Le document décrit le protocole d'extraction de l'ADN à partir de sang total, y compris les étapes de lyse des globules rouges et blancs, de séparation des protéines et de précipitation de l'ADN.
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Le document décrit le protocole d'extraction de l'ADN à partir de sang total, y compris les étapes de lyse des globules rouges et blancs, de séparation des protéines et de précipitation de l'ADN.
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TP 02 de biologie moléculaire :
L’extraction de l’ADN à partir de sang
totale
Préparé par : EL Habchi Yamina Bel Hamel Batoule Boucharaub choubaila Ferrag marwa
Dr : karouche
2023/2024 L’introduction : L’extraction de l’ADN est une technique permettant d’isoler l’ADN des cellules ou des tissus. L’ADN ainsi extrait peut ensuit être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telles que le séquençage, la PCR ou le clonage .il existe différents protocoles pour extraire l’ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe : Lyse des cellules Elimination des protéines Elimination des autres acide nucléique (l’ARN) Le but : Extraction de l’ADN à partir de sang totale. Matériels : Le sang Bicher Seringue médicale Vortex Centrifugation Papier filtre Bain de marie Les glaces Sauter Les tombons bleu Les tube EDTA Les solution (A ; B ; C) de la lyse Micro pipette Tubes de centrifugeuse Congélateur à-80c°à-20c° Portoirs pour les tubes Chloroforme Éthanol à 70% Méthode de travaille : La lyse de L'ADN se fait à partir des G. Blanc Solution A (Ph=8) : Succrosé (0 ,32M) Tris Hel (2M). Mg cl(1M), tritox100(1%). Solution B(PH+8) : tris Hcl(2M). EDTA (500mM) Na cl (5), SDS (20L). Solution C : perchlorate de sodium (5M). Calcule : 200 ml d'eau distille = 0,2L Solution A(PH=8) PM = 342,29 g/ml x Masse molaire 0, 32Mx (0,02L) =2,19g Tris Hcl (2M) ; molarité PM =157,594*2M*0 ,02L=6,303g MgcL2 : 95,21*1M*0,02L=1,90g Triton :(1%) 0,2 ml du triton (liquide) dans 20md d'eau distillée. Solution B : pH=8 Tris Hcl : 6,303 g. -EDTA : PM = (292, 242x0,5Mx0,02L) =2,92g -Na cl = 58,44x5M*0,02L =5.844g -SDS (20%)20g*20/100M=4 Solution C= 10 ml -perchlorate de sodium 5M 122, 44x5x0,012 = 6, 12g. Protocole : 1/ lyse des GR = sont détruits par choc hypnotique ménagé, le volume de 15 ml de sang est ajouté à 40 ml de la Solution hypotonique A. Le mélange est agité délicatement est puis centrifuger à 3000pm/15mm Le culot Blanchette obtenu correspond aux GB. En recouper le culot qui contient les leucocytes 2/ Lyse des GB : Le culot obtenu est suspendu dans un Volume de 2ml d’une solution B, le mélange est vortex pendant plusieurs Secondes pour bien remettre en suspension. Transférer la Suspension dans un tube de 15 ml. 3 /La protéinasion : Les protéines sont déprotéinisé par L’action du perchlorate de Sodium (solution C) 500 ul est ajouté au tube contenant le lysat puis incuber pendant 30-45 min a 65°c sous agitation douce. 4/ Extraction d'ADN : Un Volume de 2 ml de chloroforme (-20°c) est ajouté à la suspension. Celle-ci est agitée puis centrifugée à 2000pm/5 minutes. La phase Supérieure dite aqueuse est transférée dans un nouveau tube de centrifugation de 15 ml... 5/ Précipitations d'ADN 2 Volume d'Ethanol absolu conservé à 20°C Sont ajoutes. Les tubes sont agités doucement par retournement jusqu’ a la formation de la méduse d’ADN. La méduse est récupérée dans un tube appendre contenant de l'éthanol a 70% pour être laver.
Résultat : la solution Le but résultat La solution La lyse des A globules rouges
La solution La lyse des
B globules blancs La solution Séparation c des protéiens LA DO : 260nm=1,23 280nm=1,068 Donc : 1,23/1,068=1,15 Donc l’ADN est contaminé au protéine La conclusion : En conclusion, l'extraction de l'ADN à partir d'une cellule sanguine est une technique cruciale en biologie moléculaire qui permet aux chercheurs d'étudier le génome des individus et de comprendre les maladies génétiques. Les différentes méthodes disponibles offrent une grande flexibilité pour répondre aux besoins des expériences et des applications spécifiques.
