncl. Ces corégulateurs peuvent activer ou inhiber le AR et
bloquer la transcription de certains gènes cibles. A ce jour 170 protéines corégulatrices ont été
identifiées [92]. Un déséquilibre entre ses corégulateurs peut donner l’avantage aux cellules
cancéreuses et Favoriser leur proliFération. Les coactivateurs recrutent des Facteurs de
transcription pour activer les gènes régulés par le AR. En revanche, les corépresseurs forment
des complexes avec le AR et inhibent la transcription des gènes cibles du AR.

1. 1.3.3 L ‘activafion du AR par un mécanisme ligand indépendant via

1.1.3.3.1 Les facteurs de croissance

Les facteurs dc croissance IGFI (Insulin-like Growth-Factor-1), KGF (Keratinocyte

Growth Factor) et EGF (Fpidermal Growth Factor) sont capables d’activer le AR en
surexprimant certains coactivateurs (TIF2) [93]. De plus, ils sont capables d’induire l’expression
des gènes cibles du AR en l’absence d’androgènes [94]. IGF-1 est le facteur de croissance le plus
puissant testé, puisquil est capable d’augmenter cinq fois la sécrétion du PSA dans les cellules
LNCaP [94]. Ces facteurs de croissance sont des ligands pour le récepteur à tyrosine kinase. ils
initient des cascades intracellulaires complexes. Cependant, leurs effets sur la voie de
signalisation du AR ne sont pas encore bien définis. Leur mode d’action n’est pas encore
déterminé (action directe sur le AR ou sur une molécule en aval impliquée dans la voie de
signalisation). Ils sont surexprimés dans certains cancers de la prostate. Le casodex, un
antagoniste du AR, est capable de bloquer complètement l’activation du AR induite par IGF-l,
KGF et EGF [94]. Cela indique que le domaine de liaison du AR avec son ligand est nécessaire à
cette activation. Cependant, cela n’explique pas le développement d’un cancer androgène-
indépendant chez les patients traités au casodex. Il est possible que la surexpression des facteurs
de croissance soit combinée aux mutations du AR. Cela expliquerait l’apparition d’une AIPC
(androgen indepcndent prostate cancer) chez ces patients. Cependant, des recherches
supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse.

32
1.1.3.3.2 Les cylokines

Plusieurs cytokmes sont capables d’activer le AR (IL-6, IL-8) via la voie de signalisation
du N[-kB. En elTet, une étude menée par Wallner (2006) a permis de mettre en évidence la
contribution de la cytokine IL-6 dans le développement du cancer de la prostate androgène-
indépendant [95]. L’IL—6 est capable de stimuler l’activité du RA par un mécanisme ligand—
indépendant [96] qui induit une augmentation de la croissance cellulaire [97]. La surexpression
d’IL-6 protège de l’apoptose induite par la privation androgénique in iitro [97] et in vivo [98].
L’activation du AR par l’lL-6 est bloquée par les inhibiteurs de PKA, PKC (Protéine Kinase C)
et MAPK (mitogen-activated protein kinase) suggérant que ces voies de signalisation sont
impliquées dans l’activation du récepteur [96]. De plus, Ueda et al. (2002) ont montré que la
phosphorylation de la protéine co-activatrice SRC-l par les MAPK est nécessaire pour une
activation optimale du RÀ par l’IL-6 [99].

L’IL-8 permet la prolifération des cellules cancéreuses de la prostate lorsqu’elles sont

déprivées en androgènes. L’équipe de Lee et al. (2000) a montré qu’une courte exposition (30 à
120 mm) des cellules LNCaP à l’IL-8 induit la liaison du AR à la région ARE présente sur le
promoteur du PSA, via l’activation de src, et a conclu à une activation de la voie de signalisation
du AR via l’IL-8 exogène [100]. En revanche l’équipe de Araki et al. (2007) a montré qu’une
exposition prolongée des cellules androgènes-dépendantes à l’IL-8 induit une inhibition de
l’expression du AR et une activation de l’expression de certains facteurs de croissance comme
Akt et NE-kB [101].

1.1.3.3.3 Les récepteurs à tyrosine kinase

Les RTK (Receptor Tyrosine Kinase) sont des molécules de signalisation, surexprirnées
dans le cas d’un cancer. En effet, le récepteur HER-2/neu (human epidermal growth factor
receptor-2), un récepteur à tyrosine kinase, membre de la famille des récepteurs EGF est
surexprimé dans les lignées cellulaires androgène-indépendantes provenant de xénogreffes de
souris castrées [102]. Des études récentes ont montré que la surexpression du récepteur HER
2/neu peut activer le AR via la voie des MAPK. Cette dernière peut phosphoryler le AR in vitro
et induire son activation [103]. Cette voie est indépendante du domaine de liaison au ligand et
permet l’activation des gènes dépendants du AR en l’absence de ses ligands [102, 103] (Figure

33
8). Les cellules androgène-dépendantes peuvent alors être converties en cellules androgène-
indépendantes. L’activation du récepteur HER-2/neu est un mécanisme important expliquant la
progression du cancer de la prostate vers une hormono-indépendance.

Il existe une autre alternative pennettant au récepteur lIliR-2lneu d’induire l’activation

du AR via la voie Akt [104, 105]. En effet, lorsque Akt est activée par HER-2lneu, elle
phosphorylc le AR sur la sérine 213 et la sérine 791 [104], le transformant en un récepteur
androgène-indépendant (Figure 8).

La relation entre l’activation du AR par la voie des MAPK et la voie Akt ainsi que leurs
implications dans le développement d’un cancer de la prostate androgène-indépendant n’ont pas
encore été déterminés.

34
 i. .l i.’J

JA -

___•%.
(>

Jpr1

I dc, p,,,’ du .i I

I lC-)
Figure 8 Création d’unc voie d’activation du AR via les facteurs dc croissance (Adaptée dc Fcldman B.J,
Feldman D., Nature Reviews Cancer, 2001).

Le récepteur HER-2/neu (ou d’autres récepteurs à tyrosine kinase) peut être surexprimé dans le cas de
cellules tumorales déprivées en androgènes. Il active indirectement la MAPK qui n son tour phosphoryle le
AR et l’active. Il est également possible d’activer le AR via la voie AKT. En elfet, le récepteur HER-2/neu
augmente le taux de phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (Ptdlns(3,4,5)P3) via la PI3K ce qui active
AKT. Un autre moyen d’activer AKT consiste à inactiver la phosphatase à lipides PTEN ce qui inhibe la
conversion du Ptdlns(3,4,5)P en son substrat Ptdlns(4,5)P2. AKT peut également activer des voies de survie
cellulaire en phosphorylant et inactivant des protéines pro-apoptotiques comme BAD et la procaspase-9.

1.1.3.3.4 La voie de signalisation Wnt

La voie de signalisation Wnt (contraction de Wingless mutant de Drosophile et de in!,

lignée cellulaire maligne) relayée par la f3-caténine est impliquée dans l’embryogenèse, la
prolifération cellulaire, la différenciation, la migration, la communication entre les cellules, la

35
survie et la polarisation cellulaire [106]. 1)ans les tissus adultes, elle participe au contrôle de la
prolifération cellulaire. Une activation anormale de cette voie par mutation dc l’un ou l’autre de
ses composants joue un rôle important tians tin grand nombre de cancers humains. Cette voie est

alors plus couramment appelée voie APC (Ac/enmnafous Pofyposis CoIi)/f3—caténine/ TCF (T—ce!!
/icIor).

Le gène Wnt code pour une glycoprotéine sccrétée dans le réticulum endoplasmique et
qui rejoint l’appui-cil de Golgi pour être secrétée dans le milieu extracellulaire. La protéine Wnt
se lie i deux récepteurs difFérents, le preluier est im récepteur à Sept domaines
transmembranaires le Frizzled (Fzd), le second est un co-récepteur transmembranaire à un seul
domaine le LRP [107]. Le récepteur le plus important est le Fzd, il a un domaine extracellulaire
riche en cystéine qui permet la liaison avec la protéine Wnt. Le récepteur Fzd est capable de
transmettre au moins trois voies dc signalisation différentes. Une voie canonique qui régule la f3-
caténine cellulaire et deux autres voies non canonique la WntJPCP [108] et la Wnt/Ca
.
2

Lorsque la voie de signalisation canonique Wnt est inactive, la [3-caténine est dégradée.
Lorsque la voie est active, la f3-caténine est libérée dans le cytoplasme où elle exerce ses

fonctions. Dans la position «OFF», la J3—catéiIine est partie intégrante d’un complexe
multiprotéique composé de l’Axine, de la protéine phosphatase PP2A, de la glycogène synthuse
kinase-313 (GSK3J3) et d’APC. Au sein de ce complexe, l’interaction entre l’Axine et la GSK3[3
permettra la dégradation de la f3-caténine en la phosphorylani.

La position «ON» est obtenue de manière différente selon qu’il s’agisse d’un processus
normal de développement ou d’un processus de carcinogenèse. Dans le premier cas, l’activation
des récepteurs Fzd par la fixation de Wnt conduit à la phosphorylation de la protéine dishevelled
(Dsh) qui, par son association à l’Axine, empêche la GSK3f3 de phosphoryler la f3-eaténine,
rendant ainsi la liberté à cette dernière. Les f3-caténines stabilisées dans le cytoplasme vont
ensuite pénétrer dans le noyau et se lient au domaine N-terminal de LEF-l/TCF, ce qui induit un
changement de conformation qui libère le suppresseur Groucho initialement lié au LEF- 1/TCF et
permet le recrutement d’autres protéines et la formation d’un complexe de transcription actif qui
active les gènes cibles c-Myc. Ces derniers inactivent l’expression de p21 qui n’a plus d’effet sur
le cycle cellulaire [109, 1101.

36
 Dans le cas d’un cancer, la voie Wnt échappe au contrôle physiologique, si bien que les
cellules continuent à se diviser et à se comporter comme des cellules progénitrices malgré leur
localisation à la surface de l’épithélium.

Les mutations du gène codant pour les J3-caténines et le complexe boîte de destruction
sont liées au développement du cancer de la prostate [66, 71, 111, 112]. De plus l’activation de la
voie Wnt signifie qu’il y a développement d’une tumeur et progression de métastases [107, 113].

Il existe trois différentes interactions entre Wnt et AR qui favorisent le développement

d’un cancer hormono-indépendent:

La 13-caténine joue le rôle d’un ]jgpd activateur du AR: Elle peut directement se lier à
l’extrémité C-terminale du AR ce qui permet l’activation de la transcription des gènes
androgène-dépendant. Elle permet aussi une utilisation plus efficace de l’androstènedione et de
l’œstradiol (agonistes de la voie de signalisation des androgènes) et réduit l’effet du bicalutamide
(antagoniste pharmaceutique du AR).

‘çIjyj QSii est inhibée : GSK3I3 régule la dégradation de la f3-.caténine et inhibe la

transcription du AR. Elle agit donc comme un gène suppresseur de la tumeur. Cependant. elle est
inactivée par deux voies de signalisation : la voie Wnt et la voie Akt qui sont actives dans le cas
d’un cancer de la prostate ce qui explique l’évolution du cancer.

LEF-i!TCF régule l’expression de l’ARNm codant pour le AR et ses protéines : L’expression de

l’ARNm codant pour le AR est surexprimée lorsque la voie Wnt est activée. En revanche,
l’ARNm codant pour les protéines du AR est sous-exprimé. Ce résultat contradictoire s’explique
par le fait que la voie Wnt active aussi la voie de dégradation du AR.

Ces différentes interactions, sont un moyen d’activer ou d’inhiber la voie de signalisation

des androgènes ce qui permet de développer des moyens pour contrôler la croissance cellulaire et
d’évoluer vers un cancer de la prostate hormono-indépendant.

37
 —
i

Ç—

4
4

XX.X)XXXXXXX

b
‘‘‘‘
‘‘ ‘‘‘
;LJ1J
/
A.,c
P

I I

‘4
w.

Figure 9 La voie de signalisation Wnt/b-caténine (Adaptée de Kypta R.M., Waxman J., Nature Reviews
Urology, 2012).

a. La voie de signalisation Wnt/-caténine est en mode « OFF ». b. La voie de signalisation Wnt/f3-caténine est
en mode « ON ».

38
1. 1.3.4 Les i’oies A R indépendantes

11 existe d’autres voies capables de faire évoluer le cancer de la prostate vers un état
androgène—indépendant et qui ne font pas intervenir le AR (Figure 10).

• 1 .3.4.1 Les facteurs de croissances

Les facteurs de croissance comme IGFI et ses récepteurs à tyrosine kinases qui induisent
l’expression de différents gènes responsables de la croissance et de la survie cellulaire comme la
voie MAPKIRas/Raf/PKC [114].

I. 1.3.4.2 La voie de signalisation Akt

La voie de signalisation Akt joue aussi un rôle important dans le développement du

cancer androgène-indépendant sans faire intervenir le AR. En effet, PTEN est un gène
suppresseur de tumeur souvent inactivé lorsque le cancer de la prostate est à un état métastatique
avancé [I 15]. Il code pour une phosphatase ii lipide qui déphosphoryle le phosphate 3 des lipides
3-phospho-inosilol comme le phosphalidyl-inositol (3,4,5) Iriphosphates (P 1(3,4,5) P3) [Il I]. Les
lipides 3-phospho-inositol sont des messagers secondaires qui activent Akt [116—118]. La voie
Akt intervient dans la tumorigenèse en raison de son activité anti-apoptotique. En effet, Akt
phosphorvie et inactive plusieurs protéines pro-apoptotiques comme Bad et la procaspase-9
[105]. Dans les cellules normales, PTEN bloque la voie de signalisation de Akt pour permettre
aux cellules d’aller en apoptose. En revanche, dans les cellules tumorales, la fonction PTEN est
perdue, ce qui induit une augmentation de l’activité de Akt qui bloque le signal d’apoptose. De
plus, Akt est capable de contrôler l’apoptose et la prolifération des cellules cancéreuses de la
27 [115], un inhibiteur
prostate en induisant, entre autres, une diminution de l’expression de p
important du cycle cellulaire [119].

39
 1.1 .3.4.3 Bd-2

Un autre mécanisme d’évolution vers un état androgène—indépendant qui ne fait pas

intervcnir le AR est le Facteur anti—apoptotique Bel—2. En efFet, lorsque les cellules sont privées
d’androgènes, les voies apoptotiques sont activées. Bel-2 permet de déjouer la mort cellulaire
programmée causée par l’absence d’androgènes. C’est une protéine qui n’est pas exprimée dans
les cellules normales et est surexprimée dans le cas d’un cancer. Elle joue un rôle important dans
le mécanisme de survie des cellules cancéreuses de la prostate [120].

.1.3.4.4 Les régulations épigénétiques

Les régulations épigénétiques sont importantes dans le développement cellulaiie normal.

Cependant, dans certains cas, elles interviennent dans l’apparition d’un cancer. En effet, elles
altèrent l’expression des gènes suppresseurs de tumeur sans modifier la séquence d’ADN. Les
altérations les plus communes retrouvées clans les cas d’un cancer de la prostate androgène-
indépendant, sont la méthylation et les modifications des histones. La méthylation est la
modification épigénétique la plus commune affectant la fonction cellulaire. Elle consiste à
ajouter un groupement méthyle sur le carbone 5 d’une cytosine d’un dinucléotide CpG par une
méthyl transférase. L’inhibition de l’expression du gène codant pour le AR par une méthylation
de l’ADN est un mécanisme permettant aux cellules cancéreuses d’évoluer vers un état
androgène-indépendant. En effet, certaines études ont montré qu’une surexpression du AR est un
mécanisme mis enjeu par les cellules androgène-indépendantes pour compenser la diminution de
la concentration d’androgènes. Cependant, 20 % à 30 % des cancers androgène-indépendants
dont les deux lignées cellulaires les pius étudiées DU145 et PC-3 n’expriment pas le AR [121].
Cela s’explique par la perte du AR causée par une hyperméthylation du promoteur qui survient le
plus souvent dans les tumeurs androgènes-indépendantes [122]. De plus, des études ont montré
que plusieurs autres gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, de l’invasion cellulaire,
de l’architecture cellulaire, de la réparation de l’ADN endommagé ainsi que certains gènes
suppresseurs de tumeurs et des oncogènes ont été modifiés épigénétiquement dans plusieurs
tissus et lignées cellulaires cancéreuses [123, 124].

40
1.1.3.4.5 Les microRNA

Le mécanisme (le régulation des miRNA (microRNA) peut aussi avoir un impact sur la
progression du cancer vers un état androgène-indépendant. En effet, les miRNAs sont des petits
ARN non codants capables de réguler l’expression de certains gènes de façon post
transcriptionelle. Les miRNAs appartiennent à deux catégories les oncogènes et les
suppresseurs de tumeurs. Certains miRNAs sont surexprimés dans les cellules cancéreuses dans
le but d’inhiber les gènes suppresseurs de tumeurs et sont appelés miRNAs oncogéniques ou
oncomirs. En revanche, d’autres niiRNAs sont inhibés pour bloquer la progression du cancer et
sont appelés les miRNAs suppresseurs de tumeurs [125, 126].

1.1.3.5 La voie des cellules cachées

Il existe plusieurs mécanismes permettant à la cellule de devenir androgène-indépendante

et d’induire un échec de l’hormonothérapie. Cependant, d’après une hypothèse proposée par
John lsaacs (1999). cet échec est causé par une sous-population de cellules tumorales androgène-
indépendantes présentes clans la prostate avant même le début de la thérapie [127]. Ces cellules
souches épithéliales présumées sont androgène-indépendantes et leur ratio prolifération/mort
cellulaire n’est pas affecté par la privation en androgènes (Figure 10).

1.1.3.6 Les mécanismes de résistance du cancer androgène-indépendant

La mortalité causée par le cancer de la prostate s’explique par son évolution d’un état
androgène dépendant à un état androgène indépendant difficile à traiter. Cette évolution fait
intervenir différents mécanismes (Tableau 1) (Figure 10).

41
Tableau I Mécanismes d’évolution vers un caiicer de la prostate androgène-indépendant 1801.

Voie de signalisation Dépendance au ligand Dépendance au Mécanisme d’action

AR

A Sensibilité accrue du AR Androgène dépendante AR dépendante AR amplifié

AR plus sensible
DI-IT augmentée

B Modifications génétiques Pseudo-androgènes Dépendante d’un AR moins spécifique

du AR A R muté dans les
Antagonistes des Stimulation par des
cellules LNCaP et
androgenes molecules autres que les
dans les cellules
( orlicosteroides androgenes
AR
Mutations des
corégulateurs

C Activation du AR par un Androgéne indépendante AR dépendante PTEN muté

mécanisme ligand
independant Ligand inclependante FI ER-2/neu amphi ie
PI3K activée
MAPK activée
Corégulateurs mutés

D Voies de signalisation Androgène indépendante AR indépendante Voies de survie cellulaire:

AR indépendantes surexpression de BcL2
Activation d’autres
oncogènes
Inactivation des gènes
suppresseurs de tumeurs

E La voie des cellules Androgène indépendante AR indépendante Cellules souches

cachées épithéliales malignes

42
 A C

Figure 10 Cinq voies possibles expliquant Iévolution vers un état androgène-indépendant (Adaptée de
Feldman B.J, Feidman D., Nature Reviews Cancer, 2001).

A. Cette voie fait intervenir : une augmentation de la quantité de AR par amplification du gène ou une
sensibilité accrue du AR ou une augmentation dc la quantité de DHT. B. Cette voie fait intervenir : une
activation non spécifique du AR. C. Cette voie fait intervenir une activation du AR par les RTKs, par Akt
ou par les MAPK. D. Cette voie fait intervenir des voies de survies cellulaires comme Bel-2. E. Cette voie fait
intervenir des cellules souches épithéliales.

43
1.1.4 Généralités sur les métastases

La castration androgénique induit, la plupart du temps, la sélection d’une population de

cellules capables de survivre en l’absence d’androgènes. Il en résulte la formation d’un cancer
androgène-indépendant. Ces cellules induisent une augmentation de l’angiogenèse, forment des
métastases et migrent en premier lieu vers les os et les nodules lymphoïdes.

1. 1.4. 1 La dissémination

Tout d’abord, la formation de métastases nécessite l’extravasation des cellules

cancéreuses de la tumeur et leur survie pendant la migration dans la circulation sanguine. En
effet, les cellules doivent se détacher de leur tissu d’origine et cela nécessite sa dégradation. Les
mécanismes mis en jeu durant cette phase sont déterminants pour la suite des événements
particulièrement pour les cellules qui vont former le noyau métastasique clans les os. Il existe
deux facteurs qui contribuent à cette migration les changements qui apparaissent dans le tissu
stromal de la tumeur et ceux qui apparaissent dans la cellule elle même.

Les fibroblastes associés aux tumeurs solides accluièrent un phénotype myofibroblastique

suite à un contact physiologique avec les cellules tumorales, à une sécrétion élevée de facteurs de
croissance (EGF, FGF et IGF) ou encore à une hypoxie provenant du métabolisme anormal des
cellules tumorales. Les flbroblastes activés produisent un taux élevé de métallo-protéinases
matricielles et restructurent ainsi la matrice extracellulaire tumorale. Les cellules cancéreuses
ainsi que les fibroblastes, secrètent aussi beaucoup de chimiokines ce qui induit la création d’un
gradient qui recrute des leucocytes et des cellules endothéliales dans le microenvironnement de
la tumeur [128]. Ces leucocytes s’infiltrent et se différencient en macrophages associés aux
tumeurs. Ils produisent des facteurs de croissance angiogéniques, des chirniokines de
recrutement, des producteurs de vascularisation et des métalloprotéinases contribuant au
remodelage de la matrice extracellulaire [129]. Ce remodelage favorise le développement de la
vascularisation de la tumeur et la dissociation des cellules tumorales de leur tissu d’origine [128].
Pendant ce temps, des cellules vasculaires sont recrutées et créent des vaisseaux à haute

44
perméabilité qui expriment des molécules d’adhésion cellulaire permettant ainsi à la tumeur
d’avoir sa propre vascularisation interne [130, 131].

D’autres changements apparaissent dans le microenvironnement (le la tumeur comme les

mutations génétiques F1321 et épigénétiques [133]. Ces mutations vont permettre aux
transcriptomes des cellules métastasiques de développer un phénotype favorisant le détachement
tissulaire et la motilité du cytosquelette.

1. 1.4.2 La survie pendant la ,nigration

La survie pendant la migration est un facteur déterminant pour la formation des

métastases. En effet, les cellules qui arrivent à se détacher de leur tissu d’origine, mais qui ne
survivent pas l)e11daIt la migration, ne seront pas en mesure de créer un noyau métastasique.
L’environnement biochimique et mécanique de la voie de migration des cellules métastasiques
est très différent de celui du tissu épithélial d’origine. Cette migration représente donc un défi
pour les cellules cancéreuses. De plus, le tissu épithélial d’origine a une propriété unique la
mort cellulaire programmée appelée anoïkose qui se déclenche lorsqu’une cellule se détache de
son tissu nati[ L’activation de mécanismes de survie est donc une étape nécessaire pour qu’il y
ait formation de métastases osseuses.

D’après Igney et Krammer (2002). les cellules cancéreuses surexpriment les protéines
mitochondriales antiapoptotiques (Bc12, Bcl-XL et mcli). En revanche, elles diminuent
l’expression des protéines proapoptotiques (Bax, Apafi et les caspases) ou développent des
mutations qui les inactivent [134]. 11 en résulte un état moléculaire qui favorise la survie
cellulaire au détriment de I’apoptose. De plus les cellules cancéreuses inhibent la dégradation de
McI-l ce qui induit son accumulation et par conséquent une inhibition de la mort cellulaire par
anoïkose [135]. Les cellules malignes inactivent aussi la voie apoptotique induite par FADD et
les récepteurs de mort cellulaire. En effet, elles surexpriment la protéine FLIP [136] qui
séquestre FADD et bloque la voie des caspases.

45
 En plus de la i-ésistance à I ‘apoptose et à I ‘anoïkose, les cellules cancéreuses peuvent
utiliser l’autophagie comme mécanisme de survie. En effet, I’autophagie est activée suite à une
diminution de l’activité de mTOR ainsi que d’autres voies de signalisation.

1. 1.4.3 L ‘installation dans la moelle osseuse

Les cellules qui se libèrent dc leur tissu d’origine et qui survivent à la migration ne sont
pas toutes capables de créer des métastases. En effet, le nombre de cellules tumorales circulantes
par millilitre de sang dans le cas d’un cancer des ovaires est 10 fois supérieur à celui d’un cancer
de la prostate [137]. Cependant, les métastases sont rares dans le cas d’un cancer des ovaires
mais fréquentes dans le cas du cancer de la prostate. Cela suggère qu’il existe des cellules
capables de se détacher de leur tissu d’origine et de survivre dans la circulation sanguine mais
qui ne sont pas capable d’induire des métastases clans la moelle osseuse.

Au tournant du 2O’ siècle, Paget et Ewing ont émis des hypothèses contradictoires
concernant le mécanisme de développement des métastases. En effet, Ewing considère que c’est
un processus physique qui favorise le développement des métastases clans les tissus présentant
une vascularisation dense [138]. En revanche, Paget considère que les cellules cancéreuses ainsi
que le site secondaire dans lequel elles vont se loger contribuent tous les deux au développement
des métastases [139]. L’hypothèse de Paget correspond d’avantage à la réalité. En effet, la
moelle osseuse est le site de production des cellules sanguines, elle possède une vascularisation
particulièrement dense et représente de ce fait un endroit favorable au développement des
métastases. Les cellules cancéreuses induisent la Formation de métastases dans la moelle osseuse
en raison d’une affinité biologique unique contrôlée par une variété de facteurs régulant la
communication entre ces cellules et la moelle osseuse.

L’extraction des cellules cancéreuses des vaisseaux sanguins, une fois arrivées dans la
cavité de la moelle osseuse, représente une des étapes les plus importantes dans l’établissement
d’une communication entre les cellules métastasiques et la moelle osseuse. Ce processus fait
intervenir des chimiokines et leurs récepteurs en imitant le mode d’action des progéniteurs
hématopoïétiques [140].

46
I. 14.4 l’orîna(ion de métastases par les celluk’s tumorales disséminées

Les cellules tumorales qui se retrouvent dans la moelle OSSUSC sont celles qui ont fLISSi à
migrcr, à survivre dans la circulation sanguine, à s’installer, à envahir la moelle osseuse et à
survivre dans leur nouveau site de croissance. Malgré leur apparente agressivité, les métastases
mettent plusieurs années pour se développer [141, 142). Cc phénomène s’explique par un
processus biphasique dans la Formation tumorale. 1n effet, les cellules tumorales disséminées
présentent un état initialement latent suivi d’une phase agressive active. Cette cinétique
s’explique par deux états: la dormance cellulaire et la dormance de la masse [1431.

La dormance cellulaire décrit le fait que les cellules tumorales disséminées sont
métaboliquement actives mais que leur cycle cellulaire est en alTêt [143]. Dans ce cas, les
cellules survivent mais ne prolifèrent pas parce qu’elles n’ont pas les conditions nécessaires,
dans l’immédiat, pour se multiplier. En revanche, la dormance de la masse est une phase latente
durant laquelle les micro-métastases multicellulaires persistent mais ne prolifèrent pas [144]. Elle
apparait lorsque la tumeur n’a plus d’espace pour prendre du volume ou lorsqu’elle n’a pas accès
aux vaisseaux sanguins ou encore lorsqu’elle est attaquée par le système immunitaire.

1.1.4.5 Clones et cellules souches dans la/brination des métastases

En plus de la capacité d’entrer dans une phase de dormance, les cellules tumorales sont
capables d’accumuler des lésions génétiques pour pouvoir croître dans un site secondaire [145].
De plus, les travaux de Visvader et al. (2008) ont mis en évidence l’existence d’une catégorie de
cellules monoclonales à l’origine de toutes les tumeurs. Il existe donc un sous-ensemble clonaI
unique de cellules primaires cancéreuses capables de former des lésions métastasiques suite à
leur dissémination. Cette théorie ne peut s’expliquer que par la présence de cellules souches
cancéreuses. En effet, les cellules souches présentent 3 caractéristiques : la capacité de se
renouveler, de se différencier et d’induire la croissance des organes. Il semblerait en effet qu’une
sous-population de cellules présentant ces caractéristiques soient présentes dans les cancers
somatiques [146]. Cependant, d’autres travaux sont nécessaires pour confirmer cette théorie.

47
1. 1.4.6 Les différents tj’pL’S de tumeurs Ifletastasiques osseuses

La moelle osseuse normale a une architecture définie avec un compartiment produisant le

sang et un autre produisant les os. En revanche les tumeurs qui se développent pur dissémination
de métastases vers la moelle osseuse présentent dilTérents phénotypes générés par un ensemble
de facteurs uniques. En effet, ces différents phénotypes ont été classés en deux grandes
catégories les tumeurs ostéolytiques (résorbent les os) et les tumeurs ostéoblastiques
(synthétisent les os) [147].

48
 1.2 APOPTOSE ET CANCER DE LA PROSTATE

1.2.1 Généralités sur les voies apoptotiques

Plusieurs études montrent l’importance de l’induction de l’apoptose dans la prévention du

cancer par les composés naturels consommables. L’apoptose comprend deux voies majeures : la
voie extrinsèque activée par des signaux proapoptotiques provenant de la surface de la
membrane cellulaire et la voie intrinsèque qui met en jeux une perturbation de l’intégrité
membranaire mitochonciri ale.

1.2.1.] La voie intrinsèque

Elle est activée par la perte de signal des facteurs de croissance, en réponse à une
dégradation de l’ADN, à un stress oxydant, à une hypoxie, ou à une exposition à certains
composés chimiques. Elle est régulée par les protéines de la famille Bel-2 qui contrôlent la
libération des facteurs pro—apoptotique clans l’espace inter—membranaire mitochoncirial.

Lorsque le cytochrome c est libéré dans le cytoplasme, il se lie à la région C- terminale

d’Apaf-l, une protéine cytosolique capable de recruter les caspases. L’association du
cytochrome e et d’Apaf-l permet de recruter la caspase-9. Le complexe apoptosome formé par le
cytochrome c/Apaf-l/caspase-9 permet l’activation des caspases exécutrices comme la caspase
3. Cette dernière scinde à son tour des protéines cellulaires comme les protéines de structure,
nucléaires et du cytosquelette.

D’autres protéines libérées par la mitochondrie comme Smac/DIABLO et Omi/HtrA2

facilitent l’activation des caspases en bloquant ses inhibiteurs endogènes (lAPs) [148]. Un
équilibre dynamique entre les effecteurs pro- et antiapoptotique permet à la cellule de survivre
aux dommages causés à la mitochondrie. Cependant, lorsque ces dommages affectent plusieurs
mitochondries, l’action antiapoptotique des lAPs est annulée par une concentration eytosolique
importante de ses antagonistes Smac/DIABLO et Omi/HtrA2.

49
 11 existe une voie d’activation de l’apoptose milochondnale indépendante des caspases
qui fait intervenir l’activité protéase dc Omi/1 ltrA2 [149-15 1]. En effet, des études
in vitro ont
montré une dégradation de XIAP, clAP clAP2 et Apollon, des protéines anti—apoptotique,
,
par
l’activité protéase de Orni/HtrA2 [152]. Une autre voie indépendante des caspases Fait
intervenir
I’AIF et l’endonucléase G. En effet, elles sont libérées dc la mitochondrie et transloquent
dans le
noyau pour induire la condensation de la chromatine et la dégradation de l’ADN [148,
153). Le
moment précis de la libération de ces deux protéines par rapport au cytochrome e n’est
pas
encore connu de même que le moyen de dégrader l’ADN [154]. Cependant, des études réalisées
surdes cellules de mammifères montrent une coopération entre l’AIF et la cyclophiline
A pour
dégrader l’ADN [153).

Les protéines de la famille Bel-2 jouent un rôle central dans le contrôle de la voie
mitochondriale. En effet, plus de 20 membres de cette famille ont été identifiés chez l’homme
comprenant les suppresseurs (Bel-2, Bcl-xL, Mci-l, Bfl-l/A1, Bel-W et Bel-G) et les promoteurs
(Bax, Bak, Bok, Bad, Bld, Bik, Bim, Bel-Xs, Krk, Mtd, Nip3, Nix, Nora et Bel-B) de l’apoptose
[155].

En plus du cytochrome e, la mitoehondrie libère un grand nombre de polypeptides

comme AIF, EndoG. Smac/Diablo (aetivateur secondaire des caspases) et Omi/I-ltrA2
dans
l’espace inter-membranaire. Smac/Diablo et Omi/HtrA2 induisent l’activation des easpases
en
neutralisant l’effet inhibiteur des LAPs.

1.2.1.2 La voie extrinsèque

Elle est initiée par la liaison d’un ligand spécifique aux récepteurs transmembranaires de
mort cellulaire comme le récepteur CD95 (APO-l/Fas), le récepteur TNFI (TNFRI),
les
récepteurs TRAIL-Ri (DR4) ou encore TRAIL-R2 (.DR5). Ces récepteurs sont activés
par
liaison avec leurs ligands respectifs (CD95L, TNFΠou lymphotoxine-a et TRAIL) ce qui induit
leur trimérisation. Une protéine adaptatrice FADD est alors recrutée et se lie à la procaspase-8
et/ou caspase-lO pour former un complexe de mort cellulaire appelé DISC [156]. La procaspase

50
8 est activée et joue le râle d’initiateur de caspase. Elle active les caspases effectrices caspase-3
et -7 pour initier la dégradation cellulaire causant une apoptose inévitable [157].

1.2.2 Mécanismes de résistance à l’apoptose dans le cancer de la prostate

L’apoptose ou la mort programmée des cellules est un mécanisme important pour le

développement cellulaire normal, pour le système de défense cellulaire et pour la suppression de
l’oncogenèse [158, 159]. En effet, une mauvaise régulation de l’apoptose provoque le
développement des cancers et des maladies dégénératives cl vasculaires [160, 161].

Le phénotype cancéreux agressif est le résultat d’altérations génétiques et épigénétiques

induisant une dérégulation de la voie de signalisation intracellulaire comme l’apoptose [162].
Cette dérégulation joue un rôle important dans la résistance des cellules cancéreuses aux
traitements médicamenteux [159, 163]. En effet, la résistance des cellules hormono
indépendantes du cancer de la prostate, a été associée ?i une résistance à l’apoptose qui fait
intervenir différents facteurs [161 164, 165].
,

Bel-2 est la première protéine identifiée, produite par un oncogène [166, 167]. Les protéines
appartenant à la famille Bel-2 possèdent quatre régions de séquences homologues doublées
appelées les domaines homologues Bel-2 (BHI-4). Des études structurelles des protéines de
survie (Bel-2, Bcl-xL, Bel-w et Mci-l) ont mis en évidence la formation d’une poche
hydrophobe de liaison, par trois dc ces domaines (Bi11-3). Seules les protéines ayant un domaine
BH3 (Bim, Bad, Puma, Noxa, etc) et les protéines pro-apoptotique Bax/Bak peuvent se lier à
cette poche. De ce fait, plusieurs études ont développé des analogues possédant le domaine Bi-13
afin d’inhiber les protéines de survie cellulaire. Comprendre le déséquilibre qui survient dans les
membres de la famille des protéines Bel-2 est devenu essentiel dans le développement de
traitements efficaces contre le cancer.

Les protéines Bel-2 et Bci-xL sont très liées et surexprimées dans plusieurs types de cancers
[97, 168]. En effet, Bel-2 est surexprimée dans 30-60 % des cancers de la prostate, au diagnostic
et dans 100 % des cancers hormono-indépendant [169, 170]. Sa surexpression est à l’origine
d’une diminution de la réponse pro-apoptotique qui devrait survenir à la suite d’irradiations,
d’une chimiothérapie ou encore d’une castration androgénique. De ce fait, elle induit une
résistance aux traitements [17 1-175].

51
 Bel—x L est surexprimée dans 100 % des cancers de la prostate hormono—résistants. Lite est
aussi associée à un stade avancé de la maladie, à un faible pronostic de survie, à un risque de
récidive et à l’apparition de métastases [176-l 78].

Il est certain que la transition dli cancer de la prostate vers un état androgène-indépendant est
accompagnée de plusieurs changements génétiques. Par conséquent, la surexpression des
protéines clés de survie cellulaire comme Bd-2 et Bcl-xL représente un obstacle important à
l’induction de l’apoptose par chimiothérapie [97, 179—181].

Mcl— I (myeloid cell leukemia) est aussi une protéine anti—apoptotique appartenant à la
famille des Bel—2. C’est une molécule hautement régulée qui favorise la viabilité cellulaire et qui
contribue à la malignité lorsqu’elle est dérégulée [182, 183]. L’expression de Bel-2, Bel-xL et de
McI-1 augmente pendant la progression du cancer de la prostate [179].

Puisque Bel—2 et Bel—xL inhibent l’apoptose lorsqu’elle est induite par dilTérents stimulus,
leur surexpression est associée à une progression du cancer vers tin état androgène-indépendant
[168, 184-186].

Le N F—kB contrôle I ‘apoplose en régulant la transcription des gènes antiapoptotiques qui

agissent à différents niveaux. Ces gènes comprennent Bel-2, Bcl-xL et Bfl-1/A1 qui agissent au
niveau mitochonclrial [164, 165], la survivine et le X[AP qui agissent au niveau cytoplasmique,
le c-IAPI et le c-IAP2 qui inhibent l’activité de différentes caspases [166, 187] et enfin TRAF1
et TRAF2 qui agissent en amont de la voie apoptotique et qui sont à l’origine de la résistance à
l’apoptose induite par le TNF-a [187, 188]. Le NF-kB contrôle aussi le ratio récepteurs leurre
TRAIL et récepteurs de mort cellulaire TRAIL et régule ainsi la sensibilité des cellules au
TRAIL. En effet, une surexpression des protéines antiapoptotiques contrôlée par la famille des
NF-kB explique la résistance aux traitements, des cellules cancéreuses de la prostate [189-191].
De plus l’activation continue de NF-kB dans les cellules cancéreuses de la prostate, androgène
indépendantes, explique leur résistance aux agents thérapeutiques proapoptotiques [192].

TRAIL est tin ligand cytotoxique qui induit l’apoptose dans différentes cellules
cancéreuses par liaison avec son récepteur exprimé à la surface des cellules tumorales. DR5 est
un récepteur TRAIL localisé dans une région souvent perdue dans les cellules cancéreuses de la
prostate ce qui leur procure une résistance à ce ligand [179]. De plus, l’expression des récepteurs
de leurre TRAIL comme le DcR2 est plus importante dans les cellules tumorales que dans les

52
cellules normales ce qui pourrait représenter un mécanisme supplémentaire de résistance Face au
système immunitaire [172].

L’expression des caspase-1 et 3 est plus Faible dans les cellules cancéreuses dc la prostate
que dans les cellules normales. En revanche, les protéines Bel-2 sont surexprimées dans les
cellules cancéreuses de la prostate [173].

Un déséquilibre entre les facteurs de croissance et les facteurs d’apoptose induisent la

tumorigenèse. Il est donc intéressant de développer des traitements permettant de Favoriser
l’apoptose des cellules cancéreuses. Depuis quelques années, plusieurs études ont montré les
bienfaits (le certains aliments dans la prévention du cancer via l’induction de l’apoptose dans les
cellules cancéreuses. De plus, le cancer de la prostate présente toutes les caractéristiques
favorisant une approche chimiopréventive par des interventions nutritionnelles qui ont pour but
de retarder ou d’inhiber la progression du cancer. En effet, plusieurs composés naturels testés sur
des cellules cancéreuses de la prostate ainsi que sur des modèles animaux présentent un effet
préventif. Certains des composés les plus reconnus sont présents dans la grenade, les tomates, les
légumes verts, les fruits rouges, les cnicifères, le thé et le soja.

53
1.3 LA PRÉVENTION PAR L’ALIMENTATiON

La chimioprévention est une alternative intéressante dans le traitement du cancer de la

prostate en raison de sa latence, de son incidence, de la présence de biomarqueurs quantifiables,
de l’identification des lésions préHéoplastiques et enfin de son hétérogénéité [193].

Les études épidémiologiques confirment de plus en plus le rôle évident de l’alimentation

et du mode de vie dans la prévalence de risque dans le développement du cancer de la prostate et
de sa progression. La plupart du temps, les facteurs alimentaires initiateurs du cancer ne sont pas
identifiés. En revanche, plusieurs nutriments ainsi que des extraits naturels de plantes sont
reconnus pour leurs effets thérapeutiques.

D’après certaines études épidémiologiques, les Afro-américains présentent le risque le

plus élevé au monde de développer un cancer de la prostate. Les caucasiens et les Afro-
américains ont 5 à 50 fois plus de risques de développer un cancer de la prostate que les japonais
résidants au Japon [194, 195]. Le régime alimentaire joLie donc un rôle important dans le
développement du cancer de la prostate.

Certains facteurs comme le taux calorique, le ratio omega-6/omega-3, les produils laitiers
et la consommation de viande, présentent une forte corrélation avec le risque de développer un
cancer de la prostate. Ces facteurs peuvent agir comme des promoteurs ou des initiateurs
transformant une néoplasie bénigne en une forme agressive.

La consommation de graisses d’origine animale a été associée à un risque élevé de

développer un cancer de la prostate [196-198]. Le mécanisme par lequel ses graisses induisent
une carcinogenèse prostatique n’a pas encore été identifié. Cependant, elles ont un effet sur le
taux de testostérone dans le sérum, sur le stress oxydant ou encore sur l’augmentation du taux
d’hormones IGF-l. De plus, l’obésité augmente les risques de développer un cancer de la

prostate et les risques de récidive, en raison des changements survenants dans l’équilibre
hormonal. En effet, l’excès de poids dégrade l’activité des oestrogènes et de la testostérone.

Avant L’avènement des aliments traités, le ratio omega-6/omega-3 dans l’alimentation de

base était de 2:1. Aujourd’hui, les standards alimentaires ont changé et ce ratio atteint 40:1. En
effet, l’alimentation américaine est riche en omega-6 polyinsaturé (PUFAs) et en gras trans. Une

55
consommation élevée en acides gras saturés provenant de la viande rouge, des jaunes d’oeufs, des
produits laitiers et des acides gras Irans contenus dans les huiles végétales hydrogénées, a été
associée à une augmentation de l’incidence du cancer de la prostate et du taux de mortalité. En
revanche une consommation élevée d’acides gras omega-3 (comme l’acide docosahexanoïque,
eicosapentanoïquc et alpha-linolénique) a été associée à une réduction du risque de développer
un cancer de la prostate. En effet, une consommation journalière de 0,5 g d’acide gras provenant
de la consommation de poissons, réduit de 24 (y
0 les risques de cancers métastasiques [199]. De

plus, les huiles végétales non raffinées, riches en phytostérols (comme le heia-sitostérol et le
campeslérol), présentent dans le régime alimentaire méditerranéen et asiatique, réduisent le
risque de développer un cancer de la prostate, contrairement aux cholestérols, aux gras saturés et
aux huiles raffinées présentes dans l’alimentation américaine.

Ceraines études cliniques réalisées pour déterminer l’effet des produits laitiers sur le
cancer de la prostate présentent certaines contradictions. En effet, une large analyse de 45 études
d’observations montre que les prodtiit laitiers n’ont pas d’effets significatifs sur le risque de
développer un cancer de la prostate [200]. En revanche, d’autres études montrent une
augmentation du risque de 11 à 39 (y
0 [201, 202]. L’augmentation du taux de calcium dans le

plasma a pour conséquence la suppression de la 1,25 (lihydroxyvitamine D3, ce qui expliquerait

cette augmentation de risque [203]. D’autres chercheurs expliquent cela par la présence de gras
saturés dans les produits laitiers et par l’augmentation du taux d’IGE-l circulante (associée à une
augmentation du risque de développer un cancer de la prostate) [204-206]. De plus certains
travaux ont montré qu’une faible consommation de produits laitiers diminuait le taux de PSA
[207].

La viande rouge est riche en acide arachidonique [208], en amine hétérocyeliques

(HCAs) (provenant d’une cuisson prolongée) et en nitrosamines (agents de conservation). Colli
et Colli (2005) ont montré une forte corrélation entre la consommation de viande rouge et la
mortalité associée à un cancer de la prostate dans deux études rétrospectives sur des populations
provenant de 71 pays [209, 210].

L’alimentation méditenanéenne et asiatique sont les plus recommandées pour prévenir

l’apparition d’un cancer de la prostate. En effet, le poisson et le soja remplacent la viande rouge.
De plus, les produits laitiers sont consommés avec modération.

56
 Le régime alimentaire « idéal » p11 prévenir le cancer de la prostate est une alimentation
faible en gras, en viande rouge et en produits laitiers et riche en fruits, en légumes, en grains
entiers, en extraits naturels de plantes (curcumin, gingembre) et en thé vert. Les composés

présentant un efFet préventif reconnu, sur le cancer de la prostate, ont été développés ci-dessous.

1.3.1 La genistéine

Les phytooestrogèncs sont des composés provenant de plantes biologiquement actives et

qui ont une structure chimique semblable aux oestradiols. Les phytoostrogènes les pius
importants sont les isoflavones. La génistéine (4’, 5, 7-trihydroxyisoflavone) est une isoflavone
présente dans le soja, les lentilles, les pois et les haricots [211]. Elle est capable d’inhiber, in
vitro, la progression des cellules cancéreuses de la prostate androgène-dépendantes et —

indépendantes [212-214]. La génistéine a plusieurs modes d’actions anti cancérigènes. En effet,

elle est capable d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses (en inhibant la tyrosine kinase, la
voie de signalisation du PTK, la topoisomérase I et II et l’histidine kinase), d’induire leur
apoptose, d’avoir des effets antioxydants (en inhibant les voies de signalisation du NF-kB et de
Akt) et enfin d’inhiber I’angiogenèse (en inhibant TGF-f3 et EGF) [215, 216].

Des études in vitro ont montré que la génistéine induisait une diminution de l’expression
du AR dans les cellules cancéreuses de la prostate via le récepteur à oestrogènes f3, ce qui induit
une modification de la réponse cellulaire suite à une stimulation hormonale. Elle induit aussi une
inhibition de la synthèse des enzymes stéroïdiennes comme la SRD5A et la CYP9 ce qui
diminue la production honnonale. Enfin, elle bloque le cycle cellulaire en phase Gl et inhibe
l’expression du PSA [211].

57
1.3.2 Le lycopène

Le lycopène est un caroténoïde présent dans la tomate, la pastèque, les raisins rouges et la
Une consommation régulière de tomates crues ou cuites aide à prévenir le cancer de la
prostate [217] et réduit sa progression [218]. La cuisson des tomates favorise la libération du
lycopène qui a la capacité d’arrêter le cycle cellulaire cl d’induire l’apoptose dans plusieurs types
de cellules cancéreuses [219]. 11 réduit aussi le taux d’JGF—l dans le sérum qui est associé à un
risque élevé de cancer de la prostate [220]. Cependant, une étude menée sur le cancer de la
prostate, des poumons, du colon et des ovaires n’a pas réussi à identifier l’effet protecteur global
du lycopène sur l’incidence du cancer [221].

1.3.3 Le delphinidine

Le delphinidine est un polyphénol provenant des baies, il est également présent dans la
grenade, les raisins, les betteraves ainsi que les aubergines [222]. Il possède des propriétés anti
oxydantes, anti-inflammatoires, et anti-angiogéniques [222]. lI induit également l’apoptose dans
les cellules cancéreuses de la prostate et inhibe la croissance tumorale in vivo [223]. En effet, les
travaux de Yun et al. (2008) montrent que le delphinidine inhibe la croissance des cellules
hautement agressives PC-3 et induit leur apoptose [224, 225]. De plus, il inhibe la voie de
signalisation Wnt/f3-caténine. Cette voie est dérégulée dans le cas d’un cancer de la prostate et
contribue à sa progression. En effet, le delphinidine induit, dans les cellules PC-3, la
phosphorylalion de GSK3f3, l’expression des protéines APC et Axine et la phosphorylation de la
13-caténine sur les résidus sérine et thréonine. Il en résulte la dégradation de la !3-caténine,
l’inhibition de sa translocation dans le noyau et par conséquent l’inhibition de l’expression des
gènes intervenant dans la croissance cellulaire [224].

58
1.3.4 La quercétine

La quercetine est un antioxydant polyphénoliquc, présent dans plusieurs Fruits et légumes

et particulièrement dans les oignons, les brocolis, les pommes, le vin rouge et le soja. Ce
flavonoïde, en plus de ces propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires, a des effets
antiprolifératifs contre les cellules cancéreuses de la prostate. Cependant, son mécanisme
chimiopréventif n’est pas encore bien défini [226]. La quercétine est associée à des propriétés
pro-apoptotiques. En effet, elle induit l’arrêt du cycle cellulaire à la phase G] et module certaines
protéines de régulation du cycle cellulaire comme la cycline Dl et la CDK4. Elle induit la
libération du cytochrome c et active la caspase-9 et -3. Dans les cellules LNCaP, elle inhibe la
voie PI3KJAkt, supprime la phosphorylation de Bad (une protéine pro-apoptotique de la famille
des Bd-2), ce qui bloque l’intéraction entre Bcl-xL et Bax provoquant la libération dii
cytochrome e et l’activation des caspases [227]. Elle inhibe aussi la prolifération des cellules PC-
3 [228] et réduit le risque de métastases. En effet, elle inhibe l’expression de MMP2 et 9 dans les
cellules PC-3 via l’inhibition des protéines kinases [229]. Elle empêche ainsi la dégradation de la
matrice extracellulaire, étape nécessaire à l’initiation de l’invasion tumorale.

1.3.5 Les crucifères

La consommation de crucifères comme le brocoli, le chou-fleur et le chou, réduit le

risque de développer un cancer de la prostate. En effet l’indole-3-carbinol (13C) présent dans les
crucifères réduit la prolifération et induit l’apoptose des cellules cancéreuses de la prostate
hormono-résistante [230]. L’13C produit, durant la digestion, plusieurs métabolites dont le
diindolylméthane (DIM). Des travaux réalisés, in vivo clin vitro, ont montré que l’13C et le DIM
inhibaient la croissance des cellules cancéreuses androgène-dépendantes et -indépendantes. En
effet, DIM et 13C agissent comme des antagonistes du AR dans les cellules LNCaP. De plus,
DIM induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses de la prostate androgène-indépendantes
(DU 145 et PC-3).

59
1.3.6 Le thé

Le thé vert, l’Oolong et le thé noir proviennent des fluilles (le la même plante Camellia
S!nL’nsis. Cependant, leurs contenus chimiques ainsi que leurs goûts sont très différents en raison
de la méthode de fermentation. Les feuilles de thé sont très riches en polyphénols appelés
catéchines. Des études épidémiologiques récentes ont montré que l’epigallocaiechine-3-gallate,
l’epigallocatechine et l’epicatechine-3-gallate diminuaient le risque de développer un cancer de la
prostate [231-235]. En effet, l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) représente 10 à 50 % des
catéchines totales. fi inhibe la croissance des cellules tumorales en agissant comme tin
antioxydant. Elle induit l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire des cellules cancéreuses via
l’altération de la voie Pi3KJAkt, la protéine kinase C, l’inhibition de la voie inflammatoire (NF
kB et COX-2), la modulation du facteur 10E et de l’axe du récepteur androgènes [236, 237].

1.3.7 La grenade

La grenade est un fruit provenant de l’arbre Punica granatuin. Cet arbre est cultivé dans
le bassin méditerranéen, l’Afghanistan, l’inde, la Chine, le Japon, la Russie et dans certaines
régions des États-Unis [238]. Le fruit est constitué de trois parties : les graines, le jus et la peau
incluant les cloisons internes. D’autres parties de la plante tels que les racines, l’écorce, les
feuilles et les fleurs peuvent être utilisées [7].

Les graines représentent 3 % du poids total du fruit et contieiment 20 % d’huile. L’huile

est composée de 80 % d’acide gras conjugués octadécatriènoïques, avec un taux élevé d’acide
gras 9 cis, Il trans et 13 cis et de 7 % d’acide linoléique [239, 240]. La majorité de l’huile (95
%) est composée d’acide gras, les 5 % restant sont des stérols, des stéroïdes, des composés de la
gaine de myéline et des cérébrosides [241]. La matrice des graines contient de la lignine [242],
de l’acide hydroxycinnamique et des dérivés antioxydants de la lignine [243]. Le jus représente
30 % du poids total du fruit. Il contient six anthocyanines (la pelargonidine 3-glucoside, la
cyanidine 3-glucoside, la delphinidine 3-glucoside, la pelargonidine 3,5-diglucoside, la cyanidine

60
3,5-diglucoside et la deiphinidine 3,5-diglucoside) des ellagitannins et des tannins hydrolysables.
Au total, 124 composés naturels ont été identifiés clans la grenade [244]. Le jus contient
également des minéraux dont le f’er est le plus important [245]. Le péricarpe contient des
flavonoïdes, des tannins, des polysaccharides complexes et probablement des alcaloïdes [7, 246].
Les feuilles contiennent des tannins, de l’apigénine, des flavones et des minéraux. Les fleurs
contiennent (les composés l)résellls aussi dans les feuilles (acide gallique) et les grains (acide
ursolique) [7]. L’écorce et les racines contiennent des alcaloïdes (Tableau 2).

La grenade est riche en composés polyphénoliques comme les anthocyanines et les

tannins. Elle a un effet antioxydant plus important que le thé vert et le vin, ainsi qu’un effet anti-
inflammatoire [247, 248].

Plusieurs études in vivo et in vitro ont mis en évidence les propriétés anticancéreuses de
la grenade [249-254]. De plus, des études récentes ont montré que la consommation de jus de
grenade par des patients souffrant du cancer de la prostate avec un taux de PSA élevé, à la suite
d’un traitement primaire, diminue significativement le taux de PSA en doublant le temps de
survie de 15 à 54 mois (p <0.001) [255].

Le traitement des cellules cancéreuses DU-145, PC-3 et LNCaP avec des extraits de la
grenade induit une activation de l’apoptosc et une inhibition de la viabilité cellulaire [256]. De
plus, les travaux de Seeram et al. (2005) sur des souris nudes athymiques, transplantées avec des
cellules cancéreuses CWR22RvI, androgène-dépendantes, et nourries avec des extraits de
grenade, ont mis en évidence une diminution de la taille des tumeurs ainsi que du taux de PSA
sérique [257].

Les ellagitannins sont les polyphénols les plus abondants du jus de grenade [255]. Ces
composés, ainsi que leurs produits d’hydrolyse comme l’acide ellagique, inhibent la progression
du cancer de la prostate en bloquant la division cellulaire et en stimulant l’apoptose [258]. De
plus, les ellagitannins sont métabolisés par la flore intestinale et produisent l’urolithine A et B
conjuguées dans le foie pour être excrétés dans les urines, 12 à 56 heures après l’administration
de 8 oz (250 mL) de jus de grenade à des patients. Ces urolithines circulent dans le sang et
peuvent atteindre plusieurs organes cibles où les effets des ellagitannins ont été observés [259].

L’acide punicique, un acides gras conjugué présent dans l’huile des graines de grenade
[260], inhibe la formation des prostaglandines [251]. Des études in vitro ont également montré

61
une inhjhition de l’invasion des cellules cancéreuses PC-3 suite à leur exposition à un mélange
d’extraits d’huiles de grenade [257, 261, 262]. L’acide punicique induit également un effèt
cytotoxique sur les cellules leucémiques via une péroxydation lipidique [263].

L’acide gallique, un acide hydroxybenzoïque contenu dans le jus, les fleurs et la peau
[264, 265] induit l’expression de p53/p2l, l’arrêt de la phase Gi et l’apoptose des cellules
cancéreuses de la vessie [266]. 11 inhibe également la croissance des cellules cancéreuses de la
prostate DU-145 et induit leur apoptose [267].

Les anthocyanidines contenues dans la peau comme le delphinidine, le cyanidine et le

pelargonidine [268] ont des activitées antiangiogéniques, antioxydantes et anticarcinogènes
[269]. Ils inhibent également l’activité dc la cyclooxygénase, la production de l’oxyde nitrique et
le récepteur du facteur de croissance épidermal [270]. Ils possèdent également une activité
antirnutagénique [271].

Le kaempferol est un flavonol contenu dans la peau [272]. 11 agit en synergie avec la
quercetine pour inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du sein [273]. 11 inhibe
également l’activité de l’acide gras synthase, dans les cellules tumorales humaines [274].

Les flavan-3-ols comme les catéchines et l’épicatéchine, présents dans le jus et la peau,
inhibent la métalloprotéinase—9 et l’invasion des cellules tumorales. [275].

62
 Tableau 2 Sélection de quelques composés de la grenade et leurs actions connues contre le cancer 12761— J
jus, L : feuille, I’ fleurs, S : graines, B écorce de l’arbre, R écorce des racines de l’arbre

Classe chimique Nom du composé Partie de Prévention du cancer et traitements

la plante

Acide hydroxybenzoïque Acide gallique J, L, F Induit l’expression dc p53/p2l, stoppe la phase

GI et l’apoplose dans les cellules cancéreuses
Acide ellagique J, L, S de la vessie
Inhibe la croissance et entraîne la mort (les
cellules DU-145

Anlhocyanidincs Delphinidine L Activités antiangiogéniques, antioxydantes et

anticancérigènes
Cyanidine L

Pelargonidine L

Acides gras conjugués Acide punicique S Améliore la fènction des cellules B in vivo
Cause un effet cytotoxique sur les cellules
leucémiques par péroxydation lipidique

Acides gras Acide linoléique S Inhibent la CYPI9 dans des expériences non
V V
cellulaires
non COOl ugues Acide oleique
Acide palinitique
Acide stéarique
Acide cis
‘accén ique
Acide trans
vaccén ique

Flavan-3-ols Epigallocatéchine J, L inhibiteur puissant dc la métalloprotéinase-9 et

3-gallate (ECGC) de l’invasion des cellules cancéreuses
Epicatéchine Antagoniste des facteurs de croissance
responsables des maladies prolifératives
Epicatechine gallate

Flavonols Quercétine J, L Le kaempférol agit en synergie avec la

quercétine pour inhiber la prolifération des
Flavones Lutéoline L cellules cancéreuses du sein
Diminue la synthèse des acides gras dans les
Flavonol glycoside Kaempferol L cellules cancéreuses
Induit l’apoptose des cellules en activant les
récepteurs de mort cellulaire et les caspases

63
1.3.8 Les elcosanoides

L’inflammation fait intervenir des molécules présentant une structure similaire à celle des
hormones, appelées eicosanoïdes. Certains eicosanoïdes favorisent I’ inflammation chronique
d’autres l’empêchent. De plus, ils jouent un rôle important dans la régulation du système
immunitaire. Ils sont synthétisés i partir d’acides gras polyinsaturés provenaHt dc l’alimentation.
Certaines enzymes synthétisent de «bons» eicosanoïdes anti—inflammatoires d’autres synthétisent
de «mauvais» eicosanoïdes pro-inflammatoires. Les <(bons» eicosanoïdes sont synthétisés 1 partir
des acides gras oméga-3 présents dans le poisson, les graines de lin, les noisettes et les légumes
verts. Les «mauvais» eicosanoïdes sont synthétisés à partir d’acides gras omega-6 présents dans
les huiles végétales, utilisées pour la fabrication des aliments industriels, comme l’huile de soja,
de tournesol, de maïs, de carthame et de coton. La production d’eicosanoïdes dans le corps
dépend essentiellement de la composition en acides gras du régime alimentaire.

Les enzymes COX-2, 5-LOX et 12-LOX synthétisent des eicosanoïdes qui jouent un rôle
important dans la progression du cancer de la prostate. Ces enzymes produisent des eicosanoïdes
pro-inflammatoires comme la prostaglandine E2 et le leucotriène B4. De plus, la surexpression
de COX-2 est tin prédicateur de mauvais pronostic dii cancer de la prostate [277]. Il est donc
important de limiter la production d’eicosanoïdes pro-inflammatoire en favorisant la
consommation d’omega-3. Il est aussi possible de limiter l’action des enzymes COX et LO qui
favorisent la carcinogenèse en consommant des acides gras qui limitent leur activation.

1.3.9 Les extraits naturels de plantes

Les extraits naturels de plantes contiennent des agents anti-inflammatoires qui agissent de
façon moins spécifique et leur valeur thérapeutique est de plus en phis reconnue. Plusieurs
chercheurs ont étudié une variété d’extraits naturels de plantes pour identifier leurs effets
spécifiques et non spécifiques sur les COX et les LO. Le curcumin, le gingembre, le basilic, le
resveratrol et la berbérine sont les agents anti-inflammatoires les plus prometteurs. Le curdumin

64
est un diféruloylméthane. Il est capable de prévenir le cancer de la prostate en modulant les
suppresseurs de l’apoptose et les facteurs de croissance qui favorisent sa progression [278, 279].
Le gingembre comporte plus de 20 composés chimiques capables d’inhiber COX-2 et 5-LO. Il a
des propriétés antioxydantes et anti—inflammatoires et prévient l’apparition de plusieurs cancers
[280]. Le resvératrol est une phytoalexine polyphénolique présente dans le raisin rouge et dans
les cacahuètes [28!]. Le resvératrol inhibe la croissance des cellules LNCaP, DU-145
(androgène-indépendante) et PC-3 de façon dose-dépendante. De plus, il réduit le stress oxydant
en diminuant la production de NO dans les cellules PC-3 et DU-145 [282]. 11 induit l’apoptose
dans les cellules LNCaP et DU 145 via les voies MAPK [283] ou via le récepteur Fas [284] et
module l’expression du AR [282].

1.3.10 Les acides gras polyinsaturés (PUFAs)

Des études ont montré qu’une consommation même modérée de poissons gras a des
propriétés protectrices contre le cancer de la prostate. A l’origine de ce phénomène, les acides
gras à longue chaîne aux propriétés anti—inflammatoires et anti—tumorales [285]. Des études in
vitro ont montré que les acides gras Oméga—3 présents dans l’huile de maquereau, de saumon, de
sardines, d’anchois et de thon ou encore extraits des plantes comme le canola, le soja et les
graines de lin [286], diminuent le taux de testostérone dans le sang, reconnue pour accélérer la
progression du cancer de la prostate. De pldms, ils inhibent l’expression du PSA [287]. L’acide
eicosapentanoïque (EPA, 20:5n-3) et l’acide docosahexanoïque (D1IA, 22:6n-3) présents dans
les poissons gras, inhibent l’activité des eicosanoïdes et des androgènes, reconnus pour leurs
effets stimulants sur la croissance des cellules cancéreuses de la prostate [288].

65
Il existe plusieurs mécanismes d’action des PUIAs contre la carcinogenèse

1.3.10.1 L ‘inhibition de I ‘acide arachidonique (Ail, 20:4,i—6) ô I ‘origine de la s),1/u’se des

elcosano ïcles

Une des fonctions les plus importantes des PUFAs (acides gras n-3 et n-6) est reliée
leur conversion en eïcosanoïdes, caractérisés par une durée de vie courte, une structure proche
des hormones et comportent 20 atomes de carbones. Les eicosanoïdes sont biologiquement
importants puisqu’ils modulent l’inflammation et la réponse immunitaire. Ils jouent un rôle
important dans la coagulation, la croissance et la différenciation cellulaire. Comme le PUlA le
plus abondant de la membrane cellulaire est le AA, la plupart des eicosanoïdes produits ont des
propriétés pro-inflammatoires [289-291] et procarcinogènes [292]. Donc, le meilleur moyen de
diminuer le risque de cancer, est de supprimer la synthèse des eicosanoïdes provenant du AA.

1.3.10.2 La modulation de l’activité des facteurs de transcrivflon, de l’expression des

gènes et des voies de signalisation.

Les PUFAs, et leurs métabolites, peuvent exercer un effet anti-tumoral en affectant

l’expression de certains gènes ou encore en modulant certaines voies de signalisation impliquées
dans le contrôle de la croissance cellulaire, de la différenciation cellulaire, de l’apoptose, de
l’angiogenèse et de l’apparition de métastases.

1.3.10.2.1 Le récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes (PPAR)

Le premier facteur de transcription identifié, régulé par les acides gras, est le PPARci
[293]. C’est un membre de la famille des PPAR qui comprend aussi le PPAR et le PPARy (l,
‘y2 et ‘y3). Ce facteur de transcription activé par un ligand a d’abord été identifié dans la
régulation du métabolisme lipidique et dans l’homéostasie. Des études récentes ont mis en
évidence son implication dans la prolifération cellulaire, la différentiation et les réponses
inflammatoires [294]. PPAR’y est exprimé dans les cellules épithéliales du cancer de la prostate
[295]. De plus, des études ont montré que l’agoniste du PPARy, le troglitazone, est capable de
bloquer ou d’inverser la progression d’un cancer de la prostate [296-298]. Puisque ses ligands

66
privilégiés Sont les PUFAs (LA, a-LNA, AA et LPA) [299, 300], il représente une cible
intéressante pour le traitement du cancer de la prostate.

1.3.10.2.2 Le facteur de transcription nucléaire kB (NF-kB)

La ftimille des facteurs de transcription nucléaire kB ou NF—kB est impliquée dans

l’expression des gènes codant pour les cytokines, l’adhésion cellulaire, l’activation du cycle
cellulaire, l’apoptose et la carcinogenèsc [301]. En effet, l’activation constitutive de NF-kB dans
le cancer joue un rôle dans la croissance tumorale [301]. Une étude expérimentale a montré une
diminution significative de l’activation du Nh-kB par des acides gras n-3 dans les macrophages
de murins [302].

1.3.10.2.3 Les radicaux libres et les espèces réactives d’oxygènes (ROS)

Elles sont produites dans les cellules et peuvent attaquer les PUFAs pour former des
hydroxypéroxydes qui à leur tour produisent des radicaux libres et des aldéhydes réactifs. Ces
métabolites génèrent des adduits d’ADN exocyclique pro-mutagénique dans les cellules
humaines ce qui favorise l’apparition d’un cancer [303, 304]. L’auto-oxydation des acides gras
exposés à l’air atmosphérique, est proportionnelle au nombre de doubles liaisons présentes dans
la molécule. Puisque les PUFAs n-3 possèdent plusieurs insaturations, il est évident qu’ils
favorisent la péroxydation lipidique et donc la carcinogenèse. Ces conclusions proviennent de
travaux réalisés in vitro dans des systèmes homogènes [305]. Cependant, plusieurs études
démontrent que la consommation d’acides gras n-3 supprime les maladies causées par les
radicaux libres comme le cancer et l’athérosclérose, ce qui suggère que la péroxydation lipidique
in vivo est différente de celle in vitro [306].

Takahashi et al. (2002) ont montré que certains gènes codant pour des enzymes
antioxydantes, comme la glutathion transférase et la supéroxide dismutase, sont surexprimées
chez des souris nourries avec de l’huile de poisson [307]. 11 existe donc un effet protecteur contre
la production d’espèces réactives d’oxygène et contre l’initiation du cancer. De plus, la
génération de radicaux oxygénés est impliquée dans l’initiation de l’apoptose et dans l’activation
des défenses naturelles contre les cellules transfonriées ou étrangères [308]. Donc, l’effet

67
inhibiteur des acides gras n-3 sur la prolifération cellulaire, est, en partie, expliqué par la
formation de produits oxydés qui induisent l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire.

1.3.11 Les micronutriments

À ce jour, aucun nutrimeni n’a été identifié comme un chimioprotecteur capable d’agir
seul, mais plutôt en synergie avec un large spectre de micro—nutriments. La vitamine E, le
sélénium, le calcium, la vitamine D et le zinc jouent un rôle dans la prévention du cancer de la
prostate [309].

Les vitamines sont un groupe de composés organiques essentiels pour le fonctionnement

normal du corps. Elles sont présentes dans différentes sources alimentaires. D’après une étude
effectuée par l’institut américain de la recherche sur le cancer (AICR), plus de la moitié des
adultes âgés de plus de 45 ans consomment des multivitarnines pour diminuer le risque de
développer un cancer. Plusieurs études in vitro sur des cellules cancéreuses de la prostate ont
montré que la vitamine E (plus particulièrement l’alpha- et le gainrna—tocophérol) réduisent le
risque de développer un cancer de la prostate de 32 % [310, 3 11]. En effet, la vitamine E a une
activité antioxydante et détoxifianle des radicaux libres formés dans la membrane des cellules
cancéreuses [312]. De pius, elle induit l’arrêt du cycle cellulaire des cellules cancéreuses et
induit la surexpression de p27, un régulateur du cycle cellulaire [313].

Le sélénium est un minéral essentiel qui permet à la vitamine E d’avoir un potentiel

redox. Il est présent dans les noix du Rrésil, daiis le thon, l’espadon et les huitres. Le taux de
sélénium présent dans l’alimentation diffère en raison dc la diversité des sols dans lesquels les
aliments sont cultivés. Des études sur les populations ont montré que les hommes atteints du
cancer de la prostate ont un taux en sélénium plus faible que celui des hommes sains. Le
sélénium inhibe l’angiogenèse et la prolifération cellulaire [314] et induit l’apoptose in vitro
[315].

La vitamine E combinée au sélénium induit un arrêt de la prolifération des cellules

anormales. Cependant, une étude contradictoire réalisée sur 35 000 hommes a montré que ni le

68
sélénium ni la vitamine E n’avaient d’eFfets sur la réduction du risque Ijé au développement du
cancer de la prostate [316]. D’autres investigations concernant la chimioprévention du sélénium
sont en cours [193, 299, 300].

Pour prévenir l’ostéoporose chez les hommes tgés de plus de 50 ans, il est recommandé
de consommer 1,200 mg de calcium par jour. Cependant, des études épidémiologiques ont
montré qu’une consommation importante de calcium augmentait les risques de développer un
cancer de la prostate. Il est donc important de déterminer la limite maximale de consommation
de calcium pour limiter les risques. En effet, une consommation importante réduit la production
de 1,25(011)2 vitamine D qui a des propriétés antiprolifératives et anti-métastasiques sur le
cancer de la prostate [3 17, 3 18]. Des études ont montré que les régions du monde où l’exposition
au soleil était plus faible, et par conséquent la production de vitamine D aussi, la prévalence du
cancer de la prostate était plus élevé [319, 320].

La quantité de zinc dans les cellules cancéreuses de la prostate est inférieure à celle des
cellules normales [321]. En effet, dans les cellules normales, le zinc agit comme inhibiteur d’une
enzyme, la m-aconitase, qui fait partie du cycle de lCrebs. La faible teneur en zinc dans les
cellules cancéreuses leur permet de compléter le cycle de Krebs, de prodmiire de l’énergie et de se
multiplier de façon incontrôlée [322].

69
OL
2 HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
 Le cancer de la prostate est un cancer très fréquent qui présente un taux de mortalité
important. Durant les deux dernières décennies, le nombre de cas a fortement augmenté grâce à
un test de dépistage sanguin de la PSA. C’est un cancer dont la croissance et la progression
dépendent essentiellement des androgènes et plus particulièrement de la DHT. En effet, la
testostérone est convertie en DHT par une enzyme stéroïdienne la SRD5A, la DuT se lic alors au
AR et induit son activation. Ce dernier une fois activé induit l’expression des gènes intervenant
dans la prolifération cellulaire, incontrôlée dans le cas d’un cancer.

Il existe actuellement plusieurs traitements contre le cancer de la prostate comme

l’hormonothérapie qui a pour but de bloquer l’action de ces androgènes. Cependant, en plus des
effets secondaires indésirables, ces traitements induisent une résistance aux traitements [2]. En
effet, les cellules cancéreuses évoluent invariablement vers un état androgène-indépendant
difficile à traiter [3].

C’est un cancer qui survient vers l’âge de 50 ans et évolue la plupart du temps lentement.
Pour toutes ces raisons, les traitements préventifs semblent être les plus appropriés. En effet, des
études épidémiologiques ont mis en évidence l’importance des facteurs environnementaux dans
le développement du cancer de la prostate et plus particulièrement l’influence du régime
alimentaire dans la prévalence des risques de développer ce cancer [5, 6]. Des études récentes
ont mis en évidence les propriétés thérapeutiques (chimiopréventives et chimiothérapeutiques)
des composés naturels et plus particulièrement de certains dérivés de la grenade sur le cancer de
la prostate [7, 323]. Les recherches actuelles tentent de mettre en évidence le composé bioactif
présent dans la grenade et responsable partiellement ou totalement d’un effet thérapeutique.

Nous émettons l’hypothèse que cet effet chimiopréventif se traduit, dans les cellules
liormono-dépendantes, par un effet antiandrogénique capable d’inhiber la croissance
cellulaire. Cet effet antiandrogénique se traduirait par la modulation de l’expression du AR ou
encore par la modulation de l’expression des gènes codant pour une enzyme clé de la synthèse de
novo des stéroïdes, la SRD5A. En revanche, nous pensons qu’une diminution de la viabilité

des cellules cancéreuses hormono-dépendantes et hormono-indépendantes ferait intervenir

d’autres voies cellulaires indépendantes de la voie androgénique.

Notre objectif est de détenniner l’effet antiprolifératif des composés naturels extraits de
la grenade sur les cellules cancéreuses de la prostate.

73
Ojeçhf 1 f[ç g rqItrgjU çï

Treize composés de la grenade appartenant à différentes classes chimiques et présentant

des effets préventifs sur différents cancers ont été sélectionnés. Les effets antiprolifératifs et
antiandrogéniques de ces composés ont été déterminés sur les lignées cellulaires LNCaP grâce à
une méthode colorimétrique qui permet d’estimer le nombre de cellules viables cultivées dans
une plaque de microtitration à l’aide d’un spectrophotomètre. La lignée cellulaire LNCaP
(Lymph Node Carcinoma of Ihe Prostate) est disponible comme modèle in vitro pour étudier
l’effet de différents composés à différents niveaux d’évolution du cancer dc la prostate [324j.
Les composés présentant des effets antiprolif’ératif’s sur les LNCaP ont été sélectionnés pour
identi fier leurs e ITels antiandrogéniques.

L’effet mtiandrogénique a été défini comme étant l’inhibition de la capacité

transcriptionelle du AR. Pour cela nous avons déterminé la modulation de l’expression protéique
du AR par immunobiLvardage de type western sur des extraits protéiques nucléaires et
cytoplasmiques provenant des cellules LNCaP, exposées aux composés extraits de la grenade.
Nous avons également déterminé la modulation de l’expression des gènes codant pour la
SRD5A 1 et pour le PSA par une RT-PCR semi-quanhitative.

Objectif2 : Effets cytotoxigues et apoptotigues

Les composés induisant une diminution de la viabilité cellulaire des cellules cancéreuses
LNCaP et PC-3 ont été sélectionnés pour identifier leurs effets apoptotiques. De plus, nous avons
testé leurs effets sur la viabilité des cellules épithéliales normales RWPE-l.

Les voies apoptotiques mises enjeux ont été déterminées grâce à différentes techniques:
Les cellules ont été colorées avec de l’iodure de propidium (PI) pour identifier les cellules
nécrotiques et avec du Hoechst 33342 pour identifier les cellules apoptotiques, puis observées au
miscroscope à fluorescence. Un dosage de l’ADN fragmenté a aussi été réalisé. Enfin, les voies
apoptotiques mises en jeux ont été identifiées par immunobuvardage de type western.

74
Q*git$ ; kwwgna4i*g ç’q,ppgn,garçi, ICN&

Nous avons testé sept acides gras polyinsaturés, dont quatre isomères de l’acide
punicique, que nous avons sélcctionné comme composés de référence. Nous avons identifié les
composés les plus cytotoxiques sur les cellules LNCaP, PC-3 et avons déterminé le lien entre
leurs activités biologiques et leurs structures chimiques spécifiques. Pour cela nous avons réalisé
une analyse 3-D grâce au logiciel PubChem Compound qui pennet de différencier des composés
ayant la même formule brute, mais dont la formule développée est différente. De plus, il permet
d’identifier la structure du composé le plus actif et de le comparer à d’autres composés ayant les
mêmes propriétés physico-chimiques. C’est un moyen de comprendre la différence structurelle
qui peut exister entre les composés et qui n’est pas visible en 2-D.

75
76
3 DEUXIÈME PARTIE : ARTICLES
3.1 CHAPITRE I : Les effets antiprolifératifs, antiandrogéniques et
proapoptotiques de l’acide punicique dans les cellules cancéreuses de la
prostate LNCaP

3.1.1 Traduction du résumé de l’article

Le cancer de la prostate est une maladie de plus en plus répandue chez les hommes. De
plus, la chirnioprévention par des composés extraits de la grenade (punica granafuin) présente
plusieurs effets bénéfiques. Nous avons déterminé les effets antiprolifératifs, antiandrogéniques
et pro-apoptotiques de 13 composés purs, extraits de la grenade, sur des cellules cancéreuses de
la prostate androgène-dépendantes LNCaP. Les cellules ont été cultivées dans un milieu de
culture dépourvu de stéroïdes et ont été exposées à des concentrations croissantes de composés
de la grenade (1-100 tiM) en présence de dihydrotestostérone (DuT) à 0.1 nM. L’inhibition de la
croissance cellulaire a été mesurée après 4 jours d’exposition grâce à un test colorimétrique le
WST-l. Quatre composés, à une concentration de 10 tM et plus, ont été capables d’inhiber la
croissance des cellules stimulées par la DI-IT. Ces composés ont inhibé l’accumulation du
récepteur à androgène, stimulé par la DHT, dans le noyau. De plus, ils ont inhibé l’expression
des gènes dont l’expression dépend du récepteur à androgène, du PSA et de la 5a-réductase de
type i à des concentrations 10 jiM. La contribution de l’apoptose à la diminution de la
croissance cellulaire observée à été déterminée. En effet, trois composés l’EGCG, le kaernpférol,
et plus particulièrement, l’acide punicique, ont provoqué une fragmentation de l’ADN après 24 h
iM. De plus, l’acide punicique, un acide
d’exposition à des concentrations allant de 10 à 100 1
gras abondant dans les graines de la grenade, a induit une apoptose via la voie intrinsèque. En
conclusion, l’acide punicique, le constituant principal des graines de la grenade (70-80 %),
possède des propriétés antiprolifératives sur les cellules cancéreuses de la prostate androgène-
dépendantes LNCaP. Ces propriétés font intervenir des mécanismes antiandrogéniques et pro
apoptotiques.

79
3.1.2 Contribution dc l’étudiante

Toutes les expériences, la rédaction du manuscrit ainsi que la soumission à des revues
scientiliques ont été réalisées par le premier auteur de l’article.

80
3. 1.3 Growth inhibitoiy, antiandrogeuic and pro—apoptotic eJfrcts ofpunicic acid in LNCaP
hunian prostate cancer celis

Jihane Gasmi and J. Thornas Sanderson

Institut National de la Recherche Scientifique, Institut Armand-Frappier, Université dii Québec,

Lavai, Québec, Canada

Corresponding author:

J. Thomas Sanderson, PhD

IN RS- Institut Arnand-Frappier

531 blv des Prairies

Lavai, Québec, Canada H7V1B7

Phone: (450) 687-5010 ext 8819/ Fax: (450) 686-5309

E-mail: thomas.sanderson(i2iaf.inrs.ca

J Agric Food Chem 2010 Nov 10.

81
z8
Abstract
Prostate cancer is a comrnonly diagnosed cancer in men and dictary chemoprevention by
pomegranate (Punica granafuin) extracts has shown noticeable benefits. In this study we
inves[igated the growth inhibitory, anliandrogenic and pro-apoptotic efkct oU 13 pure cornpounds
Found in the pomegranate in androgen—dependent LNCaP human prostate cancer ceils. Ceils
deprived oC steroid hormones were exposed 10 increasing concentrations (I-100 ltM) of
pomegranate compounds in the presence of 0.1 nM dihydrotestosterone (Dl IT) and inhibition of
ceil growth was measured by WST-l colorirneiric assay aCter a 4 day exposure. Four compounds
epigallocatechin gallate (EGCG), deiphinidin chloride, kaempferol and punicic acici were found
to inhibit DIIT-stirnuiated ccli growth at concentrations of 10 pM and above. Tiiese four
pomegranate compounds inhibited DHT-stirnulated androgen receptor nuclear accumulation and
the expression of the androgen receptor-(AR)-dependent genes prostate specific antigen (PSA)
and steroid 5a-reductase type 1 (SRD5AI) al concentrations >10 iM. We determined the
possible contribution of apoptosis to the observed decrease in ccli growth and found that three
compounds, EGCG, kaempcerol and, in particular punicic acid, induced DNA fragmentation aCter
a 24h treatment, at concentrations in the 10-100 11M range. Punicic acid, an important fatty acid
in pomegranale seeds, was furiher round 10 induce inirinsic apoptosis via a caspase-dependent
pathway. In conclusion, punicic acid, the main constituent of pornegranate seed (70-80%)
exhibited potent growth inhibitory activities in androgen-dependent LNCaP celis, which appear
10 be rnediated by both antiandrogenic and pro-apoptotic mechanisrns.
Keywords: Pornegranate, punicic acid, SRD5AI, PSA, LNCaP, apoptosis.
Abbreviations: AR: androgen receptor; CS-FBS: Charcoal stripped fetal bovine serum; DMSO:
dimethylsulfoxide; Dl-11: dihydrotestosterone; PSA: prostate specific antigcn; SRD5A1: steroid
5Œ-reductase type 1.

83
1. Introduction

Prostate cancer is the rnost common cancer diagnosed in North American men, and is the
third leading cause of cancer death in western countries (1). The number of cases diagnoseci bas
increased over the last decades in part due tu the developmeHt of sensitive tests for the detection
of prostate cancer markers, such as prostate-specific antigen (PSA) which are expressed
androgen-dependently and are secreted into the blood circulation (2).
Most prostate cancers are initially androgen-dependent and the main treatrnent option at
this early-stage is androgen ablation (3, 4). However, after initial successful response to androgen
ablation therapy, niost prostate cancers progress 10 an androgen—resistant state that is highly
aggressive, metastatic, and oftcn leads to death (5).
Compelling risk cactors involved in the developrnent and progression oC prostate cancer
include older age, a camily history oC prostate cancer, and race. Increasing interest bas centered on
nutritional or other environmental factors that either offer protection against prostate cancer or
increase its incidence. Asian men have rnuch Iower incidences of prostate cancer and benign
prostatic hyperplasia (BPH) than their Western counterparts (6). Moreover, vegetarian men have
a lower incidence oC prostate cancer than omnivorous males. Taken together, both populatioiis oC
men C0flSUC Iow—fat, high—fibre diets containing fruits and vegetables, which provide a rich
supply oC antioxidants, weak dietary estrogens and possible anti-androgens. This implies that
environmental factors, rather than genetics alone, contribute substantially to the risk of
developing prostate cancer (7).
Dielary chemoprevention of prostate cancer is increasingly considered to be an important
way to reduce this health problem (8, 9). Recently, pornegranate (Punica granatum) a source of
many polypheno is including ellagitannins, punicaligins, gallotannins, anthocyanins and
flavonoids lias shown promise in the prevention of prostate cancer as lias been demonstrated in
studies with extracts and/or isolated bioactive compounds (10-12). More recently, ellagitannin
metabolites foniied in the gut, such as urolithin A and B are being considered as biologically
active agents against prostate cancer (13); they appear to have protective (anti-inflammatory)
actions in colon (14), although littie is yet known about their concentrations in prostate,
therapeutically relevant levels or mechanism of action.
We hypothesize that certain compounds found in the pomegranate have growth inhibitory
and antiandrogenic properties which contribute to their protection against the developrnent and

84
growth o!’ prostate cancer. The objective of the present study was 10 examine the potcntial
protective effects of a number of pure compounds known In be Found in various parts of the
pomegranate, including punicic acid, which is the predominant trienoic acid in this fruit (15). The
effects ofpomegranate compounds on ccli growtb, and apoptosis were exarnined in an androgen
dependeni and androgen receptor (AR)-positive hurnan prostate cancer ccli une (LNCaP). Since
androgens and the androgen receptor (AR) piay centrai roles throughout prostate cancer
deveiopment, the effects of pomegranate polyphenols and fittty acids were cvaiuated on the
transcription oC genes for the AR-dependent dihydrotestosterone (DHT)-synthesizing enzyme
SRD5AI (steroid 5 reductase type 1), PSA and nuclear androgen receptor levels.

2. Materiais and methods

2.1. Pomegranate compounds

Punicic acid, gallic-, cis-vaccenic-, trans-vaccenic- and quinic acid wcre purchased from
Larodan Fine Chernicais AB (Maimô, Sweden), kaempferol, deiphinidin chloride, pelargonidin
chloride, cyanidin chloride, malvidin chloride, epicatechin (EC), epicatechin gal late (ECG) and
epigallocatechin gallate (EGCG) were purchased from Extrasynthèse (Genay, France) (Table 1).
Ail compounds were dissolved in DMSO as 1000-fold concentrated stock solutions. Although
some compounds are water soluble we chose DMSO [‘or ail solutions to remain consistent. The
quantitative pomegranate contents of these compounds in the actual fruit, as far as known, are
summarized in Table I.

2.2. Ccli culture

Androgen-dependent LNCaP celis (American Type Culture Collection, Manassas, USA)

were rnaintained and cultured in RPMI 1640 medium supplernented with 10 % FBS and 1 %
penicillin/streptornycin in a hurnidified atmosphere of’ 5 % C0
2 al 37°C. Ceils in 75cm
2 flasks
were grown to 80 % confluence and then seeded in rnulti-weli ccli culture plates for the
experimental procedures, Fresh batches of LNCaP celis were cryogenicaily frozen (in steps of
1°C until -80°C; then frozen in liquid nitrogen) al passage number 4-5 for future use. Passage
numbers between 2 and 25 were used; after 25 passages androgen responsiveness dcclined.

85
2.3. Cet! growth inhibition assa

LNCaP celis were seeded in 96-weil plates (Fisher, Ottawa, ON) at a concentration of
4 cells/well in 100 jii phenol red—free culture medium with 10 % CS-FBS (charcoal-stripped
5x10
fetal bovine serum) for 24h, 10 arrest ccli growth by rernoving steroids. Ceils were then exposed
b soivent (negative) control (0. 1 % DMSO), DHT (0.1 nM; positive control for stimulation of
ccli growth), or the pomegranate compounds (3, 10, 30 and 100 iiM) in the presence of 0.1 nM
DHT (an approximate 5
EC
( ) for increased ceil growth) for 48h. The medium was then refreshed
anci the celis were exposed for a further 48h to the sarne experimental treatments. A WST-l ccli
viability assay (Roche Applied Science, Germany) was performed according (o the
manufacturer’s instruction. Absorbance was measured at 440 nm using a Spectramax M5
multifunctional spectrometer (Molccular Devices, Suimyvale, CA).

2.4. Assay ofapopiosis

Celis werc secded at a concentration of 0.5 X cells/weli in 100 tl ofcomplete culture

medium in 96-weil plates for 24h. The pornegranate compounds (0, 1, 3, 10, 30, 100 pM) were
added and the celis were incubated for an additional 24h. A Ccii Death Detection EL1SAs kit
(Roche Applicd Science) was used 10 determine the formation of cytoplasmic histone-associated
DNA—fragments foliowing the manufacturer’s instructions.

2. 5. Prote in isolation aiicl immiinoblolting

A Ne-Per Nucicar and Cytopiasmic Extraction Reagent kit (Pierce Biotechnoiogies,

Rockford, IL) was used for the extraction of nuclear and cytopiasmic protein fractions. Ccii
pellets were lysed in RIPA buffer containing iX protease inhibitor cocktail, and protein
concentrations were detenriined using the Bradford assay. Proteins (15 jig) were resolved by
SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane (Bio-Rad, Mississauga, ON). Membranes were
biocked with 5% reconstituted rniik powder (Sobeys, Mississauga, ON) and then probed with the
appropriate prirnary and secondary antibodies at 4°C overnight. Antibody-antigen complexes
were visualized by Immobiion Western Chemiluminescence reagents (Miilipore, Billerica, MA)
using a Versadoc imaging system (Biorad, Mississauga, ON). J3-actin and GAPDH were used as
protein loading (reference) controis. The mouse antibodies raised against human 13-actin,
androgen receptor and caspase-8 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA). The rabbit antibodies raised against human caspase-9, cleaved PARP, Bc12, Bax, GSK-3f3

86
and pIiospho-GSK-3f3 were purchased from Ce!! Signalling l’echnology (Danvers, MA).
GAPDII, phospho-Aktl and Aktl were purchascd from Millipore. Electrophoresis and
immunoblotting equipment was purchased from Bio-Rad. LY294002 (Sigma-Adrich, St Louis,
Mo), a phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitor was used as positive control for inhibition
oC Akt phosphorylalion al the Ser473 position.

2.6. mRNA extraction and reverse transcription polyrnerase chain reaction

5 cells/well in 2 mi phenol red-free

LNCaP ceils were seeded at a concentration of 3 X i0
with CS-FBS in 6 wells plates for 24h to arrest ccli growth. Celis were then exposed for 24 h to
soivent (negative) control (0.1 % DMSO), DHT (0.1 nM; an approximate EC
50 value for PSA
induction and positive control for stimulation of AR-dependent gene expression), or the
pomegranate compounds (1,3, 10, 30, 100 pM) in the presence of 0.1 nM DHT. Total RNA was
prepared using a 1-iigh Pure RNA Isolation Kit (Roche Appiied Science) and was reverse
transcribed and amplified using a one-step Access RT-PCR kit (Promega, Madison, WI). RT
PCR reactions were performed in 25 111 containing 100 ng RNA and 23 jil MasterMix.
Oligonucleotide primers (Invitrogen, Carlsbad, CA) were inciuded in the reactions with
sequences as follows: PSA (accession number M26663, NCBI GenBank): 5’ GCC TCT CGT
GGC AGG GCA GT 3’ (forward), 5’ CTG AGG GTG AAC TTG CGC AC 3’ (reverse);
SRD5AI (accession number M32313): 5’GCG AGG AGG AAA GCC TAT GC 3’ (forward), 5’
CAG GGC ATA GCC ACA CCA CT 3’ (reverse) ; f3-actin (accession number M 10277): 5’ GTA
CCC TGG CAT TGC CGA C 3’ (forward), 5’ TAA CGC AAC TAA GTC ATA GTC C 3’
(reverse). Cycling conditions for PSA were as fol!ows; denaturing at 95°C for I mm, annealing at
58°C for 1 mm, extension at 72°C for 2 min for 35 cycles. Cycling conditions for SRD5A1 and
3-actin were as follows; denaturing at 95°C for 1 mm, annealing al 59°C for 1 mm, extension at
72°C for 2 min for 35 cycles. These conditions were chosen to produce amplified products in the
exponential phase, assuring semi-quantitative results were obtained.

2. 7. Statistical analyses

Ail treatments were performed in quadniplicate (growth inhibition experiments) or in

triplicate (immunobiotting and apoptosis experiments) per experirnent and each experiment was
performed three times independently. Ail densitometric analyses of immunoblots were expressed
as normalized means ± SDs. Statisticaliy significant differences 05
(*p<O. were determined using
)

87
one-way ANOVA with ‘l’ukey poslerlor test. 1C
50 values were calculaled using non-linear curve
fit analysis and are presented as means ± 95% confidence intervals, based on the average of 3
independent experiments. Ail analyses were performed using GraphPad Prisrn v5.03 (GraphPad
Software, San Diego CA).
3. Results
3. / Growth inhibitory and antiandrogenic e/j’cts ofpoinegranate compound
LNCaP celis, aftcr initial deprivation of steroids (24h), were exposed to the thirtecn
pomegranate compounds For 48 h, in the presence oFa growth inducing (0.1 iiM) concentration of
DuT. DuT (0.1 nM) alone stimulated ccli growth by 3-4 fold and control ceils increased in
number by about 2% (flot shown). Only four pornegranate compounds displayed a consistent
concentralion-dependent (3-100 iM) growth inhibition oC DHT-stimulaled LNCaP ceils. These
were EGCG, deiphinidin chloride, kaernpferol and punicic acid (Fig. 1), with 1C
50 values of 34 +

8, 38 + 7, 29 + 6, and 18 ±4, respectively. LNCaP ceils, conditioned in the sarne way as in the
growth inhibition experirnents, were incubated with increasing concentrations (3-100 jiM) of
EfGCG, deiphinidin chloride, kaempferol or punicic acid in the presence of 10 nM of DHT (the
DHT concentration required to produce a clear increase in AR protein in nucleus) for 24h. DHT
induced AR nuclear accumulation (deterrnined by immunoblotting) was inhibited by EGCG at
concentrations I O tM (Fig. 2A) and by deiphinidin chioride, kaernpferol arid punicic acid at a
concentration of 100 1
iM (Fig. 2B-D). None of the pomegranate compounds were cytotoxic when
tested in the absence of DHT (flot shown). In a parallel experiment using the sarne conditions,
total RNA was extracted and levels of PSA, SRD5AI and [3-actin mRNA were determined by
serni-quantitative RT-PCR. DHT-stirnulated expression of PSA and SRD5A1 was inhibited at
concentrations ?3 tM for punicic acid (Fig. 3D and H), and ?30 l.LM for EGCG (Fig. 3A and E)
iM for deiphinidin chloride (Fig. 3B) but without
and kaempferol (Fig 3C and G) and at 100 1
statistically significani effect on the expression of SRD5A1 (Fig 3F).
3.2. Do growth inhibitory poinegranate compounds induce apoptosis in LNCaP celis?
To test whether the decrease in cdl growth by these cornpounds was due to induction of
apoptosis, we determined LNCaP nuclear DNA fragmentation afier a 24h exposure to the four
pornegranate compounds (10, 30 and 100 jiM) in complete culture medium. EGCG and
tM in LNCaP celis. However punicic acid was the most
kaernpferol induced apoptosis above 30 1

88
potcnt compound since it induccd apoptosis al 10 i1V1 (Fig. 4) and was scicctcd for ftirthcr
cxpcrimcnts.
iM) in
Celis were treated with increasing concentrations of punicic acid (0, 3, 10, 30, 100 1
compicte culture medium for 24h. A reduction in Bc12 expression by punicic acid was seen at 30
and 100 tM indicating thal disintegration oC milochondrial structures had occurred resulting in
initiation oC the apoptotic pathway, likely via activation oC the caspase 9 cascade as we detected
caspase 9 cleavage (Fig. 5). Further evidences in favour of apoptosis wcrc chromatin cleavage
resulting in oligonucleosonial DNA fragmentation and cleavage oC PARP. PARP is one oC the
targets of active caspase-3 and punicic acid induced its cicavage into an 89-kDa fragment aftcr
24h of exposure, which was statistically significant at a concentration 30 iM. Punicic acid
further caused inactivation oC Akt via reduction of the active phospho-Akt-Ser 473 and reduced
iriactivation ofGSK-3(3 by decreasing the inactive phopho-GSK-313-Ser 9 at 30 M, afier 1h of
exposure (Fig. 6).

4. Discussion

Prostate cancer is an important malignant disease in men, particularly in western

countries. The number of new cases in United States in 2009 vas estimated to be aimost two
hundred thousand with an estirnated death toi! of almost thirty thousand (16). To prevent and
control this disease more effectiveiy, there is a need 10 identify chemopreventive approaches (17,
18) (11, 19). Pomegranate fruits, juices and extracts have been used extensively in ancient
cultures for various medicinal purposes (20). Pomegranate polyphenols are potent antioxidants
that have been shown both in vitro and in vivo 10 inhibit the growth of prostate and certain other
forms of cancer (21-23).
In Ibis study, we have demonstrated that 4 ouI of the 13 pornegranatc cornpounds we
tested (Table 1), EGCG, deiphinidin chloride, kaempferol and punicic acid had growth inhibitory
effects (Fig. 1) and pro-apoptotic activities (deiphinidin chloride excepted) (Fig. 4) in LNCaP
androgen-dependent human prostate cancer celis. Ail four compounds significantly inhibited the
expression levels of AR proteins in a concentration-dependent manner (Fig. 2), as well as
reducing the DHT-rnediated up-regulation of PSA and steroid 5ct-reductase SRD5A1 gene
expression in LNCaP ceils (Fig. 3). Inhibition of gene expression invo!ved in androgen
synthesizing enzymes and reduction ofnuciear AR levels may contribute to the growth-inhibitory
effects ofthese compounds.

89
 Thc LNCaP ceils express androgcn reccptors and Iheir growth is androgen-dependent.
Ccli growth rcquircs androgcn rcccplor activation and local steroid 5ci-reduction oC circulating
testosterone to produce the potent androgen DHT (24) which is an effective inducer of
transcription of PSA rcsulting in incrcased synthesis and secretion of PSA protein. Our study
shows ihat Cour pomegranate compounds are able 10 down-regulate the expression oC these AR
dependent marker genes in LNCaP ceils (Fig. 3), as well as reducing nuclear AR levels (Fig. 2),
indicating that these compounds flot only interfère with AR-dependent ccli growth but also affect
the conversion oC testosterone mb hie more potent dihydrotestoslerone. In the case of EGCG, our
findings contirm studies that have shown that catechins (EGCG) present in green tca,
polyunsatured fatty acids such as y-linolenic acid, ellagitannins, the flavonoids and lignans are
aiso inhibitors oC 5a-reductase (25-2 7). Although the structures oC EGCG and EG are very
similar only EGCG had significant antiandrogenic effects. This is likely due to the additional
clcctron donating hydroxy-group on the phenyl B-ring of EGCG, which increases the
clectronegative properties of this phenolic moiety. It is known that the interaction of DHT with
the ligand-hinding pocket oC the AR is driven predominantly by electrostatic bonds (28, 29).
Thus, the highly hydroxylated EGCG bas the greatest potential to interfere with the binding of
DHT to the AR. In support oC ibis, electron-spin resonance studies have shown that EGCG is
considerably more eicctrostaticaily charged than its epicatechin analogues that lack three
hydroxygroups on the B-ring (30). This study also showed that the gallate group (the
hydroxylated D ring — Table 1) had no influence.
The present study bas demonstrated that out of the 4 most growth inhibitory and anti
androgenic pornegranate compotLnds seiected, punicic acid was the most potent inducer of
apoptosis in LNCaP ceils (Fig. 4). It bas previously been shown to inhibit breast cancer
proliferation and induce apoptosis in MDA-MB-23 1 and MDA-ERalpha7 celis (31). Severai
apoptosis-associated genes or proteins have been shown to play critical roles in regulating
apoptosis. These include caspases, Bc12 Uamiiy members and PARP (32, 33). To determine
whether these proteins are involved in the mediation of punicic acid-induced inhibition of LNCaP
ccli growth, wc examined caspase activation and cieavage of PARP by Western blotting (Fig. 5).
Bc12 is an upstream effector molecule in the intrinsic apoptotic pathway and has been identified
as a potent suppressor of apoptosis [12]. Most cancers, including prostate cancer, generaily
overexpress Bc12 (34, 35) thereby escaping apoptosis and undermining effective therapy. Bc12

90
forms a heterodimer with the apoptotic protein Bax and neutralizes ils apoptotic cffccts. We
showed Ihat punicic acid, 11w mosl abundant Irienoic acid found in the pomegranate, sjgnificanlly
decreased Bc12 protein levels after a 24h treatment without affecting the level of Bax protein
(Fig. 5). These resulis suggest that punicic acid-induced apoptosis is mediated via down
regulation oC Bc12 anliapoptolic proteins together wilh an decreased Bc12/Bax ratio in LNCaP
cells. Alteralion oC this ratio is a decisive factor in whether ceils will undergo apOptoSis. We
found that punicic acid downregulates Bc12, which rcsults in cytochrome e release from the
milochondria. This initiales an apoptolic process by activation oC caspase 9 which once iniliated
goes on to cleave procaspase-3. Activated caspase-3 cleaves poly(ADP-ribose) polymerase
(PARP) and allows the degradation of DNA to continue. Taken together, these data clearly
indicate that punicic acid is an efficient inducer oC apoptosis via this pathway in LNCaP celis.
Apoptosis is a normal cellular fiinction that controls excessive proliferation by eliminating
unnecessary or damaged celis. Cancer celis have devised several mechanisms 10 inhibit apoptosis
and prolong their survival. Akt serves as one of the major anti-apoptotic factors in apoptotic
pathway. Akt is constitutively activated in LNCaP ceNs (36), therefore, it is possible that Akt
provides survival support In prostate cancer celis in the absence of androgens. Since we have
shown that punicic acid inhibits the phosphorylation of Akt, survival support of these cells is
eliminated and they are driven towards apoptosis (Fig. 6). The principal characterized
physiological substrate of Akt is glycogen synthase kinase-313 (GSK-3f3) (37), which was initially
identifïed as an enzyme that regulates glycogen synthesis in response to insulin (38). GSK-3f3 is a
ubiquitously expressed protein-serine/threonine kinase whose activity is inhibited by Akt
phosphorylation in response to growth factor stimulation. Here we show that GSK-313 is involved
in the regulation of apoptosis, identifying il as a critical downstream element of the P1 3-
kinase/Akt ce!! survival pathway (Fig. 6). Although, identification of the GSK-313 targets that
regulate apoptosis is a critical nexi step. Also, our observation that both Akt and caspase 9 are
associated with apoptosis induced by punicic acid brings up the question whether both pathways
are activated independently or that they interact.
Our findings confirrn studies that have shown that EGCG, delphinidin chloride, and
kaempferol have anti-tumor effects on prostate cancer celi une LNCaP (18, 39-46). However, we
are the first to show that punicic acid, which is the main trienoic acid in pomegranate seed ou,
has greater pro-apoptotic effects than EGCG, kaempferol or deiphinidin ch!oride. We postulate

91
that mixtures of the numcrous hiologicaliy active compounds in the pomegranate may have
additive or synergistic efiects resulting in more effective inhibition oC ccli growth than any one
single compound. As these compounds appear to have different/complementary mechanisms of
growth inhibi[ory action they could also be effective agents for Ihe treatment of both androgen
dependent and androgen-independent prostate cancer cells (47, 48). We wiil address the above
hypotheses in future studies. Future studies shouid furtherrnore focus on the bioavailabie
metabolites that are formcd and their biologically relevant concentrations in plasma and ideaily in
target organs ofinterest such as the prostate.
In conclusion, our resuits show that among several other compounds found in the
pomegranate, punicic acid bas a relatively potent growth inhibitoiy and antiandrogenic effect on
androgen-dependent LNCaP celis. This is also the first study to implicate Akt as a key mediator
of apoptotis induced by punicic acid. Impairment of the PI3KIAkt pathway by punicic acid
appears to be an important and relevant chemotherapeutic mechanisni against prostate cancer
growth.

Acknowledgements
We wouid like to thank Dave Lanoix, Patricia Rivest and Talai Oufkir for their technical
assistance with the experiments. We would also like to thank Dr Ephraim Lansky for bis
important advice. This work was supported financialiy by a Natural Sciences and Engineering
Council (NSERC) of Canada grant (No 313313) to Thornas Sanderson.

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96
 120.0

100.0
X

C 80.0
e
— EGCG
DeIphinidinchIoride
60.0
—A-— Kaempferol
.2
L —*— Punicic acid
40.0

c 20.0

0.0
O 1 3 10 30 100
Concentration (pM)

Fig 1

97
 A fl(IT(lOnM( B Dlii (10 nNl(
DM01) o 3 (1) 30 00 DM0)) 0 3 H) 30 ((1)) kD

II)) 110
AR AR
fl-actin I —
1
[3—actin
44

IiGCG concentration (iiM) Deiphinidin chloridc concentration QiM)

C 01H (lOnM( D DI1T(lOnM(

DM00 0 3 Hi 30 (0) kiH DM00 1) 3 0 30 (0) kD

AR

[3-actin
— — — — — I
I
AR

f3-actin
r —
—
——— — —
— •
— HO

-i-l

Kaenij,flruI concentration (pM) Punicic acid concentration (pM)

Fig 2

98
 A B
DHT(0.I iiM)
DHT(0.1 nM)
I)MSO O 10 30 100
DMSO o 3 10 30 100
PSA bp
PSA

e e e — P-actin — — — — —
— 250 bp
I ii

1)clphinidin clilonde concentration (pM

EGQG concentration (tM)

C
I)
fl14T(O I nM
DHT(0.I nM)
DMSO O 10 30 100 DMSO O In fl 100
PSA — — -
444 bn
PSA — — —

13-actin I1-aetin — — — — 250 b

Kaempferol concentration (iiM) Punicic aeid concentration (

M)
0

Fig 3

99
 E
F DI li’ (0.1 nM)
1)1 II’ (0.1 nfvI
DMSO (1 3 0 30 100
DMS(.) (1 3 1(1 30 100

— — SRD5AI 314 bp

(1-actin 250 bp
• —— e — - — -v-v —
Deipliinidi n chloride concentraLion (IL M)
EGCG conceiitratto ().tM)

G H
DuT (0.1 nM)
Dl IT (0.! nM)
DMSO 1) 3 0 30 100
DMSO 0 3 0 30 100
SRD5A I 314 bp
— -

Il-actin 250 bp
-
— -w www
Kaempferol concentration (i M) Punicic acid concentration QiM)

Fig 3 (suite)

100
 0.8

0.7

E
0.6

LI)
0.5
Q

0.2
z

0.1

0.0
0 10 30 100

Compound concentration (iiM)

Fig 4

101
 0 3 10 30 100 pM punicic acid, exposure24h

procaspase 8
— —
— — —— procaspase-9

Cleaved Caspase 9

e Cleaved PARP

— Bc12

—— Bax

GAPDH

Fig 5

LY24O’I2 Ci 3 iCi 3i1 M punicic acid, exposure 1h

pAKT (Ser473)

—-- -—-- --
AKT

*
. -— pGSK33 (Ser9)

----
F GSK33
4

GAPDH

Fig 6

102
Figures legends

Figure 1. The effect of EGCG, deiphinidin chloride, kaempferol and punicic acid on growth and
survivai of LNCaP celis. Celis were cuitured with increasing concentrations of pomegranate
compounds For 4 days (with a re-dosing aFter 48h, see section 2.3) in phenol red- and steroid-ftee
medium in the presence oC 0.1 nM oC DHT and ccli viabiiity was detennined by WST-l assay.
Negative control celis rcceived 1 jiL of DtVISO (and dernonstrated negiigible ccli growth; about
2% ofthat oCO.l nM DHT) and positive control ceils were exposed to I iiL oCDHT (0.1 nM) 10
stimulate ccli growth. The average ± SD ofthree independent experiments is shown. 1C
50 values
were calcuiated as described in section 2.7 and are iisted in section 3.1.

Figure 2. Nuclear leveis of AR protein. LNCaP celis were incubated with increasing
concentrations of (A) EGCG, (B) deiphinidin chloride (C) kaempferoi or (D) punicic acid in
phenol-red and steroid-free medium for 24h in the presence of 10 nM of DHT. Protein levels of
AR in the nucleus were determined by immunoblot analysis. Equal loading of proteins was
verified by stripping and reprobing the biots with f3-actin antibodies. Negative control ceils
received 0. I % DMSO and positive controi ceils were exposed to 10 nM of DHT in 0. 1% DMSO
to induce nuclear accumulation ofAR. Ail trcatrnents were norrnalized to the DHT control. The
densitometric analyses to the right represent the mean ± SD of three independent experiments,
where an (*) indicates a statistically significant decrease in nuclear AR levels (one-way ANOVA,
p<O.O5). An (*) above a bracket indicates ail four treatments were significantiy different from the
DHT control.

Figure 3. RT-PCR analysis of the expression of androgen-dependent prostate marker genes (PSA
and SRD5A 1 respectively) in LNCaP ceils treated with increasing concentration of EGCG (A, E)
deiphinidin chioride (B, F), kaempferol (C, G) or punicic acid (D, H) in phenol red- and steroid
free medium in the presence oC DHT (0.1 nM) for 24h. Total RNA was extracted and levels of
PSA and f3-actin mRNA were determined by RT-PCR. Negative control ceils received 0.1 %
DMSO and positive control cells were exposed 10 10 nM of DHT in 0. 1% DMSO 10 induce
nuclear accumulation of AR. Ail treatments were normaiized to the Di-IT controi. The
densitometric analyses to the right each represent the mean ± SD of three independent

103
experiments, where an (*) indicates a statislically signilicant dccreasc in cither PSA or SRD5A1
expression levels (onc-way ANOVA, p<O.05). An (*) above a bracket indicates ail four
treatments were significantiy (lifferent from the DHT control.

Figure 4. Apoptotic e(Tects of tGCC, deiphinidin chloride, kaempferol and punicic acid in
LNCaP ceils. Ceils in conipiete cuhure medium were exposed to the Four compounds For 24h.
Apoptosis was deterrnined by Ccii Death Detection EL1SA kit. The combination of three
independent experiences is shown. (*) Indicates slalisticaily significant ditTerence From vehicie
control (one-way ANOVA, p<O.05).

Figure 5. Punicic acid activales caspase-9 and mitochondriai apoptosis in prostate cancer celis.
Concentration-dependent caspase-9 processing anci cleavage of the caspase-3 substrate PARP
aftcr 24h treatment in LNCaP celis. One oC three experirnents is shown. The densitornetric
analyses to the right reflect the normalized average band intensities of ail three experirnents. (*)
Significantly ditTerent From DMSO control, one-way ANOVA, p<O.05.

Figure 6. Punicic acid decreased phosphorylation oC Akt at Ser473 (active form) above 10 .iM
and Ihat of GSK-33 al Ser9 (inactive forrn) al 100 .tM in LNCaP celis after a 1h exposure. The
PI-3-kinase inhibitor LY294002 (30 jiM) was used as positive control. One of three experirnents
is shown. The densitornetric analyses reflect the nonnalized average band intensities of ail three
experirnents. (*) Significantly different from DMSO control, one-way ANOVA, p<O.05.

104
‘Fable I ‘l’hc thirtecn poinegranate compounds uscd in this study, their predominant localisation
.

in the fruit and approximate concentrations.

Pomegranatecompound Approximate Source (12) Reference -

concentrations
Epicatechin 0.8 mg/L Juice with (49)
.OH peel

OH

‘OH

Epicatechin gallate 1.6 mg/L Juice with (49)

0H
peel
HOOâr

0H

“;OH

Epigallocatechin gallate Quantitative Juice with

OH
data flot peel, leaf
OH
available
HO ,L0[
OH

H OH

fOH

Delphinidin 237.8 mg/L Juice with (47)

OH (as glucosides) peel
, OH

HOl

Pelargonidin 5.9 mg/L Juice with (47)

OH (as glucosides) peel
OH

HO
OH

Cyanidin 181.3 mg/L Juice with (47)

. OH (as glucosides) peel
HO

105
‘fable I continued

Malvinidin Quantitative Juice with peei

OMe data flot
OH available
HOO
JOMe

joH
OH
Punicic acid 67-80% of ail Seed ou (50)
fattyacids
2
HO

L_____________
cis-Vaccenic acid Quantitative Seed ou
data flot
available
trans-Vaccenic acid Quantitative Seed ou
O
data flot
availabie

Quinic acid 002—6.72 gIL Juice with pee( (51)

OH
HOr>

HO’ OH
OH
Galiic acid Quantitative Juice, peel
O OH data flot flower
available

I
HO OH
OH
Kaempferoi Quantitative Juice, leaf
OH data flot

Ho:
I avaiiable

106
3.2 CHAPiTRE II: L’acide jacarique et ses géoisomères octadécatriénoïques
induisent l’apoptose dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine, une étude
méchanistique de la relation structurc/activité en 3-D

3.2.1 Traduction du résumé de l’article

Les acides gras non-essentiels provenant des plantes sont des nutriments alimentaires
importants. Certains ont été identifiés comme ayant des propriétés chérnopréventives contre différents
cancers comprenant le cancer de la prostate. Dans cette étude, nous avons déterminé l’effet cytotoxique
et apoptotique de sept acides gras C-18 sur différents types de cellules cancéreuses humaines. Ces
acides gras comprennent l’acide jacarique et punicique présents dans le jacaranda et l’huile des graines
de la grenade, respectivement, trois géoisomères octadécatriénoiques (l’acide alpha- et béta-calendique
et l’acide calalpique) et deux acides gras C-18 mono-insaturés (l’acide Irans- et cis-vaccenique).
L’acide jacarique et quatre de ces géoisomères octadécatrienoiques induisent sélectivement l’apoptose
dans les cellules cancéreuses de la prostate hormono-dépendantes (LNCaP) et hormono-indépendantes
(PC-3). En revanche, ils n’affectent pas la viabilité des cellules épithéliales normales de la prostate
(RWPE-l). L’acide jacarique induit la mort des cellules LNCaP de façon concentration- et temps-
dépendants, en activant la voie apoptotique intrinsèque et extrinsèque. Il en résulte le clivage de PARP
I, la modulation de la famille de protéines pro- et anti-apoptotique Bel-2 et une augmentation du
clivage de la caspase-3, -8 et -9. De plus une activation de la voie de signalisation de la mort cellulaire
impliquant le récepteur de mort cellulaire 5 a été observée. En revanche, l’acide jacarique induit
l’apoptose dans les cellules PC-3 via l’activation de la voie intrinsèque seulement. La confonnation
spatiale cis, trans, cis de l’acide jacarique et de l’acide punicique joue un rôle clé dans l’augmentation
de l’efficacité de ces deux acides gras en comparaison aux cinq autres acides gras C-18 testés. Des
analyses conformationelles et tridimensionelles utilisant la base de données PubChern
(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) montrent que la capacité cytotoxique des acides gras C-18 est reliée
à leur degré de similarité conformationelle vis-à-vis du composé cytotoxique de référence, l’acide
punicique. Ces similarités sont basées sur une forme optimisée (ST) et des scores de similarité (CT).

107
L’acide jacarique étant le plus proche hiologiquement de l’acide punicique (STST—opt 0.81; CTCT—
opt = 0.45). Cette analyse 3-D de la similarité entre les structures nous a permit de classer les acides
gras géoisomériques en fonction de leur potentiel cytotoxiquc. Contrairement une évaluation 2-D de
la position de la structure cis/trans qui ne le permet pas. Nos résultais méchanistiques montrent que les
acides gras non-essentiels provenant de l’alimentation, ont des propriétés biologiques et
chémopréventives. De plus, ils présentent une relation structure-activité en 3—D qui peut être exploitée
afin de développer de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement du cancer de la prostate et
cela indépendamment de la sensibilité aux hormones.

3.2.2 Contribution de l’étudiante

Toutes les expériences ainsi que la rédaction du manuscrit ont été réalisées par le premier auteur
de l’article. L’analyse 3-D a été réalisée par le Or Thonias Sanderson.

108
3.2.3 Jacaric acid and its octadecatrienoic acid geoisomers induce apoptosis selectively in
cancerous human prostate celis: a mechanistic and 3-D structure-activity study

Jihane Gasnii and J. Thomas Sanderson

Institut National de la Recherche Scientifique (INRS), Institut Armand—Frappier, Université du Québec,

Lavai, Québec, Canada

Corresponding author:

J. Thornas Sanderson, PhD

INRS-lnstitut Armand-Frappier

531 blv des Prairies

Lavai, Québec, Canada H7V 1B7

Phone: (450) 687-5010 cxl 8819 / Fax: (450) 686-5309

E-mail: thomas. sandersonaiafinrs.ca

Phytornedicine 2013 Feb 27.

109
011
Abstract

Piant-derived non-esscntial fatty acids are important dietary nutrients, and sorne are purported to have
chemopreventive properties against varions cancers, including that oC the prostate. In this sludy, we
determined the ability of seven dietary C-18 fatty acids to cause cytotoxicity and induce apoptosis in
various types of human prostate cancer ceils. These fatty acids included jacaric and punicic acid found
in jacaranda and pomegranate seed ou, respectively, three octadecatrienoic geometric isomers (alplza
and beta-calendic and catalpic acid) and two mono-unsaturated C-18 fatty acids (trans- and cis
vaccenic acid). Jacaric acid and four of its octadecatrienoic geoisomers selectively induced apoptosis in
hormone-dependent (LNCaP) and -independent (PC-3) human prostate cancer celis, whilst flot
afTecting hie viability oC normal hurnan prostate epithelial celis (RWPE-l). Jacaric acid induced
concentration- and tirne-dependent LNCaP ccli death through activation of intrinsic and extrinsic
apoptotic palhways resulhing in cleavage of PARP-l, modulation ofpro- and antiapoptotic Bel-2 family
of proteins and increased cleavage of caspase-3, -8 and -9. Moreover, activation of a ccii death
inducing signalling cascade involving death receptor 5 was observed. Jacaric acid induced apoptosis in
PC-3 celis by activation ofthe intrinsic pathway only. The spatial conformation cis, 1,-ans, cis ofjacaric
and punicic acid was shown to play n key role in the increased potency and efficacy of these two fatty
acids in comparison ho the five other C-18 fatty acids tested. Three-dimensional conformational
analysis using the PubChern Database (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) showed that the cytotoxic
potency oC the C-i 8 fatty acids was related to their degree oC conformational similarity to our cytotoxic
reference compound, punicic acid, based on optirnized shape (ST) and feature (CI) similarity scores,
with jacaric acid being most ‘biosimilar’ T0Pt
5
(ST 0.81; CTCT0Pt = 0.45). This 3-D analysis of
structurai similarity enabled us to rank geoisorneric fatty acids according to cytotoxic potency, whereas
a 2-D positionai assessrnent of cis/lrans structure did not. Our findings provide mechanistic evidence
that nutrition-derived non-essential fatty acids have chemopreventive biological activities and exhibit
3-D structure-activity relationships that could be exploited to develop new strategies for the prevention
or treatment of prostate cancer regardless of hormone dependency.

Keywords
Prostate cancer; jacaric acid; punicic acid; geoisomers; 3-D conformation; structure-activity; apoptosis;
intrinsic; extrinsic; death receptor; PubChem Compound Database.

111
 Background

Prostate cancer has become Ihe most freciuently diagnosed and the second leading cause oC
cancer-rclated dcaths among men in western countries. It is estimatcd that in the year 2012, over 241
thousand new cases wiIl be diagnoscd and more (han 28 thousand men wilI die from prostate cancer in
the Uniied States alone (Siegel et al., 2012). Early stage prostate cancer is often androgen-dependent
but if not successfully treatcd may progress to a hormonc-indepcndent form that is difficuit to treat and
resuits in increased mortality. Thus developing novel trealment options for prostate cancer at various
stages has become an important medical need. Pariicularly the use of safe and effective
chemopreventive agents could significantly reduce disease-related mortality. The focus of much
research has been on discovcry of natural cornpounds that may be used in the prevention of prostate
cancer.
It has been shown that apoptosis may be induced or inhibited by a variety of nutritional
compounds known to have health benefits including fatty acids (Yasui et al., 2006a; Yasui et al.,
2006b; Yasui et al., 2005). Many plant seed oils contain conjugated trienoic fatty acids in the form of
conjugated linolenic acids (Liu et al., 1997). Most conjugated fatty acids are 18-carbon cornpounds
originating from oleic, linoleic, linolenic aiid stearidonic acids. They occur in terrestrial plant lipids,
especially seed oils, and include dienes, trienes and telraenes.
The fact that high amounts of naturally occurring conjugated fatty acids such as conjugated
linolenic acids, which are geometric and positional isomers of linolenic acid, are present in certain
plant seed oils (Chishoim and Hopkins, 1967) indicates these fatty acids are far more available for
dietary purposes than previously thought. [or example, a/pha-calendic and jacaric acid are contained in
relatively high arnounts in pot marigold secd ou (62.2%) and blue jacaranda seed ou (36%),
respectively (Takagi and Itabashi, I 98 1).
In this study we examined the ability of seven dietary C-18 fatty acids to induce apoptosis in
hui-nan horrnone-dependent LNCaP and hormone-independent PC-3 prostate cancer celis, as well as
immortalized nonra1 prostate epithelial ceils (RWPE- 1). We choose two isomers of oleic aeid (trans
vaccenic and cis-vaccenic acid) and five isorners of linolenic acid (jaearic, punicic, alpha-calendic,
beta-calendic and catalpic acid), to determine possible (geo)isorneric differences in induction of
cytotoxicity of prostate cancer celis.

112
Materials and methods

Reagents

Jacaric, punicic, a!pha-calcndic, beia-calendic, catalpic, and /rans- and cis-vacccnic acid wcre
purchased From Larodan Fine Chemicals AB (Malmô, Sweden) (Table 1). AIl compounds were
dissolveci in [)MSO as l000-cold concentrated stock solutions. Punicic acid was used as positive
control sincc we prcviously showed it to induce apoptosis in LNCaP ceils (Gasmi and Sanderson,
2010).
Antihodics against Bd-2, Bax, cleaved caspase 8 (Asp 391), caspase 9, caspase 3, cleaved
PARP (Asp 214), Bad, phospho Bad (Ser136), Bid, FasL, Fas and FADD were purchased from Celi
Signaling Technology (Danvers, MA). Antibodies against death receptors DR4 and DR5 were
purchaseci from Millipore (Billerica, MA). Anti-J3-actin was purchaseci from Santa Cruz Biotechnology
(Santa Cniz, CA).

Ce!! culture

LNCaP, PC3 and RWPE-l (immortalized normal adult prostate epithelial cells) cells were
obtained from the Ainerican Type Culture Collection (Manassas, United States). LNCaP and RWPE-I
ceils wcre cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1%
HEPES, 1% sodium pyruvale and penicillin/streptomycm in a humidified atmosphere of 95% air and
2 at 37°C. PC-3 ceils were grown in 1:1 (v/v) Dulbeccos modifled Eagle medium/Hams F-12
5% C0
nutrient mix (DMEM/F12) supplemcnted with 10% FBS arid 1% penicillinlstreptomycin.

Ce!! viability

LNCaP, PC-3 and RWPE-l cells were seeded in 96-well plates (Fisher Scientific, Ottawa, ON)
at a concentration of I x 4 cells/well
o in 100 i1 of their respective complete culture rnediuin for 24h.
Cells were then exposed to the fatty acids (1, 3, 10, 30 and 100 jiM) for 24h; DMSO solvent (0.1%)
iM). A WST-1 cell viability assay (Roche Diagnostics, Laval, QC)
was used as negative control (0 1
was performed according to the manufacturer’s instruction. Absorbance was rneasured at 440 nm using
a Spectrarnax M5 multifunctional spectrorneter (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). LDH leakage as
a measure of celi membrane integrity and possible indicator of necrosis, was also assessed using a
Cytotoxicity Detection Kit (Roche Diagnostics).

113
Measuremen! ofapoptosis

LNCaP and PC-3 ceils wcrc sccdcd at a concentration of 0.5 x i0 cells/weIl in 100 iii of
complele culture medium in 96-well plates For 24h. The Fatty acids (0, 3, 10, 30 and 100 i.LM) were
added and the ceils were incubatcd for an additional 24h. A Ccli Death Detection EL1SA
5 kit
(Roche Diagnostics) was used foliowing the manufacturer’s instructions. The assay is a quantitative
immunoassay that detects the histone-associated DNA Fragments produced during apoplosis.

Western bio! analysis

Western biot analysis was carried out according to a previous study (Gasmi and Sanderson).
Ceils were seeded in 6-weIi CeliBind plates (Fisher Scientific) in complete culture medium for 24h.
Ceils were then exposed to fatty acids (0, 1, 3 and 10 i.LM) for 24h. Adherent ceils werc coilccted using
a ccli scraper, then rinsed in cold phosphate-buffered saline (PBS) thrce times followcd by
centrifugation al 700 g for 5 min. After removing the PBS, the ccii peilets were Iysed in RIPA buffer
containing lx protease and phosphatase inhibitor cocktail. Then, ccii lysates were centrifuged at 4°C,
15000 rpm for 1 5 min and protein concentrations (from the supernatant) were determined using a BCA
protein assay kit (Pierce Biotechnologies, Rockford, IL). Proteins (50 jsg) were separated on 10% SDS
polyacrylamide gel and then transferred onto PVDF membranes (Bio-Rad, Mississauga, ON). After
blocking with 5% non-fat dry muR reconstituted in Tris-buffered saline (TBS), the membranes were
incubated with appropriale primary antibodies at 1:250 to 1: 1000 dilutions in TBS overnight al 4°C.
Secondary anlibodies conjugaled with horseradish peroxidase at 1:5000 dilution in TBS were added for
1h at room temperature. Antibody-antigen complexes were visualized by Immobilon Western
Chernilurninescent horseradish peroxidase substrate (Millipore) using a Versadoc imaging system
(BioRad). Beta-actin was used as protein loading control.

Fluorescence rnicroscopy

LNCaP and PC-3 ceils were seeded in 24-well CeilBind plates (Fisher Scientific) in complete
culture medium for 24h. Ceils were then exposed to jacaric acid (0, 3, 10, 30 and 100 11M) for 0, 4, 6, 8
and 24h. Propidium iodide and Hoechst 33342 were added to each well (1 tg/well) and ceils were
incubated at 37°C for 10 min and then inspected by fluorescence rnicroscopy. Images were collected
with a Nikon Eclipse TE2000 inverted fluorescence microscope under 20x magnification. A filter cube
with an excitation waveiength range of 330-380 nm was used to visuaiize Hoechst-stained celis. Celis

114
stained with propidium iodide were visuaiized using a fiiter cube with an excitation wavelength oC 532-
587 nrn.

Statis1ici/ atialysc’s

Ail treai.menls wei-e perforrned in triplicate per experirnent and each experiment was perforrned
three times independently. Statislically significant dilTerences (* p < 0.05) were de(ermined using one—
way analysis of variance (ANOVA) with Tukey pos/erior test. Correlation coefficients wcre calcuiated
by the method oC Pearson (Zar, 1999). The concentrations at which 50% inhibition of ceil viability
50 values) were calculated using non-linear curve-fit analysis and presented as means
occurred (1C ±

95% confidence j ntervais of three independent experiments. The relationship between optim ized
50 values were evaluated by one-phase exponentiai decay curve fitting
similarily values and 1C
(commoniy useci (o describe the process of dissociation of a compound from a biological target). Ail
statistical anaiyses were perforrned using GraphPad Prism v5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Structure conforinational analyses

Structure conformational analyses were performed using the three-diniensionai (3-D) analysis
capabilities of the PubChem Compound Database deveioped by the US. National Institutes of Health
(ht://pubchem.ncbi.nim.ov) (Bolton et al., 201 la). The first ten most diverse conformations (of
which the firsi is the Iheoreticaiiy rnost energy—minimized conformation in a vacuum) (Boiton et ai.,
2011b Hawkins et al., 2010) ofeach fatty acid were compared to those ten ofpunicic acid. which was
chosen as reference molecule (Gasmi and Sanderson, 2010). The two types of resultant similarity
scores (we use the lerminology of (Bolton et al.) throughout), ST (shape-Tanimoto) and CT (color
Tanimoto), representing ‘shape-similarity’ based on overlap of molecular volume and ‘feature
similarity’ based on alignrnent of ‘compatible’ functional groups, respectively, were used to evaluate
the degree of similarity of the fatty acids to punicic acid. The ST and CT values obtained for ah
conformationai pairs of each pair-wise fatty acid comparison were evaluated for highest ST score (ST
optimized or ST0Pt), highest CT score (CT-optirnized or CT(I.0)t) or highest cornbined score
(ComboT(STT)0Pt) which is sirnply the highest ranking sum of ST and CT values. Two other possible
T0)t (ComboTST0Pt) or the sum of CTCT01Jt and ST(’ToIJt
comboT scores are the sum of STsT01)t and CT
5

(ComboTC’0). In our analyses, the CornboT’l)0P1 value obtained for each pair-wise fatty acid
comparison was the sarne as the ComboTST0pt value and this latter terni is used throughout.

115
 ConFormation-specific intra- and intermolecular distances (Â) hetween atoms were delermined using
PubChem 3D Viewer (Bolton et al., 201 la).
Resuits
Octadecatrienoic acid decrease viahility 0/ prostate cancer ceils bit! no! o/nor,nal celis
Five conjugated octadecatrienoic acids caused a concentration-dependent decrease in the
viabilily of LNCaP and PC-3 ceils, but not of RWPE-1 immortalizcd normal epithelial celis. These
were, in order of decreasing potency, punicic, jacaric, beta-calendic, catalpic and a/pha-calendic acid
(Fig. 1), with 1C
50 values (mean + SEM) of9.0 ± 1.2, 11.8 ± 1.0, 14.8 ± 1.1, 25.7 ± 1.9 and 36.3 ± 3.9
jiM, respectiveiy in LNCaP ceils. In PC-3 celis, punicic, jacaric, hela-calendic, catalpic and alpha
calendic acid had 1C
60 values of 1.6 ± 0.3, 2.2 ± 0.4, 3.5 ± 0.6, 5.2 ± 0.9 and 8.8 ± 1.2 fLM, respectively.
These 1C
50 values were strongly linearly correlated between LNCaP and PC-3 cells (r 0.990, n 5; p
<0.01) with a siope of 0.25 ± 0.021 indicating a 4-foid difference in sensitivity between the ccli types
to octadecatrienoic fatty acid-induced ceil cleath. Jacaric acid, together with punicic acid as we had
previously shown (Gasmi and Sanderson, 2010), were the most cytotoxic octadecatrienoic acids in
LNCaP and PC-3 ceils, whereas the mono-unsaturated cis- and !rans-vaccenic acid did flot affect ccii
viabiiity in any of the ccli lines.
Jacaric acic/ inchices (une— anS concentration—depencleni apoptosis ancl necrosis o/LNCaP and PC—3
ce lis
To asscss whether the octadecatrienoic acid-mediated decrease in ce!! viability was due to
induction oC apoptosis as we bac! shown previously cor punicic acid (Gasmi and Sanderson, 20 I 0),
DNA fragmentation in LNCaP and PC-3 ceils was rneasured aller a 24h cxposure to jacaric, punicic,
alpha-calcndic, beta-caiendic and catalpic acid in complete culture medium. A significant increase of
DNA fragmentation was caused by jacaric acid (and our positive control, punicic acid) in LNCaP and
PC-3 ceils at concentrations above 10 jiM (Fig. 2). Although an observed increase in DNA
fragmentation is an indication of apoptotic ccli death il does not preclude necrosis as a contributing
rnechanism. We found that punicic acid at 10 and 30 l.IM caused a significant increase of LDH leakage
from LNCaP and PC-3 ceils into culture medium (not shown), a measure of ccii membrane integrity
and indicator of necrosis, whereas jacaric acid did not. To avoid the influence of necrotic ccli death,
jacaric acid was selected for further analysis of octadecatrieonic acid-mediated apoptotic cell death.
Jacaric acid caused a concentration- and tirne- dependent increase of condensed nuciei observed by
Hoechst3342 staining in LNCaP and PC-3 ceils, resulting in about 50% apoptotic ccii dcath aller a 24h
exposure to 10 p.M in each ccli une (Fig. 3). Detaiied morphological analysis by fluoroscopy showed

116
that al concentrations oU jacaric acid oC 30 iIM or above, more necrosis than apoptosis was observed
with each ccli une, as detcrmined by propidium iodide staining (Fig. 4). Based on these observations,
we dccided to continue our investigations of the activation of the apoptotic rnachinery by jacaric acid
using concentrations oC 10 tM and below and an exposure lime oC 24h, to avoid influence oCnecrotic
effects.
.Iacaric Cicici i,uluces iiifïinsic apoptosis o/PC—3 celis and intrinsic and extrinsic apoptosis o/LNCaP
ce Ils
A reduction ofBci-2 expression by jacaric acid was seen at 10 11M inclicating that disintegration
of mitochondrial structures had occurred resulting in initiation of the apoptotic pathway in LNCaP
ceils. Jacaric acid (1-10 jiM) increased poiy ADP ribose polyrnerase-(PARP)-1 cleavage concentration
dependently in bolh LNCaP and PC-3 prostate cancer celis after a 24h exposure. Jacaric acid aiso
caused a strong concentration-dependent increase in cieaved caspasc-9 in both LNCaP and PC-3 celis.
Jacaric acid concentration-dependently increased levels of cIeaved caspase-8 in LNCaP ceils indicating
involvernent of the extrinsic apoptotic pathway in this prostate cancer cdl une (Fig. 5). Activation of
FADD and p15 Bid al 3 and 10 11M (Fig. 6) and involvement of caspase-8 prompted us to examine
whether death receplors piayed a role in jacaric acid-induced LNCaP ccli dcath. Indeed, jacaric acid
increased protein expression ofDR5 at 1, 3 and 10 1
iM but did not influence steady-state levels ofother
TNF receptors such as DR4 and Fas (Fig. 6).
Sfruc/ure—ac/it’ity analysis
In structure-activity analysis the aim is to relate the biological activity of compounds to their
moiecular structural properties. The five geoisomeric octadecatrienoic fatty acids in our study differed
3- b 5-fold in cytotoxic potency yet have identical physico-chemicai properties such as hydrophobicity
(XlogP3 6.6 ± 0.22), acid dissociation constant (pKa 4.78 ± 0.1) and polar surface area (37.3 À), as
well as identical measures of flexibility such as thirtcen rotatable bonds. However, a key difference
arnong geoisomers is their three-dimensional orientation and the differential influence this would have
on a putative 3-D interaction with a cellular target rnacromolecule, thus potentially explairiing
differences in cytotoxic potencies. We used this pharmacophore hypothesis to suggest that it is the
orientations of carboxylic acid group and hydrophobie carbon chain that are key to the biological
activities of the C-18 fatty acids. We performed a 3-D conformational analysis using the 3-D bols
provided by the PubChern Compound Database to obtain quantitative measures of overlap of structural
shape and features among our seven C-18 fatty acids (Table 2). Punicic acid, being the most cytotoxic
compound, was used as reference to which the degree of 3-D similarity of the other 6 fatty acids was

117
determined. This analysis showed that jacaric and punicic acid were ahle b attain 3-D conformations
with the closest structural and functional resemblance to each other (Fig. 7A), whereas the structure of
cis-vaccenic acid was most divergent from that of punicic acid (Fig. 7B). A correlation cxistcd between
the 1C
50 values oC the octadecatrienoic acids and tue optimal comhined structural similarity values
(ComboTS1)1) for shape (ST) and feature (CT) overlap with punicic acid (Table 2) in LNCaP ceils (r =

-0.870; n 4; p = 0.08) and PC-3 celis (r = -0.854; n = 4; p = 0.12). As Ihere is no reason 10 suppose
that cytotoxic potency is linearly dependent on optimizcd similarity scores, we performed a stalisticaliy
more informative non-linear correlation analysis and determined that cytotoxic potency was lost
exponentially with decreasing ComboTST0, STsT0 or CTc’01)t value in either ccli une and that iower
ST-opt ST-opt C’T-opl
plateau values for ComboT , ST and CT were approximated to be 0.97, 0.74 and 0.28,
respectiveiy (r
2 > 0.998; n = 5; each celi une).

Discussion

11 has becorne increasingly clear thal aitered apoptotic signalling plays an important role during
tumour deveiopment and resistance b prostate cancer therapies. Thus, the search for possible
therapeutic strategies involving the modulation of various apoptotic pathways has attracted
considerable interest in recent years. Naturai cornpounds have received increasing attention as possible
leads for the development of chemopreventive agents for Ireatment of prostate cancer. Indeed, some
naturally occurring conjugated fatty acids act as growth inhibitors and inducers of apoptosis of breast
and colon cancer celis (Suzuki et al., 2006; Yasui et ai., 2006a; Yasui et al., 2006b; Yasui et al., 2005).
Octadecatrienoic acid-induced apoptosis in prostate cancer celis
We are the first to show that five octadecatrienoic fatty acids, jacaric, punicic, alpha-calendic,
heta-calendic and catalpic, but flot two octadecaenoic (trans and cis-vaccenic) fatty acids (Table 1),
have growth inhibitory effects (Fig. I) in androgen-dependent LNCaP and androgen-independent PC-3
human prostate cancer ceils. Furthermore, these fatty acids were selective for tumorigenic cells, as thcy
did not affect the viability of immortalized, proliferating normal prostate epithelial RWPE-1 ceils.
Jacaric acid, a natural •fatty acid derived from jacaranda seed ou, is a potent and selective
inducer of apoptosis in hormone sensitive and hormone refractory prostate cancer celis. Decreased cdl
viabiiity by jacaric acid (Fig. 1 and 3) was associated with significantly increased DNA fragmentation
(Fig. 2), chromatin condensation (Fig. 4) and cleavage of PARP-1 (Fig. 5), indicating that apoptosis is
an important part of the mechanisrn by which jacaric acid in}iibits the growth of both types of prostate
cancer ceils, in the absence of necrotic ccli death, particulariy at concentrations of 10 j.tM and below.

118
l’iirihermore, hy perForming delailed concentration- and time—response experinlents (Fig. 3 and 4), we
could differentiate between apoptotic and necrotic ccli death induced byjacaric acid. This ailowed us to
cvaluate, spccificaily, the carly-stagc apoptotic mcchanisms ofjacaric acid-induccd prostate cancer ccli
death within a concentration and time range that avoided non-selective necrosis oC ceils caused by
concentrations that would be both mechanisticaily and dietarily irrelevant. Although littie is known
about dietary blood concentrations and fate of jacaric acid and its geometric isomers, a few
investigations of the absorption and metaholism of alpha-eleostearic (9Z,1 IE,13E-octadecatrienoic)
and punicic acid have been done in rats (Tsuzuki et al., 2006; Tsuzuki et al., 2004; Yuan et al., 2009).
Those studies found that the lnajorily of these two fatty acids was slowly absorbed in an unchanged
state in rat intestine and that part of each absorbed fatty acid was converted into 9Z, 11E-
octadecadienoic acid, al(hough Ibis conversion was slower for punicic acid (Tsuzuki et al., 2006). In
the case of a/pha-elcostearic acid, which was administered as the major constituent (68.9%) of 1 g of
tung ou, hoth intact and converted product were Found in biood plasma and liver 6 h after
iM, respectively
administration, with a/phu-eicostearic acid levels reaching about 500 and 900 1
(Tsuzuki et al., 2004).
The present study reports for the first time, sensitivity of LNCaP ceils 10 TRAIL receptor DR5-
mediated extrinsic apoptosis by jacaric acid (Fig. 6). LNCaP ceils are considered to be relatively
resistant to TRAIL-induced extrinsic apoptosis (Chdn et al., 2001) but may be sensitized by combined
exposure to TRAIL and certain chemotherapeutic agents (Voelkel-Johnson et ai., 2002) or natural
compounds (Shankar et ai., 2007). The rnechanisms by which TRAIL-resistance may be overcome
include inhibition of rnRNA synthesis (Chen et al., 2001), Akt signalling (Chen et al., 2001) and
proteosome ftrnction (Christian et al., 2009). Possible mechanisms by which jacaric acid increases
DR5-mediated apoptosis are currentiy under investigation.
lnterestingly, we show that PC-3 celis, which are considered 10 be more sensitive to TRAIL
induced extrinsic apoptosis than LNCaP celis (Chen et al., 2001), are also more sensitive to jacaric
acid-induced apoptotic celi death, although flot via the extrinsic pathway. One possibility is that jacaric
acid acts on a target to overcome resistance to DR5-mediated apoptosis in LNCaP celis that does not
(or to a lesser extent) play a role in PC-3 cclis. This larget could be the unique rnechanism ofcross-talk
between the Akt and androgen receptor (AR) signalling pathways, which conveys a certain degree of
resistance 10 LNCaP ceil apoptosis by maintaining levels of survival-related signaling rnolecules,
importantiy those ofp2l (Gartel, 2009; Gorospe et aI., 1997), which is AR-regulated (Kadowaki et al.,
2011). This cross-talk mechanism does flot exist in AR negative PC-3 ceils. Akt is known to be

119
 constitutiveiy active in LNCaP celis and we Ihunci it lu be inhibited by punicic acid (Gasmi and
Sanderson, 2010), although whcthcr this lcd to caspase $ activation was not determined. Another
important protein lacking in PC-3 celis is p53, which is expresscd functionally in LNCaP ceils.
However, we did not [md jacaric or punicic acid 10 increase p53 activity or ils phosphorylalion al
serine-15 in LNCaP cefls (flot shown); nor did they increase Bax or Fas in LNCaP ceils (Fig. 5) as
would be expected (Li et ai., 2003). 11 is possible that the increased sensitivity of PC-3 celis to our fatty
acids is in part due to absence of p53 expression, whereas in LNCaP celis functional p53 protein may
give those ceils more opportunity for repair, thus rendering them more resistant to apoptosis, (Scott et
al., 2003). RWPE-1 celis also contain wild type p53 yct were not susceptible (o jacaric acid-induced
apoptotic ccli death, suggesting in une with other studies (Skjoth and lssinger, 2006) that p53 status is
flot the major determinant orsensitivity b chernicai-induced ccli dealli. The exact criteria that influence
p53 to stimuiatc ccli cycle arrcst and DNA repair or apoptosis (extrinsic or intrinsic) are stili not well
understood and whether p53 piays a permissive or restrictive role (or any role) in jacaric acid-induced
apoptosis in our prostate cancer ccli unes warrants ftirther studies.
In any case, the greater sensitivity of PC-3 ceils to jacaric acid-induced apoptosis, where
extrinsic apoptosis does flot play a role, is cleariy related to the ability of this fatty acid b disrupt
mitochondriai function. How the relative balance of prosurvival and proapoptotic signais ultimately
contributes 10 the sensitivity or resistance of LNCaP and PC-3 ceils b undergo apoptosis by either
extrinsic or intrinsic apoptosis is a complex and not fully understood process.
The abiiity oCjacaric acid b activate intrinsic apoptosis in both LNCaP and PC-3 prostate
cancer celis may be reiated to increased lipid peroxidation as observcd by Shinohara and coworkers in
DLD-1 human colorectai adenocarcinoma celis (Shinohara et ai., 2012), aiteration ofceliuiar fatty acid
composition or altered regulation oC expression oC certain genes (Hockenbery et al., 1990). It bas been
reported that ovcrexpression of Bel-2 in transgenic models leads to protection of rnany ccli types
against apoptosis induced by a variety of oxidative stresses, including lipid peroxidation (Hague et ai.,
1997; Pourzand et al., 1997; Reed, 1994). Studies have also shown an elevated expression ofBcl-2 in
neoplastic human prostate tissues (Colombel et al., 1993) and sincejacaric acid, as wefl as punicic acid
(Gasmi and Sanderson, 2010), inhibit Bel-2 expression in LNCaP celis (Fig. 6), they act as
antineoplastic agents in these prostate cancer celis.
Sfructure-activity relationships ofocladecafrienoic acids
Jacaric and punicic acid stand out from the other linolenic acid isorners as the inost potent
cytotoxic agents and their effectiveness is evidently related to certain similarities in 3-D molecular

120
structure. Although ail five studied octadecatrienoic acids have three conjugated double-bonds, oniy
jacaric and punicic acid each have these double bonds in a cis-trans-cis conformation. Our 3-D
conformationai analyses using the PubChem Compound Database conflrrn that jacaric acid resembled
the most cytotoxic reFerence compound punicic acid more [han the other octadecatrienoic Fally acids
based on various simiiarity scores (Fig 7 and Table 2). This observation is consistent and not consistent
with an earlier study of conjugated octadecatrienoic acids that conciuded that 9, 11, 13 fatty acids were
systematically more cytotoxic than 8, 10, 12 geoisomers in hurnan monocytic leukemia cells (Suzuki et
al., 2001). They did Hot include the 8, 10, 12 geoisomerjacaric acid in their study and we found jacaric
acid [o be more cytotoxic [han the 9, 11, 13 geosiorner catalpic acid, and that this could be predicted
from the ranking of their optirnized 3-D sirnilarity scores relative to punicic acid. Another study
reported that, arnong seven geoisomeric octadecatrienoic fatty acid, jacaric acid was the rnost cytotoxic
compound (1C
50 3.4 tM) and punicic acid the weakest (1C
59 7.9 tM) (Shinohara et ai., 2012). As
the 1C
50 values of ail other geoisomers feu between these two values and no variabiiity in these values
were reported il is unclear if any statistically significant differences in potcncy werc observed in DLD
I celis. The investigators conciuded that [bey couid flot find a clear reiationship between structural
differences of the conjugated triene system and cytotoxic effects. in our present study, we have
addressed this question and our findings provide strong evidence that 3-D molecular structure is a far
more useful iredictor of biological aclivity [han a 2-D assessmenl of structure based on cis/lrans
comparisons.

We should keep in mmd that similarity scores ai-e meaningful only with intimate knowledge of
the nature of the molecules under study and caution should be taken in interpreting their values. Trans
vaccenic acid exhibited no cytotoxicily in our human prostate cancer ceils yet had reasonably high
shape (ST
T0T)t
5 0.72) and feature (CTCT0T)t = 0.36) overiap with punicic acid (Table 2) and had a
cornboTSToPt score of 1.01, which was greater than that of, for example, alpha-calendic acid
(colnboTST0 0.97). Other physico-chemical differences between trans-vaccenic acid and the
octadecatrienoic acids such as hydrophobicity (XlogP3 6.4 ± 0.1) and acid dissociation constant (pKa
= 4.77 + 0.1) are flot significantly different. However, a visual examination using PubChem Compound
of the 3-D conformations of trans-vaccenic acid that resulted in optimal sirnilarity values when
superposed on punicic acid cleariy showed that either the superposed carboxylic acid groups had
opposite orientations (when shape-optimized; Fig 8B) or the C-18 carbon chains were divergent (when
feature-optimized; Fig 8C), thus forrning wedge shaped superpositions. Such deviations from the
structural orientation of punicic acid were flot observed with the octadecatrienoic acids, which had

121
superpositions with aligned carboxylic acid groups and tightly convergent C-18 chains (e.g. alpha
calendic acid in Fig 8A). In fact, the CT-optirnized intermolecular distance between the C-18 atoms of
punicic acid and trans- or cis-vacccnic acid were 6.19 Â (Fig 7C) and 6.89 Â (not shown), respectively,
whereas it was on average 1 .09 + 0.2() Â (n=4) ftr hie octadecatrienoic acids (distance indicated For
alpha-calendic acid in Fig 8A).
1h is also apparent that even among struclurally highly similar compounds the relationship
between optimized sirnilarily scores and biological activity is flot linear and that achivity clecreases
rapidly with decreased ST or CT score. The calculated plateau values of ST ST-op( (0.74), CT CT-opt (0.28)
and comboTSToIl (0.97) SuggeSt that scores ah or below these values have littlc relevance in assessing
biological activity, at least ofthis series of octadecatrienoic acids. In this context it is interesting to note
that a con Formational analysis of the overlap oC punicic acid with itself produced an STsT0 value of
0.73 and CT0lt value of 0.23 for the closest two different diverse conformations within the same
molecule. These values are below the empirically determined plateau values and below those obtained
when punicic acid is superirnposed on the other octadecatrienoic fatty acids. Taken together, when
similarity scores are interpreted sensibly, it is clear that the PubChem Compound Database provides
numerous 3-D bols and a wealth of information useful for the detailed assessment of 3-D molecular
structure and its relation to experimentally determined biological activities. We demonstrate in the
present study that these tools are extremely useful in evaluating relationships between 3-D molecular
structure and cytotoxic potency of a series of naturally occurring, plant-derived C-18 fatty acids, by
being able to discriminate among molecules with otherwise (almost) identical physico—chemical
properties.

Competing interests
The authors declare to have no competing interests.

Acknowledgernents
We would like to thank Alexander Goldberg for his technical assistance with the experirnents.
We would like to thank Moharned Touaibia (University of Moncton, NB) for his calculations of
physico-chernical constants. This work was supported financially by a Natural Sciences and
Engineering Research Council (NSERC) of Canada grant (No 313313) to JTS.

122
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125
Table 1. Seven naturally occurring C—18 fatty acids used in this study with their sources of high

accumulation.

Fatty acid IUPAC name Molecular structure Higli accumulator

iacaric (SZ, 10E,! 2Z)—octadeca— Jacaranda iniinosifolic,

8,10,12-Irienoic acid seed ou (62%) (Takagi
and Itabashi, 1981)
Punicic (9Z, I I E, I 3Z)-octadeca- Punica granaluin sced
HO

9,1 1,1 3-trienoic acid ou (67-80 %) (El

--

Shaarawy and
Nahapetian, 1983)
alpha-Calendic (8E,! 0E,! 2Z)-octadeca- Calendula officinalis
8 10 !2-trienoic acid seed oi! (60 %)
H0
(Chishoim and
Hopkins, 1967)
beia-Calendic (8 E, 10E,! 2E)-octadeca- Calendula officinalis
8,10,1 2-trienoic acid seed ou (minor)
(Chishoim and
Hopkins, 1967)
Catalpic (9E, I 1 E, I 3Z)-octadeca- j OH
Catalpa bignonioldes
9,1 1,13-trienoic acid seed ou (25.5 %)
(Ozgul-Yucel, 2005)
trans-Vaccenic (E)-octadec- I I -enoic MiIk fat (data
HO
acid
.

unavailable)
(Destaillats et al., 2005)
cis-Vaccenic (Z)-octadec-1 1-enoic Sea buckthorn bernes
acid (data unavailable)
(Yang and Kallio,
2006)

126
Table 2. Optimized similarity scores obtamed using the PubChem Compound Database cor the 3-D

structural companson oC six C—18 fatty acids wilh punicic acid (sec Materials and Methods).

PubChem CID Fatty acid ’° a)

5
ST
t CTdT0t a) CornboTS0 b) CornboToj)t

5281126 Punicic 1 1 2 2

5282817 Jacaric 0.81 0.45 1.18 1.07

5282818 alpha-Calendic 0.74 0.23 0.97 0.97

5282819 heia-Calendic 0.76 0.31 1.06 1.01

5385589 Catalpic 0.74 0.34 0.99 0.92

5281127 trans-Vaccenic 0.72 0.36 1.01 1.01

5282761 cis-Vaccenic 0.67 0.16 0.73 0.52

a) The underlying calculations, assumptions and meaningfulness of optimized sirnilarity scores shape

tanirnoto (ST01l) and color-tanimoto (CT0Pt) are reviewed(Bolton et aI., 201 la; Bolton et al.,

2011b,c,d)

b) The obtained CornboTST0pt scores had the same values as CornboTT +CT)opt scores.

127
Figure 1.

LNCaP PC-3 RWPE-1

200 200 20O

Concentration (pM) Concentration (pM Concentration (pM)

—i 1—jacaric acd — —punicic acid —.—alpha calendic acid —.--beta calendic acid
—— catapic acid —Â--trans-vaccenic acid — — cis-vaccenic acici

128
Figure 2.

PC-3
—C—JacrIc cid
**

O -- - 1
O ---catalpicacid
0 1 10 100 O 1 10 100
Concentraton (pM) Concentratioi (pM)

Figure 3.

100 100

80 80

LNCaP PC-3

Concentration (jjM) Concentration (IJM)

129
 t ) :I (ttçrl t ) :i:
.2 -2

:
ç: i i
‘:4
j I _: __i_:ç jrI n I ) :i: :u:J
j)UI %
U%VJ
DO%F]
dDN1
£-Dd
Il Hill
•J7 IllIJ
Figure 5.

LNCaP 0 1 3 10 (iJM) Jacaric acid, exposure 24h

Cleaved caspase 8

Cleaved caspase 9
A!

r : Cleaved PARP

13-Actin

PC-3 0 1 3 10 (pM) Jacaric acid, exposure 24h

L Cleaved caspase 8

_____
L- -

Cleaved caspase 9

L Cleaved PARP

f3-Actin

131
 -

01 r’

o
I-
- z
C)
-U
c)

U D D mm

D I-

- F’)
c_ri r’)

-U
-ÇD
c)

c)

_ w w D c mm

g F3X
D
D
Figure 7.

133
Figure 8.

134
Figures Iegends

Figure L Effcct of seven C-18 fatty acids on the viability of (from Ieft to right) LNCaP and PC-3
human prostate cancer ceils and RWPE— I irnmortalized human prostate epithelial celis, aCter a 24h
exposure. Negative control ceils received 0.1% DMSO. The average ± SD of three independent
experiments is shown; each experiment was performeci in triplicate. 1C
50 values were calculated by
GraphPad Prism and are Iisted in section 3.1.

Figure 2. DNA fragmentation induced by five octadecatrienoic acids in LNCaP (left) and PC-3 (right)
human prostate cancer celis (24h exposure). Negative control ceils received 0.1% DMSO. The average
+ SD oC three independent experirnents is shown; each experirnent was performed in triplicate.
Responses marked with an asterisk were significantly different from control (* p<O.O5; **
p <0.01).

Figure 3. Jacaric acid-mediated concentration- and time-dependent loss of intact LNCaP (left) and PC-
3 (right) celis. Intact ceil morphology was assessed quantitatively by fluorescence microscopy as
described in Materials and Methods. Negative control ceils received 0.1% DMSO. The average + SD of
three independent experiments is showa; each experiment was performed in triplicate.

Figure 4. Jacaric acid-medïated concentration- and time-dependent increase in apoptotic and necrotic
LNCaP (left) and PC-3 (right) ceils. Apoptotic nuclear morphology (chromatin condensed nuclel, CC)
was observed after Floechst 33258 staining using fluorescence inicroscopy. Celis were also stained with
propidium iodide (PI) to distinguish apoptotic from necrotic celis and determine the percentage of each
celI population.

Figure 5. Jacaric acid induces caspase-8, -9 and PARP cleavage in LNCaP (top) and PC-3 (bottom)
celis. Ceils were exposed, in complete culture medium, to 1, 3 and 10 iMjacaric acid for 24h. Cleaved
PARP, caspase-8 and -9 were detected by western blotting. One representative experiment of three is
shown.

Figure 6. Jacaric acid activates extrinsic apoptosis via death receptor 5 in LNCaP ceils. One
representative experiment ofthree is shown.

135
Figure 7. Conformational superposition oC punicic acid on (A) jacaric acid (STsI0 0.81) or (B) cis—
vaccenic acid (STsl0 = 0.67) demonstrating the importance of 3-[) structural orientation in the
cytotoxic activity of C-18 fatty acids. Jacaric acid was abic to align its carboxylic acid group and C-18
carbon chain closely In those oCpunicic acid (A), whereas cis-vaccenic acid (B) was not.

Figure 8. Optimized conformalional superpositions of punicic acid on (A) a/pha—calendic acid (ST0Jt
= ST(’ToT)t
0.74; CT(’T011 = CT
T0Pt
5 ° = 0.72; CTs
0.23), (B) lrans-vaccenic acid (ST
5 01)t
1 0.29)
or (C) trans-vaccenic acid (CTCT0P1 = 0.36; STc0 = 0.65), demonstrating the necessity of visual
evaluation of 3—D structural superpositions, despite relalively high similarily scores. Although
conformational superposition ofpunicic acid on non-cytotoxic trans-vaccenic acid (B & C) resulted in
combined sirnilarity scores that were greater than those resulting rrom superpostilon ofpunicic acid on
the cytotoxic alpha-calendic acid (A), the orientation of the paircd carboxylic acid groups were either
opposite to each other (when ST-optimized; see B) or the paired C-18 atoms were signiflcantly further
apart from each other (when CT-optimized; sec C).

136
4 DISCUSSION GÉNÉRALE
 Les Facteurs environnementaux, et plus particulièrement, le régime alimentaire, jouent un

rôle important dans le développement du cancer de la prostate. Les traitements actuellement

proposés présentent des eFFets secondaires indésirables en plus d’induire une résistance des
cellules cancéreuses au boul de quelques années de traitement. La Prévention alimentaire est
donc une alternative intéi-essante. En effet, l’identification de molécules potentiellement
bioactives aux propriétés préventives et anti-cancéreuses devient Fondamentale.
Nous avons étudié l’effet antiprolifératif de composés naturels extraits de la grenade sur
les cellules cancéreuses de la prostate. Afin de réaliser nos travaux, nous avons choisi de
privilégier différents modèles cellulaires et des expériences in vitro. En effet, le modèle animal
ne répond pas à toutes les conditions nécessaires à cette étude. Il devrait présenter les mêmes
situations cliniques que celles rencontrées chez l’homme c’est-à-dire que la tumeur devrait être
d’origine humaine, avoir un temps de doublement relativement lent mais suffisamment rapide
pour permettre des études dans des délais raisonnables, être androgène-dépendante, produire le
PSA, créer des métastases ganglionnaires et osseuses, et progresser vers un état androgéno
indépendant après castration [325]. De plus, il faut savoir que le cancer de la prostate varie chez
l’homme d’une tumeur à une autre et cela en terme d’agressivité, de sensibilité aux androgènes et
d’aspect histologique. Il n’est donc pas réaliste de créer un modèle d’étude chez l’animal qui
puisse répondre à toutes ces conditions. De plus, le cancer de la prostate est très fréquent chez
l’homme. Cependant, il apparaît rarement de manière spontanée chez l’animal. Il existe
néanmoins plusieurs modèles de cancer de la prostate chez le rongeur qui ont permi d’identifier
l’hétérogénéité cellulaire tumorale, les mécanismes d’hormono-résistanee et le pouvoir
métastatique. Néanmoins, tout principe oncologique découvert sur une tumeur chez l’animal doit
être étendu et validé sur des tumeurs humaines. C’est pourquoi nous avons réalisé la majorité de
nos expériences sur la lignée tumorale prostatique humaine LNCaP. Cette lignée fait partie des
rares lignées cellulaires du cancer de la prostate androgéno-sensibles disponibles à l’heure
actuelle. 11 existe d’autres Lignées cellulaires androgène-dépendantes comme la ALVA-3 1 [326]
et la ALVA-4l [327] qm sont moins répandues.

Les LNCaP ont été isolées d’un ganglion sous-claviculaire métastatique d’un homme de
50 ans ayant un adénocarcinome prostatique [328]. Les cellules LNCaP expriment le récepteur
aux androgènes et aux oestrogènes. Le AR présente une mutation 868
(Thr est remplacée par une

) dans le domaine de liaison au ligand, ce qui lui confère une plus grande affinité pour les
868
A1a

139
androgènes, les anti—androgènes et les oestrogènes [329]. La prolifération des cellules LNCaP est
importante en présence d’androgènes de même que l’expression du PSA [3301. De plus, toutes
les enzymes clés impliquées dans le métabolisme des androgènes sont présentes à l’exception de
la 5 a-réductase de type Il. Enfin, ces cellules peuvent croître facilement en culture [331, 332].
Toutes ces caractéristiques font des LNCaP la lignée cellulaire la plus étudiée et la mieux
caractérisée en termes de cellules cancéreuses de la proshtte AR positive [333].

Nous avons également travaillé sur la lignée cellulaire PC-3 afin d’identifier les effets (les
composés naturels à un stade plus évolué du cancer de la prostate. En effet, ces cellules ont été
établies à partir d’une métastase osseuse d’un homme de 62 ans ayant tin adénocarcinome
prostatique de grade IV et ayant suivi une hormonothérapie [334]. Ces cellules ne répondent piis
aux androgènes, aux glucocorticoïdes, u aux facteurs de croissances. Elles n’expriment pas le
AR et le PSA et ont une faible activité dc la SRD5A [334]. Pour cette raison elles ont été
utilisées pour déterminer les changements biochimiques advenant dans les cellules cancéreuses
de la prostate à un stade avancé et étudier leur réponse suite à un traitement chimiothérapeutique.

La lignée PC-3 est l’une des lignées les plus utilisée en recherche en plus de la lignée
DU 145. Cependant, il existe d’autres lignées cancéreuses androgène-indépendantes, moins bien
caractérisées, telles que les EB-33 [335], PC-93 [336], TSU-PR1 [337], JCA-l [338], ND-1
[339], PPC1 [340], et DuPro-l [341].

Les lignées PC-3 et DU-145 peuvent être cultivées facilement in vitro et peuvent produire
des carcinomes peu différenciés après inoculation sous cutanée chez la souris irninunodéficiente.
Cependant, aucune de ces lignées cellulaires ne répond aux déprivations androgéniques et
aucune n’exprime le AR, ne présente d’activité 5 u.-réductase ni ne produit de PSA. Ces lignées
ont permis de créer des sous-lignées cellulaires à pouvoir métastatique vers des organes sélectifs
chez la souris immunodéficiente [342-344]. Elles sont donc plus adaptées à une étude qui
privilégie les mécanismes moléculaires liés au pouvoir métastatique des cellules du cancer de la
prostate [344].

Les cellules RWPE-l ont été utilisées afin de déterminer l’effet cytotoxique des
composés naturels testés sur les cellules épithéliales normales de la prostate. En effet, ces
cellules proviennent de la zone périphérique d’une prostate adulte histologiquement normale
transfectée avec un papilloma virus humain 18 (HPV-18) et exprimant le PSA et le AR. Nous

140
avons choisi ces cellules parce qu’elles ont les caractéristiques des cellules normales et
représentent un bon modèle pour étudier la régulation de la croissance prostatique et la
carcmogenèse. De plus, ce sont les cellules nonnales les mieux caractérisées disponibles
actuellement [345].

Est-ce que l’effet chimiopréventif des composés naturels extraits de la grenade, capables
d’inhiber la croissance des cellules androgènes-dépendantes, se traduit par un effet
antiandrogénique?

Les androgènes, et plus particulièrement la DHT, sont indispensables à la croissance et au

développement du cancer de la prostate. En effet, dans la prostate, la testostérone est convertie en
DUT par la SRD5A1 et 2 et a une grande affinité pour le AR [16]. Lorsque la Di-IT se lie au AR,
le complexe pénètre dans le noyau de la cellule et se fixent sur l’ADN de certains gènes cibles,
ce qui en modifie l’expression [20-22]. Les gènes ainsi régulés codent pour des protéines
impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires, et en particulier la division cellulaire et
l’expression du gène codant pour le PSA [23-27].

Pour déterminer l’effet chimiopréventif des composés naturels extraits de la grenade sur
les cellules cancéreuses de la prostate, nous avons tout d’abord déterminé leurs effets sur les
cellules cancéreuses androgènes-dépendantes LNCaP qui ont les caractéristiques du cancer de la
prostate à ses débuts. En effet, nous avons testé différents composés purs extraits de différentes
parties du fruit et appartenant à différentes classes chimiques (acides hydroxybenzoique,
anthocyanidines, acides gras conjugués et non conjugués, flavan-3-ols et fiavonol glycoside) et
avons identifié 4 composés, l’épigallocatéchine gallate (EGCG), le deiphinidine chloride, le
kaernpférol et l’acide punicique, capables d’induire un effet antiprolifératif dans les cellules
androgènes-dépendantes LNCaP stimulées par la DiIT. Ces composés inhibent l’expression du
AR nucléaire de façon dose-dépendante et diminuent l’expression des gènes codant pour la
SRD5A1 et le PSA.

Les cellules LNCaP ont besoin d’androgènes pour leur croissance ainsi que pour
l’activation du AR. De plus, la testostérone doit être convertie en DHT par la SRD5AI [346]

141
pour permettre la transcription du gène codant pour le PSA. Nous avons montré que quatre

composés de la grenade étaient capables d’inhiber l’expression des gènes cibles du AR dans les
cellules LNCaP en induisant une diminution de la quantité de AR nucléaire. Ces composés
influencent non seulement la croissance cellulaire AR dépendante, mais aussi la conversion de la
testostérone en DI-iT. De plus, nos résultats confirment des travaux qui ont montré que les
catéchines (EGCG) présentes dans le thé vert, ainsi que certains acides gras polyinsaturés comme
l’acide linolénique, les ellagitannins, les flavonoides et les lignines sont aussi des inhibiteurs de
la 5a-réductase [347-349]. Les travaux de Iguchi et al. (2012) ont également mis en évidence les
effets antiandrogéniqucs d’analogues du resveratrol sur les cellules LNCaP [350]. Cet effet
antiandrogénique se tiaduit par une inhibition du Akt. Ils expliquent cette inhibition par une
surexpression de PTEN qui est un inhibiteur de Aki ou par une inhibition de la voie PI3KJAkt
via le facteur de croissance EGF. Cependant, ni le resveratrol ni ses analogues ne présentent des
effets sur l’expression protéique du AR. Les auteurs expliquent cela par la faible concentration
du composé utilisé (10 LM). Cependant, nous avons montré une diminution de l’expression du
AR à la même concentration avec l’EGCG. D’autres travaux montrent une inhibition de la
phosphorylation du AR par Akt suite à l’exposition des cellules LNCaP à des extraits de
champignon comestible, le Coprinus comatus [351]. En effet, le AR subit des modifications
post-traductionelles. Il est phosphoiylé par Akt sur la Ser 210/2 13 et la Ser 790cc qui le stabilise
et le protège de la dégradation protéolytique. Lorsque Akt est inhibé, la dégradation du AR par le
protéosome est favorisée. De plus, la voie Pl3KIAkt permet la survie des cellules cancéreuses de
la prostate lorsqu’elles sont déprivées en androgènes [352]. Cela pourrait expliquer la diminution
de l’expression du AR et du Akt observée dans notre étude.

Les travaux de Chuu et al. (2009) montrent des effets antiprolifératifs de l’EGCG sur les
cellules LNCaP à partir de 80 1
iM [353]. Ils montrent également une inhibition de la croissance
tumorale et de l’expression du PSA suite à une injection intrapéritonéale de l’EGCG dans des
souris TRAMP. Nous avons montré que quatres composés de la grenade, EGCG, delphinidine
chloride, acide punicique et kaempferol, présentaient des effets antiprolifératifs sur les cellules
LNCaP avec un 1C
50 inférieur à 40 i1
M. Cette concentration est plus faible et plus pertinente que
celle utilisée par l’équipe de Chuu dans le cas d’une étude in vivo.

142
Est-ce que l’inhibition de la croissance des cellules cancéreuses hormono-dépendantes et -

indépendantes, par les acides gras conjugués, fait intervenir d’autres voies cellulaires
indépendantes de la voie androgénique?

La voie PI3K/Akt joue un rôle important dans la croissance cellulaire, la survie,

l’adhésion et la migration dans différents types de cellules. Elle est constitutivement activée dans
les cellules cancéreuses de la prostate androgène-dépendantes LNCaP [354]. tille permet aux
cellules de survivre lorsqu’elles sont déprivées en androgènes. C’est également l’une des voies
de signalisation qui permet aux cellules cancéreuses d’échapper à l’apoptose. La GSK-3f3, une
proteine-sérine/thréonine kinase constitutivement active dans la cellule, est le subirat préférentiel
de Akt. Elle est impliquée clans la régulation de la voie Wnt et dans la promotion de l’apoptose
mitochondriale via la phosphorylation de Bax et sa transiocation dans la membranne de la
mitochondrie [355]. Son activité est inhibée par la phosphorylation de Akt suite à une
stimulation par des facteurs de croissance. Nous avons montré que l’acide punicique inhibait la
phosphorylation de Akt et bloquait son activation. De plus, nous avons montré que GSK-3f3 était
également impliquée dans la régulation de l’apoptose puisqu’elle constitue un facteur important
dans la voie de survie cellulaire gérée par la voie PI3K/Akt. Nous nous sommes alors intéressé
aux voies de signalisation apoptotiques induites par l’acide punicique.

Il existe plusieurs protéines impliquées dans la régulation de l’apoptose comme les

caspases, les protéines de la famille des Bel-2 et les PARP [356, 357]. Bel-2 est une protéine
effectrice dans la voie apoptotique extrinsèque, elle a été identifiée comme étant un suppresseur
de l’apoptose. Elle est souvent surexpriinée dans les cellules cancéreuses de la prostate [358,
359] ce qui leur permet d’échapper au mécanisme apoptotique. En effet, Bel-2 bloque l’action de
la protéine pro-apoptotique Bax en formant un hétérodimère avec cette dernière. Nous avons
montré que l’acide punicique, acide gras polyinsaturés présent en grande quantité dans l’huile
des graines de grenade, induisait l’effet antiproliféralif le plus important dans les cellules LNCaP
et que cet effet antiprolifératif se traduit également par un effet apoptotique dans les cellules
LNCaP. En effet, il induit une diminution de l’expression des protéines Bel-2 dans les cellules
LNCaP sans influencer l’expression protéique de Bax. Il en résulte une diminution du ratio Bel-

143
2/Bax qui est tin Facteur décisif de l’évolution de la cellule vers l’apoptose et une cascade de
réactions qui permettent la libération du cytochrome c et l’activation des caspases effectrices.

Les travaux dc Grossmann et al. (2010) ont mis en évidence les effets antiprolifératifs et
apoptotiques de l’acide punicique sur le cancer du sein. Dans cette étude, les auteurs montrent
que cet acide gras en formant du diacylglycérol, induit une péroxydation lipidique à l’origine de
l’activation de la voie des PKC et de la cascade apoptotique [360]. lIs mettent en evidence
l’inhibition de la péroxydation lipidique, induite par l’acide punicique, par une exposition des
cellules cancéreuses du sein à l’a—tocotrienol. Cependant, une autre étude réalisée sur un groupe
de 80 hommes sains montre que la péroxydation lipidique induite suite à la consommation
d’acides gras oméga-3 n’est pas inhibée par une supplémentation en vitamine E [361]. La
péroxydation lipidique ayant lieu in vitro ne répond donc pas de la même manière que celle mise
enjeu in vivo [306]. 11 est donc difficile de prédire l’effet apoptotique induit via la péroxydation
lipidique, c’est pourquoi nous nous sommes d’avantages intéressés aux voies de signalisation
apoptotiques.

Nos résultats confirment les effets protecteurs identifiés chez d’autres composés naturels
comme l’EGCG, le deiphinidine chloride et le kaempférol sur les cellules cancéreuses de la
prostate [223, 233, 234, 362-367]. De plus, nous avons montré, pour la première fois, l’effet
apoptotique de l’acide punicique qui est bien plus élevé que celui de l’EGCG, du kaempférol ou
encore du delphinidine chloride. En effet, d’après les travaux de l-iafeez et aI. (2008) l’activation
de la voie de signalisation du NF-kB induit l’inflammation et provoque la carcinogenèse [368].
Une inhibition de l’activité du NF-kB dans les cellules PC-3 exposés au delphinidine chloride a
été mise en évidence ainsi qu’une induction de l’apoptose intrinsèque, il faut savoir, qu’une
inhibition prolongée du NF-kB n’est pas favorable à la prévention du cancer. Un effet préventif
consisterait d’avantage à inhiber la cause initiale de l’activation constitutive de la voie NF-kB
dans les cellules cancéreuses et non pas à une inhibition prolongée. C’est pourquoi l’utilisation
d’inhibiteurs de NF-kB dans le traitement du cancer doit éviter l’immunosuppréssion associée à
une inhibition prolongée de ce dernier [369].

Les travaux de Hastak et al. (2003) ont mis en évidence l’effet apoptotique induit par
EGCG dans les cellules LNCaP. Cette apoptose fait intervenir deux facteurs de transcription
importants, le NF-kB et le p53. En effet, l’EGCG induit une augmentation de l’expression du

144
p53 qui Favorise l’apop(ose en augmentant l’expression de Bax et de p21. Il inhibe également la
protéine MDM2 impliquée dans la dégradation du p53. EGCG inhibe le NF-kB ce qui induit une
diminution de l’expression de 8c12 et de Bcl-xL et Favorise ainsi l’apoptose [370]. Ces travaux
ont été réalisés sur les cellules LNCaP dont le p53 est sauvage, mais ces résultats ne peuvent pas
s’appliquer aux cellules PC-3 dont le p53 est muté [371]. Notre but est d’identifier un Composé
capable d’induire I ‘apoptose clans les deux lignées cellulaires.

La dérégulation des voies apoptotiques joue un rôle important clans le développement des
tumeurs cancéreuses de la prostate et dans la résistance aux traitements. C’est l)oI1quoi un intérêt
croissant pour la modulation des voies apoptotiques est apparu dernièrement clans les statégies
thérapeutiques contre le cancer de la prostate. Nous avons montré que l’acide punicique Faisait
intervenir différents mécanismes d’action permettant d’inhiber la croissance des cellules
cancéreuses LNCaP. Nous avons donc testé ses effets sur les cellules cancéreuses androgène-
indépendantes PC-3 et avons testé quatres de ses stéréoisomères.

Les composés naturels comme les acides gras polyinsaturés sont capables d’inhjber la
croissance cellulaire et d’induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein et du colon
[372-375]. Nous sommes les premiers à avoir identifié l’effet antiprolifératif de cinq acides gras
octadéeatriénoiques (acide punicique, jacarique, a/pha-ealendique, hé/a-calendique et catalpique)
dans les cellules LNCaP et PC-3. Nous avons également montré que ces acides gras n’affectaient
pas la viabilité des cellules normales RWPE-1.

Parmi ces acides gras, l’acide jacarique provenant des graines de l’arbre jacaranda
miniosi/lia, s’est distingué par son effet inducteur efficace et sélectif de l’apoptose dans les
cellules du cancer de la prostate hormono-sensibles et hormono-résistantes. En effet, la
diminution de la viabilité des cellules exposées à l’acide jaearique a été associée à une
augmentation de la fragmentation de l’ADN, de la condensation de la chromatine et du clivage
de PARP. Cela indique que l’apoptose induite par l’acide jacarique, joue un rôle important dans
l’effet antiprolifératif observé dans les deux lignées cellulaires. De plus il induit une mort
cellulaire que nous avons réussi à différencier de la nécrose grâce aux observations réalisées au
microscope à fluorescence.

Les cellules LNCaP surexpriment Akt en raison d’une faible expression de la phosphatase
à lipides PTEN qui est une inhibitrice de la PI3K. Les LNCaP sont normalement résistantes à

145
l’apoptose extrinsèque indiLite par les récepteurs TRAIL [376]. LIles peuvent cependant être
sensibilisées à cette voie suite à une exposition combinée de TRALL et d’agents
chimiothérapeutiques [377] ou de composés naturels [378]. Nous avons identifïé, pour la
première fois, l’induction de l’apoptose par l’acide jacarique via le récepteur de mort cellulaire
TRAIL-R2 ou DR5 dans les cellules LNCaP. Cependant, le mécanisme par lequel il induit une
sensibilisation des cellules LNCaP au TRAIL reste à identifier. D’apiès la littérature, afin de
surmonter la résistance au TRAIL, plusieurs mécanismes sont possibles comme l’inhibition de
Akt. En effet, Akt est constitutivement activée dans les cellules LNCaP, elle intervient dans la
régulation de la sensibilité au TRAIL et bloque la cascade apoptotique en inhibant l’activité de
Bid [376]. Un autre moyen permettant de contourner la résistance au TRAIL dans les cellules
LNCaP consiste à inhiber la fonction du protéosome 26S, ce qui retarde la dégradation de la
caspase 8 et favorise l’apoptose extrinsèque induite par TRAIL [379].

Les cellules PC-3, sont normalement plus sensibles que les cellules LNCaP à l’apoptose
extrinsèque induite par TRAIL [376]. Cependant, nous avons montré que les cellules PC-3
étaient plus sensible à l’apoptose induite par l’acide jacarique, mais que cette apoptose ne faisait
pas intervenir la voie extrinsèque. Une explication possible est que l’acide jacarique agit au
niveau d’une cible qui bloque la résistance à l’apoptose induite par DR5 dans les cellules LNCaP
et que cette cible n’est pas active dans les cellules PC-3. Cette cible ferait intervenir une
intéraction entre la voie Akt, faiblement active dans les cellules PC-3 et le AR. Les cellules
LNCaP sont alors plus résistantes face à l’apoptose grâce aux molécules de survie cellulaire et
plus particulièment les p
21 [380, 381] qui sont régulées par le AR [382]. Ce mécanisme
d’intéraclion n’est pas présent dans les cellules PC-3 puisqu’elles n’expriment pas le AR. Nous
savons également que Akt est constitutivement activée dans les cellules LNCaP et que cette voie
est inhibée par l’acide punicique [383]. L’implication d’une intéraction entre la voie Akt et AR
expliquerait l’activation de la voie apoptotique extrinsèque induite par l’acide jacarique dans les
cellules LNCaP.

La capacité de l’acide jacarique à induire une apoptose intrinsèque dans les deux lignées
cellulaires LNCaP et PC-3 peut être dûe à la péroxydation lipidique, à la dégradation en acides
gras de la composition cellulaire ou encore à un déséquilibre dans la régulation de certains gènes
[384-387]. Des études ont mis en évidence une surexpression de Bel-2 dans des tissus
néoplastiques de la prostate humaine [120]. Puisque l’acide jacarique et punicique [383] inhibent

146
l’expression de 13c1—2 dans les cellules LNCaP, ils pourraient agir comme des agents
antinéoplastiques dans les cellules cancéreuses de la prostate.

Est-ce qu’il existe un lien entre la structure et l’activité des composés naturels actifs ?

Les isomères possèdent une formule brute identique, mais des formules développées ou
seini-développées différentes qui leur confèrent des propriétés physiques ct chimiques
différentes. L’acide punicique, jacarique, alpha- calendique, béta-calendique et catalpique sont
des isomères à I 8 atomes de carbones et trois doubles liaisons conjuguées dont la structure
spaciale est différente. L’acide punicique et jacarique se distinguent des trois autres isomères
d’acides linoléniques étudiés. Ce sont les composés les plus actifs et les plus cytotoxiques et leur
efficacité est reliée à une similarité dans leur structure moléculaire 3-D. En effet, seul l’acide
punicique et jacarique ont une con formation cis—frans—cis.

Notre analyse conformationelle en 3-D réalisée grâce à la base de données des composés
de Pubmed, confimie que l’acide jacarique est le composé le plus proche du composé
cytotoxique de référence, l’acide punicique. Cette analyse est basée sur différents scores de
similitudes. Cependant, une précédente étude réalisée sur des acides gras conjugués
octadécatriénoiques confirme que les acides gras 9, 11, 1 3 sont plus toxiques que les isomères 8.
10, 12 dans les cellules de leucémie monocytaire humaine [263]. Cependant, cette étude n’a pas
indu l’acide jacarique, un isomère 8, 10, 12 dans son analyse.

Nous avons également montré que l’acide jacarique était plus cytotoxique que l’acide
catalpique, un isomère 9, 11, 13 et avons confirmé cela par une analyse 3-D en leur attribuant un
classement. Ce classement est déterminé par un score de similarité relatif à l’acide punicique.
Nos résultats mettent en évidence l’importance de la structure moléculaire 3-D dans la prédiction
de l’activité biologique en comparaison à une évaluation basée sur la structure 2-D. Cependant, il
est important, de connaitre la nature de la molécule étudiée et d’être vigilant quant à
l’interprétation de ces valeurs.

L’acide trans-vaccénique n’a pas d’effet cytotoxique sur les cellules cancéreuses de la
prostate. En effet, il ne présente pas de similarité avec le composé de référence, l’acide punicique

147
 suite à une analyse 3—D. En revanche, lorsque d’autres facteurs physico-chimiciues comme
l’hydrophohicité et la constante de dissociation sont pris en compte, aucune différence
significative n’apparait entre l’acide trans—vaccéniqile et l’acide punicique. Une analyse visuelle
en 3-D réalisée grâce au logiciel PuhChem Compound montre une valeur optimale de similarité
entre l’acide trans-vaccénique et l’acide punicique lorsqu’ils sont superposés. En revanche, la
superposition des groupements d’acide carboxylique des deux acides gras montre une orientation
opposée (lorsque la forme est optimisée) ou une divergence de la chaine dc carbones C-18
(lorsque les caractéristiques de chevauchement sont optimisés) ce qui forme des superpositions
en forme de coin. Ce type de déviation structurelle de l’acide punicique n’est pas observée avec
les acides octadécatriénoiques dont les groupements d’acide carboxylique se superposent et dont
la chaine C-18 converge, comme c’est le cas pour l’acides alpha-calendique. De plus, la distance
intermoléculaire CT optimisée entre les atomes C-18 de l’acide punicique et l’acide trans- ou cis
vaccénique est plus grande que celle des acides octadécatriénoiques.

Nous avons également montré qu’entre les composés similaires structurellement, la

relation entre les scores de similarité optimisés et l’activité biologique n’est pas toujours linéaire.
Nous avons aussi déterminé la valeur limite permettant d’évaluer l’activité biologique de cette
série d’acides ocladécatriénoiques.

Il est certain que la base de données PubChem Compourid offre plusieurs outils d’analyse
3-D ainsi que plusieurs informations pennettant une évaluation détaillée de la structure
moléculaire et de sa relation avec l’activité biologique déterminée expérimentalement. Nous
avons montré que ces outils étaient très utiles dans l’évaluation de la relation entre la structure
moléculaire 3-D et la puissance cytotoxique d’une série d’acides gras C-18 provenant de
certaines plantes. De plus, elle a permi de Faire la différence entre des molécules ayant des
propriétés physico-chimiques presque identiques.

Et le stress oxydatif dans tout cela?

Le stress oxydatif se définit comme étant un déséquilibre de la balance entre les

prooxydants et les antioxydants en faveur des premiers, ce qui conduit à des dégâts cellulaires

148
irréversibles. Il se traduit par la Formation d’espèces réactives de l’oxygène (1RO) dont Font
partie les radicaux libres, le péroxyde d’hydrogène et l’oxygène singulet. Toutes ces espèces sont
potentiellement toxiques pour l’organisme car elles peuvent inactiver des protéines, induire des
cassures au sein de l’ADN avec pour conséquence une altération du message génétique, dégrader
les sucres, oxyder les lipoprotéines et initier des processus de péroxydation lipidique au sein de
la membrane cellulaire en s’attaquant aux acides gras polyinsaturés.
En situation normale, les ERO soiit produites en permanence par notre organisme mais un
système efficace de défenses antioxydantes (vitamines, enzymes, oligoéléments) permet de
réguler cette production afin de prévenir tout dégât cellulaire excessif. Cependant, plusieurs
études épidémiologiques ont mis en évidence que de faibles taux sanguins en antioxydants ou en
oligoéléments (vitamines C et E, sélénium) sont étroitement associés avec une incidence plus
élevée de cancers.

L’équipe de Shinohara et al. (2012) a comparé les effets cytotoxiques, in vitro, de huit
isomères de l’acide linolénique sur des cellules cancéreuses coloréctales humaines, DLD-l
[388]. Ils ont conclu que l’acide jacariquc et l’acide catalpique étaient les plus cytotoxiques et
qu’ils induisaient l’apoptose dans les cellules DLD-1 via la péroxydation lipidique sans expliquer
le lien entre l’activation de l’apoptose et la péroxydation lipidique. Ils ont également montré une
diminution de la taille des tumeurs chez des souris transplantées avec des cellules DLD-1 et
nourries au préalabale avec de l’acide jacarique pendant une semaine.

Les chercheurs ont mesuré la péroxydation lipidique dans les cellules DLD- 1 exposées
aux acides gras cytotoxiques les plus puissant. Ils ont utilisé tout d’abord le test TBARS afin de
mesurer la quantité de malondialdébyde, produit final de la péroxydation lipidique. Ensuite, ils
ont mesuré la quantité de lipide hydropéroxyde, premier produit issu de la péroxydation
lipidique, avec le test LOOH. Enfin, ils ont réalisé un test antioxydant en présence d’a
tocophérol ou de butylhydroxytoluène (Bi-IT) pour quantifier le malondialdéhyde à nouveau.

La péroxydation lipidique est un processus qui fait intervenir les acides gras
polyinsaturés, cibles privilégiées des radicaux libres. Dans une première étape, ils se
transforment en péroxydes lipidiques (ROOH). Sous l’action de métaux de transition (fer,
cuivre), ils se décomposent en une série de sous—produits dont font partie les aldéhydes.

149
 La inalonedialdéhyde (MDA) se mesure de façon fiable par une méthode de
chromatographie liquide à haute performance (IIPLC). Toutefois, son estimation reste un indice
peu représentatif de la présence d’une péroxydation lipidique puisqu’elle ne représente qu’un

pourcent des produits de décomposition des péroxydes lipidiques. En revanche, plus sensible et
beaucoup plus spécifique est la mesure d’un autre aldéhyde, le 4 hydroxynonénal (uNE)
provenant de la dégradation des péroxydes d’acides gras de la fimille w—6.
De plus, pour déterminer l’effet réel d’une péroxydation lipidique sur l’intégrité
cellulaire, il faudrait mesurer également la contre-balance des antioxydants. En effet, le plasma
humain est riche en antioxydants de petite taille de type hydrophile (acide urique, acide
ascorbique (Vit C), glutathion, bilirubine) et lipophile (a tocophérol (Vit E), rétinol (Vit A), f3
carotène, ubiquinone). De plus, les globules rouges sont très riches en enzymes antioxydantes
comme la supéroxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion péroxydase (GPx). Dans le
cas d’un stress oxydatif chaque antioxydant est affecté à des degrés divers. Il est dès lors
nécessaire d’évaluer de manière plus globale la capacité antioxydante globale d’un échantillon
biologique face à un stress oxydant pour conclure à un effet réel.
La péroxydation lipidique des acides gras polyinsaturés à l’origine de l’apoptose des
cellules cancéreuses DLD-I mise en évidence dans cet article, doit être confirmé par la mesure
dii potentiel rédox du tissu qui est plus représentatif du stess oxydant total.

150
5 CONCLUSION ET PERSPECTIVES
 Les solutions actuellement disponibles pour traiter le cancer de la pi-ostale, présentent des
effets secondaires indésirables en plus d’augmenter les risques dc développer une résistance aux
traitements. L’identification de l’impact majeur, que les conditions de vie peuvent avoir sur le
risque de développer un cancer de la prostate a eu pour conséquence le vif intérêt, durant les
dernières décennies, pour l’alimentation. Plusieurs études ont mis cii évidence l’effet préventif de
différents composés naturels extraits des plaiites sur le cancer de la prostate. Plus
particulièrement, la grenade, fruit au riche passé éthnomédical, figure parmi les fruits les plus
intéressants.

La grenade comporte des composés appartenant ?i différentes classes chimiques dont les
effets préventifs, sur le cancer de la prostate, ont été testés, précédemment, sur un système de
culture cellulaire, sur un modèle animal et sur une étude clinique humaine de phase 11.
Différentes préparations de grenade ont été utilisées (huile, jus, péricarpe) [238, 255, 257, 262,
349, 389-391]. Ces travaux ont montré que les extraits de grenade inhibent la croissance des
cellules LNCaP, PC-3 et DU 145 sans affecter les cellules épithéliales normales [3891. Ces effets
font intervenir des changements dans le cycle cellulaire et induisent l’apoptose.

Nos résultats ont permi d’identifier parmi treize composés extraits de la grenade, un

composé particulièrement puissant, l’acide punicique. Il induit des effets antiprolifératifs et

antiandrogéniques dans les cellules LNCaP, en plus d’induire Lapoptose via la voie PI3KIAkt.
Cette voie est constjtutjvernent active dans les cellules LNCaP et représente une cible
thérapeutique intéressante dans le traitement du cancer de la prostate car elle intervient, entre
autre, dans l’évolution du cancer vers un état hormono-résistant.

L’acide jacarique, un isomère de l’acide punicique provenant de l’arbre Jacaranda

inimosifolia est un acide gras polyinsaturé qui présente trois doubles liaisons conjuguées et une
structure cis, trans, cis comme celle de l’acide punicique. Il induit l’apoptose dans les lignées
cellulaires cancéreuses de la prostate androgène-dépendantes et —indépendantes. Il active la voie
apoptotique extrinsèque et intrinsèque dans les cellules LNCaP et induit l’apoptose intrinsèque
dans les cellules PC-3. C’est le composé le plus cytotoxique pour les cellules cancéreuses de la
prostate après l’acide punicique. Une analyse 3-D a permis de constater que la structure cis,
trans, cis des deux isomères était associée à un effet cytotoxique plus puissant sur les cellules
cancéreuses.

153
 Une étude plus approfondies reste cependant nécessaire pour identifier la structure
spécifique susceptible d’induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses de la prostate ainsi que
les facteurs induisant l’activation d’une voie apoptotique au détriment de l’autre ou des deux à la
Cois. Il s’agit également de comprendre le mécanisme de fonctionement activé en fonctjon de la
lignée cellulaire dans laquelle s’opère l’apoptose.

L’acide punicique et jacarique sont les composés les plus actifs identifiés. lIs induisent
l’apoptose des cellules cancéreuses de la prostate et peuvent être utilisés pour prévenir le cancer
de la prostate. Cependant, leurs propriétés pharmacocinétiques doivent être déteminées pour
permettre leur utilisation. En effet, il est important de connaitre leur absorption par les cellules
intestinales, leur distribution cellulaire chez l’homme ainsi que les quantités efficaces in vivo.

Les travaux de Di Silverio et al. (2003) réalisées sur des souris nudes athymiques
transplantées avec des cellules CWR22RvI androgènes-dépendantes montrent que la taille des
tumeurs chez les souris nourries avec des extraits de grenade a significativement diminuée d’une
façon dose dépendante de même que leur taux de PSA [256]. Les souris ont été nourries avec 0.1
% et 0.2 % (poids/vol) d’extraits de grenade. Les doses ont été calculées suivant l’hypothèse
selon laquelle un individu en bonne santé pesant approximativement 70 kg peut boire 250 à 500
ml de jus de grenade provellalit d’un ou de deux fruits, respectivement. De plus, une étude
clinique récente, réalisée par Palier et al. (2012), sur des hommes souffrant d’un cancer de la
prostate localisé montre une diminution du taux de PSA chez 13 % des patients ayant reçu les
comprimés POMx contenant les extraits de grenade [392]. Ils reçoivent I à 3 g de polyphénols
extraits de la grenade, correspondant au contenu de 8 oz de jus de grenade pur. Ces comprimés
contiennent une quantité plus importante de punicalagin et de ses isomères. Cette étude comporte
cependant plusieurs points faibles comme l’absence d’un groupe placebo, l’absence d’un lien
dose réponse évident et enfin l’absence d’une étude in vivo sur des tissus de prostate pour
confirmer le changement dans le taux de PSA.

Les travaux de Tsuzuki et al. (2003) mettent en évidence l’absorption de l’acide

punicique administré aux rats, en majorité sous sa forme initiale le rendant ainsi plus actif au
niveau des cellules cancéreuses contrairement à l’acide OE-éléostéarique dont une partie est
convertie en acide linoléique moins actif [393]. Cependant, l’absorption de l’acide punicique par

154
les intestins des rats est lente en raison de ses propriétés lipophiles. Les travaux de Cassidy et al.
(1996) ont montré que les isoulavones daidzcine et génistéine sont plus facilement absorbés par
les intestins et atteignent un pic dans le plasma plus rapidement lorsqu’ils sont liés un
groupement f3—glucoside [394]. L’acide punicique pourrait être conjugué à une fibre alimentaire
hydrosoluble comme l’inuline pour raccourcir son temps d’absorption. De plus, pour augmenter
sa biodisponibilité, des techniques tels que les self-microemulsifying drug delivery system (ou
SMEDDS) qui forment une microémulsion d’huile dans de l’eau après agitation dans la phase
aqueuse pourrait être utilisées. Cette technique favorise la solubilisation d’une substance
hydrophobe en formant spontanément des Inicrogouttes avec une surface interfaciale plus large
qui a pour conséquence d’augmenter l’absorption du composé hydrophobe dans le tractus
digestif. La complexation avec une cyclodextrine peut également être utilisée pour conserver les
propriétés structurelles et physicochirniques d’un composé hydrophobe et faciliter son action
dans les tissus cibles comme la prostate [395, 396].

Aucune étude ne spécifie les propriétés pharmacocinétiques de l’acide jacarique. De plus

la différence structurelle entre l’acide jacarique et l’acide punicique pouvant favoriser
l’absorption de l’un ou de l’autre de ces acides gras doit être déterminée.

Des études récentes ont mis en évidence l’existence d’un lien entre le stress oxydant dans
le réticulum endoplasinique et la surexpression de DR5 induisant l’apoptose dans les cellules
cancéreuses humaines du foie exposées au guggulstérone (stéroide naturel présent dans la plante
Guggul). L’acide jacarique induit une apoptose extrinsèque dans les cellules LNCaP et
surexpirne le récepteur de mort cellulaire DR5. Il serait donc intéressant de déterminer le stress
oxydant du réticulum endoplasmique suite à l’exposition des cellules LNCaP à l’acide jacarique
ainsi que de déterminer son effet sur le facteur de transcription CHOP qui joue un rôle important
dans la régulation du DR5.

155
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