INITIATION AUX BIOTECHNOLOGIES

Biotechnologies = Technologies du vivant, par le vivant et pour le vivant (pour l’homme)

- Technologie = savoir-faire, méthodes…
- Biologie = nature, vivant
Ex : médicaments, OGM, boulanger, fromager (levures, bactéries), vin (microorganisme), soie pour les vêtements=
Biotechnologies sont anciennes et sont présentes dans notre quotidien

On va aborder :
- Principales techniques d’amélioration génétique
- Principales questions posées par ces techniques
- Principaux exemples d’OGM

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 BIOTECHNOLOGIES VEGETALES ET AMELIORATION DES
PLANTES

Chapitre 3 : méthodes d’obtention de variabilité génétique

Les biotechnologies ne sont pas nouvelles, elles sont déjà utilisées depuis très longtemps (ex : production de pain
et de vin = utilisation du vivant pour en produire) Mais au niveau de l’éthique elles sont souvent interprétées comme
étant des choses nouvelles, qui pourraient avoir des impacts non contrôlés à la foi sur l’homme mais aussi
l’environnement. De plus se pose la question de l’éthique = jusqu’où on peut modifier/contrôler le vivant. En effet, le
principal sujet d’actualité correspond majoritairement à la modification du génome humain mais aussi des plantes,
pour pouvoir en faire ce que l’on veut, pour modifier l’expression des gènes de bases.
Dans ce chapitre on ne s’intéresse pas au règne procaryote, on s’intéresse aux plantes génétiquement modifiées
ainsi qu’aux animaux génétiquement modifiés. Ainsi on essaye de mettre à disposition des agriculteurs de nouvelles
variétés.
Objectifs généraux en amélioration génétique des plantes, c’est d’augmenter le « champ des possibles » de
l’utilisation des plantes :
 Pour le producteur/agriculteur (Ex : résistance aux maladies)
 Pour le transformateur (Ex : meilleur usage industriel)
 Pour le distributeur (Ex : meilleure conservation)
 Pour le consommateur (Ex : meilleur goût)

I- Méthodes d’obtention de variabilité génétique

1) Hybridation

Hybridation : Le processus génétique de croisement de parents génétiquement différents (de génotypes différents ou
d'individus d'espèces différentes) pour produire un individu hybride.
Stratégies générales en amélioration génétique des plantes :
- Sélection massale : basée sur l’observation et le repérage d’individus élites apparus spontanément (=
aléatoire) lors de reproductions sexuées aléatoires

- Sélection généalogique : sélection orientée par l’homme, en « choisissant » les parents d’un croisement
sexué (intervention de l’homme) : apparaît au XXème car découverte et meilleure connaissance en génétique
On passe d’une sélection « massale » à une sélection généalogique (recherche des descendants, filiation parentale)
(19ième – 21ième). Cela passe par des croisements contrôlés (on choisit les parents qui nous intéresse, dont un des deux
possède une résistance très forte à une maladie par exemple). On veut que la résistance passe dans l’autre individu
pour qu’il fasse de gros grains (par exemple) mais aussi qu’il possède la résistance à la maladie. On vérifie qu’à
chaque croisement on garde les qualités mais aussi que la résistance est présente.
L’homme peut utiliser l’hybridation afin d’obtenir de nouvelles espèces de plantes présentant des caractères utiles à
l’homme. Ainsi, le progrès génétique peut être mis à profit des agriculteurs (ex : les céréales à paille).

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Pour procéder à une hybridation, l’homme va tout d’abord sélectionner judicieusement les 2 parents à croiser = plan
de sélection par sélection massale. L’homme va choisir un spécimen qui a déjà subi spontanément une amélioration
favorable pour l’agriculture. Ce spécimen possède donc une valeur agronomique. On va ensuite croiser ce spécimen
avec un autre par croisements sexués reproduits de multiples fois = rétrocroisement = sélection généalogique.

Un rétrocroisement s’effectue en moyenne sur 10 ans. Il s’agit d’une épuration génétique. En effet, le but étant
d’obtenir l’acquisition du caractère désiré chez la lignée récurrente par une succession de croisements et de
sélections. Le premier croisement est effectué entre la lignée donneuse (lignée possédant le caractère intéressant) et la
lignée receveuse (celle à qui on veut transmettre le caractère). Suite à ce croisement seuls les descendants ayant
acquis le caractère intéressant vont être conservés (= vérification de la présence du gène intéressant dans le génome du
descendant), les autres vont être éliminés. Les descendants conservés vont être à nouveau croisés avec un spécimen de
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la lignée receveuse et ainsi de suite jusqu’à obtenir une lignée convertie, c’est-à-dire que la lignée receveuse ou
récurrente a reçu le caractère désiré.

Ce travail de création végétale est long, il s’effectue sur plusieurs générations de plantes (ici besoin de 10 années).
Suite à ces 10 ans de sélections afin d’obtenir le spécimen désiré, il est ensuite nécessaire de suivre ce nouveau
spécimen. Pour cela, il va être étudié et testé pendant 2 ans (= examen de passage) avant de pouvoir éventuellement (si
aucun pb) être inscrit au catalogue. Si l’inscription est acceptée, le spécimen va devoir être multiplié (= faire des
cultures : nécessité de production de semences) avant d’enfin pouvoir être commercialisé. Processus long environ 20
ans ici = donc processus coûteux. Autre limite : nécessité d’avoir deux parents qui ont la capacité de se reproduire =
compatibles = interféconds (donc espèces génétiquement proches).

 Processus long donc on utilise la biotechnologie pour réduire ce temps et ceux notamment en utilisant la
culture in vitro

2) Augmentation de la variabilité génétique

Aujourd’hui l’homme est capable d’augmenter la variabilité génétique et ce notamment grâce au développement de la
culture in vitro (C.I.V) = placer des cellules, tissus, profils cellulaires dans une situation/milieu contrôlés. Cette
nouvelle méthode s’appuie notamment sur la totipotence cellulaire.
Totipotence cellulaire : capacité que possède (ou non) une seule cellule de se diviser, puis de différencier et
spécialiser les cellules obtenues afin de « régénérer » un individu complet (tissus, organes). Ex typique : la cellule œuf
fécondée. Cette totipotence cellulaire est présente dans tous les végétaux même si elle n’est pas toujours exprimée. De
plus, chez les végétaux les cellules totipotentes ne sont pas présentes qu’au stade embryonnaire mais tout le long de la
vie de la plante.

Culture in vitro : la plante pousse sur un milieu 100% artificiel (fabriqué par l’homme cf fascicule technique)  il
existe des recettes de milieu de culture. Le milieu doit être adapté aux besoins et conditions de vie de la cellule en
question. La biotechnologie utilise quasiment toujours la culture in vitro.

Principe de la culture in vitro :

Tout d’abord, on fabrique un milieu de culture adéquat pour la cellule concernée. Cette dernière, si les conditions de
vie sont bonnes va se multiplier/proliférer (= prolifération cellulaire) grâce à l’ajout d’hormones végétales. Suite à
cette prolifération cellulaire, il va y avoir la formation d’un cal aussi appelé microcal = obtention d’un amas cellulaire
non différencié. Le passage par la phase CAL n’est pas obligatoire/absolue. Pour obtenir ce cal, on utilise le
phénomène de la totipotence végétale en dédifférenciant les cellules d'un explant prélevé sur la plante mère.

A partir de cellules initiales, que l’on fait développer, par exemple en faisant une saignée sur une plante, puis on
stimule sa reconstruction grâce à des cytokinines, qui forment à l’aboutissement un Cal, un amas indifférencié
d’organes d’un végétal : par exemple de tiges. Ainsi à partir de cette masse cellulaire on peut essayer de réorganiser
cette masse par des messagers hormonaux, par exemple la formation de bourgeons. (Tiges feuilles …). Ainsi on peut
reproduire une plante dans sa totalité grâce au patrimoine génétique dans le noyau des cellules. On utilise alors des
milieux de cultures qui se rapproche de l’idéal de développement. Un milieu type par exemple : milieu de Murashing
et Skoog (ou MS : composé d’ingrédients nécessaires à la vie végétale). On gélifie le milieu pour qu’il soit un peu
rigide afin que la plante ait un support solide.
Milieu de culture in vitro adéquat décrit par 2 chercheurs = milieu de Murasbige et Skoog (MS)
- Sels minéraux
- Provitamines
- Auxines, cytokinine, autres régulateurs…. (Molécules)
- Saccharose : Culture in vitro toujours enfermé donc pas de photosynthèse pour ces plantes d’où ajout de
saccharose (mais risque de voir apparaître des champignons)
- Agent gélifiant : agar-agar

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La biotechnologie a pour objectif notamment de trouver des méthodes/techniques pour réduire le nombre d’année de
sélection des individus à différents niveau de mise en place d’1 nouveau spécimen (ex : au stade du croisement, mais
aussi, de la sélection ou encore de la multiplication des semences).

5 principales méthodes/techniques qui ont créé de la diversité :

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 Mutagénèse :

La mutagénèse, c’est chercher à augmenter la probabilité de la mutation dans les cellules = rendre plus fréquent/plus
probable l’apparition de mutations. On provoque donc ces mutations mais on ne peut pas sélectionner la mutation qui
va survenir = phénomène aléatoire (Mutation : modification spontanée et anormale du génome, souvent sans
conséquence mais pas tjrs = en temps normal il y a une réparation du chainon modifié, mais il se peut que ce chaînon
soit mal réparé et puisse laisser une opportunité qu’il développe un nouveau phénotype). Pour augmenter ces accidents
génétiques on utilise des agents mutagènes de 2 types : physique (rayon X et UV) et chimique (traitements chimiques,
agents intercalants = molécules qui s’intercalent au sein de l’ADN et décaler le cadre de lecture des polymérases
amenant par ex à la non production de protéines).
Les mutations peuvent survenir à différents niveaux du cycle cellulaire : ex : au niveau phase de duplication de l’ADN
phase S (copie non identique = erreur). Les agents mutagènes augmentent la prob qu’un nucléotide ne soit pas mis au
bon endroit.

 Au final mutagénèse  obtention d’individus « monstre »  seuls qq individus seront utiles à l’homme

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 Multiplication végétative et obtention de variants soma clonaux :

On cherche à multiplier un individu à partir d’un fragment de celui-ci. On va donc identifier l’individu végétal à
multiplier puis on en prélève une portion (ex : morceau de feuille) et on pourra à partir de ce morceau de feuille
obtenir des milliers d’autres individus. Cette méthode est valable pour le végétal car les plantes ont des cellules
beaucoup moins différenciées et totipotentes.
Principes :
On prend un morceau d’un individu (ex : feuille), puis on reproduit de manière in-vitro cet individu, par culture et
repiquage. L’individu va se régénérer (on laisse individu formé une plante complète). On va donc obtenir un individu
complet et identique/conforme à l’individu de base = multiplication végétative (clonage).

Cette multiplication est possible chez les plantes grâce à leurs cellules qui sont faiblement différenciées et leur
totipotence. Une cellule végétale est totipotente « toute puissance », capable de reproduire un individu complet. On
passe par un état indifférencié, appelé cal.
Obtention de variants :
Parfois ou court de la culture in vitro, il se produit des accidents de culture (phénomène rare/exceptionnel). En effet,
les repiquages peuvent être trop nombreux et stressants et produire des variants. Quand on laisse l’individu qui a été
soumis à ces accidents de culture former à nouveau une plante complète on se rend compte qu’on obtient un individu
différent de celui de base (VS multiplication végétative/clonage) = obtention de variants soma clonaux  on ne sait
pas exactement pourquoi mais on se demande si ce n’est pas dû à une perte de mémoire de la programmation
génétique.

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Les variants sont obtenus suite à une multiplication végétative non conforme. On ne peut cependant pas parler de
mutant car à aucun moment l’individu n’a été soumis à un traitement mutagène. L’apparition de ces variants est
totalement aléatoire, on ne peut pas maitriser leur apparition.

Limite de ces 2 dernières techniques :

- Techniques très aléatoires non contrôlées
- Besoin de faire bcp d’essais pour espérer obtenir une mutation : coûteux
- Les résultats sont aussi aléatoires donc pas nécessairement utile à l’homme (intervention de la chance trop
importante). Du coup chercheurs veulent maitriser ce qui va se passer pour cela :

La culture d’embryon immatures :

Une variété de tournesol sauvage contient des avantages pour la survie mais non pas pour l’agronomie. On va donc
chercher à croiser une plante sauvage avec une plante cultivée = fécondation = croisement interspécifique. Mais on
obtient individu sans embryons (pas de graine) dû à une incompatibilité cellulaire. En effet, les cellules
embryonnaires en cours de développement sont incompatibles avec les cellules tissulaires maternelles. Les embryons
sont donc voués à mourir.

On va donc procéder à un « sauvetage d’embryons immatures ». On extrait les embryons avant qu’ils avortent et on
les met dans un milieu de culture in vitro pour qu’ils s’y développent. Cet embryon sauvé à l’origine immature donne
alors un nouveau plant = régénération d’une plante  obtention d’une plante à caractères nouveaux (rapprochement
génétique avec individu avec avantage).
Nécessité d’un choix judicieux de parents puis obtention d’un hybride. Dans cette technique, on a plus à faire face au
caractère aléatoire des méthodes précédentes.

Limites :
- Si les parents sont trop éloignés génétiquement il n’y pas de fécondation et donc pas obtention embryon.
- Les différences génétiques en fin de processus sont donc beaucoup plus variables qu’avec les deux méthodes
précédentes.
- La variabilité génétique est différente et en général plus grande. La plante obtenue est différente de ces deux
parents.

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  Pour parer l’éloignement génétique des parents on peut procéder à une fusion du protoplaste :

Fusion du protoplaste :

Protoplaste = cellule végétale dont on a enlevé la paroi pectocellulosique

Tout d’abord on va débarrasser la cellule de sa membrane pectocellulosique grâce à des enzymes. Les parois des
cellules végétales sont collées les unes aux autres grâce à la pectine qu’il va falloir dissoudre pour isoler les cellules
de l’amas cellulaire. Pour cela on utilise une enzyme : la pectinase.

Après l’obtention de cellules isolées on veut enlever leur paroi pour cela on doit enlever cellulose de la paroi.
Digestion de la paroi pectocellulosique grâce à une enzyme la cellulase qui va grignoter paroi.

Enzyme 1 : pectinase (désagrège la pectine collant les cellules entre elles) = séparation de 2 cellules
Enzyme 2 : cellulase (désagrège la cellulose de la paroi rigide) = digestion de la paroi

Suite à ces 2 étapes, on obtient des protoplastes = cellules déshabillées. Attention il ne faut pas que le milieu de la
cellule induise une turgescence de la cellule donc il faut gérer les caractéristiques osmotiques de la cellule pour
qu’elle n’explose pas.

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On cherche à produire des protoplastes pour les cellules dont on cherche à associer les génomes. On parle dans ce cas
de fusion des protoplastes. Pour aboutir à l’éventuelle fusion, il faut créer un milieu qui favorise la fusion entre les
membranes des cellules dépourvues de parois : il pourra alors y avoir la mise en commun des deux contenus
cellulaires. Cependant lors de la fusion des protoplastes, l’homme ne peut orienter les résultats qui sont aléatoires.
Ainsi on peut obtenir :
- Des cellules non viables : le plus fréquent
- Survie de la cellule qui ne va maintenir qu’un seul des deux noyaux : qq fois
- Obtention d’une cellule avec fusion des noyaux (=mélange des contenus nucléaires) : rare. Dans ce cas précis,
la fusion des protoplastes conduit à la production d’hybrides somatiques possédant des caractéristiques
différentes. Les cellules survivantes vont être sélectionnées et germer pour donner des hybrides somatiques.

Hybride somatique : organisme issu de la fusion de 2 protoplastes issus eux-mêmes de 2 individus différents.
L’hybride somatique formé peut parfois être stérile ce qui peut permettre d’éviter d’avoir à faire une castration par
exemple pour le maïs.

Ex : Pomate = patate + tomate = hybride le plus célèbre. Cette fusion des protoplastes est viable car les 2 individus
sont issus du même genre (=génome proche) : Solanum tuberculosum et Solanum lycopersicum

Ce type d’expérience possède des atouts. En effet, par rapport à une reproduction sexuée (fusion des noyaux des
gamètes uniquement) même les organites contenus dans le cytoplasme sont mis en commun. Il y a donc une
conservation de l’information contenu dans les organites (tel proto a fait conserver son organite tandis que l’autre a
disparu ou il peut y avoir conservation des 2 organites).

Transfert de gènes :

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La transgénèse : consiste à introduire un ou plusieurs gènes dans un patrimoine génétique déjà existant, avec comme
objectif d’importer de nouvelles caractéristiques à l’organisme receveur :
- Soit on introduit un nouveau caractère
- Soit on inactive un caractère (avec un gène anti-sens)

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Ex : Un OMG peut être un organisme où l’on active un gène :
- Transgénèse : on insère un gène anti-sens du gène cible (celui qu’on cherche à inactiver)
- On aboutit à la fin à un ARN double brin (car le gène anti-sens s’apparie à l’autre gène)
- L’ARN double brin détruit par la cellule car c’est une anomalie

Pour parvenir à l’isolement d’un gène, il faut tout d’abord trouver le gène intéressant. Quelque soit l’organisme, les
gènes sont lus et codés selon les mêmes règles.

Barrière d’espèces . La transgénèse est une technique qui permet de passer outre cette barrière d’espèce sans pour
autant la détruire. En effet, il n’y a pas intervention de reproduction sexuée au cours de la formation d’un nouvel
individu par transgénèse.

Changement d’organisme : on insère ensuite le gène dans un vecteur biologique (ex : bactérie). Ce dernier est à
l’origine pathogène. Il va être désarmé au préalable de son vecteur pathogène. Puis on remplace à l’endroit précis du
vecteur pathogène par le gène qui nous intéresse.

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Aspect historique :

La transgénèse est une technique qui a être développée parce qu’on a repéré un type de maladie végétale : la galle du
collet = Agrobacterium tumefaciens = rhizobium radiobacter. Cette maladie correspond à une atteinte au niveau du
collet de la plante (racine-tige). Ce sont les cellules de la tige qui se sont développées pour donner un masse croissante
noire et tubéreuse. Cette bactérie réagit auprès d’une cellule végétale suite à une blessure. Des composés phénoliques
sont alors libérés en réponse à la lésion. Cependant ces composés sont des déclencheurs de l’activité virale de la
bactérie.

La zone T = morceau d’ADN voué à être envoyé dans la cellule végétale. Il y a alors un transfert de ce brin dans la
cellule végétale. L’ADN T va s’intégrer alors au brin d’ADN de la cellule végétale et va augmenter/répliquer le
nombre de cellules végétales portant ce brin d’ADN. Cela va provoquer :
- Un maintien en phase de division permanent
- La synthèse d’opines (structurellement voisines de certains acides aminés)

La cellule végétale est forcée de synthétiser des opines, cependant elle n’a pas le matériel nécessaire pour les dégrader
ni s’en servir : elle les externalise. Les opines servent à la nutrition de la bactérie.

Utilité pour les biotechnologies :

On supprime la capacité à se reproduire ainsi que le contenu de la zone T, sans pour autant perdre la capacité à se
transformer, il faut juste intégrer un gène à la place de cette zone T qui sera pris en charge de la même manière.

Le transfert direct de gènes :

Il existe d’autres méthodes de transfert direct de gènes que celle de la transgénèse :

- Via des micro-injections dans les cellules cibles grâce à des micropipettes. C’est l’une des techniques les plus
courantes pour les cellules animales et non végétales.
- Par voie virale. Inconvénients : virus beaucoup plus petit que la bactérie + méconnaissance des virus.

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Meilleures solutions :

- On injecte par l’intermédiaire de protoplastes : action de PEG (profil de molécules chimiques qui va
déstabiliser la membrane suffisamment pour créer temporairement des micropores qui vont perméabiliser la
membrane. Le protoplaste va ainsi pouvoir intégrer la cellule et se retrouver au niveau de son noyau.
- Electroporation : des chocs électriques perméabilisant (ouverture) la membrane pour un cours laps de temps
afin de faire entrer les protoplastes.
- Via un bombardement de microparticules : la biolistique = on tire avec le dispositif une quantité de
microparticules enrobées d’ADN : certaines vont rebondir, d’autres vont pénétrer dans le cytoplasme, d’autres
encore vont arriver au niveau du noyau ou tomber (tout est possible).

 Inconvénient de ces techniques : la réussite n’est pas maîtrisée/contrôlée

BILAN :

Que ce soit par transfert direct ou indirect, il est possible de voir arriver de nouveaux gènes à l’intérieur d’une cellule.
En revanche, aucune de ces techniques n’assurent une réelle efficacité de la transformation génétique, c’est-à-dire que
le gène arrive dans le nouveau génome mais il faut que ce dernier s’exprime/soit utilisé par la cellule cible. Si ça ne
donne rien en termes d’effets, la transformation n’est pas aboutie donc échec. Rien ne certifie que ces intégrations se
font à 100%. À tout moment, passage par culture in vitro peut être nécessaire pour régénérer la culture (multiplication,
régénération d’individu complexes).

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Réalisation de la construction génétique : les différentes étapes du mécanisme d’intégration d’un gène

(1) Identification d’un gène d’intérêt sur un organisme donneur (ici Bt = Bacillus thuringiensis  quand cette
bactérie arrive dans l’organisme, elle agresse les larves en les intoxicant)
(2) Isoler le gène d’intérêt
(3) Intégrer le gène d’intérêt dans une construction génétique (ex : gène pris chez un procaryote qui présente des
aspects communs et d’autres différents par rapport au gène qu’on va remplacer. Le promoteur (identification
du début du gène) et le terminateur (terminaison du gène) procaryote ne fonctionnent pas de la même façon
que leur équivalent procaryote). La construction génétique doit favoriser le repérage des éléments de
transformation. Le gène marqueur ou de sélection (criblage important) va apporter la capacité de survie aux
cellules si elles ont été transformées, sinon elles mourront suite au traitement. Ex : résistance aux molécules
toxiques.

 La construction génétique est bâtie sur un présupposé : tout l’ensemble va être collé dans la zone T
d’aggrobacterium si on envoie un gène d’intérêt  envoie de l’autre, toute la région T est envoyée (tout
ou rien)

Multiplication de la construction génétique : le clonage

Introduction du plasmide recombiné dans la bactérie  multiplication rapide de la bactérie  isolement des
plasmides. Capacité de trucider les E. coli au moment venu, externalisation des plasmides en quantité suffisante pour
pouvoir engager la transformation.

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Utilisation d’aggrobacterium :

Transformation biologique :

Via des aggrobacterium.

Principe de coculture : explants de la plante à transformer mis en présence d’aggrobacterium  sélection des
cellules transformées  traitement par un agent sélectif (antibiotique : correspond au gène de criblage, herbicides…).
Théoriquement, l’ensemble des cellules doivent mourir avec cet agent sauf s’il y a eu transformation génétique. Les
cellules transformées vont donc être les seules à se développer.

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Les étapes de la transgénèse :

Transfert direct : microparticules enrobées d’ADN + sélection des cellules

Régénération : culture in-vitro
Evaluation : expression du gène
Incorporation : par des croisements dans une variété commerciale dite élite

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Fixation de matériel génétique :

Réduire de qq années le cycle de sélection par une fixation de matériel génétique. Fixer 2 individus de la même variété
donnera un organisme propre ou semblable. Le sélectionneur choisit des parents judicieux pour améliorer la
descendance sexuée.

Problème : la reproduction sexuée. En effet, on a du mal à prédire génétiquement un croisement.

Rappels de la génétique : les plantes sont des organismes diploides et fonctionnent par paire de chromosomes qui
comportent une information génétique. Le gène qui détermine la couleur du petit pois = gène phénotypique.
- Allèle grain lisse (L)
- Allèle grain ridé (r)
La plupart des gènes existent donc sous différentes formes : allèles. Le grand L signifie un rapport de dominance.
Lorsque sur une même paire de chromosome j’ai les deux formes (L et r) : L l’emporte. La dominance de l’allèle
détermine le caractère.

Hétérozygote : deux allèles différents au sein d’une même paire de chr

Homozygote : deux allèles identiques au sein d’une même paire de chr.

Si hétérozygote  majuscule l’emporte. Ce qui explique que la différence génétique (au niveau des allèles) ne sera
pas toujours visible.

Cas d’une plante diploide :

Plante hétérozygote avec un caractère dominant grain lisse L. production de gamètes :

- Ovules L-r
- Pollen L-r
Autofécondation : le pollen de la plante va tomber sur l’ovule de la même plante  4 versions potentielles de résultats
d’autofécondation :

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 - Version homozygote
- Version hétérozygote
 3 à phénotypes lisses
 1 à phénotype ridé
Si on veut du lisse on élimine dans l’idéal les petits poids contenant des allèles r. Or on ne sait pas le phénotype. Donc
on réalise encore une autofécondation des petits pois pour révéler le caractère lisse fixé.

L’haplodiploidisation :

Technique qui joue entre l’haploidie et la diploidie. Cette technique rend l’intégralité des gènes homozygotes. On
passe d’un niveau haploide au niveau diploide par les cellules reproductrices. On passe d’une plantule haploide (n) à
une plantule diploide (2n). On est parti des gamètes.

- Production de plantes haploides :

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Androgénèse : obtention d’un embryon à partir d’une fécondation par un spermatozoïde normal. Et d’un ovule dont
les chromosomes ont été annulés, détruits  récupération des anthères. On met en culture des anthères et on obtient
soit un CAL soit un embryon. On fait ensuite la régénération de l’embryon ou du CAL qui vont produire chacun une
plante haploide. On part des grains de pollen.

Gynogenèse : même chose mais on part des ovules cette fois

La diploidisation :

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On réalise un repiquage en terre de la plante diploide. Puis on réalise un traitement à la colchicine. Cela provoque la
diploidisation d’une seule cellule car elle empêche la mise en place du fuseau achromatique. On a un certain nombre
de cellules qui auraient doublé sa quantité d’ADN.

Puis on réalise un repiquage en terre. Les grains des épis stériles sont ensuite récoltés et semés. En grandissant, ils
forment des plantes diploides 100% homozygotes.

 Ceci permet donc de réduire de qq années le cycle de sélection et donc d’accélérer l’obtention de
variétés parfaitement fixées.

Multiplication végétative conforme : méthode de réduction d’années de multiplication

Faciliter la connaissance du génome :

- Par l’établissement de cartes génétiques.
- Par sélection assistée par marqueurs moléculaires
- Principales méthodes utilisées : RFLP, RAPD, AFLP, microsatellites

3) Problèmes liés à l’utilisation des biotechnologies végétales :

Commission du génie biomoléculaire est créée en 1986. Elle regroupe des experts du domaine concerné de façon à
avoir un panel de personnes ayant un regard croisé sur la dissémination des OGM. Elle essaye d’estimer les
conséquences, et les éventuels problèmes dus à la production des OGM.

En 1996-1997 : les OMG furent une nouveauté sociétale, c’est leur sortie médiatique. La commission travaille donc
sereinement avec l’appui de la machine médiatique. Cette commission a donc eu des dossiers végétaux à étudier. Les
types d’OMG sont :

- Plantes
- Thérapies géniques
- Micro-organismes
- Produits recombinés

Sur les 450 dossiers, 360 concernaient des OMG végétaux (PGM) et le reste pour les autres. Les profils de plantes
concernés sont des plantes d’intérêt agronomique : le maïs, le colza et le tabac transgénique. Le tabac est le matériel
végétal de base sur lequel les plantes ont été mises en culture ce qui explique l’intérêt que lui a porté la commission en
1987. Cependant, il a ensuite été doublé par les autres plantes. Donc tabac = plante modèle. Le soja transgénique est
moins utilisé en raison de sa faible présence en France, car on en cultivait peu.

Type de modification génétique le plus présent au niveau de ces OMG : résistance ou tolérance aux herbicides ou aux
insectes. Donc faire en sorte que le travail de l’agriculteur soit facilité et amélioré. Exemple : le colza et la chicorée
male stérile sont pensés pour faciliter la vie des sélectionneurs.

Le maïs est une plante dioique : les gamétophytes males et femelles sont bien séparés sur la plante. On enlève donc
directement la partie male manuellement. On diminue ce risque d’autofécondation.

Pour le colza et la chicoré, ils ne sont pas dioques donc impossible d’enlever l’élément male. Donc production OMG
male stérile.

Risques associés à la culture au champ de plantes transgéniques :

La technique de transgénèse n’est pas « en soi » un facteur de risque. Intrinsèquement c’est dangereux comme tout,
mais comme tout il suffit d’être conscient des différentes formes de danger.

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Un risque : c’est la probabilité de survenue d’un danger. En effet, chaque OMG étant différents l’évaluation des
risques doit se faire « au cas par cas ».

Risques associés à la culture au champ de plantes transgéniques (selon la CGB) : (des plus gros au moins gros
risques pour la santé)

- Risques toxiques : pour limiter ces risques on réalise des tests toxicologiques

- Risques allergiques : exemple : le soja est pauvre en aa soufrés. Donc des chercheurs ont cherché à faire
produire au soja des protéines « soufrées ». Ces protéines étaient présentes dans la noix du Brésil. Les tests
toxicologiques ont démontré un profil de ce soja très allergisant en raison de la présence du soufre provenant
de la noix.

- Risques nutritionnels : on compare l’OMG avec le non OMG. En faisant des analyses comparatives on relève
le principe d’équivalence en substance

- Risques écologiques :

 Fuite de gènes

Fuite de gènes : (potentielle réalité) : gène qui peut se retrouver ailleurs que dans la plante mère. Ex : Maïs va devenir
résistant/tolérant à un herbicide grâce à un transfert de gènes. Si cette capacité vient à fuiter vers une autre plante
comme une mauvaise herbe (fuite de gène) présente dans le champ de maïs, on ne pourra donc plus détruire cette
mauvaise herbe avec cet herbicide  risque d’envahissement de la mauvaise herbe  risque économique et
agronomique. Ce risque est réel puisqu’une plante dissémine son pollen et donc ses gènes qui peuvent être récupérés
par d’autres plantes. Pour gérer ce risque (le fait que la mauvaise herbe soit devenue résistante) on cherche un autre
herbicide capable de détruire cette mauvaise herbe  risque gérable. Ce risque n’est pas uniquement lié aux OGM
mais il existe depuis longtemps et ce notamment à cause du développement de produits chimiques.

Pour qu’il est fuite de gène vers une autre plante, il faut qu’il ait un croisement (reproduction sexuée) entre le maïs et
la mauvaise herbe. Or on ne peut pas croiser n’importe qu’elle plante ensemble, il faut que les 2 espèces soient
génétiquement proches. Or le maïs n’est pas originaire de France donc en France il n’y a pas de plantes génétiquement
voisines d’autres.

Ex : colza rendu résistant à l’herbicide mais cette fois cette plante possède plein de plantes voisines (ex : moutarde,
ravenelle = mauvaises herbes) donc ici capacité de transmettre gène résistant à l’herbicide.

 Effets toxiques sur population non cibles

Le gène transgène va tuer des populations non cibles au départ. Ex : maïs rendu résistant à un insecte (larve) : la
Pyrale  plante est devenue capable de tuer les larves de cet insecte car plante a acquis une nouvelle molécule
toxique/mortelle pour les larves mais pas pour le maïs Bt. Mais est ce que cette toxicité pour la pyrale ne pourrait pas
aussi avoir des effets sur d’autres insectes comme les abeilles ? En effet, les abeilles bon pollinisateur du maïs Bt mais
aussi de nombreuses plantes. Pour gérer ce risque on va chercher à savoir s’il y a présence de cette molécule toxique
Bt dans le nectar + vérifier que cette molécule n’est pas toxique pour les autres insectes mais aussi pour l’homme. En
revanche risque important de déséquilibre pour l’insecte.

Bt : molécules toxiques transmise

 Sélection d’agents pathogènes résistants

Ex : mon maïs est performant et je le cultive sur millier hectare alors j’impacte de plus en plus la population de pyrale
qui dans le pire des cas peut disparaître mais le plus probable : je vais faire progressivement apparaître les conditions
22
de sélections de résistances (apparition de nouveautés génétiques : devient résistants = pression de sélection) à cette
molécule toxique Bt. La population non résistante de pyrale va continuer de diminuer tandis que la nouvelle résistante
va continuer de se développer. Conséquences écologiques : changement des populations de pyrales (mutations). Mais
risque économique et agronomique : les pyrales résistantes vont être de plus en plus nombreuses et donc vont pouvoir
manger le maïs avec la molécule Bt  donc maïs n’est plus protégé et va pouvoir être mangé par les larves.
Problématique non nouvelle. Pour contrer ce risque il ne faut pas cultiver uniquement du maïs Bt mais au contraire
différents types car il est peu probable que la pyrale acquière en même temps plusieurs résistances à des molécules
toxiques différentes.

 Chaque OGM doit être interrogé au cas par cas

Conclusion CGB : le niveau de risque a été gradué en trois niveau

- 1er niveau (le plus faible) : global de transgènes qui ne confèrent pas d’avantage sélectif à l’organisme qui le
possède. Ex : les plantes stériles  organisme incapable de produire du pollen et donc de se reproduire 
population vouée à disparaître  donc transgène qui n’a aucun risque écologique même s’il fuite puisque le
mécanisme va se bloquer tout seul puisque non reproduction.

- 2ème niveau (intermédiaire) : transgènes susceptibles de conférer un avantage sélectif mais dans des
conditions/circonstances particulières uniquement. Ex : résistance aux herbicides  situation particulière =
épandage de l’herbicide idem pour le cas de la pyrale circonstance particulière = larves en train de manger le
maïs.

- 3ème niveau (le plus élevé) : transgènes qui confèrent/provoquent en permanence un avantage sélectif quel que
soit les circonstances. Ex : un individu qui croît plus vite = gain de vigueur, de production. Donc tous les
avantages qui accroît le rendement. Pas d’exemple à citer car on n’est pas capable de le faire car il est
nécessaire de connaitre l’origine génétique (gènes) en cause dans le gain de productivité d’une plante. On ne
sait pas quels gènes sont en jeu (ils sont très nombreux), on ne peut donc pas les sélectionner et les extraire.

Intérêts potentiels à développer des plantes génétiquement modifiées (OGM)

- Diminution de l’utilisation de pesticides : si OGM possède déjà dans son génome la résistance à un pesticide
- Augmentation des rendements  nourrir population mondiale
- Ressources de connaissances scientifiques
- Transformer un organisme végétal en usine de production de molécules à valeur ajoutée comme pour
l’industrie pharmaceutique
- Développer des plantes avec des capacités de dépollution des sols (inactiver polluants dans le sol) 
augmenter rendement de dépollution.

23
 Biotechnologies animales et amélioration animale (et humaine ?)

Stratégies générales : en amélioration génétique des animaux

Sélection massale : basée sur l’observation et le repérage d’individus élites apparus spontanément lors de
reproductions sexuées aléatoires.

Sélection généalogique : sélection orientée par l’homme, en « choisissant » les parents d’un croisement sexué.

Objectifs généraux : Augmenter le « champ des possibles » de l’utilisation des animaux

- Pour le producteur/agriculteur (résistance aux maladies)

- Pour les transporteurs (meilleure usage industriel)
- Pour le distributeur (meilleure conservation)
- Pour le consommateur (meilleur goût)

GROS PROBLEME DE TOTIPOTENCE

Aujourd’hui on ne sait toujours pas créer en culture in vitro un nouvel animal.

Chez les cellules animales la totipotence se perd très rapidement (au bout de 5/7 jours). Les cellules deviennent
rapidement pluripotentes. Seules les cellules souches sont totipotentes = peuvent donner naissance à un organisme
nouveau entier VS pluripotentes = peuvent se multiplier à volonté et donner un type cellulaire (ex : fois…). Puis ces
cellules deviennent à leur tour multipotentes = cellules spécialisées dans un genre tissulaire (endoderme,
mésoderme…). Puis elles deviennent unipotentes = ne donnent plus qu’un type cellulaire  cellules spécialisées =
matures et différenciées.

 Donc champ d’utilisation des cellules pour former un nouvel individu est extrêmement restreint.
24
Totipotence c’’est un nombre maximal de gènes actifs et minimal de degrés de différenciation. Cette précocité de
perte de totipotence est propre aux cellules animales et est liée au fait que le nombre de gènes actifs diminuent et le
degré de différenciation augmente au court du temps.

 Nombres de techniques pour créer nouveaux individus beaucoup moins nombreux

I- Transfert de gènes à des cellules somatiques

Transformation génétique de cellules somatiques n’a aucun effet car on ne pourra jamais régénérer un individu
nouveau complet. Mais il est possible de prélever des cellules, les mettre en culture in vitro pour des besoins
pharmaceutique = thérapie génique = modification des cellules du malade pour modifier les gènes « malades/atteints »
et ensuite les réintroduire dans l’organisme de départ. Mais la réintroduction de ces cellules « guéries » est complexe
puisque ces cellules doivent recoloniser les cellules de l’organe touché (malade). Autre problème : comment/et avec
qq types de gènes je transforme les cellules pour les guérir.

Comment transforme -t-on des cellules animales ?

On n’a pas de vecteur biologique comme chez les plantes. On peut alors passer par les virus mais aussi par la micro-
injection directe de plasmide dans une cellule. Le transfert par virus est dangereux (ex : rétrovirus sida) car il s’agit de
pathogène. On doit donc au préalable les désarmer, mais on ne peut pas toujours désarmer l’intégralité de ses aspects
pathogènes.

 Utilisation en médecine reste encore en élaboration

II- Transfert de gènes à l’embryon

Il faut intervenir très précocement = post fécondation

Il faut prélever la cellule œuf sur la mère au stade pronucléi = noyau mâle et femelle pas encore fusionner mais pst
dans une même cellule. Je micro-injecte dans un noyau une solution de plasmide puis j’implante dans l’oviducte la

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cellule œuf modifiée. Obtention descendance qu’il faut contrôler pour vérifier qu’elle a bien intégrer le plasmide/la
transformation.

Même technique mais cette fois sur des lapins. Ici seuls 2 lapins ont hérité de la modification sur les 6.

Chez la souri le taux de réussite avoisine les 10% de réussites  taux de rentabilité relativement faible puisqu’à
chaque fois il faut récupérer ovocyte = travail conséquent.

On cherche à contourner ce pb de rendement en augmentant le nb de cellules prélevées au départ pour augmenter

rendement. Donc cette fois on récupère cellules qui ont commencé à se diviser = cellules souches embryonnaire
(cellules ES). On les met en culture (on a une population de cellule)  micro-injection ou injection plus globale
(puisqu’on a plus de cellules) par liposomes = vésicules fabriquées pas homme qui contient plasmide qu’on veut
transférer  vésicules vont fusionner avec la membrane des cellules  on provoque la transformation des cellules 
contrôle = trie des cellules qui ont été modifiée = sélection des cellules ES ayant les gènes étrangers 
réensemencement des embryons avec les cellules transformées.

 Mais je réintroduis mes cellules parmi des cellules non transformées (ici introduction de blastomères de
souri grise chez un blastocyste de souri blanche) = obtention animal chimère (ici souri avec tâches
blanches et grises car les différents amas cellulaires : les modifiés et les non modifiés se sont développés
chez le nouvel individu)

 Technique aléatoire, transgénèse

 Actuellement seule les AGM animal génétiquement modifié sont possibles pour former de nouveaux
organismes mais technique qui a une limite : on a apporté au nouvel organisme le gène d’intérêt mais
nécessite fécondation gamètes parents et donc très aléatoire : on a choisi deux parents mais obtention
zygote avec le gène d’intérêt aléatoire donc nécessité nouveau croisement sexué pour être sur obtenir
souche avec caractéristiques recherchées

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Comment je fais pour commercialiser/multiplier l’individu en question ? puisque toujours reproduction sexuée donc
différent de clonage

III- Techniques de clonages

Technique de clonage repose sur la sélection de mammifères intéressants. Premier individu cloné révélé au public en
1996 = brebis Dolly = premier animal obtenu par transfert de noyaux somatiques = production à l’identique d’individu
adulte = clonage

Intervention de 2 brebis = une à tête blanche (réelle donneuse celle qui va être clonée) et une à tête noire. On prélève
cellules glande mammaire = cellules somatiques de la blanche et on les met en culture in vitro en milieu pauvre =
milieu stressant  donc cellules modifient leur mode de développement cellulaire  elles se sont mises en G0 = arrêt

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des divisions = stade quiescent. Simultanément prélèvement chez noire d’ovocytes haploïdes. On l’énucléé (enlève
noyau) par aspiration du noyau  contexte cellulaire avec tous les organites exceptés le noyau.

Puis on stimule électriquement les ovocytes anucléés qui permet mise en commun cellules somatiques à 2n et cellules
ovocytes = reconstitution artificielle d’un ovocytes fécondé 2n avec ici 100% infos génétiques d’origine d’un parent et
donc avec caractéristiques que d’un parent.

Choc électrique = embryon = remise en contexte dans un organisme maternel. Il faut un certain nombre d’ovocytes
fabriqués in vivo et implanté chez mère pour obtenir un seul clone car certains embryons ne vont pas réussir
l’implantation (avortement d’embryons).

 Obtention d’un clone = individu nouveau génétiquement identique à un individu initial adulte et donc
dont on connaît les caractéristiques VS transgénèse !

 Cette technique sera ensuite étendue à d’autres animaux

Dolly a aussi permis de progresser sur de nombreuses connaissances : extrémités des chromosomes équipés de
télomères = horloge biologique. En effet, Dolly est née avec des télomères déjà âgées puisqu’elle a récupéré des
chromosomes déjà âgés  implique développement précoce de certaines pathologies/maladies.

Attention Dolly pas à 100% identiques à l’organisme de base : puisque mise en commun des contenus cytoplasmiques
de 2 individus différents (noir et blanc) = mitochondries apportées par noir bien plus important que par blanc =
hybridation de matériels génétiques = il existe des pathologies mitochondriales.

IV- Application du génie génétique aux animaux d’élevages

1- Sexage des embryons

Exemple pour un producteur de bovin :

- Cherche à avoir davantage de vache femelle si produit du lait
- Cherche à avoir davantage de vache mâle si produit de la viande

On va donc chercher à déterminer le sexe au préalable développement embryon pour ne faire développer/grandir
qu’organisme intéressants

2- Marquage du gène d’intérêt = technique de SAM

3- Intérêt d’utilisation d’animaux transgéniques

 Transformer un organisme animal en modèle de pathologie humaine : ce qui va permettre de tester sur animal
de nouveaux remèdes mais aussi de mieux comprendre une pathologie.

 Xénogreffes : actuellement problème de disponibilité d’organe humain donc on va chercher organes sur un autre
organisme non humain : le porc = production biologique d’organes de remplacement pour l’homme. Mais
questions éthiques mais aussi des problèmes : plus conditions de rejets plus importantes puisque non
reconnaissance des cellules = non soi. Autre problème risque de transfert de pathologie = transfert d’un organe
entier avec possibilité de posséder des pathologies quasis indétectables. Aujourd’hui encore en recherche = pas
encore développée et répandue.

 Transformer un organisme en producteur de molécules à hautes valeurs ajoutées type médicament. Exemple
production dans le lait de protéines médicamenteuses. Hormones de croissance humaine est fabriquée/produite par

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 des bactéries modifiées génétiquement ce qui a permis de produire en laboratoire hormone de croissance « pure »
non porteuse de maladie/gènes défaillants.

Autre « axe d’utilisation des cellules animales et surtout humaines :

la médecine : thérapie cellulaire/génique

Les cellules souches :

- Embryonnaires ES

- Somatiques adultes : petits massifs cellulaires capables de régénérer certaines cellules qui vont
préférentiellement renouveler les cellules du cerveau, foie…

- iPSC (induites par modifications génétiques) : cellules souches induites par modifications génétiques pour les
rendre comparable à des cellules souches somatiques.

- STAP (induite par stress cellulaire) : non modifiées génétiquement mais stressées. Elles vont donc retourner à
un état de cellules souches pluripotentes.

Comment les cellules souches pourraient nous guérir ?

1) Mise en culture de cellules souches

2) Intervention sur cellules
3) Réimplantation dans organisme receveur/malade

 Thérapie cellulaire

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Critique : on utilise des embryons humains qu’on va détruire pour réaliser cette technique questions éthiques ?
Question aussi de la propriété de ces cellules ?

Pour répondre à critique embryon utilisation on va aller chercher des cellules souches somatiques adultes : mais
« potence » plus faible en général seulement multipotence obtenue en culture + difficultés variables de prélèvement de
ces types de cellules dans l’organisme (en effet cellules souches présentes sous forme de petits amas cellulaires)

Donc mise en place d’une nouvelle technique :

Cellules souches pluripotentes induites iPSC : retransformer une cellule du malade = rajeunir une cellule pour les
rendre pluripotentes = médecine régénératrice. Technique découverte et mise en place par Yamanaka. Il a montré que
seulement 4 gènes sont indispensables à la reprogrammation cellulaire : OCT4, SOX2, C-MYC, KLF4.

Les cellules iPSC semblent être le matériel idéal pour lancer des thérapies cellulaires mais on remarque que le
développement de ces cellules a induit le développement de certains cancers = prolifération cellulaire non maîtrisées.

CRISPR cas9 : technique mise au point en 2012 par deux femmes. Elles ont mis au point une technique de courtes
répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées. Cas9 = enzyme qui dégrade double hélice d’ADN =
endonucléase. Technique qui va révolutionner l’obtention de modifications génétiques au sein des cellules animales
mais aussi végétales (AMG/OMG). En effet, elle va gommer incertitude du devenir du gène d’intérêt dans le nouvel
organisme : je vais pouvoir choisir l’endroit ou je l’implante.

On cible une zone et pour cela par CRISPR cas9.

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Thérapie cellulaire risque aussi d’être révolutionnée puisqu’on va pouvoir sélectionner/cibler endroit de mise en place
du nouveau gène mais aussi couper le gène défectueux pour le remplacer par un gène réparateur/fonctionnel. Mais
encore très compliquer à réaliser concrètement.

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CC2 Biocellulaire dernière semaine de noël = oral

Sujet : chercher un OGM végétal

- Notation sur pertinence du choix : plus le sujet est original et illustrant possible d’une technique ou bien fondé
de la chose. Etudié à 100% OGM : comment on l’obtient (sauf si trop redondant par rapport au cours), intérêt
production, utilisation actuelle/future = risques intérêts critiques Q et pb que ça soulève = apporter discours
scientifique mais aussi personnelle (avancée ou dangereuse)

- Envoyer par mail notre choix d’OGM au prof en étant le plus précis possible : nature de la transformation et
organisme transformer

- Vérifier qu’on a assez de matière pour parler 20min

- Se chronométrer !!!! être capable de parler sans papier

Temps d’oral : 20 min + temps variable d’échange avec l’auditoire mais possible de poser des questions au cours de
l’oral + prise de conscience de nos défauts/qualités + durant échange il faut participer poser des questions-critiquer
pour avoir points bonus + attention si non écoute des oraux points malus

Nombre de diapo selon temps oral : attention images/vidéos doivent être libres de droits d’auteur

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