Règles de base pour travailler en toute sécurité dans un

laboratoire de microbiologie

I. Les précautions générales

1. Le port d’une blouse de laboratoire ou de tout autre vêtement de protection est obligatoire
dans le laboratoire de microbiologie
2. Avant toute manipulation, il est conseillé de se laver soigneusement les mains
3. Il est interdit de boire, de manger, de fumer, d’utiliser des produits cosmétiques ou
d’entreposer de la nourriture dans les zones de travail
4. Les cheveux doivent être attachés
5. Il est interdit d’utiliser des pipettes à bouche
6. Les fenêtres et les portes des zones de travail doivent être fermées pendant le travail
7. Il y a lieu de limiter autant que possible le dépôt et l’utilisation d’objets personnels (ex.
sacs, téléphones portables, etc.) dans la zone de travail
8. Les zones de travail doivent être parfaitement en ordre. Les paillasses ne doivent
comporter que les appareils et le matériel effectivement employés. Les réserves ne sont
stockées que dans les zones ou les armoires prévues à cet effet
9. Il convient de travailler en condition d’asepsie. Les postes de travail sont organisés autour
d'un bec Bunsen. La flamme doit rester allumée en permanence : de cette façon, les
microorganismes de l'atmosphère sont entraînés vers le haut par le courant d'air chaud et
ne risquent pas de se déposer sur le matériel utilisé. La flamme est également utilisée pour
stériliser les instruments.
10. Il est interdit de jeter des déchets chimiques et biologiques dans les éviers → utilisez les
flacons de récupération mis à disposition
11. les vêtements de protection doivent être enlevés avant de quitter les zones de travail. Il est
interdit de fréquenter avec une blouse de laboratoire les lieux ou l’on sert ou consomme
de la nourriture.
12. Il convient de se laver soigneusement les mains une fois le travail terminé ou avant de
quitter la zone de travail et, le cas échéant, de les désinfecter; veiller à une bonne
protection de la peau.

1
 13. Le non-respect des différents points de ce règlement et des consignes de sécurité peut
entraîner l'exclusion totale des travaux pratiques de la microbiologie.

II. Précautions à prendre pour l’hygiène de la paillasse et de la hotte

Avant d’entreprendre toute manipulation, il est indispensable de prendre certaines précautions
d’asepsie afin d’éviter des contaminations extérieures et de travailler le plus proprement possible.
La paillasse sera nettoyée à l’alcool, avant le début de chaque manipulation, ainsi qu’à la fin des
TP.

III. Précautions à prendre lors de la manipulation

- Veiller à la propreté absolue des mains.
- Ne jamais ouvrir de flacons, de tubes, de boites de Pétri, hors de la zone stérile du bec Bunsen.
Même ouverts dans cette zone stérile, ne jamais les tenir verticalement, mais inclinés à 45°
environ.
- Pendant les manipulations, il est préférable de garder les bouchons dans les mains. Ne pas les
poser sur la paillasse.

IV. Précautions à prendre avec les déchets

Tout le matériel contaminé à usage unique (gants, oses, boites de Pétri, pipettes) doit être jeté
dans des sacs prévus à cet effet.
Les lames et lamelles seront placées dans des pots spécifiques contenant de l’eau de javel. Les
papiers sont à jeter dans les poubelles classiques.
Ne rien jeter dans les éviers.

V. Avant de quitter la salle, vérifiez :

Microscope :
- lumière éteinte
- pas de lame de verre sur la platine
- objectif à immersion essuyé
Paillasse nette et propre :
- pas de taches de colorants
- pas de débris de verres
- pas de matériel contaminé…

2
 Les manipulations stériles

Le travail en conditions stériles en microbiologie nécessite :

- D’éviter toute contamination du produit à examiner (par les bactéries de l’air, des
mains…)
- D’éviter toute contamination du manipulateur par le matériel à étudier (surtout les
bactéries pathogènes).

I. Installation d’un poste de travail

Au milieu de la paillasse et à 20 cm du bord se situe le bec Bunsen qui est un instrument destiné
à assurer les conditions indispensables d'asepsie (destruction locale et immédiate par la chaleur
des microorganismes se trouvant sur les objets manipulés et dans l'air ambiant).

- Utilisation du bec Bunsen

Enflammer le gaz, la virole (permet le réglage de l'arrivée d'air et de moduler la température de la
flamme) étant fermée, puis, à l'aide du robinet d'arrivée du gaz, régler son débit pour obtenir une
flamme d'environ 10 cm de hauteur.
On distingue quatre sortes de flammes :
1- la flamme éclairante (comme pour les briquets) obtenue avec une virole fermée
2- la flamme douce (de couleur bleue orangée)
3- la flamme moyenne (on ne la voit quasiment pas)
4- la flamme forte (on ne la voit pas, mais on l'entend très bien)
Pour travailler en asepsie, il faut tourner la virole pour obtenir la flamme forte.

3
Un cône bleu clair doit se former. C'est à son extrémité que la flamme est la plus chaude.
L'échauffement de l'air autour de la flamme assure une zone de convexion de 10-15 cm autour du
bec dans laquelle l'air est stérile. C'est dans cette zone qu'il faut se situer pour travailler.

Tout le matériel utilisé pour ensemencer doit être préalablement stérilisé :

- porter l'ose de platine au rouge en la passant dans la flamme, en commençant par la vis puis le
fil et la laisser refroidir à proximité du bec avant usage.
- stériliser la surface des pipettes Pasteur par 2-3 passages successifs au dessus de la flamme (ne
pas les maintenir dans la flamme sinon le verre fond). Laisser refroidir à proximité du bec avant
usage. (Après usage, les pipettes Pasteur ne sont pas réchauffées, mais directement jetées dans un
bac contenant un décontaminant comme l'eau de javel).
A gauche du bec Bunsen, on y trouve le matériel sur lequel le travail doit être effectué :
- Produit à étudier (contenant le ou les microorganismes).
- Milieux de culture : en boite de Pétri et en tubes qui seront regroupés sur des portoirs.
- Etc ...

4
A droite du bec Bunsen, on y trouve les instruments avec lesquels le travail sera effectué :
- Les pipettes Pasteur : pipettes stériles à longue effilure terminale destinées le plus souvent
au transport stérile de produits liquides. Non graduées, elles sont achetées prêtes à
l'emploi. Elles sont à utiliser avec une poire d'aspiration.
- Les instruments métalliques :
 l'anse de platine ou ose, c'est l'instrument le plus utilisé. Le fil, terminé par une boucle de
2 mm de diamètre, sert pour les prélèvements et les ensemencements des produits
bactériens solides ou liquides.
 Une pince en inox : qui servira à manipuler les lames.
On y trouve un bac contenant de l'eau de Javel (3 degré chlorométrique): on y mettra tous les
instruments contaminés qui ne peuvent pas être décontaminés par la flamme du bec Bunsen, la
plus part du temps les pipettes Pasteur et les pipettes en plastique.

5
II. Quelques instruments du laboratoire

Bec Bunsen Boîtes de Pétri

Autoclave Öses en platine

6
Tubes et portoirs Agitateur vibreur (Vortex)

Pipette Pasteur

7
 Les techniques d’ensemencement

Afin de pouvoir identifier une espèce bactérienne de façon convenable, il faut faire des tests ou
des expériences dessus. Il est souvent utile d’avoir une quantité importante de bactéries. Pour
cela, on multiplie la souche en réalisant des ensemencements sur une gélose ou dans un milieu
liquide adapté.
Les principaux types d’ensemencements réalisés au laboratoire:
- ensemencement d’un bouillon
- ensemencement et isolement sur milieu gélosé

1- Ensemencement d’un bouillon nutritif

L’utilisation d’un bouillon permet une pousse rapide et homogène des bactéries. Cependant, il a
des désavantages. En effet, s’il y a plusieurs espèces bactériennes dans un prélèvement ou une
contamination extérieure, il est impossible de différencier les différentes espèces bactériennes
puisque les cellules se trouvent en milieu liquide donc mélangées…
La technique d’ensemencement d’un bouillon est par contre très simple :
- Stériliser l’instrument servant à prendre la souche bactérienne d’origine (pipette dans le
cas de bouillon, anse dans le cas d’une colonie)
- Prélever la souche à ensemencer
- Stériliser l’ouverture du flacon de bouillon stérile
- Ensemencer le bouillon à l’aide du prélèvement effectué précédemment
- Ré-stériliser l’ouverture du flacon de bouillon
- Stériliser l’instrument
Il ne reste plus qu’a incuber dans les conditions optimales de croissance.

2- Ensemencement et isolement des bactéries sur milieu gélosé

Isoler c’est séparer les divers microorganismes contenus dans le prélèvement initial.
Un isolement peut être envisagé pour :
Séparer des microorganismes différents au sein d’un mélange
Purifier une souche contaminée ou contrôler sa pureté

8
A- Cas de boite de Pétri

C’est le type de base des ensemencements.

En effet, il permet s’il est bien réalisé, d’obtenir des colonies isolées, donc d’obtenir des cultures
pures d’une espèce bactérienne.
Le principe de ce type d’ensemencement est d’épuiser un dépôt initial en faisant des étalements
successifs dans différentes directions, d’où le nom de la technique : par épuisement.

Deux techniques sont couramment appliquées :

3 ou 5 étalements successifs.
La technique en 3 étalements (méthode de Buttiaux):

- Dépôt initial de la souche prés d’un bord d’une boite de gélose adaptée à l’espèce désirée
- Étalement de ce dépôt en réalisant des stries serrées sur environ 1/2 de la boite
- Stérilisation de l’instrument d’étalement
- Étalement d’une partie des stries précédentes, après avoir fait tourner la boite d’environ
90°
Répétition des deux étapes précédentes 1 fois.

9
La technique en 5 étalements (méthode américaine) :

- Dépôt initial de la souche prés d’un bord d’une boite de gélose adaptée à l’espèce désirée
- Étalement de ce dépôt en réalisant des stries serrées sur environ 1/3 de la boite
- Stérilisation de l’instrument d’étalement
- Étalement d’une partie des stries précédentes, après avoir fait tourner la boite d’environ
50°
- Répétition des deux étapes précédentes 2 fois.
- Faire un Z final vers le centre de la gélose

Si la technique est correctement réalisée et si le dépôt n’est pas trop important, après incubation,
la boite doit présenter des colonies isolées en son centre.

10
B- Cas d’une gélose inclinée

Une pente de gélose est ensemencée en réalisant des stries transversales du fond du tube vers le
sommet de la tranche gélosée. La piqure en gélose profonde consiste à ensemencer un milieu
solide (ou semi-solide) en plongeant le fil droit, verticalement dans le milieu. L'inoculum (à la
pointe du fil) est ainsi distribué tout le long du trajet dans la gélose. On utilise ce procédé pour
inoculer en profondeur les zones micro-aérobies ou anaérobies du milieu ou pour l’identification
biochimique des bactéries.

11
 Notion des milieux de cultures

1- Définition
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se
multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du microorganisme étudié ce qui
implique :
- couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la source de carbone et
d’énergie ;
- présenter un pH voisin du pH optimal de croissance;

2- Les différents types de milieux

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences
nutritives des microorganismes.
On distingue généralement :
- les milieux synthétiques de composition exactement connue, qualitativement et
quantitativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour l’étude des bactéries autotrophes ou pour
étudier les besoins nutritifs d’un germe. Ils sont rarement utilisés en routine à l’exception de
quelques uns.
- Les milieux empiriques ou complexes de composition connue seulement avec approximation
car dépendant des matières premières utilisées : extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et
éventuellement liquides biologiques (sérum, sang…) mais qui conviennent aux microorganismes
étudiés. Ce sont les milieux les plus employés aujourd’hui. Exemple : LB, Columbia, Chapmen,
Tryptycase soja, Chocolat, …
Une autre distinction de milieu se fait par la consistance de ceux-ci. En effet, les micro-
organismes se développent parfaitement dans les milieux liquides mais l’isolement bactérien
nécessite des milieux solides afin de séparer les différents germes présents dans un prélèvement.
On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide. Le gélifiant le
plus utilisé est l’agar-agar ou gélose : il s’agit d’un polygalactoside sulfaté présentant la
propriété de former avec l’eau un gel solide à une température inférieure à environ 60 °C tout en
étant liquéfiable par ébullition.

12
3- Description de quelques milieux

a- Les milieux non sélectifs

On regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont
en général de préparation assez simple et généralement peu coûteux. Ces milieux contiennent une
base nutritive constituée de molécules azotées (acides aminés, facteurs de croissance diverses…)
provenant de l’hydrolyse de produit d’origine vivante (animale, végétale, mycélienne) comme les
peptones, les extraits de viande ou de levure.
Souvent, les milieux non sélectifs comportent une molécule et son système de révélation (sucre le
plus souvent) ce qui permet une première discrimination des genres mais ce n’est pas obligatoire.
Exemple : La gélose Mueller-Hinton
Infusion de viande de boeuf 300 ml.L-1
Peptone de caséine 17.5 g.L-1
Amidon de maïs 1.5 g.L-1
Agar 17 g.L-1
Préparation :
• 38 g par litre.
• Stérilisation à l'autoclave.
Pour préparer ce milieu il faut peser 38g de poudre et la mélanger dans 1L d’eau. Il faut
homogénéiser puis chauffer en agitant. Il faut porter à ébullition pendant environ une minute.
Ensuite il faut stériliser la gélose à l’autoclave durant 15 minutes à 121 °C.

N.B : Pour préparer n’importe quel milieu de culture, il faut appliquer les conditions de
préparation décrites sur la bouteille qui contient le milieu, ensuite il faut le stériliser avant son
utilisation.

13
Cette gélose standardisée est la gélose permettant de tester l'action des antibiotiques sur les
bactéries. Elle peut être additionnée de sang (pour les Streptococcus), d'extrait globulaire (pour
Haemophilus), Elle doit être coulée en boîte de façon à obtenir une épaisseur de 4 mm. Il existe
un bouillon équivalent. Ce milieu permet la pousse de nombreux microorganismes.

b- Les milieux non sélectifs enrichis

Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en
molécules organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide d’ascite, de l’extrait globulaire, …
Les qualités nutritives peuvent être améliorées par dénaturation thermique des constituants, en
particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants.
Les plus utilisées sont les géloses au sang frais ou au sang cuit, et la gélose chocolat.
Exemple 1 : La gélose au sang
C'est une gélose rouge vif contenant des globules rouges (souvent du sang de mouton). Peu
sélective, elle permet cependant d'apprécier l'hémolyse qu'effectuent certaines bactéries. Les
bactéries capables de détruire complètement les globules rouges (ce qu'on appelle une hémolyse
bêta) formeront des colonies entourées d'une zone claire facilement visible sur la gélose rouge; si
l'hémolyse est incomplète (hémolyse alpha), la zone d'hémolyse sera moins claire et verdâtre.
Une hémolyse complète est visible entre autres dans le cas du Streptocoque du groupe A.
Le sang peut être d’origines diverses : cheval, mouton, lapin, homme, bœuf (attention certains
germes présentent un type d’hémolyse sur un sang et un autre type d’hémolyse avec un autre
sang). Il est à ajouter à raison de 5 à 10% au milieu de base (Columbia, Tryptycase soja, Mueller
Hinton, coeur cervelle). Celui-ci ne doit pas contenir de glucose, car il inhibe les hémolysines.

14
Exemple 2 : La gélose chocolat
Elle n'a rien à voir avec le chocolat. Sa couleur brune vient du sang cuit qui entre dans sa
composition. La gélose chocolatée est appropriée pour cultiver certaines bactéries capricieuses en
termes de facteurs de croissance. En plus des globules rouges cuits qui
libèrent des substances nutritives, la gélose chocolatée renferme souvent quelques additifs exigés
par certaines bactéries. On y ajoute aussi des antibiotiques destinés à interdire la croissance de
certains organismes, afin de mieux sélectionner les colonies à faire pousser. Cette gélose est
utilisée entre autres pour cultiver Neisseria gonorrhoeae et Haemophilus.

c- Les milieux sélectifs

Un milieu sélectif est un milieu qui permet de sélectionner le type de bactéries qui pourront
pousser sur celui-ci, alors que tous les autres microorganismes présents sont inhibés. Un milieu
de culture est rendu sélectif pour une espèce microbienne lorsque sont seules satisfaites les
exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce. Les
principaux facteurs de sélection microbienne utilisés seuls ou en association sont:
• La température d'incubation
• Le pH du milieu
• La faculté d'utiliser une source nutritive déterminée (azote, carbone)
• La résistance à l'action bactéricide d'un antiseptique ou d'un antibiotique
Plusieurs milieux sélectifs sont utilisés en microbiologie :

1) Le milieu Chapman
La gélose Chapman est le milieu sélectif des bactéries halophiles et plus particulièrement
fermentant le manitol.
Son pouvoir inhibiteur est obtenu par de fortes concentrations de Chlorure de sodium (7,5% ou
75g L-1) qui sélectionnent les microorganismes halophiles parmi lesquels figurent les

15
Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les Enterococcus, certains Bacillus, certaines
Levures et même de rares bacilles gram-.
Composition d'un litre de milieu:
Peptone 10 g
Extrait de viande de bœuf 1g
Chlorure de sodium 75 g
Mannitol 10 g
Rouge de phénol 0,025 g
Agar 15 g
Eau distillée 1l
pH 7,4

Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du mannitol comme source de carbone et

d'énergie. Il est mis en évidence grâce à un indicateur coloré de pH: le rouge de phénol. La
fermentation du mannitol est mis en évidence par virage au jaune du rouge de phénol autour des
colonies.
• Si le milieu reste rouge, les colonies sont mannitol - car elles ne fermentent pas le mannitol,
légère alcalinisation du milieu par l'utilisation de peptones dans leur métabolisme énergétique.
• Si le milieu devient jaune, les colonies sont mannitol + car elles fermentent le mannitol dans
leur métabolisme énergétique avec acidification du milieu.

Milieu avant incubation

16
2) Le milieu EMB (milieu éosine bleu de méthylène)
C’est un milieu d’isolement sélectif des entérobactéries. Il est utilisé pour isoler et identifier
Escherichia coli et Enterobacter ainsi que les bactéries intestinales à Gram -.

Composition d'un litre de milieu:

Peptone pancréatique de gélatine 10 g
phosphate dipotassique (PO4 K2H) 2g
lactose 10 g
éosine jaune 0,4 g
bleu de méthylène 0,065 g
Agar-agar 15 g
pH 6,8
Eau distillée 1 000 ml

Le bleu de méthylène et l'éosine jaune sont deux colorants inhibiteurs partiels des bactéries Gram
+ tel que les entérocoques. Ces colorants assurent la différenciation entre les germes fermentant
le lactose (lactose +) et les germes qui ne le fermentent pas (lactose -).

Lecture:

Escherichia coli:

Colonies violet foncé; bombées faiblement confluentes, de 2 à 3nmm de diamètre, à centre noir
étendu à plus des 3/4 du diamètre et qui présentent un éclat métallique verdâtre en lumière
réfléchie.
Enterobacter aerogenes:

Colonies bleuâtres à centre brun foncé, aplaties, plutôt confluentes, de 4 à 6 mm de diamètre qui
ne présentent qu'occasionnellement un éclat métallique.
Citrobacter:

Colonies violettes à léger reflet métallique.

Klebsiella:
Colonies brunâtres, muqueuses.

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Salmonella et Shigella:

Colonies ambrées, transparentes.

E. coli (gauche) et Enterobacter aerogenes (droite)

18
 Utilisation des milieux sélectifs

Utilisation des milieux sélectifs : milieu Chapman et gélose EMB pour l’indentification et la
différenciation entre E. coli et Staphylococcus aureus

Technique

Incubation des boites à 37° C pendant 24 heures.

Lecture des résultats

19
 La coloration de Gram

A- Principe
La coloration de Gram est la base de l’identification d’une souche bactérienne. Elle doit être
parfaitement maîtrisée car c’est le point de départ du choix des examens complémentaires à
effectuer, des milieux à ensemencer, etc…
Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives » apparaissent roses
tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont colorés en bleu foncé/violet.
(remarque : certaines bactéries telles que les Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le
même frottis, on les dit « Gram labiles » et les différences de coloration sont dues à des
différences d’âge des bactéries)
La coloration de Gram est une coloration qui teste l’alcoolo résistance d’une souche bactérienne.
En effet, les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de constitution de
la paroi :

Les bactéries Gram négatives ont une paroi plus fine que celles à Gram positives. De plus, cette
paroi est très riche en lipides (membrane externe de la paroi) dans laquelle l’éthanol est fortement
soluble…

B- Technique

1- Préparation du frottis de coloration

Un frottis est un étalement mince, homogène, sec et fixé de l’échantillon à colorer.

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Technique :
A partir d’une culture en bouillon :
Prélever une goutte de bouillon à la pipette ou à l’anse, la déposer au centre d’une lame propre et
sèche.
Etaler cette goutte par des mouvements concentriques partant du centre vers l’extérieur, afin
d’obtenir un frottis de 2 à 3 cm de long sur 1 cm de large.
Sécher le frottis au dessus de la veilleuse du bec bunsen ou près de celui-ci à l’air ambiant.

A partir d’une culture en milieu solide :

Dissocier une fraction de colonie dans une goutte d’eau physiologique stérile préalablement
déposée sur une lame.
Opérer comme avec un bouillon

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2- Coloration de Gram

Réactifs :
Cristal violet
Lugol (iode, iodure de potassium)
Alcool à 95°
Safranine
Technique
- Coloration : violet de gentiane phéniqué durant une minute. Toutes les bactéries prennent ce
colorant et sont donc colorées en violet.
- rincer à l’eau du robinet
- Mordançage : recouvrir la lame de réactif de Lugol 1 minute (réactif iodo-ioduré qui accentue la
coloration).
- Rincer à l’eau
- Epreuve (alcoolo résistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi seconde dans un pot d’alcool puis
rincer à l’eau du robinet immédiatement. Pendant cette étape, les lipides de la paroi des Gram
moins sont dissous et l’alcool peut donc pénétrer dans le corps bactérien et expulser le violet de
gentiane. Les bactéries Gram moins sont alcoolo-sensibles et sont donc décolorées. La paroi des
Gram plus ne laisse pas passer l’alcool et sont dites alcoolo-résistantes et restent colorées en
violet.
- Contre coloration : Fuschine diluée au 1/20ème ou de safranine pendant une minute. Toutes les
bactéries prennent le colorant mais le violet masque la fuschine. Les « Gram positives »
apparaissent donc violettes, les « Gram négatives », recolorées par la fuschine, apparaissent roses.
- Rincer à l’eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier absorbant.
- Observer à l’objectif 100 à immersion, à pleine lumière.
N.B : la coloration de Gram est parfois appelée coloration V.L.A.F afin de se rappeler les
colorants et dans quel ordre ils doivent être utilisés (Violet, Lugol, Alcool, Fuschine).

22
Gram + Gram –

23
 Tests biochimiques de l’identification bactérienne

Lors de l’identification d’une espèce bactérienne, certains critères permettent d’orienter notre
diagnostic de façon précise. Après la coloration de Gram, on procède à l’étude des propriétés
biochimiques des bactéries.
Dans cette séance de TP, on va mettre en évidence la présence de certaines enzymes spécifiques
comme la catalase, l’oxydase, la nitrate réductase…

1- Recherche de la catalase
La recherche de la catalase présente un intérêt taxonomique en ce qui concerne les bactéries à
Gram positif.

Principe
La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2)
avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante :

Technique
Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle on
ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes).

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Lecture
L’apparition immédiate de bulles de gaz est significative de la présence d’une catalase
Catalase + : effervescence.
Catalase - : pas d'effervescence.

Causes d’erreurs
Réalisation du test sans précaution à partir d’une gélose au sang : le sang possède une activité
catalasique, suspension bactérienne insuffisante, eau oxygénée périmée, souche « catalase faible»

2- Recherche de l’oxydase
La recherche de l’oxydase (ou cytochrome oxydase) présente in intérêt taxonomique en ce qui
concerne les bactéries à Gram négatif.

Principe
Ce test est à la base de l’identification des bactéries à Gram négatif. Il permet la détection du
cytochrome oxydase; enzyme entrant dans divers couples d'oxydoréduction. Agissant sur un
substrat incolore, cet enzyme entraîne la formation d'une semi-quinone rouge. Cette dernière, très
instable, s'oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre.

25
Donc, le test oxydase consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie à oxyder un réactif
incolore en un dérivé (semi-quinone) rose violacé.

Technique
Sur un papier filtre stérile, déposer un disque d'oxydase imprégné de diméthyl-para-
phénylènediamine.
Humidifier le disque avec quelques gouttes d'eau distillée stérile. Un excès d'eau peut nuire à la
lecture. À l'aide d'un cure-dent prendre la bactérie à identifier (culture de 18-24 heures) et la
déposer sur le disque.

Lecture
Apparition d'une coloration violette immédiatement : la souche est dite oxydase positive.

Causes d’erreurs
Réalisation du test à partir d’un milieu glucidique, un glucide ayant été attaqué : une fermentation
peut cacher une respiration…, quantité insuffisante de bactéries, humidification trop importante
du disque entraînant l’élimination du réactif, réactif périmé, instrument « oxydase+ » (certains
métaux) ou portant des traces de colorant violet…, lecture trop tardive : au-delà de 30-40
secondes, le réactif s’oxyde spontanément à l’air…

26
3- Recherche de nitrate réductase

Principe
L'étude de la réduction des nitrates se fait par la mise en évidence des nitrites formés. Ces
derniers en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rose.
L’enzyme nitrate réductase B catalyse la réaction des nitrates en nitrites (réduction assimilatrice).

Les nitrates peuvent aller également jusqu’au stade azote (N2). Dans ce cas, on doit compléter
par l'épreuve de Zoo Bell, épreuve qui consiste à ajouter de la poudre de zinc au milieu:
- si le zinc réduit les nitrates encore présents en nitrites, la coloration rose apparaît et la
réaction est négative (bactéries sans nitrate réductase)
- si au contraire, la teinte du milieu reste inchangée, le stade nitrite a été dépassé donc les
bactéries possédant un nitrate réductase très active.
Technique
A une culture en bouillon nitraté de 24 à 48h d'incubation à 30°C, on ajoute cinq gouttes de
réactif de Griess.
Après agitation, la lecture est immédiate.

Lecture
- coloration rose ou rouge: nitrates réduits en nitrites (nitrate réductase positive NR+).
- milieu restant incolore: ajouter un peu de poudre de zinc (réducteurs des nitrates) ; agitation,
inclinaison du tube de culture en position presque à l'horizontale et attendre cinq minutes avant la
lecture:
- si le milieu devient alors rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n'ont pas été
réduits par la bactérie: nitrate réductase négative NR-.
- si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactéries les ont réduit au-delà du stade
nitrites: nitrate réductase positive NR +.

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4- Etude du type respiratoire
Il s'agit de cultiver les bactéries à étudier dans un milieu de culture contenant un gradient de
pression partielle en oxygène.

Milieu de culture utilisé

On utilise le milieu viande foie (VF) coulé en longs tubes fins (des tubes de Prévot de 9 x 180
mm). Ce milieu, après régénération, est maintenu liquide et en surfusion pour expulser les gaz
dissous dans la gélose.
L’aération du tube, par dévissage partiel du bouchon, permet la pénétration progressive de
l’oxygène, ralenti par la présence de la gélose et assure la création d’un gradient de pression.

Technique

- Régénérer le milieu en le plaçant au bain-marie pendant 30 min à 100° C (pour éliminer tous les
gaz dissous) puis refroidir (maintenir en surfusion) 10 min à 45° C.

- Ensemencer en vrille du bas vers le haut à l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée.
- Solidifier à l’eau froide et incuber à 37 °C pendant 24 heures.
Solide, le milieu possède un gradient de concentration en O2 où il est plus abondant en surface.

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L'endroit où se trouvent les colonies dans le tube détermine le type énergétique :
1- Les aérobies obligatoires (strictes) nécessitant une teneur en oxygène moléculaire suffisante
pour pouvoir se multiplier
2- Les anaérobies facultatifs (exemple: Escherichia) ne demandent pas d’oxygène mais se
développent mieux en sa présence. Ils utilisent la respiration aérobie en présence d’oxygène.
3- Les anaérobies aérotolérants (exemple: Streptococcus pyogenes) ignorent simplement
l’oxygène et se développent aussi bien qu’il soit présent ou non.
4- Les anaérobies strictes ne se développant qu’en absence d’oxygène (exemple: Clostridium).
5- Les micro-aérophiles (exemple: Campylobacter) se développant uniquement lorsque la teneur
en oxygène moléculaire est réduite. Ces bactéries sont endommagées par les 20% d’oxygène de
l’air, mais elles requièrent une concentration inférieure située entre 2 et 10%.

N.B : Certains tubes sont difficilement lisibles en raison de la dislocation de la gélose par une
production de gaz excessive.

29
 Tests d’orientation pour identification bactérienne

L’identification d’un microorganisme est fondée sur des critères subjectifs. Quelle que soit la
qualité du travail réalisé et de la méthode d’identification utilisée, l’identification repose aussi sur
la présomption « a priori » du germe.
Toute la démarche technique d’identification peut être correcte mais aboutir à un résultat erroné.
C’est le regard critique du biologiste qui peut détecter cette erreur. Il se base sur la présomption
diagnostique a priori de l’espèce grâce à la connaissance de l’environnement au sens large et des
limites de la méthode d’identification.
Toutes les méthodes disponibles possèdent des limites qu’il est impératif de reconnaître. Il
n’existe pas une classification unique universelle mais des classifications. La reconnaissance des
espèces par les procédés d’identification est basée les propriétés phylogéniques ou biochimiques
de plusieurs souches jugées comme représentatives.
Une mauvaise hypothèse de départ peut conduire à un faux diagnostic sans qu’aucune erreur ne
puisse être détectée dans le processus d’identification.
La technique d’identification absolue est l’hybridation ADN/ADN, mais elle n’est pas utilisable
en routine.

Etude de la famille des Enterobacteriaceae

Les Entérobactéries (Enterobacteriaceae) constituent l'une des plus importantes familles de
bactéries, autant du point de vue quantitatif (plus d'une quarantaine de genres) que du point de
vue qualitatif. Elle regroupe ainsi de nombreux genres, très ubiquitaires, et ceux-ci sont
fréquemment rencontrés en pathologie infectieuse ainsi que dans les bio-industries (fermentation
de fromages et produits laitiers, traitements médicaux supplétifs, production de toxines à usage
cosmétique, industrie pharmaceutique pour la fabrication d’agents antiviraux…)
La famille des entérobactéries se définit par les caractères suivants :
- Bacilles à Gram négatif
- Mobiles ou immobiles selon les espèces
- Facile à cultiver, poussant sur milieux de culture ordinaires
- Aéro- anaérobies facultatifs
- Fermentant le glucose avec ou sans production de gaz
- Réduisant les nitrates en nitrites
- Ne possédant pas d’oxydase (oxydase négative)

30
La famille Enterobacteriaceae comporte de nombreuses espèces appartenant à une vingtaine de
genres, rangés dans cinq groupes :

Groupes groupe I groupe II groupe III groupe IV groupe V

Genres Salmonella Escherichia Klebsiella Proteus Yersinia

Citrobacter Shigella Enterobacter Morganella
Serratia Providencia

1- Tests pour l’étude du métabolisme glucidique

La dégradation des glucides peut se faire soit par voie anaérobie (fermentation), soit par voie
aérobie (respiration, oxydation).
- lors des respirations le glucide est oxydé en CO2, par le dioxygène (ou un autre oxydant
minéral) ;
- lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu
qu'ils acidifient sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont cependant pas également
acidifiantes.

a- Mise en évidence de l’utilisation d’un glucide par acidification

Pour des fins taxonomiques, il est intéressant d’étudier la capacité des bactéries à dégrader les
glucides : glucose, Mannitol, Saccharose…

Milieu :
- Eau peptonée au rouge de phénol
- Glucide : glucose ou mannitol ou saccharose incorporé à la concentration finale de 1%
- un tube de Durham, placé dans le tube (contenant le milieu de culture) en position renversée
afin d’étudier la production de gaz par le métabolisme du glucose.

Technique
- Ajouter stérilement le glucide étudié (glucose, mannitol, saccharose) dans le milieu (eau
peptonée au rouge de phénol) pour obtenir une concentration finale de 1%
- Agiter (l'agitation doit être douce pour éviter l'entrée d'air)
- Ensemencer les tubes avec 2 à 3 gouttes d’une suspension dense de la bactérie à étudier
31
- Des tubes non ensemencés seront utilisés comme témoins
- Ne pas revisser à fond le bouchon.
- Incuber les tubes ensemencés et les témoins à l'étuve à 37° C pendant 24 heures.

Lecture

La dégradation du glucide rend le milieu acide, ce qui provoque un virage de couleur du rouge au
jaune.
La présence du gaz dans la cloche de Durham montre que la bactérie a la caractéristique de
production du gaz.
- Virage au jaune → dégradation du glucide (+)
- Gaz dans le tube de Durham → production du gaz (+)
- Virage au jaune sans production de gaz dans le tube de Durham → glucide (+), gaz (-)
- Milieu inchangé → glucide (-), gaz (-)

b- Etude de la voie d’attaque des glucides : le type métabolique

Grâce à cette étude, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des
bactéries isolées.
L’étude de la voie d’attaque des glucides permettent de vérifier si la bactérie a un métabolisme
respiratoire (oxydatif) ou fermentaire

32
Milieu :
- CTA : le milieu CTA est le mieux adapté aux bactéries exigeantes, il est donc d’un usage très
répandu. Sa composition est la suivante : peptone, rouge de phénol et Agar.

Technique

- Régénérer le milieu au bain-marie bouillant. Ramener à 45° C

- Ajouter aseptiquement le glucide étudié pour obtenir une concentration finale de 1%
- Agiter (l'agitation doit être douce pour éviter l'entrée d'air) et laisser le milieu se solidifier en
plongeant le tube dans l'eau froide
- Ensemencer les tubes par piqûre centrale au fil droit chargé
- Deux tubes non ensemencés seront utilisés comme témoins,
- Ne pas revisser à fond le bouchon.
- Incuber les tubes ensemences et les témoins à l'étuve à 37° C pendant 24 heures

Lecture

Bactéries fermentatives: Culture et virage au jaune soit uniquement en profondeur, soit dans
tout le tube
Bactéries oxydatives : Culture et virage au jaune uniquement en surface du tube
Bactéries inactives ou inertes : Alcalinisation uniquement en surface qui devient rouge foncée :
pas d’utilisation du glucide, mais des peptones
Pas de modification du milieu : bactérie n’utilisant pas le glucide et n’alcalinisant pas à partir
des peptones
Le milieu CTA peut servir aussi pour l’étude de la mobilité des bactéries, du fait de sa faible
teneur en gélose (gélose molle), les bactéries peuvent s’y déplacer.
Les bactéries mobiles troublent le milieu
Les bactéries immobiles persistent près de la piqûre d’ensemencement
Les bactéries aérobies strictes ne cultivant pas dans la profondeur, leur mobilité ne pourra être
lue.

c- Le type métabolique : le milieu Hajna- kligler

Le milieu Hajna- kligler est utilisé pour l’étude des entérobactéries parce qu’il apporte de façon
simple, de nombreux renseignement taxonomiques :

33
- utilisation des glucides (glucose et lactose)
- production d'hydrogène de sulfate (H2S)
- Production de gaz

Milieu :
La composition du milieu kligler est la suivante :
- Lactose à 1 %
- Glucose à 0,1%
- Indicateur de pH : rouge de phénol
- Indicateur de H2S : citrate ferrique et thiosulfate de sodium

Technique
Une colonie est ensemencée en réalisant une piqûre centrale dans le culot et des stries serrés sur
la pente.
Remettre le bouchon du tube sans le revisser (vis débloquée)
Incubation à 37° C pendant 24 heures

Lecture
Le glucose présent dans le culot, est attaqué par voie fermentative entraînant une acidification du
milieu avec production ou non de gaz. Sur la pente, le lactose sera alors oxydé et fermenté. La
production du H2S se manifeste par un noircissement du culot
Fermentation du glucose et du lactose : accumulation d’acide, virage au jaune
Bactéries glucose (+) → culot jaune
Bactéries lactose (+) → culot et pente jaune
La production de gaz : on peut observer quelques bulles ou une poche gazeuse qui décolle
complètement le milieu du fond du tube
Gaz (+) → décollement du culot
La production d’H2S : elle se manifeste par un noircissement du milieu
Bactéries H2S (+) → noircissement du milieu
Interprétation de la fermentation des sucres :
Le milieu kligler contient le lactose à forte concentration (1%) et le glucose à faible concentration
(0,1%).

34
Le glucose (monosaccharide) est utilisé avant le lactose.
Le lactose est hydrolysé par la β-galactosidase en glucose et galactose qui subissent alors la
fermentation fermentative.
Dans les premières heures de culture, le milieu devient jaune par fermentation du glucose, puis
l’acidification s’accentue si le lactose est à son tour fermenté.
Si le lactose n’est pas fermenté, la pente subit une réalcalinisation en présence de l’air et devient
rouge

d- Recherche de la β –galactosidase: Test O.N.P.G

Principe :
Pour dégrader activement le lactose, les microorganismes doivent posséder deux enzymes : la
perméase et Βêta -galactosidase.
L’épreuve ONPG permet de mettre en évidence la β -galactosidase qui dégrade l’ONPG soit
l’orthonitrophényl-β-Dgalactopyranoside qui possède une structure analogue au lactose.
35
Le lactose est formé de deux molécules glucose et galactose, tandis que l’ONPG est composé
d’une molécule d’orthonitrophényl liée à un galactose.
L’hydrolyse de l’ONPG (composé incolore) libère l’orthonitrophényl qui est responsable de la
coloration jaunâtre de milieu, Ce processus se fait selon la réaction illustrée dans la figure.

Technique
- Préparer une suspension dense des bactéries, prélevées à partir du milieu Kligler dans un tube à
essai stérile contenant 0.5ml d'eau physiologique, puis y ajouter un disque ONPG prêt à l’emploi
- Incuber au bain Marie à 37° C

Lecture
Une coloration jaune stable, apparaissant généralement en moins de 30 minutes
traduit la libération de l’O.N.P.G, donc la présence d’une β –galactosidase.

La lecture peut se faire à des intervalles de temps différents : après 15mn, 30mn,
1 heure, 6 heures et 24 heures.
Le test ONPG est positif lorsque la suspension bactérienne se colore en jaune
citron.
Control positif : Escherichia coli
Control négatif : Proteus

36
e- Étude des différentes voies fermentatives : le type fermentaire
Les entérobactéries dégradent le glucose par deux voies fermentaires particulières :
- Voie des "acides mixtes" : où les acides formés sont nombreux : acide formique, acide acétique,
acide lactique… La quantité d’acide formée est suffisante pour amener le pH à des valeurs
inférieures à 4,5
- Voie dite de "butane-diol" : qui conduit à la formation d’acétoïne (acétyl-méthyl-carbinol). Il y
a d’autre part production d’acides, mais en quantité moindre que précédemment et le pH reste
voisin de 6.
Deux réactions permettent de préciser le type fermentaire de la bactérie : réaction au rouge de
méthyle (RM) et réaction de Voges-Proskauer (VP)

Réaction au rouge de méthyle

Elle consiste à mettre en évidence l’acidification finale d’un milieu glucosé par la fermentation
du glucose, cette acidification provoque le virage du rouge de méthyle (rouge à un pH ≤ 5; jaune
pH ≥ 5.8).

Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne)

Elle permet de mettre en évidence la production d’acétoine (acétyl- méthyl -carbinol) à partir du
glucose. En milieu alcalin, l’acétoine se transforme en butandione qui réagit avec l’α-naphtol et
donne une coloration rouge (dont l’intensité est augmentée en présence de créatine)

Milieu :
Milieu Clark et Lubs : eau peptonée glucosée à 5 pour milles
Une colonie de la souche à étudier est ensemencée sur le milieu Clark et Lubs puis incuber à 37°
C pendant 24 heures.
- Réaction de rouge de méthyle (RM)
Prélever 2 ml d’une culture sur milieu Clark et Lubs
Ajouter 2 gouttes d’une solution de rouge de méthyle
- Réaction de Voges-Proskauer (VP)
Prélever 1 ml de culture de 24 heures sur milieu Clark et Lubs
Ajouter 0,5 ml de solution d’α-naphtol et 0,5 de soude à 40%
Agiter, laisser reposer 15 minutes à la température ambiante

37
Lecture
Test VP:
L’apparition d’une teinte rouge à la surface indique la présence d’acétoïne → VP (+)
Coloration rouge: VP (+)
Coloration jaunâtre: VP (-)
Test RM:
Coloration rouge: pH < 4,5 → RM (+)
Coloration jaunâtre: pH > 6 → RM (-)
N.B: En générale (sauf exception), les germes RM (+) sont VP (-) ou inversement

Control positif RM : Escherichia coli ; control négatif RM: Enterobacter aerogenes

Control positif VP : Enterobacter aerogenes ; control négatif : Escherichia coli

38
2- Tests pour l’étude du catabolisme protéique
Une protéine est une molécule comportant de l’azote et composée d’une séquence d’acides
aminés (au nombre de 20) reliés par des liaisons peptidiques.
La dégradation protéique, libère des acides aminés.

a- Recherche de la gélatinase : Méthode de Frazier

En bactériologie, la dégradation des protéines par les protéases est souvent défini par la capacité
d’hydrolyse de la gélatine par une enzyme spécifique "la gélatinase".

Milieu :

Gélose à la gélatine

Technique
Ensemencer en touches ou en strie, à l’anse, la surface de la gélose
Après 2 à 5 jours d’incubation à 37° C, verser sur le milieu 1 à 2 ml de réactif Frazier :
(HgCl2 , HCl concentré)

Lecture
Il se produit un précipité blanchâtre partout où la gélatine n’a pas été hydrolysée
Zone transparente autour de la strie → gélatinase (+)
Précipité blanchâtre → gélatinase (-)

39
b- Recherche des désaminases
Certaines bactéries possèdent des désaminases capables de catalyser la réaction suivante :

L’acide α-cétonique est mis en évidence par une réaction colorée avec le chlorure de fer III.
La coloration varie selon la nature de l’acide formé.
En pratique, on recherche :
Tryptophane désaminase (TDA)
Phénylalanine désaminase (Ph DA)
Comme la bactérie TDA (+) et aussi PH DA (+) et inversement, il est préférable de rechercher la
Ph DA, dont la lecture est plus aisée

Recherche de la Phénylalanine désaminase (Ph DA)

Technique
Ensemencer une gélose à la Phénylalanine
Incuber à 37° C pendant 24 heures
Recouvrir la culture de quelques gouttes de chlorure de fer III

Lecture
Coloration vert intense → ph DA (+)

Ph DA (+)

40
c- Recherche des décarboxylases
Les décarboxylases ou carboxylases, scindent les acides aminés entraînant la formation de
l'amine correspondant avec la libération de CO2 suivant la réaction :

La recherche des décarboxylases s’effectue par l’alcalinisation des milieux d’étude.

Les décarboxylases sont:
LDC
- La lysine décarboxylase (LDC) : Lysine -------------------> Cadavérine + CO2
ODC
- L’ornithine décarboxylase (ODC) : Ornithine ---------------------> Putricine + CO2
ADH
- L’arginine dihydrolase (ADH) : Arginine ---------------------------> Agmatine + CO2

Milieu :

- Bouillon de Moeller ; ce milieu est dépourvu de peptone. Sa composition est la suivante :

Glucose
Extrait de levure
- Indicateur pH : bromocrésol pourpre
- Un seul acide aminé ; celui dont on veut chercher la décarboxylation

Technique
Le test est réalisé avec le milieu Moeller réparti dans 4 tubes à hémolyse différents:
1- le premier tube constitue le témoin. Il contient essentiellement du glucose en petite quantité et
du pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH.
2- les trois autres tubes contiennent en plus du milieu témoins, un des trois acides aminés
suivants : Arginine, Lysine ou Ornithine à la concentration finale de 1%
3- après ensemencement, 1ml de vaseline stérile est ajouté dans chaque tube et le tout sera incubé
à 37° C pendant 24 heures.

41
N.B : Le milieu Moeller doit être conditionné dans des tubes de diamètre étroit où la culture
s’effectue en anaérobiose ; si non recouvrir la surface du milieu avec de la vaseline.

Lecture
La fermentation du glucose entraîne une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthèse de la
décarboxylase. Celle-ci dégrade l’acide aminé qui donne de l’amine (composé alcalin).
L’alcalinité de l’amine entraîne le virage de l’indicateur au violet après une courte phase de
jaunissement :
Glucose → acides (milieu jaune)
Acide aminé → amine (milieu violet)
Donc, virage au violet et milieu trouble → DC (+)
Si la bactérie ne possède pas une décarboxylase, le milieu reste acide et donc
jaune.
[- la réaction est positive lorsque le témoin vire au jaune (acidification du milieu
due à l'utilisation du glucose). Les tubes contenant l'acide aminé restent violet
(phénomène due à l'alcalinisation).
- la réaction est négative lorsque les tubes contenant l'acide aminé et le témoin
virent au jaune (acidification)]

d- Recherche de la production d’indole

Certaines bactéries dégradent le tryptophane grâce à une enzyme " la tryptophanase"
Le test indole sert à déterminer si la bactérie produit de l’indole à partir du tryptophane (acide
aminé).
L’indole ainsi produit donne avec le réactif de Kovacs une coloration rouge

42
Milieu :
Eau peptonée riche en tryptophane

Technique
A partir du milieu eau peptonnée déjà ensemencé, mettre 1 ml de ce milieu dans un tube à
hémolyse.
Ajouter à ce tube à hémolyse 5 gouttes de réactif de Kovac

Lecture
Après agitation:
- Anneau rouge : indole positif.
- Anneau brunâtre (couleur du réactif): indole négatif.

Control positif : Escherichia coli ; Control négatif : Klebsiella pneumoniae

e- Recherche de l’uréase
Toutes les bactéries hydrolysent l'urée grâce à la réaction suivante:

Le CO2 et le NH3 se combinent en donnant le carbonate d'ammonium (CO3 (NH4)2) qui alcalinise
le milieu (augmentation du pH).

CO2 + 2NH3 + H2O -----------------------------> CO3 (NH4)2

La recherche de l’uréase consiste donc à mettre en évidence l’alcalinisation du milieu à l’urée
grâce à un indicateur de pH (rouge de phénol).

Milieu :
Bouillon à l’urée

43
Technique
La recherche de l’uréase se fait selon le procédé :
Dans les tubes d’urée agar, et à l’aide d’une anse stérile, on ensemence des colonies de la souche
test âgée de 24heures, on incube à 37° C pendant 24 heures.

Lecture
- L’uréase est positive s’il y a virage de couleur du jaune vers le rouge
violacé ou vers le rose rouge.
- L’uréase est dite négative s’il n’y a pas de changement de couleur.

Control positif : Proteus

Control négatif : Escherichia coli

44
3- Etude du métabolisme des acides organiques
Les acides organiques (citrate, malonate, acétate) sont des sources de carbone possible pour des
nombreux micro-organismes. Dans la pratique courante, rechercher sa capacité à utiliser le citrate
est un critère incontournable de l’identification d’une entérobactérie.

e- Recherche de citrate perméase

Le milieu utilisé est le citrate de Simmons, qui ne contient que le citrate comme seule source de
carbone. Seules les bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc capables de se
développer sur ce milieu.
L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu, qui permet un virage de couleur du vert
au bleu.

Milieu :
Citrate de Simmons, dont la composition est la suivante :
Ions minéraux (ammonium en particulier)
Citrate de sodium
Bleu de bromothymol
Agar

Technique
La pente du milieu est ensemencée d'une suspension bactérienne, par stries longitudinales au
moyen d'une anse.
Les tubes sont légèrement fermés (vis non bloquée)
L'incubation se fait à 37° C.

Lecture
La croissance de la bactérie sur le milieu indique que cette dernière possède
du citrate perméase. Cependant s’il n’y a pas de développement, la bactérie
ne possède pas cette enzyme.
Culture abondante avec virage du vert au bleu de l’indicateur → Citrate (+)
Culture abondante sans virage au bleu (bouchon non dévissé) → Citrate (+)
Pas de culture et pas de virage au bleu → Citrate (-)

45
 Utilisation de la galerie API 20E
Appareillage et Procédé d’Identification

API 20 E est un système standardisé pour identifier les Enterobacteriaceae et autres bacilles à
Gram négatifs non exigeants.
Elles utilisent le même principe que les techniques biochimiques conventionnelles l’identification
des bactéries.
Elles se présentent sous forme de cupules prête à l’emploi contenant le substrat lyophilisé
nécessaire aux différents tests biochimiques. Version miniaturisée et standardisée, elles ont
l’avantage de standardiser les caractères biochimiques recherchés pour améliorer la
reproductibilité inter-laboratoire en éliminant le choix subjectif des tests « importants » pour la
caractérisation, elles limitent la variabilité technique (utilisation de système de distribution
possible). Leur utilisation est simple.

Principe
Cette bande test API-20E (de bio-Merieux, Inc.) possède 20 compartiments de test déshydraté
séparés. Une suspension bactérienne est utilisée pour réhydrater chacun des puits. Certains des
puits auront des changements de couleur résultants des différences de pH. D’autres produisent
des sous-produits qui doivent être identifiés avec des réactifs. Un numéro de profil est déterminé
d’après la série de tests + et -, qui permet d’identifier l’espèce à l’aide du logiciel d’identification.

Technique

1- Préparer une suspension de la bactérie dans une éprouvette de saline

Inoculer une grosse colonie (diamètre de 2-3mm) de la bactérie dans une solution de 0.85%
NaCl. Il faut s’assurer que la suspension est homogène sans agrégats de bactéries qui flottent.

2- Inoculer la bande API

- En tenant la bande à un léger angle avec le dessus de la table, inoculer la suspension
bactérienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur stérile.
- Toucher l’extrémité de la pipette sur le côté de la cupule permettant au fluide de pénétrer dans
le puits par l’action capillaire tout en appliquant une pression légère sur le bulbe. Ceci devrait
prévenir la formation de bulles dans les puits.
Chaque puits doit être rempli jusqu’au cou (voir diagramme).
- Pour les tests [CIT], [VP] et [GEL], remplir tubes et cupules

46
- Suite à l’inoculation, remplir complètement la section de la cupule des microtubes ADH, LDC,
ODC, H2S et URE avec de l’huile minérale pour créer une anaérobiose.

3- Incuber la bande dans sa chambre

- Remplir le bas de la chambre avec juste assez d’eau pour remplir les indentations.
- Placer la bande dans ce réservoir du bas.
- Placer le dessus de la chambre d’incubation sur le bas et étiquetée là.
- Placer la bande à 37o C

Lecture et interprétation
Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture.
- Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les tests nécessitant
l’addition de réactifs :
• 1 goutte de réactif de Kovac à l’IND (faire la lecture dans les minutes qui suivent)
• 1 goutte de réactif de Barritt A et B au VP (une réaction positive peut prendre jusqu'à 10
minutes)
• 1 goutte de FeCl3 au TD

N.B : Le test de la recherche de production d’indole doit être réalisé en dernier, car cette réaction
libère des gaz qui risquent d’altérer l’interprétation d’autres de la galerie. Ne pas remettre le
couvercle d’incubation après l’ajout de réactif.

47
Identification
L’identification est obtenue à partir du profil numérique.

Détermination du profil numérique :

En additionnant à l’intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des réactions

positives, on obtient 7 chiffres.

48
Exemple :

Code de la souche : 5144572 Identification : Escherichia coli

L’identification est réalisée à l’aide du logiciel d’identification : entrer manuellement le profil

numérique à 7 chiffres.

49
 Antibiogramme

Les antibiotiques sont des composés chimiques, élaborés par un micro-organisme ou produit par
synthèse et dont l’activité spécifique se manifeste à dose faible sur les micro-organismes.
La détermination de la sensibilité d’une bactérie à divers antibiotiques est d’une grande
importance en microbiologie. Elle permet l’élaboration des milieux d’isolement sélectifs, le
contrôle d’une infection par chimio-thérapeutique et enfin elle peut être utilisée comme approche
dans la caractérisation et l’identification bactérienne.
L’antibiogramme d’une souche peut être déterminé en milieu liquide par la méthode de la CMI
(concentration minimale inhibitrice) ou par la technique des disques.

Milieux :
Mueller-Hinton normale : bactéries non exigeantes (Entérobactéries)
Mueller-Hinton au sang : Streptocoques
Mueller-Hinton avec NaCl 5% : Staphylocoques résistants aux β-lactamines
L’épaisseur de la gélose dans la boite doit être de 4 mm

Technique
- Couler la gélose dans une boite de pétri
- Laisser prendre en masse
- Prélever 2 ou 3 gouttes de la suspension bactérienne, les déposer à la surface de la gélose, les
étaler avec un râteau
- S’assurer que la surface de la gélose est bien séchée, et y déposer les disques de celluloses
imprégnées d’antibiotique
- Placer la boite de pétri à basse température +4°C pendant 15 à 30 mn afin de permettre aux
antibiotiques de diffuser dans la gélose avant que les bactéries ne commencent à se multiplier
- Retirer la boite du réfrigérateur et la placer dans l’incubateur, à la température optimale de
croissance du germe à étudier (37° C) pendant 24 h.
N.B : les boites doivent être placées couvercle en bas.

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