Unité de Formation et de BURKINA FASO

Recherche Sciences et
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UFR /ST
Ministère de la sante
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Université
Groupe de Recherche
Aube Nouvelle
Action en Sante

Filière : Bio Analyse et Assurance Qualité

PROTOCOLE DE STAGE

PREVALENCE DES ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXINOGENE PAR LA

METHODE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE CHEZ LES ENFANTS DE MOINS DE
5 ANS EN ZONE PERI-URBAINE DE OUAGADOUGOU

Période du stage : 04 Avril au 30 Septembre

Présenté par : BAMOUNI Raïssa Roseline

Maitre de stage : Dr SERME Samuel

Année universitaire : 2022-2023

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Table des matières
Introduction.................................................................................................................................2

I. Hypothèse de recherche.................................................................................................3

II. Objectifs......................................................................................................................3

1. Objectif général..........................................................................................................3

2. Objectifs spécifiques...................................................................................................3

III. Méthodologie...............................................................................................................3

IV. Caractérisation moléculaire de E. Coli enterotoxinogène......................................5

1. Extraction de l’ADN total bactérien.........................................................................5

2. Amplification de l’ADN bactérien............................................................................5

3. Préparation du mix....................................................................................................6

4. Amplification..............................................................................................................6

5. Révélation des produits d’amplification..................................................................6

V. Chronogramme des activités.........................................................................................7

VI. Résultats attendus......................................................................................................8

Bibliographique.......................................................................................................................10

1
Introduction
Escherichia coli (E. Coli), est une bactérie intestinale des organismes à sang chaud, Gram
négatif, du genre Escherichia, en forme de bâtonnet. E. coli est une bactérie aero-anaerobie
facultative, appartenant au groupe des colibacilles, très commune chez l’être humain. Elle
constitue avec d’autres bactéries anaérobies facultatives, 0,1% du microbiote intestinal La
plupart des souches sont inoffensives, voire bénéfiques pour l’être humain. Cependant,
certains sérotypes d’E. coli peuvent être pathogènes, entraînant alors des gastro-entérites,
infections urinaires, méningites ou sepsis.(1)
Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), les maladies diarrhéiques sont la deuxième
cause de décès et entraînent une morbidité élevée chez les enfants de moins de cinq ans.
Parmi ces pathogènes bactériennes responsable de diarrhée figure Escherichia coli
enterotoxinogène qui est l’un des pathovars d’E.coli. On estime environ 100 millions
d’épisodes diarrhée et plus de 60000 décès des enfants de moins de moins de 5 ans en 2015
causé par Escherichia coli enterotoxinogène dans les zones d’endémie.(2) Si dans les pays
développés la situation est meilleure grâce à l’hygiène de vie et le développement des
installations sanitaire, il n'en ai pas de même dans les pays en développement. En effet
plusieurs facteurs concourent à l'infection d’ETEC dans les pays en voie de développement :
l’ingestion d'aliments et d'eau contaminés, le manquent des infrastructures sanitaires et
également l’acquisition d'eau potable, la prévalence élevée des agents pathogène dans
l’environnement.(3) Le traitement se fait essentiellement par antibiothérapie approprié. A ce
jour il n’existe pas de vaccin contre les diarrhées à ETEC. Afin de permettre une meilleure
prévention de la transmission des infections a ETEC notre étude ces fixée pour objectif de
déterminé la prévalence des ETEC par la méthode de biologie moléculaire chez les enfants de
moins de 5 ans en zone péri-urbaine de Ouagadougou dans le but de disponibiliser des
données afin d’améliorer la lutte.
Ainsi pour rendre de manière fidèle et analytique les conclusions de notre étude notre plan
s’articulera autour de deux axes : la première partie portera sur les objectifs de l’étude, et la
seconde partie sur la méthodologie, le diagnostic biologique, les résultats et la discussion.

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 I. Hypothèse de recherche
Pour mener à bien notre étude, les hypothèses suivantes ont été émises :

 La prévalence des ETEC est très élevée au Burkina Faso

 La PCR à une très grande sensibilité par rapport à la culture

II. Objectifs
1. Objectif général
Déterminer la prévalence d’Escherichia coli enterotoxinogène (ECET) par la biologie
moléculaire chez les enfants de moins de cinq ans en milieu péri-urbain de Ouagadougou au
Burkina Faso.

2. Objectifs spécifiques
OS1 : Obtenir des colonies sur des boîtes de pétris à partir de la culture des souches
suspectes d’E. coli (colonies roses)

OS2 : Extraire l’ADN des bactéries à partir des colonies obtenues après culture sur
boîte de Pétris par la méthode de choc thermique

OS3 : Amplifier l’ADN obtenu après extraction par la PCR multiplex

OS4 : Migrer le produit amplifié sur un gel d’agarose pour la détection des gènes des
toxines ST thermostables (STh et STp) et thermolabiles (LT) produites par des isolats
cliniques d’E. coli enterotoxinogène (ECET)

III. Méthodologie
1. Cadre de l’étude

Notre étude se déroulera au Burkina Faso plus précisément dans la ville de Ouagadougou

2. Site de l’étude

Les échantillons seront analysés dans l’unité de biologie moléculaire du laboratoire du

Groupe de Recherche Action en Santé (GRAS) basé à Ouagadougou.

3. Type d’étude et période d’étude

Il s’agit d’une étude de transversale sur une période de 6 mois allant de juillet à
décembre 2023
4. Population d’étude

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L’étude portera sur 300 enfants de moins de 5ans sans distinction de genres, d’ethnies ou de
religions, et vivant dans la zone d’étude.

5. Critères d’inclusion

On été inclus dans cette étude les enfants de moins de 5ans :

 ayant été sélectionnés au hasard dans la base de données

 dont les parents ou tuteurs ont donnés quitus afin de s’inscrire dans l’étude ;
 dont les parents ou tuteurs n’ont pas prévu de déménager de la zone pendant la
période de l’étude ;
 dont les parents ou tuteurs sont prêts à fournir des échantillons biologiques au
besoin
6. Critères de non inclusion

On été exclus de cette étude les enfants de moins de 5ans :

 vivant dans la zone de desserte du Système de Surveillance Sanitaire et

démographique de Ouagadougou (OHDSS) et dont le ménage n’a pas été
sélectionné au hasard dans la base de données ;
 sélectionnés au hasard dans la base de données OHDSS et dont les parents ou
le tuteur n’a pas donné quitus favorable pour que l’enfant participe à l’étude
ayant un problème de santé
7. Taille de l’échantillons

Dans cette étude 300 enfants de moins de 5ans ont été retenus

8. Collecte des données

a) Collecte des données socio-démographique

Les données seront collectées à l’aide d’une fiche d’enquête.

b) Collecte des données biologique

Les données biologiques seront collectées à l’aide de registre de laboratoire et l’aide de rendu
de résultat.

9. Matériels et méthodes

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 a) Matériel et réactifs
Le matériel utilisé pour notre étude sera de deux ordres à savoir :

 Les matériels biologiques : les selles

 Matériels techniques : le milieu d’enrichissement MacConkey, des ensemenceurs, des
tubes Eppendorf, l’eau PCR, plaque chauffante, une balance, barque a électrophorèse,
Agarose, les amorces, les cônes, une pipette, du Tris Borate EDTA, du gel
Red,marqueur de poids moléculaire, un amplificateur (Thermocycleur), Axygen
(système de document de gel)

b) Méthodes

Nous utiliserons les échantillons pour la mise en culture sur le milieu d’enrichissement
MacConkey afin d’avoir des colonies suspectes d’Escherichia coli(colonies roses )pour la
caractérisation moléculaire

IV. Caractérisation moléculaire de E. Coli enterotoxinogène

Une caractérisation moléculaire sera faite afin d’identifier les gènes responsable d’ETEC tel
que : les LT, STP, STH

1. Extraction de l’ADN total bactérien

L’extraction d’ADN bactérien sera réalisée par thermolyse Ainsi, à l’aide d’une pipette
Pasteur stérile, une masse de culture bactérienne pure provenant des colonies de 18-24 heures
d’incubation sera prélevée et ajoutée dans un tube Eppendorf (Hamburg, Allemangne)
contenant 100 µL d’eau distillée stérile. Le tout sera placé dans un bain marie bouillant à
100°C pendant 10 min. Ensuite, les tubes seront centrifugés à vitesse maximale pendant 2
min. Le surnageant environ 90 µl (contenant l’ADN bactérien) de chaque tube sera transféré
dans un nouveau tube Eppendorf identifié et conservé à -20°C jusqu’à son utilisation pour les
réactions PCR.

2. Amplification de l’ADN bactérien

Le principe de cette technique moléculaire est d’utiliser de manière répétitive l’une des
propriétés des ADN polymérases qui est celle de pouvoir synthétiser un brin complémentaire

d’ADN à partir de couple d’amorces. La réaction correspond à la succession d’un certain

nombre de cycles comportant chacun trois étapes : une dénaturation, une hybridation et une
élongation. Tous les éléments nécessaires à la réaction sont contenus dans un tube qui sera
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soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape de la PCR. Ces cycles de
températures sont réalisés automatiquement par un programme préenregistré dans le
thermocycleur (Applied Biosystem).

3. Préparation du mix
Les amorces spécifiques à chaque gène de E. coli enterotoxinogène seront utilisées
pour la PCR multiplex. Ainsi, 1 µl du surnageant contenant l’ADN bactérien sera ajoutés à 19
µl de mix (volume total, 20 µl) constitué de 10,5 µl de l’eau PCR, 2,5 µl du Master mix
(compléter la composition) et 1 µl de chaque amorce.

4. Amplification
Les différentes étapes d’amplification de l’ADN se dérouleront par cycles successifs dans le
thermocycleur. Les paramètres variables seront : le temps, la température de chaque étape
d’amplification et le nombre de cycles. Le programme PCR sera :

- Préchauffage à 95°C pendant 2 min

- Dénaturation initiale à 95°C pendant 15 sec

- Hybridation à 52°C pendant 30 sec

- Extension finale à 72°C pendant 10 sec] suivi de 30 cycles de l’étape de

dénaturation-

extension

- 72 °C pendant 2 min, pour parfaire l’élongation finale

- 10°C à durée illimitée pour fin d’amplification. Les amplicons seront migrés sur un
gel d’agarose à 2 %.

5. Révélation des produits d’amplification

a) Préparation du gel
Le gel d’agarose concentré à 5 % (p/v) [2,5g d’agarose/150 ml de tampon Tris, Borate, EDTA
(TBE) 1X (Prolabo, France)] sera préparé. Le mélange sera chauffé jusqu’à obtentionn d’une
phase homogène limpide. Puis dans l’agarose refroidie et encore liquide, seront ajoutés 4,5 μl

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du réactif Redsafe (Prolabo, France). La solution obtenue sera bien mélangée et coulée dans
un support de gel pour électrophorèse sur lequel un peigne sera fixé formant les puits
nécessaires au dépôt des amplicons obtenus après la PCR. Après solidification du gel, le
peigne sera retiré et le gel sera placé dans une cuve à électrophorèse, contenant le TBE 1X. La
cuve d’électrophorèse sera remplie avec le tampon (TBE 1X) jusqu’à immersion totale du gel.

b) Dépôt des échantillons et migration

Le dépôt des échantillons sera réalisé selon le plan suivant : dans chaque tube PCR contenant
les amplicons, il sera ajouté 2 gouttes de tampon de charge (bleu de bromophénol avec alcool)
et l’ensemble sera bien mélangé. Dix (10) µl de ce mélange seront prélevés à l’aide d’une
micropipette et déposés dans les puits du gel d’agarose. Un marqueur de poids moléculaire de
100 pb sera utilisé. La migration électrophorétique sera faite à 100 volts pendant 1 heure.

c) Visualisation des produits PCR

Après la migration, le gel et son support seront retirés de la cuve et le gel sera placé sous une
lampe UV muni d’un système de documentation de gel connecté à un ordinateur à l’aide de
laquelle la photo du gel sera enregistrée. Grâce au réactif redsafe, les produits d’amplification
seront visualisés par fluorescence.

V. Chronogramme des activités

Activités/ Avri Ma Jui Juille Aou Septembr Octobr Novembr Décembr

Période l i n t t e e e e

Rédaction du
protocole
Collecte
analyse des
échantillons
Saisie/
analyses des
données
Rédaction du
mémoire
Correction du

7
 DM
Soutenance

VI. Résultats attendus

Les caractéristiques socio démographiques des participants seront identifiées

La prévalence des infections a ETEC sera identifiée

8
Bibliographique

1. Escherichia coli. In: Wikipédia [Internet]. 2023 [cité 24 août 2023]. Disponible sur:
https://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Escherichia_coli&oldid=206666141
2. Institut Pasteur [Internet]. 2015 [cité 24 août 2023]. Escherichia coli
entérohémorragiques (ECEH). Disponible sur:
https://www.pasteur.fr/fr/centre-medical/fiches-maladies/escherichia-coli
3. CDC. Centers for Disease Control and Prevention. 2022 [cité 23 août 2023]. Assessing
Access to Water & Sanitation. Disponible sur:
https://www.cdc.gov/healthywater/global/assessing.html