Cours Test ELISA

Dr. KACEM N.
S
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

ou
test d'immuno-absorption enzymatique
Histoire:
La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par deux
scientifiques suédois, Peter Perlmann (investigateur principal) et Eva
Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.
A la fin des années 60, Stratis Avrameas et GB Pierce mettent au point la

technique d'immunoenzymologie, technique d'analyse par réaction entre
antigènes et anticorps et utilisant comme marqueur des enzymes.
Principe:
La technique ELISA est une technique immuno-enzymatique de

détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce
à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme
préalablement fixée à l'anticorps.
Le test ELISA indirect:
Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
Il se réalise en 4 étapes:
1. La première étape appelée "coating" de l'antigène
2. La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser
3. La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de
détection.
4. La quatrième étape consiste à révéler les anticorps
fixés
Première étape
Elle consiste à incuber (à 4°C pendant une nuit) dans

des puits, la solution d'antigène spécifique de
l'anticorps recherché.
La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait
électrostatiquement.
Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les
antigènes en excès avec du tampon de lavage.
Deuxième étape
Incubation de la solution d'anticorps à doser.

Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène.
Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les
anticorps à doser en excès avec du tampon de
lavage.
Troisième étape
• Incubation de la solution d'anticorps de détection

• Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les
anticorps à doser.
• Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de
détection en excès avec du tampon de lavage.
• Les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en
présence de son substrat le transforme en produit de réaction
détectable et mesurable grâce à l'apparition d'une coloration.
Quatrième étape
On incube à température ambiante et à l'obscurité une

solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme.
L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la

présence de l'anticorps à doser.
L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité

d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps
recherché.
un résultat qualitatif indiquera la présence ou
l'absence d'un antigène dans l'échantillon. Les
valeurs-seuil sont déterminées par l'analyste et
peuvent être basées sur la statistique.
dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densité

optique ou les unités de fluorescence de
l'échantillon sont interpolées sur une courbe
d'étalonnage.
Comparaison des mécanismes réactionnels
de différentes techniques
Traceur
Anticorps secondaire
Anticorps primaire
Antigène
Plaque de Feuille de
Echantillon polystyrène nitrocellulose
ICC ELISA IMMUNO-BLOT

La technique ELISA compétition
La technique utilise une protéine à rechercher

immobilisée sur un support plastique et un anticorps
spécifique conjugué à une enzyme qui est révélé par
l’addition d’un substrat qui se colore.
Ce système de révélation est mis en compétition par

une mise en présence préalable d’un échantillon à
doser avec l’anticorps conjugué.
L’anticorps conjugué est alors bloqué par la protéine
recherchée et n’est donc pas révélé sur le support
plastique.
Ce système fonctionne à l’envers dans le sens où plus
il y a de protéine présente moins il y a de coloration.
Avantages de la technique
L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.

Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
technique accessible à tous les biologistes.
La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage
spécialisé.
La validité des trousses est d'environ un an.
Inconvénients de la technique
 La limite de détection est moins bonne que la radio-immuno-assays: RIA.

La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température,
du pH et de l'éclairement.

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Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

A la fin des années 60, Stratis Avrameas et GB Pierce mettent au point la

La technique ELISA est une technique immuno-enzymatique de

Elle consiste à incuber (à 4°C pendant une nuit) dans

Incubation de la solution d'anticorps à doser.

• Incubation de la solution d'anticorps de détection

On incube à température ambiante et à l'obscurité une

L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la

L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité

dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densité

ICC ELISA IMMUNO-BLOT

La technique utilise une protéine à rechercher

Ce système de révélation est mis en compétition par

L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.

 La limite de détection est moins bonne que la radio-immuno-assays: RIA.

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