Ziani Module Biologie Moléculaire Et Génie Génétique L3 Micobiologie

‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬
République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعلـين العالي و البحث العلوي‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
‫جاهعـت حسيـبت بن بىعلي الشـلف‬
Université HassibaBenbouali de Chlef
‫كليت علىم الطبيعت و الحياة‬

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
‫قسن البيىلىجيا‬
Département de Biologie
Cours du module
Biologie moléculaire et génie

génétique
Destiné aux étudiants de 3emeannée Licence Microbiologie
2020/2021
1 1. Expression de l’information génétique
Partie I : Biologie moléculaire
Chapitre 1 : Expression de l’information génétique: synthèse protéique (Transcription,

Traduction).
Introduction
La synthèse d'une protéine nécessite que les acides aminés spécifiques qui la constituent
soient assemblés dans un ordre précis. L'information nécessaire à cette synthèse se trouve
dans les gènes. L'expression d'un gène conduit à la biosynthèse d'une protéine et se fait en
deux étapes, la transcription et la traduction.
1. Comment se déroule la transcription du gène ?
• Le lieu de synthèse des protéines est le cytoplasme de la cellule. L'information génétique

codée dans l'ADN se trouve dans le noyau. La taille trop importante des molécules d'ADN ne
leur permet pas de traverser les pores de la membranaire nucléaire. La transmission de
l'information génétique entre le noyau et le cytoplasme est assurée par une molécule beaucoup
plus petite qui sert d'intermédiaire : l'ARN messager (ARNm).
• L'ARNm est synthétisée dans le noyau sous l'action d'un complexe enzymatique,
l'ARNpolymérase, au cours d'un phénomène appelé transcription. Elle passe ensuite dans le
cytoplasme.
• Après ouverture de la double hélice d'ADN, l'un des deux brins, appelé brin transcrit, sert
de « matrice » à la synthèse d'une nouvelle chaîne. Il se forme un brin d'ARN dont la
séquence est complémentaire d'une portion du brin transcrit de la molécule d'ADN. Cette
synthèse se réalise à partir des ribonucléotides contenus dans le nucléoplasme. Les
ribonucléotides sont des molécules constituées de trois éléments : une molécule d'acide
phosphorique, une molécule de ribose et une base azotée (A, U, C ou G). Il n'y pas de thymine
dans la molécule d'ARN, elle est remplacée par l'uracyle.
• L'information génétique est conservée car la séquence des nucléotides de l'ARNm est
imposée par celle de l'ADN dans le respect de la complémentarité des bases. L'ARNm est une
molécule simple brin et ne forme pas de double hélice.
Transcription de l’ADN procaryote

Le gène (ou cistron) est un segment d’ADN qui constitue l’unité d’expression menant à la
formation d’un produit fonctionnel qui peut être sous la forme d’ARN ou de polypeptide.
Chez les procaryotes plusieurs gènes peuvent faire partie d’une même unité de transcription,
on parle d’unité polycistronique dont l’exemple le plus classique est l’opéron lactose (cf.
chapitre de régulation de l’expression des gènes).
Chez les eucaryotes les unités de transcription sont monocistronique (exception chez certains
vertébrés).
II) Transcription de l’ADN procaryote

L’ARN polymérase est une protéine ADN dépendante, multimérique possédant les sous-
unités α, β, β’ et σ. Elle est présente sous deux formes l’enzyme-cœur (α2ββ’) et
l’holoenzyme (α2ββ’σ). Les ARN polymérases ne nécessitent pas d’amorce et ne possèdent
pas d’activité exo-nucléasique et donc de correction d’erreur, le taux d’erreur est ainsi plus
important que pour les ADN-polymérases, mais ce taux est supporté.
Les nucléotides triphosphates sont additionnés à l’extrémité 3’ de la chaîne en cours de
synthèse par complémentarité de la matrice d’ADN. L’hydrolyse de la liaison anhydride
fournit l’énergie pour la synthèse de la liaison phosphodiester.
La réaction est réalisée en milieu tamponné à pH neutre, contenant du sel de Mg2+, un agent
de protection des groupements SH de l’enzyme (agent réducteur comme le β-
mercaptoéthanol), les 4 ribonucléotides (rNTP) et de l’ADN bicaténaire contenant un
promoteur comme matrice.
La molécule d’ADN est composée d’un brin matriciel (ou brin anti-codant) dirigé par
définition de 3’ vers 5’ et servant comme son nom l’indique de matrice à l’ARN-polymérase,
ainsi que d’un brin codant dirigé par définition de 5’ vers 3’ et ayant une séquence identique à
l’ARN transcrit mise à part le fait que la thymine est changée par l’uridine. L’ARN messager
est lui monocaténaire et dirigé tout comme le brin codant de 5’ vers 3’.
Chez E-coli, une seule ARN-polymérase catalyse la synthèse de tous les ARN de la cellule
(en mettant à part l’ARN des amorces nécessaire à la réplication de l’ADN).
La transcription est divisée en plusieurs étapes : la pré-initiation, l’initiation, l’élongation et la
terminaison.
1) Pré-initiation
Le promoteur est une séquence d’une centaine de nucléotides située dans la région régulatrice
et désignant le début de la transcription. Il est situé en amont du site d’initiation et porte des
éléments de séquence reconnus par l’ARNpolymérase et déterminant le sens de la
transcription.
Le promoteur est constitué de courtes séquences conservées d’une unité de transcription à
l’autre et appelées séquences consensus :
 En -10 du site d’initiation on trouve la TATA box ou boîte de Pribnow : « TATAAT »
 En -35 du site d’initiation on trouve : « TTGACA »
La force (ou efficacité) intrinsèque d’un promoteur est définie par le nombre relatif
d’initiation par unité de temps (vitesse de la transcription). Elle dépend de la proportion des
paires de bases A-T par rapport aux paires de bases CG, de la position des séquences en -35 et
en -10, en effet plus les séquences consensus sont proches du site d’initiation plus le
promoteur sera fort et finalement de la force d’interaction de l’ARN-polymérase avec le

promoteur.
Le promoteur agit sur la transcription du segment d’ADN qui lui est adjacent sur le même
chromosome, on dit que le promoteur est actif en « cis ». Le promoteur n’est pas actif sur les
séquences codantes situées ailleurs sur le chromosome, dans ce cas là on parlerait alors du
qualificatif « trans ». Le cis s’oppose au trans.
L’affinité de l’ARN-polymérase pour l’ADN dépend de la forme de l’enzyme : l’enzyme-
coeur a une affinité faible et non spécifique, l’holoenzyme a une affinité très forte et
spécifique pour le promoteur. On peut faire la remarque que la sous-unité sigma σ à l’état
libre ne se fixe pas sur l’ADN.
La sous-unité β’ étant basique et l’ADN étant acide, ce sera elle qui facilitera l’interaction du
complexe avec le promoteur. La sous-unité sigma σ permet donc une reconnaissance
spécifique du promoteur par l’ARN-polymérase et diminue l’affinité de l’enzyme pour les
régions non promotrices. Il agit de manière cyclique, en effet après l’initiation faite, le facteur
sigma se détache pour être recyclé et réutilisé pour d’autres initiations de gènes.
L’ARN-polymérase entraîne la dénaturation des deux brins d’ADN sur 14 paires de
nucléotides, on parle de complexe ouvert qui augmente encore l’affinité de l’enzyme pour la
double hélice.
2) Initiation
L’initiation correspond à la synthèse de la première liaison phosphodiester réalisé par la sous-
unité β qui correspond à la sous-unité catalytique de l’ARN-polymérase.
Le déroulement des premières étapes de la transcription est donc :
1. liaison non spécifique de l’holoenzyme.
2. formation d’un complexe fermé au niveau du promoteur
3. formation du complexe ouvert (déroulement sur 14 nucléotides)
4. Mise en place du premier nucléotide (très souvent A ou G)
5. Allongement de 4 à 5 nucléotides
6. Détachement du facteur sigma, après la transcription des 4-5 premiers nucléotides
3) Elongation
L’élongation correspond au déplacement de la bulle de transcription le long de la molécule
d’ADN. La région désappariée est alors de 70 paires de bases. Pendant la transcription, l’ARN
forme un court appariement avec le brin matriciel de l’ADN formant une hélice hybride
ADN-ARN sur une dizaine de paires de bases.
4) Terminaison
La terminaison se fait lorsque l’enzyme arrive au niveau d’une séquence spécifique appelée
terminateur.
Le terminateur se présente sous la forme d’un palindrome (cf. lexique) qui peut être parfait ou
imparfait. Ce palindrome entraîne une complémentarité de séquence au niveau de l’ARNm
qui permet la mise en place d’une structure en épingle à cheveux (ou tige-boucle) qui est un
appariement intra-chaîne qui déstabilise l’ARN-polymérase jusqu’à dissociation.
Elle peut être facilitée par un facteur rho ρ suivant la séquence du terminateur, on met ainsi en
évidence des terminateurs rho indépendant (environ les 2/3) et des terminateurs rho dépendant
(environ 1/3) :
 Pour les terminateurs rho indépendant on trouve une structure en épingle à cheveux
riche en paires de bases GC, suivie d’une séquence poly-U d’environ 6 nucléotides
permettant une dissociation plus facile de l’hybride ADN-ARN.
 Pour les terminateurs rho dépendant on trouve une structure en épingle à cheveux plus
courte et qui n’est pas riche en paires de bases G-C et qui est non-suivie d’une
séquence poly-U. Il y a donc nécessité du facteur rho qui a une affinité pour les ARN
en court de synthèse, le parcourant de 5’ vers 3’ jusqu’à trouver l’ARNpolymérase. Le
facteur rho est ATP dépendante, dont l’hydrolyse permettra la dissociation du
complexe.
5) Maturation des transcrits primaires
Le transcrit primaire correspond à l’ARN non mature qui nécessite une maturation sous forme
de clivages ou de modifications de bases. Cette maturation n’est pas obligatoire. Après
maturation on obtient l’ARN mature. On peut prendre quelques exemples comme la
maturation du transcrit primaire donnant les ARNr (transcrit primaire 45 S) ou les ARNt par
des ribonucléases, ou la maturation du transcrit primaire codant les ARNm. Généralement, il
y a peu de modifications pour les ARNm ; beaucoup d’ARNm sont traduits en protéines alors
qu’ils sont encore transcrits (Attention : il n’y a pas de noyau chez les procaryotes).
Le transcrit primaire code soit pour un produit, on parle d’ARN monocistronique, soit
plusieurs produits, on parlera alors d’ARN polycistronique.
2. Comment fonctionne le code génétique ?
• Les protéines sont constituées de 20 acides aminés différents, alors que l'ADN est réalisé à
partir de 4 nucléotides symbolisés par l'initiale de leur base azotée A, T, C, G. Pour pouvoir
établir une correspondance entre les 20 acides aminés et les 4 nucléotides, il faut considérer
des combinaisons de 3 nucléotides, appelées codons. Chaque codon correspond à un seul

acide aminé.
• On appelle code génétique la correspondance étroite entre le « langage » de l'ADN qui
comporte 64 codons différents (combinaisons des 4 nucléotides 3 par 3, soit 43 codons), et le
« langage » protéique, qui comporte 20 acides aminés.
Un même acide aminé peut être codé par plusieurs codons différents : il y a redondance et le
code génétique est dit dégénéré.
Trois codons ne désignent aucun acide aminé (codons-stop), ils correspondent à un signal de
ponctuation. Le code génétique est ponctué.
• La correspondance entre les codons de l'ADN et les acides aminés est la même quelle que
soit la cellule vivante considérée. N'importe quelle cellule est capable de « lire » un gène
provenant de n'importe quelle autre espèce et de produire la protéine correspondante. Le code
génétique est universel.
3. Comment se déroule la traduction de l'ARNm en une séquence d'acides aminés ?
• La seconde étape de l'expression d'un gène, la traduction, se déroule dans le cytoplasme et

correspond à l'assemblage des acides aminés pour former une protéine. Cette synthèse est
effectuée selon les instructions contenues dans l'ARNm. L'information réside dans la nature et
l'ordre d'enchaînement des nucléotides. La synthèse est réalisée au niveau des ribosomes,
organites cytoplasmiques formés de protéines et d'ARN, qui fonctionnent comme des ateliers
d'assemblage.
• Le mécanisme de synthèse comporte trois étapes :
a) L'initiation, au cours de laquelle un ribosome se fixe au niveau d'un triplet de l'ARNm. Ce
triplet est toujours le codon AUG. C'est le codon d'initiation.
b) L'élongation, au cours de laquelle le ribosome se décale le long de la chaîne d'ARNm et
fait correspondre à chaque triplet rencontré, un acide aminé spécifique. Les acides aminés
s'enchaînent les uns aux autres par une liaison peptidique pour former une chaîne
polypeptidique. Cette phase requiert la présence dans le cytoplasme de la cellule d'outils
complémentaires :
 Des ARN de transfert (ARNt) : petites molécules d'ARN comportant 2 sites de

fixation, l'un pour un acide aminé spécifique, l'autre appelé anticodon pour la fixation
sur un codon de l'ARNm. Le rôle des ARNt est donc de transporter les acides aminés
jusqu'à l'ARNm et d'assurer leur mise en place dans le respect du code génétique.
 Des enzymes permettant la liaison des acides aminés à un ARN de transfert (ARNt), la
liaison des ARNt à l'ARNm et la formation de liaisons peptidiques entre les différents
acides aminés de la chaîne.
 De l'énergie.
c) La terminaison provoquée par l'arrivée du ribosome au niveau d'un codon-stop. Le

ribosome se détache de l'ARNm et libère la chaîne polypeptidique formée.
• Plusieurs ribosomes effectuent la synthèse de protéines à partir d'un même ARN. Ils se
succèdent sur le brin d'ARNm. Chaque molécule d'ARNm gouverne ainsi la synthèse de 10 à
20 molécules polypeptidiques puis il est détruit.
Schéma de la traduction d'un ARNm en chaîne polypeptidique
4. Quelles sont les conséquences de modifications de la structure d'un gène ?
• Une mutation désigne le processus par lequel un allèle naît par modification d'un gène
préexistant. Toute modification par mutation de la séquence d'un gène, donnant naissance à
un nouvel allèle, peut conduire à une modification de la structure primaire de la protéine
correspondante, c'est-à-dire de l'ordre et de la nature des acides aminés qui la composent. Elle
a parfois également pour conséquence une modification de la conformation spatiale de la
protéine, ce qui peut changer ses propriétés.
• Le plus souvent, les mutations sont ponctuelles et concernent un ou plusieurs nucléotides.

Elles se produisent au hasard le long du gène et peuvent se manifester par :
 Une substitution de nucléotides : un ou plusieurs nucléotides situés à des sites précis

du gène sont remplacés par un autre. Un ou plusieurs codons sont modifiés.
 Une délétion ou une insertion de nucléotides : un ou plusieurs nucléotides sont
supprimés ou ajoutés à la séquence nucléotidique. La succession des triplets de l'ADN
diffère alors de la séquence de référence à partir de la délétion ou de l'insertion.
• Les conséquences de ces mutations sur la séquence polypeptidique sont variables et on peut
distinguer plusieurs cas (voir tableau ci-dessous) :
a) Conséquences de la substitution d'un nucléotide
• Les deux polypeptides sont identiques. Ce phénomène se produit par suite de la redondance
du code génétique, le nouveau triplet obtenu après mutation conduit au même acide aminé :
par exemple TGG pour le codon d'origine et TGT pour le codon muté, qui correspondent tous
deux à la thréonine. La mutation est dite silencieuse.
• Les deux polypeptides diffèrent par un seul acide aminé, mais ils ont la même activité
biologique : par exemple TGG pour le codon d'origine et TCG pour le codon muté. La
thréonine est changée en sérine. La mutation est dite faux-sens.
• Les deux polypeptides diffèrent par un seul acide aminé, mais ils ont des propriétés
différentes. La chaîne polypeptidique peut être plus courte si la mutation fait apparaître un
codon-stop (exemple : AAT devient ACT, qui correspond sur l'ARNm à UAG, un des
codons-stop). La mutation est dite non-sens.
b) Conséquences de délétion ou d'insertion d'un ou plusieurs nucléotides
• Si le nombre de nucléotides perdus ou insérés n'est pas un multiple de 3, le cadre de lecture

de l'ADN (et donc de l'ARNm) est modifié. La séquence des acides aminés est différente à
partir de la délétion ou de l'insertion (exemple : AAT-TGG devient ATT-GG… par perte d'un
A). Par suite du décalage, il peut apparaître un codon-stop et la traduction s'interrompt
précocement. Le polypeptide est plus court et généralement non fonctionnel.
• Si le nombre de nucléotides perdus ou insérés est un multiple de 3, les conséquences sont

variables. Il n'y a pas dans ce cas de décalage du cadre de lecture de l'ADN, mais le
polypeptide codé présente une perte ou un gain de quelques acides aminés. Cela peut n'avoir
aucune conséquence sur l'activité du polypeptide ou au contraire le modifier profondément.
Résumé de différentes mutations ponctuelles et leurs conséquences
À retenir
• L'expression de l'information génétique se fait en deux étapes, la transcription et la

traduction.
• La transcription du gène se déroule dans le noyau. Elle aboutit à la synthèse de l'ARNm.
• L'enchaînement des nucléotides de l'ARNm est complémentaire de celui du brin transcrit de
l'ADN.
• On appelle code génétique la correspondance entre les triplets de nucléotides de l'ADN, ou
codons, et les acides aminés.
• La traduction de l'ARNm en chaîne polypeptidique se déroule dans le cytoplasme. L'ARNm
sert de matrice pour l'assemblage des acides aminés. Des ribosomes, des enzymes et de
l'énergie sont également nécessaires.
• Toute modification accidentelle d'un gène ou mutation peut avoir des conséquences sur la
structure et le fonctionnement de la protéine pour laquelle il code.
TRADUCTION CHEZ LES PROCARYOTES

eme
La traduction, est le mécanisme par lequel l’ARNm est « décodée ». C’est la 2 étape de la
synthèse des protéines. Elle succède à la transcription de l’ADN en ARNm.
Les termes « transcription » et « traduction » se comprennent très bien :
 On dit « transcription » car l’ADN est copié en ARN sans changement de langage. De
nucléotides.
 On dit « traduction » car on change cette fois de langage.
Avec l’ARNm on « parlait » nucléotides, on va maintenant, avec la chaîne peptidique formée
lors de la traduction, parler acides aminés.
Pour toute traduction, on a besoin d’un dictionnaire, ce dictionnaire c’est le code génétique.
Le code génétique :
Un code à 3 lettres, cela veut dire que 3 nucléotides (ensemble également appelée »triplet » ou
« codon ») portés sur l’ARNm seront traduits pour positionner un acide aminé (tableau 1).
Par exemple : AUG est un codon (formé de 3 nucléotides), faisant partie de l’ARNm et codant
la méthionine.
On dispose de 64 codons et sur les 64 codons :
3 codons (UAA, UAG, UGA) sont des « codons non sens » qui ne peuvent pas être traduits en
acides aminés. Ces codons sont en fait des signaux de fin de lecture, on les appelle « codon
stop ».
(UAA est également appelé codon ocre, UAG codon ombre, et UGA codon opale).
Il reste 61 codons (pour 20 acides aminés). Mise à part 2 cas, la méthionine et la tryptophane,
codées par un seul codon, les 18 autres acides aminés sont codés par plusieurs codons, de 2 à
6 (ex. : les 6 codons de Leucine).
3.2.2 Caractéristiques du code génétique

a. Universel
Le code est le même, chez tous les organismes, que ce soit un animal, une plante, une
bactérie, ou un virus.
En fait, depuis 1980 SANGER et son équipe ont remis en question ce_e notion d’universalité
du code génétique. Leurs résultats ont été obtenus avec l’ADN mitochondrial humain. En
effet dans l’ADN des mitochondries (humaines) quelques codons diffèrent :
AUA ne code plus Ile mais Met (qui est donc ici codée par 2 codons au lieu d’un).
UGA // // // stop mais Trp.
AGA // // // Arg mais stop
AGG // // // Arg mais stop.
Depuis d’autres différences portant sur d’autres codons provenant de levure, de trypanosome,
etc,… ont été mises en évidence. On a même trouvé une exception se rapportant au codon
UAA de l’ARNm cytoplasmique de paramécie (protozoaire) qui n’est pas un codon stop mais
code Gln !
On ne peut donc plus continuer à dire que le code est universel (à quelques très rares
exceptions près…).
b. Dégénéré : dégénérescence sur la 3eme base :
On dit que le code est « dégénéré » car un même acide aminé peut être codé par plusieurs
codons différents. Il convient de remarquer que dans la plupart des cas, les triplets codant un
même acide aminé ne diffèrent entre eux que par la 3 eme base. Cette dégénérescence sur la
3eme base n’est pas aléatoire : la 3 base est en effet soit U ou C donc pyrimidine (ex. : UUU
et UUC pour Phe), soit A ou G donc une purine (ex. : CAA et CAG pou Gln), soit l’une des 4
(ex. : UCU, UCC, UCA, UCG pour Ser).
3.2.3 La traduction proprement dite
a. Lieu de la traduction
C’est dans le cytoplasme, au niveau du ribosome, que s’effectue la traduction. Le ribosome
reçoit les éléments nécessaires pour la synthèse des protéines, ce sont :
les ARNt qui apportent les acides aminés: est en effet lié d’un coté par son extrémité 3’ :
CCA à l’acide aminé et d’un autre coté par son anticodon à l’ARNm (liaison faible hydrogène
entre les bases complémentaires de l’anticodon et codon).Les acides aminés dans le
cytoplasme, ne vont pas arriver libres sur le ribosome, mais liés à l’ARNt qui les transporte
(aminoacyl – ARNt).
L’ARNm : L’enchaînement des acides aminés dans une chaîne peptidique doit se faire selon
un certain ordre. Cela pourra se réaliser grâce à l’ARNm. C’est en fait lui qui porte le message
de l’ADN, il indique dans quel ordre doivent venir se succéder les différents acides aminés.
De plus, il contient, dans la grande sous unité, l’enzyme qui va « agrafer » successivement un
acide aminé de plus à la chaîne peptidique en cours d’élaboration. Cette activité enzymatique
s’appelle « peptidyl transferase ».
B. Les différentes étapes de la traduction (figures 4 et 5)
On distingue 3 principales étapes de la traduction :
 Initiation :
Près de l’extrémité 5’ phosphate de l’ARNm se trouve « un codon signal » qui indique que la
traduction doit débuter. On l’appelle « codon initiateur ». Ce codon, c’est presque toujours
AUG (les bactéries utilisent parfois GUG ou UUG), il code la Méthionine.
Toutes les chaînes peptidiques ont donc, lors de leur synthèse, méthionine comme 1 acide
aminé (cette méthionine sera le plus souvent enlevée juste après la synthèse de la chaîne
peptidique). La méthionine initiale (Eschérichia coli) n’a pas son groupement NH2 libre. Le
NH2 est bloqué par l’acide formique, ce qui donne la formylméthionine (f Met).
– Chez les procaryotes: juste avant que la traduction ne commence, le ribosome n’est pas
constitué. Les 2 sous unités ribosomiques sont en effet dissociées et libres dans le cytoplasme.
A la phase d’initiation, la petite sous unité se fixe à l’ARNm en un point spécifique situé en
amont de AUG, il s’agit de la séquence Shine-Dalgarno (5’ AGGAGGU 3’) qu’on trouve au
début de l’
ARNm. Une fois fixée, la petite sous unité migre le long de l’ARNm jusqu’à rencontrer
l’AUG (figure 4).
Un certain nombre de protéines appelées facteurs d’initiation sont nécessaire. Les bactéries
ont 3, nommés : IF1, IF2 et IF3.
L’initiation commence par la fixation d’IF1 et IF3 à la petite sous unité ribosomale libre. Ce
qui empêche sa fixation à une grosse sous unité sans une molécule d’ARNm. Par la suite, IF2
complexé avec GTP se fixe à la petite sous unité pour aider l’ ARNt initiateur de se fixer. La
petite sous unité se fixe alors à l’ARNm et localise le codon d’initiation AUG. L’ ARNt
initiateur chargé avec de la Méthionine formylée se fixe au complexe et IF3 est libéré. La
grosse sous unité peut se fixer au complexe d’initiation pour former un ribosome complet et
fonctionnel. Ceci est accompagné de la libération de IF1 et IF2 et de l’hydrolyse du GTP
(figure 4).
Figure 4 : Phase d’initiation
 Elongation : (figure 5)
Après l’initiation, le 1 acide aminé est alors en place. Il va falloir maintenant, au cours de la
phase suivante appelée élongation, former une liaison peptidique. Pour chaque acide aminé à
accrocher, c’est à dire pour chaque liaison peptidique à fabriquer, un même cycle qui contient
3 étapes est chaque fois décrit :
Première étape : accrochage d’un nouvel aminoacyl – ARNt (acide aminé – ARNt) dans le
ribosome. Le 2eme ARNt vient avec l’acide aminé n°2 dans le site A (site acide aminé) de la
grande sous unité. C’est le codon n°2 placé sur l’ARNm après le codon AUG, qui détermine
donc le choix du 2 anticodon c’est à dire du 2 ARNt, donc du 2 eme acide aminé.
Deuxième étape : formation de la liaison peptidique : il y’ a rupture entre la méthionine et le
1 ARNt (qui est éjecté ), c’est la que se forme la liaison peptidique entre : COOH de l’acide
aminé n°1 (Méthionine) et NH2 de l’acide aminé n°2 porté par l’ ARNt n°2.
Troisième étape : Translocation : le ribosome va avancer d’un cran sur l’ ARNm dans la
direction 5’ vers 3’ (un cran signifie 3 nucléotides ou encore codon). Un nouveau codon
(codon n °3) se trouve donc maintenant en face du site acide aminé. Simultanément, l’ ARNt
n°2 qui portait le dipeptide (formé de la méthionine et de l’acide aminé n°2) est passé du site
A (site acide aminé) au site P (site peptidique). Il a changé de loge, d’ ou le nom de
translocation mais il se trouve toujours en face de son codon (n°2).
De nombreux cycles vont se succéder avec à chaque fois les 3 étapes :
 Accrochage sur le ribosome de l’acide aminé – ARNt.
 Formation de la liaison peptidique.
 Translocation.
Au cours de l’élongation, la peptidyl transferase va, comme son nom l’indique, couper,
transférer, souder. A chaque fois le peptide s’allonge ainsi, d’un acide aminé.
Terminaison :
La fin de la traduction se produit lorsque le ribosome en avançant sur l’ARNm trouve un

codon stop : UAA, UAG ou UGA. Ces codons ne codent pour aucun acide aminé Il n’existe
aucun ARNt ayant un anticodon complémentaire à l’un de ces 3 codons. Il se produira alors
une coupure entre le dernier ARNt et la chaîne peptidique. La liaison ester unissant ce dernier
ARNt au dernier acide aminé est hydrolysée, libérant ainsi la chaîne peptidique (figure 30).
Figure 5: Les étapes de la traduction

REGULATION GENETIQUE CHEZ
LES BACTERIES
Comprendre la régulation génétique
chez les bactéries et son rôle.
Savoir la notion de l‟opéron.
Connaître le principe du
fonctionnement d‟un opéron
catabolique.
2
1.Introduction
1.1.Pourquoi il y a régulation de l’expression des gènes?
Pour répondre aux conditions

changeantes de l‟environnement
immédiat
3
1.2. Qu’est-ce-que la REGULATION GENETIQUE ?
=Un moyen pour la cellule de développer des mécanismes

qui lui permettent de réprimer les gènes qui codent pour
des protéines inutiles et de les activer au moment où ils
deviennent nécessaires
Deux modes de régulation de l’expression d’un gène cible

par une molécule régulatrice :
1- d‟une façon positive : l’interaction déclenche la transcription du gène
2- d‟une façon négative : l’interaction empêche la transcription du gène
4
1.3.Niveaux de régulation
5
Quelques constats
1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court,
doit pouvoir répondre rapidement à des changements de son
environnement.
2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l‟ordre de
quelques minutes).
3. La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans
le même compartiment cellulaire.
La régulation génique doit prendre effet tôt
effectivement
6
2.Régulation de la transcription
2.1.Stratégies de contrôle de l’initiation
de la transcription
2 modes distincts de contrôle de l’initiation de la

transcription
1- un contrôle constitutif qui dépend de la structure du
promoteur
2- un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de
protéines régulatrices
7
CONTRÔLE CONSTITUTIF
Niveau de base de l‟initiation de la

transcription déterminé par la structure du
promoteur.
Variabilité dans la séquence consensus du
promoteur : modification de l‟efficacité du
promoteur.
8
CONTRÔLE de REGULATION
Principe de base de la régulation de la

transcription :
La liaison d‟une protéine spécifique à un site donné
de l‟ADN influence l‟ensemble des évènements
composant l’assemblage du complexe d’initiation
et\ou l‟initiation d‟une synthèse productive d‟ARN
par l‟ARN polymérase.
9
Quelques définitions
Facteur de transcription: protéine de régulation

transcriptionnelle.
Activateur: protéine qui stimule l’initiation de la
transcription favorise l’expression d’un gène.
Répresseur : protéine qui inhibe la transcription et
empêche l’expression d’un gène.
Opérateur : site cible de la protéine répresseur
(souvent proche du site d‟initiation de la transcription)
10
11
Quelques définitions…
Gène de structure : code une protéine

structurale, une enzyme ou une protéine
régulatrice.
Gène de régulation : code une protéine
impliquée dans la régulation d’expression d’autre
gène.
12
2.2.Contrôles positif-négatif
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF:
INDUCTION
En vert : gène régulateur

En bleu : gène structural
Cas du répresseur
lac avec l’IPTG p.e.
Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérase ne peut plus

initier
13 la transcription ce qui empêche l’expression du gène.
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF:
REPRESSION
Lorsque le co-répresseur se fixe à la protéine répresseur cette dernière s’active et

se fixe à l’opérateur , l’ARN polymérase ne peut plus initier la transcription ce qui
14
empêche l’expression du gène.
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF:
INDUCTION
Cas de la CRP associée à l’AMPc
Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour

15
l’initiation au niveau du promoteur.
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF:
REPRESSION
16
Un corépresseur va inactiver l’activateur  pas de fixation de
l’ARN polymérase au niveau du promoteur pas de transcription.
En résumé
Contrôle négatif : le répresseur inactive la

transcription
Contrôle positif : l'activateur active la
transcription
Opéron inductible: Opéron répressible:

avec inducteur: avec corépresseur:
activation de la transcription inhibition de la transcription
17
2.3.Notion d’opéron
généralement trouvés chez les procaryotes, avec quelques exemples
maintenant connus chez les eucaryotes (Némathelmintes , Plathelminthes).
chez les bactéries, quand un promoteur sert une série de gènes
groupés, l‟ensemble de gènes s'appelle un opéron.
Opérateur : contrôle de la transcription

Promoteur : fixation de l‟ARN polymérase
+1 : début de la transcription
RBS („ribosome binding site‟) : fixation du ribosome
CDS („coding sequence‟): séquence codant pour une protéine
18 Terminateur : fin de la transcription
tous ces gènes sont transcrits en un ARNm simple
chaque section de ces ARNm (appelés ARNm polycistroniques) peut
alors être traduite indépendamment
les gènes d‟un opéron donné codent souvent pour plusieurs enzymes
actives dans une même voie métabolique
19
L’opéron lactose* (chez E. coli)
un exemple d’opéron catabolique inductible
négativement & positivement régulé
* lactose : disaccharide pouvant être utilisé comme source de

carbone unique pour la croissance d‟E. coli.
20
3.1.OPERON LAC: Définition et structure
1961 : Jacob et Monod décrivent comment des gènes adjacents

impliqués dans le métabolisme du lactose sont régulés de façon
coordonnée par un élément génétique localisé à proximité des gènes. Il
y a des séquences d‟ADN codant pour des produits agissant en trans ou
en21 cis. (prix Nobel de médecine et de physiologie en 1965)
Quelques définitions…
Trans : les produits sont libres de diffuser pour trouver

une cible (activateur, répresseur)
Cis : pour toute séquence d‟ADN non transformée en une

autre molécule, elle agit in situ et touche l‟ADN auquel elle
est liée (promoteur et opérateur)
Opéron : ensemble de gènes structuraux et d‟éléments

contrôlant leur expression : promoteur, opérateur et un
gène régulateur.
22
Les opérons produisent des ARNm qui codent
pour des protéines fonctionnellement reliés.
Exemple de l’opéron Lac:
23
3 gènes structuraux: z, y & a
codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du
lactose
sont exprimés continuellement à faible taux
sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent
sont modulés par le taux de glucose du milieu
24
Le gène lacZ encode l'enzyme β-galactosidase, qui décompose le
lactose (en galactose et glucose)
Le gène lacY encode la galactosidase perméase, une protéine de
transport pour le lactose.
Le gène lacA encode la thiogalactoside acétyltransférase.
Le gène lacI (gène adjacent n‟appartenant pas à l‟opéron) encode un
répresseur qui bloque la transcription de l‟opéron lactose.
Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles

25
Lactose, (substrate de l‟opéron), converti en son isomère (par
transglycosylation), l‟allolactose.
Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du
lactose).
Inducteur gratuit : induit l‟opéron mais pas métabolisé.
Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)
Lactose Allolactose
26
IPTG ou isopropylthiogalactoside
Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase:
Cinétique d’induction de l’activité β-galactosidase chez E. coli :
L'augmentation de la synthèse de β-galactosidase se produit seulement en

l'absence
27
des sources préférées de carbone/énergie telles que le glucose
3.1.OPERON LAC: Fonctionnement
Glucose/ Pas de Lactose
La protéine répresseur, codée par le gène I, est exprimée en absence ou en

présence de lactose
28
En absence de lactose, le répresseur se lie au site opérateur lac
La liaison du répresseur à l'opérateur bloque la progression de l'ARN
polymérase.
30
Opéron
éteint
REPRESSION
L’ARN polymérase étant incapable de transcrire les gènes structuraux lac, les
protéines correspondantes ne sont pas synthétisées
31
Pas de Glucose/ Lactose
Lorsque le lactose est présent dans le milieu cellulaire, il se lie au site

allostérique du répresseur Lac. Cela change la conformation du
32 répresseur
L'ARN polymérase est capable de transcrire les gènes de structure quant le
répresseur est bloqué
33
Suppression
de la
répression
Régulation
Négative
Ainsi, en présence de lactose, les gènes de structure lac sont

exprimés. Les protéines codées par les gènes Z et Y sont
nécessaires au métabolisme du lactose
34
& s’il y a les 2 Glucose/ Lactose …?!
En général:
glucose disponible comme source d'énergie
utilisation préférentielle/autres sucres
Empêchement de l'expression de plusieurs opérons

( lactose, galactose et arabinose)
=Répression des catabolites
La répression des catabolites fait intervenir une

régulation
35
positive au niveau du promoteur.
COMMENT?
Le glucose entraîne une répression des catabolites en
diminuant la concentration de l‟AMPc.
Peu de glucose => beaucoup d'AMPc => AMPc-CAP active =>

liaison à l'ADN => transcription: utilisation des autres sucres
beaucoup de glucose => peu d'AMPc => CAP inactive => pas de
transcription => utilisation du glucose
36
En effet:
37
CAP?
CAP = protéine activatrice des catabolites = facteur de

contrôle positif
CAP interrompt les voies métaboliques alternatives

lorsqu'elles sont rendues superflues par un apport de
glucose.
38
CAP : ce qu’il faut retenir
1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (=facteur de

transcription global).
2- protéine d‟environ 45 kDa qui se fixe à l‟ADN sous la forme d‟un

dimère (2 sous-unités identiques).
3- le 1er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le

1er pour lequel la structure 3D a été déterminée.
4- en présence d‟AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à

une séquence cible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu‟il
contrôle
5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec

l‟ARN polymérase
39
RECAPITULATIF
3 Scénarios :
1- Pas de lactose présent
L‟opéron est “éteint”  pas d‟ARNm synthétisé
2- Lactose présent; glucose présent également

La présence du lactose inactive le répresseur  il y a Transcription
(Parce que le Glucose est présent  cAMP est faible  CRP ne peut
aider la transcription)
3- Lactose présent; pas de glucose

la présence de lactose inactive le répresseur  il y a Transcription
(Il n‟y a pas de Glucose  [cAMP] est élevée  cAMP se fixe à la CRP
(activation)  CRP se fixe & „aide‟ la transcription : Niveau élevé de
transcription
40
41
3.1.OPERON LAC: Mutations
Analyse génétique de l’opéron
Quels sont les éléments essentiels du système de régulation ?
La génétique a joué un rôle décisif dans la

compréhension du fonctionnement de l‟opéron lac.
OBJECTIF:
 évaluer les changements qui se produisent dans
la spécificité de l‟un ou l‟autre des intervenants du
système en réalisant des MUTATIONS.
42
43
Analyse des mutants et diploïdes partiels
44
45
46
47
48
49
50
51
RECAPITULATIF
mutations Oc
Les mutations de l‟opérateur sont constitutives, car le promoteur est
incapable de fixer la protéine répresseur;
Ceci permet à l‟ARN polymérase d‟avoir libre accès au promoteur.
Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes
structuraux qui leur sont contigus.
mutations du type lac I

Les mutations qui inactivent le gène lac I entraînent:
OU BIEN l‟expression constitutive de l’opéron, car la protéine du répresseur
mutant ne peut plus se fixer sur l‟opérateur.
OU BIEN la répression de l’opéron car la protéine du répresseur mutant ne
peut plus être désactivée par le lactose.
52
III [Techniques de base de la biologie moléculaire]
Chapitre I : Préparation des acides nucléiques

(Extraction et purification)
I- Extraction et purification d’ADN chromosomique et d’ADN plasmidique
Introduction :
L’extraction et la purification des acides nucléiques et plus précisément d’ADN sont les
premières étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les
techniques d’ADN recombinant. Afin d’obtenir des molécules d’ADN hautement purifiés
exempts de tout contaminant visibles, des méthodes d’extraction adéquates devraient être
appliquées.
Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction et de purification des ADN, le
choix de la technique la plus adéquate repose généralement sur les critères suivants :
• L’organisme source,
• Le matériel de départ (tissu, feuille, graine, matériel transformé, etc.),
• Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification requis, etc.),
• L’application en aval (PCR, clonage, étiquetage, transfert d’ADN, RT-PCR, synthèse

d’ADNc, etc.)
I. Méthodes d’extraction et de purification d’ADN chromosomique :
L’extraction d’ADN chromosomique d’un matériel biologique requiert la lyse cellulaire,

l’inactivation des nucléases cellulaires et la séparation de l’ADN chromosomique des débris
cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être
suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu),
mais suffisamment douce pour préserver l’acide nucléique cible.
Généralement, il existe différents protocoles d’extraction l’ADN chromosomique qui suit

approximativement le même schéma de principe (Cseke et al., 2003; Ameziane et al., 2005):
Lyse cellulaire ou rupture de la membrane : Les procédures de lyse courantes sont accomplies
par des méthodes physiques (ex. : broyage ou lyse hypotonique), des méthodes chimique
(ex.: lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des thiols) et la digestion enzymatique
(ex.: protéinase K).
La rupture de la membrane et l’inactivation des nucléases intracellulaires peuvent être

combinées. À titre d’exemple, une solution simple peut contenir des détergents pour
solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les
enzymes intracellulaires. Après la lyse cellulaire et l’inactivation du nucléase, les débris
cellulaires peuvent être aisément retirés par filtrage ou par précipitation.
Élimination des lipides : L’élimination ou la séparation des lipides membranaires et des

débris cellulaires se fait généralement à l’aide de détergents comme le sodium dodecyl sulfate
(SDS) et par centrifugation.
Élimination des protéines de l’extrait cellulaire : La dénaturation des protéines est effectuée
à l’aide d’une protéase telle que la pronase ou la protéinase K. Après quoi, les protéines
dénaturées sont séparées de l’extrait cellulaire.
Élimination de l’ARN : l’ARN est éliminé par addition de RNase qui le dégrade rapidement
en ribonucléotides.
précipitation/agrégation/élution de l’ADN : la molécule d’ADN est précipitée par l’ajout de

l’alcool éthylique absolu permettant la formation d’une pelote blanchâtre
I.1. Extraction et purification de l’ADN génomique chez les eucaryotes :
Il existe plusieurs méthodes d’extraction et de purification d’ADN génomiques chez les

espèces eucaryote reposant sur le même principe, à la différence des sources considérées.
1) À partir d'un prélèvement sanguin humain (Méthode sans phénol/chloroforme) :
Le sang prélevé sur tube EDTA est traité le même jour ou conservé à -20°C jusqu'à
utilisation.4 mL de sang sont transférés dans un tube Falcon et additionné de 11 mL d’une
solution Tris EDTA (TE) 10 mM à pH 8. Le tube Falcon est mis dans un bac de glace pendant
30 minutes, puis centrifugé à 3000 tours/min pendant 15 minutes. Le culot est remis en
suspension dans la même solution de TE et recentrifugé à 3000 tours/min pendant 15 minutes.
Cette opération d’élimination de l’hémoglobine est répétée plusieurs fois jusqu’à obtention
d’un surnageant limpide. Le Buffy coat obtenue représente une mince couche grisâtre de
leucocytes et plaquettes d’un volume d’environ 2 mL. L’ADN génomique est extrait à partir
de ce Buffy coat par la technique de Miller (1988) selon le principe du salting out.
5 ml de tampon de lyse (TRIS/HCL 10Mm PH= 8, EDTA 1Mm, SDS 0,5%) sont additionnés
à 30 µL de protéinase K à 20mg/ml au Buffy coat. Après incubation 24 heurs à 37°C sous
agitation, on ajoute 2 mL de NaCl 5 M. Le mélange est centrifugé 10 minutes à 4000 tours
/min. Les protéines sont ainsi précipitées. Le surnageant est transverse délicatement dans un
tube Falcon de 50 mL et additionné de deux volumes d’éthanol absolu à froid. Le tout est
mélangé lentement par mouvement de rotation afin de précipiter la pelote d’ADN. L’ADN est
récupéré à l’aide d’une pipette pasteur thermo soudée à son extrémité et rincé avec de
l’éthanol à 70%.
Après un temps de séchage, l’ADN est solubilisé dans des tubes Eppendorfs contenant un
volume de la solution du TE10/1 pH 8 sous agitation rotative à37°C pendant 24 à 48h
(Miller,1988).
2) A partir d'extraits végétaux :
Parmi les procédés les plus utilisés, Méthode d’extraction et de purification au CTAB
(cétyltriméthyl ammonium bromure).Etabli pour la première fois par Murray et Thompson en
1980 (Murray et Thompson, 1980), le protocole du test au cétyltriméthyl ammonium bromure
(CTAB) a été publié ultérieurement, et plus précisément en 1987, par Wagner et ses collègues
(Wagner et al., 1987).
Cette méthode convient pour la suppression des polysaccharides et des composés

polyphénoliques qui affectent la pureté de l’ADN et donc la qualité. Le principe de la
méthode repose sur trois étapes lyse, extraction et précipitation.
Des cellules végétales peuvent être lysées en utilisant le détergent ionique cétyltriméthyl
ammonium bromure (CTAB), qui forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques
dans un environnement à faible teneur en sels. Dans ces conditions, les polysaccharides, les
composés phénoliques et les autres contaminants restent dans le liquide surnageant et peuvent
être lavés. Le complexe d’ADN est solubilisé en élevant la concentration en sels et précipité
avec de l’éthanol ou de l’isopropanol. Les principes des trois principales étapes, à savoir la
lyse de la membrane cellulaire, l’extraction de l’ADN génomique et sa précipitation sont
décris ultérieurement (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).
Lyse de la membrane cellulaire : comme il a été mentionné précédemment, la première

étape de l’extraction d’ADN est la rupture de la cellule et de la membrane nucléaire. À cette
fin, l’échantillon homogénéisé est tout d’abord traité avec le tampon d’extraction contenant de
l’EDTA, du Tris/HCl et du CTAB. Toutes les membranes biologiques ont une structure
générale commune comprenant des molécules de lipide et de protéines maintenues ensemble

par des interactions non covalentes (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke
et al., 2011).
Figure 01 : Représentation simplifiée des membranes cellulaires (http://gslc.genetics.utah.edu.).
Comme le montre la Figure 01, les molécules de lipides sont agencées sous forme de double
couche continue dans laquelle les molécules de protéine sont « dissoutes ». Les extrémités des
molécules de lipides se composent de « têtes » hydrophiles et de « queues » hydrophobes.
Dans la méthode au CTAB, la lyse de la membrane est accomplie par le détergent (CTAB)
contenu dans le tampon d’extraction. Comme la composition des lipides et celle du détergent
sont semblables, le composant CTAB du tampon d’extraction a pour fonction de piéger les
lipides qui constituent la cellule et la membrane nucléique. Le mécanisme de solubilisation
des lipides en utilisant un détergent est illustré dans la Figure 02(Somma, 2004 ; Henry,
2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).
Figure 02 : Solubilisation des lipides (http://gslc.genetics.utah.edu.).
La Figure 03 montre comment le détergent piège les lipides et les protéines, autorisant ainsi la
libération de l’ADN génomique, lorsque la membrane cellulaire est exposée au tampon
d’extraction au CTAB. Dans une concentration salique (NaCl) spécifique, le détergent forme
un complexe insoluble avec les acides nucléiques. L’EDTA est un composant de chélation qui
lie le magnésium, entre autres métaux. Le magnésium est un cofacteur pour la DNAse. En
liant le Mg à l’EDTA, l’activité de la DNAse présente est diminuée. La combinaison Tris/HCl
donne à la solution une capacité d’atténuation du pH (un pH faible ou un pH élevé
endommage l’ADN). Il est important de souligner qu’étant donné le risque de dégradation
aisée des acides nucléiques à ce stade de la purification, le temps écoulé entre
l’homogénéisation de l’échantillon et l’ajout de la solution tampon au CTAB devrait être
limité. La purification de l’ADN est réalisée dès que la cellule et les membranes de
l’organelle (comme celles qui entourent les mitochondries et les chloroplastes) sont séparées
(Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).
Figure 03 : Rupture de la membrane cellulaire et extraction de l’ADN génomique

(http://gslc.genetics.utah.edu.).
L’extraction : dans cette phase, les polysaccharides, les composés phénoliques, les protéines
et les autres lysats cellulaires dissous dans la solution aqueuse sont séparés du complexe acide
nucléique / CTAB. L’élimination des polysaccharides, ainsi que des composés phénoliques
est particulièrement importante en raison de leur capacité à inhiber un grand nombre de
réactions enzymatiques. Dans une concentration à faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les
contaminants du complexe d’acide nucléique ne précipitent pas et peuvent être enlevés par
l’extraction hors de la solution aqueuse au moyen de chloroforme. Ce dernier dénature les
protéines et facilite la séparation des phases aqueuses et organiques. Normalement, la phase
aqueuse constitue la phase supérieure. Mais si la phase aqueuse est dense, en raison de sa
concentration en sels (> 0,5 M), elle constituera la phase inférieure. L’acide nucléique aura,
en outre, tendance à se dissoudre dans la phase organique si le pH de la solution aqueuse n’a
pas été équilibré comme il se doit à une valeur de pH comprise entre 7,8 et 8,0. Au besoin,
l’extraction au chloroforme est répété deux ou trois fois afin d’enlever complètement les
impuretés de la couche aqueuse. Pour parvenir à la meilleure récupération possible de l’acide
nucléique, une rétroextraction de la phase organique peut être réalisée à l’aide d’une solution
aqueuse qui est ajoutée ensuite à l’extrait précédent. Une fois que le complexe d’acide
nucléique a été purifié, la dernière étape de la procédure peut être accomplie. Il s’agit de la
précipitation (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).
Précipitation : à ce stade final, l’ADN génomique est libéré du détergent. À cette fin, la
solution aqueuse est tout d’abord traitée à l’aide d’une solution de précipitation composée
d’un mélange de CTAB et de NaCl à concentration élevée (> 0,8 M NaCl). Le sel est
indispensable à la formation d’un précipité d’acide nucléique. L’acétate de sodium peut être
préféré au NaCl pour sa capacité de tamponnage. Dans ces conditions, le détergent, qui est
plus soluble dans l’alcool que dans l’eau, peut être élué, tandis que l’acide nucléique (ADN)
précipite. Le traitement successif par 70% d’éthanol permet une purification ou élution
supplémentaire des sels résiduels (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et
al., 2011).
I.2. Extraction et purification de l’ADN génomique chez les procaryotes :
L’objectif de la méthode est de purifier l'ADN génomique de source procaryote tel que d'E.
coli. Les cellules sont d'abord concentrées après centrifugation puis lysées. On réalise ensuite
une extraction au phénol ce qui permet de se débarrasser des protéines cellulaires. Les
molécules d'ARN sont éliminées par des RNase. Pour concentrer l'ADN, la méthode utilisée
est la précipitation à l'éthanol.
1) Lyse cellulaire et dénaturation des protéines :
Dans un tube à centrifuger en polypropylène, 3mL de culture d'E.coli sont introduit puis
Centrifugé 5minutes à 150 g, le culot est dissolu dans 2,5 mL de tampon S.E (saline-EDTA,
pH=8). Une solution de lysozyme de 0,15 mL est ajouté et incuber 30 minutes à 37°C puis
ajouter 0,2mL de SDS. Le mélange est incubé 10 minutes à 60°C, puis refroidi dans la glace
jusqu'à température ambiante. 0,60mL de NaCIO4 sont ajouté lentement et mélangé par
agitation douce (Nicolas et Daniel, 2000).
2) Extraction au phénol :
Un volume de 3,5mL de phénol saturé est mélangé par retournements successifs pendant 5
minutes de manière à maintenir une émulsion. Le tube est ensuite centrifugé à 16000 x g
pendant 5 min à température ambiante pour séparer la phase aqueuse de la phase phénolique.
La phase aqueuse supérieure, qui contient l'ADN génomique est récupérée dans un nouveau
tube, puis traitée de la même façon avec un mélange phénol/chloroforme. Après ce dernier
traitement la seconde solution aqueuse obtenue est additionné avec 100µg de RNase par mL,
puis le mélange est incubé 15 minutes à 37°C. Une autre extraction par le mélange
phénol/chloroforme est nouvellement appliquée, la phase aqueuse récupérée est mélangé avec
le même volume de chloroforme afin d'éliminer toute trace de phénol. Le tube est ensuite
centrifugé à 16000 x g pendant 5 min à température ambiante pour sépare la phase aqueuse de
la phase organique (Nicolas et Daniel, 2000).
3) Concentration de l'ADN par précipitation à l'éthanol
2,5 volumes d'éthanol à 95% et un volume V d'acétate de sodium à une concentration finale
de 0,3 M sont ajouté à un volume de la phase aqueuse, le mélange est incubé 30 minutes à -
20°C, puis centrifugé 15 minutes à 12000 g. Le culot obtenu est lavé par une solution
d'éthanol à 70%. Centrifuger à nouveau 5 minutes à 12000 g et éliminer le surnageant, le culot
est séché afin d'éliminer les traces d'éthanol. Le précipité est dissout dans 0,5mL de SSC
(sodium saline citrate) (Nicolas et Daniel, 2000).
II. Méthodes d’extraction et de purification d’ADN plasmidique :
II.1. Les plasmides : Rappel
 Petites molécules d’ADN habituellement circulaire

 Existant indépendamment des chromosomes de l’hôte
 Présents chez nombreuses bactéries (quelques levures et mycètes)
 réplication autonome (=réplicons) indépendamment des chromosomes
 Portent un nombre de gènes très réduit (≤30)
 A information génétique non-essentielle pour l’hôte
 En nombre variable:
 Plasmide à copie unique (1 seul/cellule hôte)
 Plasmides à copies multiples (40 ou + /cellule hôte)
II.2. Purification par Lyse alcaline :
C’est Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire, consistant à une
préparation sélective de l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant
l'ADN du chromosome bactérien selon les étapes suivantes (Turner et al., 2000; Cseke et al.,
2003 ; Cseke et al., 2011) :
 Lyse des cellules par le détergent (SDS) en présence de soude (pH 13) donnant une
Dénaturation de l'ADN total,
 Neutralisation rapide par acétate de potassium (pH 5,5) donnant une renaturation de
l’ADN plasmidique et une précipitation de l’ADN Chromosomique,
 Concentration de l'ADN plasmidique par précipitation à l'alcool et récupération de
l’ADN par centrifugation,
 Suspension de l’ADN plasmidique dans TE ou Eau pure et élimination des ARN par
ribonucléases (hydrolyse sélective des ARN/ ADN intact).
II.3. Purification par Gradient de chlorure de césium :
Les acides nucléiques sont séparés par ultracentrifugation isopycnique en chlorure de césium
(CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5mol/L. Cette
possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage.
Un gradient de densité stable est réalisé par ultracentrifugation du CsCl en présence d’un
agent intercalant le Bromure d’éthidium ou BET reposant sur l’affinité du BET pour les
différentes formes d’ADN. La densité moyenne de l’ADN chromosomique bactérien et d’un
plasmide sont différents en présence de BET. Les molécules d’ADN se séparent en fonction
de leur densité indépendamment de leur taille ou de leur masse : elles se stabilisent en cours
de centrifugation au point où leur densité est égale à celle du milieu environnant. Cette
technique, appelée centrifugation isopycnique (à l’équilibre de densité), est utilisée pour la
purification en grande quantité les plasmides bactériens (Figures 04) (Cseke et al., 2003 ;
Cseke et al., 2011).
Figure 04 : Purification de plasmide sur gradient de Chlorure de Césium (Cseke et al., 2011).
II- Les techniques d’extraction de L’ARN
Introduction :
Il existe différents protocoles pour extraire l‘ARN avec même schéma de principe:
 Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou détergents) ou

enzymatique (lysozyme ou la lyticase),
 Protection des ARN de l’action des ARNases.
L’extraction des ARN peut être réalisée selon deux grands principes : 1) les différences de
propriétés physico- chimiques entre les différents acides nucléiques et les protéines ; 2)
l’adsorption sélective des acides nucléiques sur un support solide.
Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules les ARN messagers (ARNm) représente la
classe la plus étudié. Se caractérisent par la présence du côté 3'terminal d'une une longue
queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle.
I. Méthodes de lyse et d’homogénéisation :
Une étape préalable de lyse cellulaire et d’inactivation des nucléases est préalablement
appliquée avant tous procédé d’extraction afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans
chaque cellule. À l’exception des tissus qui subiront une étape préalable de pulvérisation
avant toute lyse, lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres
cas. Différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques existe selon les
types cellulaires. Les méthodes mécaniques sont destinées aux cellules et aux tissus par
contre les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin
de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture
mécanique. Dans la plupart des cas, la lyse est réalisée dans des conditions dénaturantes pour
casser les cellules. En outre, la plupart des agents dénaturants utilisés sont de puissants
inhibiteurs des RNAses.
La méthode de référence décrite par Chirgwin et al. en 1979 homogénéisait les prélèvements
dans une solution 4 M de thiocyanate de guanidinium, agent puissant de dénaturation des
protéines, additionné de beta2-mercaptoéthanol qui permet de rompre les ponts disulfures
protéiques (Chirgwin et al., 1979). Chomczynski et Sacchi ont ensuite amélioré cette méthode
pour accélérer la procédure d’extraction en combinant lyse au thiocyanate de guanidinium à la
phase d’extraction au phénol-chloroforme (Chomczynski et Sacchi ,1987).Cette modification
s’est avérée particulièrement intéressante lors de la réalisation de grandes séries d’échantillons

ou lorsque l’on ne dispose que de petites quantités cellulaires ou tissulaires. À l’heure
actuelle, la plupart des coffrets disponibles sur le marché reposent sur ces deux principes avec
des proportions de thiocyanate de guanidinium et phénol-chloroforme qui leur sont
propres (SFBC, 2002).
II. Méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux :
Initialement, toutes les préparations d'ARN impliquaient la lyse totale des cellules avec des
détergents forts et/ou du phénol et du tampon. Cela provoque une lyse immédiate des cellules
mais également une inactivation des RNases cellulaires en raison de l'action dénaturante du
détergent et du phénol. des sels dénaturants puissants sont utilisés tels que le guanidinium HCl
ou le thiocyanate de guanidinium (Chirgwin et al., 1979; Ullrich et al., 1977). La figure 9
montre un procédé couramment utilisé pour l'isolement de l'ARN cellulaire total (Greene,
1998).
Les cellules ou tissus cultivés sont lysés dans une solution de guanidinium. Le lysat est
ensuite appliqué sur un gradient graduel avec une couche inférieure contenant 5,7 M de CsCl,
qui dépasse la densité de l'ADN mais pas celle de l'ARN. Lorsque ceci est centrifugé pendant
18h, l'ADN contaminant est piégé à l'interface entre le lysat et le CsCl haute densité, l'ARN
traversant la couche de CsCl et les granulés au fond. Ceci est simplement une étape de
fraction qui réalise une purification initiale de l'ARN. Le culot d'ARN est ensuite récupéré,
extrait avec du phénol chloroforme pour éliminer les protéines résiduelles, puis précipité. Si
une petite quantité de CsCl est dissoute dans le lysat (1 g / 1,5 ml de lysat), ceci ajoute une
densité suffisante au lysat pour que les protéines s'accumulent sous la forme d'une bande
dénaturée au sommet. Cette procédure peut également être utilisée pour préparer un ADN
chromosomique piégé à l’interface entre un CsCl de basse et haute densité (Greene, 1998).
.
Figure 05 : Extraction d’ARN total par la méthode de Chirgwin modifiée (Greene, 1998).
III. Méthodes d’extraction et de purification des ARN messagers :
Dans certaines cas, il peut être préférable d’extraire les ARN messagers polyadénylés (poly
(A+)) et non les ARN totaux (Tableau 01). En effet, dans une cellule de mammifère, les ARN
messagers codant pour des transcrits spécifiques d’un type cellulaire donné représentent
moins de 10 % des ARN totaux produits. Les 90 % restants correspondent aux ARN
impliqués dans les étapes transcriptionnelles ou traductionnelles (ARN ribosomaux (28S, 18S
et 5S), ARN de transfert, ARN nucléaires et ARN mitochondrial. Cette approche permet ainsi
d’augmenter la sensibilité de la méthode en éliminant les ARN ribosomaux et les ARN de
transfert les plus abondants, notamment pour les transcrits faiblement exprimés. Elle est
utilisée pour : 1) le northern blot lorsque les ARNm sont présents en faible quantité; 2) la
réalisation de la technique de RNA mapping à l’aide de la méthode d’extension d’amorce
dans le but de déterminer la position du site d’initiation de la transcription ; 3) la construction
de banque d’ADNc, pour l’étude de l’expression des gènes à l’aide de puces d’ADNc; 4) la
réalisation de la technique de mRNA différentiel display; 5) la réalisation de traduction in
vitro; 6) la réalisation de la technique de Rnase protection assay consistant à utiliser une sonde
ARN anti sens partiellement complémentaire de l’ARN étudié protégeant l’ARN vis-à-vis des
Rnases. Parce qu’il comporte une queue poly(A) d’environ 200 nucléotides pour les cellules
de mammifères, l’ARN messager peut être purifié par chromatographie d’affinité (Sene et al.,
1982 ;SFBC, 2002). Il se fixe sélectivement par complémentarité de séquence sur des
colonnes d’oligo (dT) (Figure 06). Deux approches peuvent être utilisées : soit les ARNm sont
purifiés à partir des ARN totaux préalablement extraits, soit directement à partir du
prélèvement source sans passage intermédiaire sous forme d’ARN total (SFBC, 2002).
Figure 06 : Purification d’ARNm par chromatographie sur oligo (dT) cellulose (Greene,
1998).
Différents procédés sont utilisés : 1) par exemple, les Coffrets Sigma utilisent des oligo (dT)
30 liés de façon covalente à des billes de polystyrène de un micromètre pour capter par
hybridation des ARN polyadénylés. Les polystyrènes donnent moins de liaisons non
spécifiques que la cellulose et restent en suspension lors de l’hybridation avec les ARNm en
l’absence d’agitation (Sene et al., 1982 ;SFBC, 2002) ; 2) les coffrets Clontech utilisent des
billes de latex coatées par des oligo (dT). Dans des conditions très salines, les ARN poly(A)
se lient aux particules de latex à 68oC. Les billes latex-ARNm sont remises en suspension
dans un tampon de lavage et transférées sur un filtre permettant de recueillir facilement les
billes de latex. Après deux lavages, les ARNm sont élués dans un tampon peu salin ou de
l’eau Rnase-free ; 3) les coffrets Roche Diagnostics et Promega (PolyA Tract System 1 000®)
utilisent des sondes oligo (dT) 20 marquées à la biotine et des billes magnétiques coatées à la
streptavidine. La biotine et la streptavidine présentent l’une des affinités les plus fortes en
biologie. Les hybrides sont ainsi capturés grâce aux billes magnétiques (SFBC, 2002)..
Tableau 01 : Comparaison entre l’ARN total et l’ARN poly A pour différentes applications
(SFBC, 2002).
Application ARN totaux ARN poly (A)

Northern blot ++ +++
RT -PCR +++ +++
Race –PCR - +++
Construction de banque + +++
ADNc
Nuclease protection ++ +++
Traduction in vitro - +++
Primer extension ++ +++
Protein truncation test +++ +++
Differential display + +++
Microarray + +++
+++ Recommandé ; ++ satisfaisant ; + possible ; - impossible
Chapitre II : Séparations des acides nucléiques
Electrophorèse et analyse de l’ADN
Introduction
Les être vivants eucaryotes ou procaryotes contiennent dans la plus parts des génomes
fragmentés : chromosomes et plasmides bactériens ; chromosomes nucléaires, génomes
chloroplastiques et mitochondriaux, virus…etc. L’étape préliminaire dans l’étude d’un
génome peut être de le résoudre en ses composants. Il existe plusieurs techniques pour
analyser de façon globale la structure des génomes et les fractionner en leurs composants.
Parmi les techniques les plus courantes en biologie moléculaire est l’électrophores sur gels
d’Agarose ou de polyacrylamide (Callen et Perasso, 2005).
I. Électrophorèse : définition et principe de la technique
Le terme électrophorèse vient de : électroce qui signifie énergie électrique et de phoresis

(photo en grec) qui veut dire porter, avoir en soi.
L’électrophorèse technique de biologie moléculaire permet de séparer des fragments d’ADN

linéaires de différente taille selon le principe du tamisage moléculaire. Les molécules d’une
taille comprise entre quelques centaines de paires de base et une vingtaine de kilo bases ont
une mobilité approximativement inverse au logarithme de leur taille : c’est la méthode de
choix pour déterminer la taille de fragments de restriction par référence à un standard de
fragments d’ADN de mobilité connue (Tagu et Moussard, 2003; Callen et Perasso, 2005).
Le principe est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement à pH7~8 (à
cause de l'ionisation de leurs groupements phosphate), vers l'anode (+) sous l'effet d'un champ
électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel en fonction de la taille des
molécules. Deux principaux polymères sont utilisés: l’agarose et le polyacrylamide (Tagu et
Moussard, 2003; Callen et Perasso, 2005).
L’agarose est un polysaccharide formé d'alpha et de bêta-galactoses, extrait des algues
rhodophytes des genres Gellidium et Gracillaria (Figure 07) (Imerson 2011). Il forme un gel
solide lorsqu’il est dissout dans une solution aqueuse à des concentrations entre 0,5% et 2%
(W/V) (Tableau 02). L’agarose utilisé pour l’électrophorèse est une forme plus purifiée de
l’agar utilisé pour les plaques de la culture bactérienne (Nussinovitch, 1997; Nussinovitch,
2010).
Figure 07: Structure de l’Agarose (Kahajdova et Karovicova, 2009).
Tableau 02 : Pourcentage d’agarose approprié pour les tailles des fragments à séparer.
Pourcentage d’agarose (W/V) (%) Tailles de molécules d’ADN linéaires

0,3 5 à 60000 pb
0,6 1000 à 20000 pb
0,7 800 à 10000 pb
0,9 500 à 7000 pb
1,2 400 à 6000 pb
1,5 200 à 4000 pb
2 100 à 3000 pb
Les fragments de taille inférieure à la centaine de pb sont séparés sur des gels plus fortement
réticulés, gels d’acrylamide utilisés en particulier pour le séquençage.
Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide de formule brute C3H5NO (extrêmement
neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et
de bisacrylamide qui est l'agent portant (Figure 08). Les taux de ces deux substances sont
variés afin d’obtenir différents maillages et donc différentes densités de gel variant de 4% à
20% (poids/volume). La polymérisation est réalisée grâce à l'ajout de deux réactifs:
le TEMED (N,N,N',N'tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent
des anions hyperactifs en présence de lumière ( Rosenberg ,2006; Maurer, 2011).
Figure 08 : Polymérisation d’acrylamide et de bisacrylamide (Burlingame et al., 1992).

L’ADN est visualisé à l’aide de bromure d’éthidium, qui s’insère entre les plateaux de base
adjacents (Figure 09) et fluoresce dans le rouge orangé quant on l’excité avec une lumière de
longueur d’onde inférieure à 300nm.
(c)
Figure 09 : (a) structure bromure d’ethiduim, (b) processus d’insertion entre les
plateaux de base adjacents, (c) fluoresce d’ADN dans le rouge orangé.
Chapitre III:
Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot blot
III-1. Southern blot
I. Southern blot principe et technique :
Le Southern blot est une technique décrite par Edwin M. Southern en 1975 pour rechercher
spécifiquement des fragments de DNA sur électrophorèse en les hybridant avec une sonde
complémentaire marquée par un radioisotope (Southern, 1975; Coleman et Tsongalis, 1997;
Gelehrter et al., 1998 ; Read et Donnai, 2007 ; Walker et Rapley, 2009).
Les étapes successives de cette technique sont les suivantes (Figure 10):
1. Extraction et purification de l’ADN génomique.

2. L’ADN à étudier est digéré à l’aide d’enzymes de restriction différentes en de très
nombreux fragments par exemple dans le tube 1, une digestion par l’enzyme 1 est
réalisée, dans le tube 2 une digestion par l’enzyme 2 ;etc….
3. Le mélange des fragments est soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose.
4. Le gel d’électrophorèse est ensuite immergé dans une solution alcaline (hydroxyde de
sodium) afin de permettre la dénaturation de l’ADN bicaténaire en ADN
monocaténaire.
5. Afin de repérer les fragments d’intérêt, il faut en premier les hybrider. L’hybridation
ne peut pas être effectuée sur le gel dont la structure immobiliserait les sondes, de ce
fait il faut transférer les fragments sur un filtre de nitrocellulose ou de nylon.
L’emplacement des fragments séparés par l’électrophorèse est conservé au cours du
transfert.
6. En pratique, un montage est réalisé en disposant par-dessus le gel, une feuille de
membrane de nitrocellulose ou de nylon recouverte d’une pile de papier absorbant
puis en comprimant gentiment l’ensemble par un poids, les fragments sont transférés
grâce à une montée par simple capillarité de tampon imprégnant le gel puis la
membrane où le DNA va se fixer par des liaisons stables (Figure 11).
7. afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la membrane, cette dernier est alors
chauffée dans le cas de nitrocellulose ou exposée au rayonnement UV s’il s’agit de
nylon.
8. La membrane avec l’ADN fixé est ensuite incubée dans une solution contenant une
sonde marquée complémentaire du fragment de DNA que l’on recherche a révélé la
position, la température d’incubation est assez basse pour que l'hybride se forme mais
assez élevée pour que cet hybride soit parfaitement complémentaire.
9. La membrane est ultérieurement lavée des molécules de la sonde qui ne sont pas
fixées à leur DNA complémentaire.
10. Selon le type de sonde utilisée, la position sera déterminée par autoradiographie ou par
fluorescence. L’information obtenue est double : la présence de marquage confirme la
présence de la séquence d’intérêt et sa position permet de déterminer la taille du
fragment de restriction.
Figure 10 : Technique du Southern blot (Tagu et Moussard, 2003).

Figure 11 : Montage représentatif du transfert capillaire des ADN ou ARN sur membranes de
nitrocellulose ou de nylon (Walker et Rapley, 2009).
II. Application de la technique du Southern blot :
Le Southern blot peut détecter la présence des gènes homologues entre les espèces. Par
exemple, si un gène d’intérêt biologique a été localisé chez le rat, il est possible de construire
une sonde marquée à partir du gène de rat et de l'utiliser pour rechercher un gène homologue
chez l'homme par analyse Southern bolt. Le transfert d'ADN peut également être utilisé pour
évaluer le nombre de copies d’un gène spécifique, ce qui constitue une réponse à l’effet des
conditions particulières de l'environnement et explique souvent la résistance aux médicaments
dans les cellules de mammifères (Stark et Wahl, 1984 ;Ruiz et al., 1989).L'analyse Southern
permet d'identifier des mutations, des délétions ou des réarrangements qui altèrent l'intégrité
d'un gène spécifique, ce qui peut être utile dans le pronostic de certains types de cancer et
dans le diagnostic prénatal de maladies génétiques.
De plus, le Southern blot est un outil précieux pour le clonage moléculaire, offrant un
mécanisme de localisation des séquences spécifiques dans des clones d’ADN de
bactériophages et de cosmides (Coleman et Tsongalis, 1997).
III-2. Northern blot
I. Northern blot principe et technique :
Cette technique a été appelée en référence au Southern blot. Le northern blot est une
technique simple et couramment utilisée pour la détection et la quantification d’ARN
spécifiques provenant d’un type de cellule ou de tissu particulier. Dans cette méthode, les
molécules ARN total ou ARNm sont isolés et séparés par électrophorèse sur gel d’agarose
selon leurs tailles. Le gel est préparé avec du formaldehyde pour dénaturer l'ARN et empêcher
la formation de structures secondaires. Après la séparation sur le gel d’agarose, l’ARN est
coloré au bromure d’éthidium et visualisé à la lumière ultraviolette. (Ausubl 1997;Varma et
Oelmüller ,2007). Les ARN complémentaires de la sonde sont identifiés après transfert sur
une membrane de Nylon ou de nitrocellulose qui est ensuite soumise à l’hybridation.La sonde
peut être une molécule d’ADN ou d’ARN, marquée chimiquement ou radioactivement. Selon
le type de marquage les molécules d’ARN seront déterminées par autoradiographie ou par
fluorescence (Figure 12) (Varma et Oelmüller ,2007; Dubey, 2014; Tagu et al., 2018).
Figure 12 : Technique du Northern Blot (Dubey, 2014).
II. Application de la technique du Northern blot :
Le Northern blot et ses variations sont utilisés dans la recherche en biologie moléculaire afin
d’évaluer la taille de l’ARN étudié ainsi que la taux d’expression et d’accumulation d’une
population d’ARN dans un tissu donné (feuille, racine, tige,,,) à un moment déterminé de son
développement (différentes phase de l’embryogenèse) ou sous l’effet d’un stress biotique ou

abiotique . Aussi elle permet d’étudier la dégradation de l'ARN et leur demi-vie. Enfin cette
technique sert à détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage
des ARN (Varma et Oelmüller ,2007 ;Dubey, 2014 ;Tagu et al., 2018).
III-3. Western blot
I. Western blot principe et technique :
En 1979, H. Towbin et ses collaborateurs ont mis au point la technique de Western Blot ou
immunoblot pour détecter une protéine nouvellement codée par une cellule transformée. Son
principe repose sur la réaction antigène-anticorps; il s’agit donc d’une technique
d’immunodétection. Dans cette méthode, les sondes d'acide nucléique radiomarquées ne sont
pas utilisées.Cette technique se déroule en plusieurs étapes (Figure 13) (Walker ,2002;
Klionsky ,2009; Dubey, 2014):
 Extraction des protéines à partir des cellules et séparation par SDS-PAGE

(électrophorèse sur gel depolyacrylamideen présence dedodécylsulfate de sodium) en
fonction de leur taille, le SDS servant de détergent pour l'électrophorèse et de
dénaturant pour les protéines a structure tridimensionnel.
 une fois que les protéines ont migré, elles sont transférées sur une membrane de
nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La liaison des protéines à la
membrane se fait grâce à des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane
et les protéines.
 Incubation de la membrane de nitrocellulose avec un anticorps primaire, qui est un
anticorps spécifique qui se lie aux protéines et forme un complexe anticorps –
protéines d’intérêt. Le lavage de la membrane est effectué à l’aide d’une solution de
lavage pour éliminé tous les anticorps non hybridés.
 Addition d’un anticorps secondaire qui est conjugué à de la couleur, de la radioactivité
ou une enzyme aux fins de la détection, par exemple :un anticorps secondaire de
chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort (horseradishperoxidase ;
HRP) qui est considérai comme un une enzyme conjugué permettant la visualisation
de la protéine d’intérêt (Figure 14).
 Incubation dans un milieu réactionnel spécifique de l’enzyme pour visualisé sont

action. Les bandes sont visible une fois il y a formation du complexe protéine-
anticorps primaire-anticorps secondaires – enzyme. Un filme radiographique est
exposé au gel et les séquences hybrides sont détectées par autoradiographie. Les
bandes montrent la présence de protéines recherchées.
Figure 13 : Représentation de la technique de western blot (Dubey, 2014).
Figure 14 : Un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de

raifort (HRP) pour détection des protéines d’intérêt (Dubey, 2014).
II. Avantages et applications de la technique de western blot :
Le Western blot présentes beaucoup d'avantages par rapport à d'autres dosages d'immuno-
absorption tels que la méthode d’ELISA. Le Western blot permet la séparation du mélange
protéique par taille, charge et/ou conformation par rapport au test ELISA dont le concept est
différent. La méthode d'élimination décrite permet de détecter plusieurs cibles, contrairement
au test ELISA qui permet de ne détecter qu'une seule protéine. Étant donné que
l'électrophorèse de protéines sur gel sépare les protéines en bandes, il est possible de
déterminer la taille de la protéine/du polypeptide cible. Il est également possible de (semi-
)quantifier la protéine d'intérêt en exécutant en parallèle une analyse interne de quantité sur
les échantillons dans le gel. De la même manière, la teneur en protéines des échantillons peut
être comparée (échantillon A comporte plus de protéines que l'échantillon B).
Les applications du western blot dans les laboratoires de recherche sont nombreuses
englobant (Holmes, Pollenz, 1997, King, 1998 ; Walker ,2002) :
 La détection et l’analyse de la nature des protéines à faible abondances dans un milieu

biologique.
 L’analyse d’expression des protéines recombinantes et la détection des protéines
contaminants.
 La combinaison entre les réactions immunologique et l’analyse des tailles des
molécules protéiques possible par la méthode du western blot a permis l’analyse des
modifications post-traductionnel des protéines.
 La Détermination de la taille et la quantité de protéines dans un échantillon donné.
 Le diagnostic des maladies: détecte les anticorps anti-virus ou les bactéries présentes
dans le sérum.
 La technique de Western blot est le test de confirmation du VIH. Il détecte les
anticorps anti-VIH dans le sérum du patient (Gurtler, 1996).
 Utile pour détecter les protéines défectueuses.
 Test définitif des maladies de : Creutzfeldt-Jacob, de Lyme, de l'hépatite B et de
l'herpès.
III-4. Dot blot
I. Dot blot principe et technique :
Le dot blot est une technique simple de détection des molécules d’ADN, d’ARN ou de
protéines. Cette méthode permet de transféré directement les acides nucléiques (ADN ou
ARN) depuis un milieu liquide sur une membrane sans passé pas les étapes de séparation et
d’électrophorèse. Les étapes de cette technique sont les suivantes (Figure 15) (Tripathi, 2010;
Dubey, 2014):
 Extraction et purification d’ADN ou d’ARN de différente source.

 Appliquer directement sous forme de petits points sur la membrane de nitrocellulose.
 Si il s’agit de molécule d’ADN, dénaturer le par un traitement alcalin au NaOH 0,4M
pour former des brins simples.
 Les échantillons sont immobilisés sur la membrane par chauffage à 80°C pendant 2 à
3 Heures.
 Incuber la membrane portant les différents échantillons dans une solution de sondes
marquées, qui vont s’hybridées avec les molécules d’ADN ou d’ARN spécifiques.
 Illimitation des sondes non liée par lavage.
 Les sondes utilisées sont radioactive est sont détectées par autoradiographie. Sur la
membrane les points noirs représentent les échantillons dans lesquels l'ADN ou l’ARN
cible est présent ou la sonde s'est liée (Figure 16).
La mise en place des points des échantillons sur la membrane peut être sous forme de rond ou
effectuée à l'aide d'un appareil où le dépôt se fait en fente, dans ce cas on parle de Slot blot
qui est la même technique que le dot blot (Tripathi, 2010).
Figure 15 : Représentation de la technique de Dot blot (Tripathi, 2010).

Figure 16 : Image originale de Dot blot (Dubey, 2014).
II. Avantages et applications de la technique de Dot blot :
Cette technique aide à détecter des molécules d’ADN ou d’ARN spécifiques dans un
échantillon sans étape d’électrophorèse. De nombreux échantillons peuvent être criblés en
même temps en un seul passage sur la même membrane de nitrocellulose. Il est possible de
déterminer la quantité de l’ADN ou l’ARN spécifique en utilisant un densitomètre qui
pourrait balayer les signaux autoradiographiques et quantifier l'intensité d'un acide nucléique
hybride dans l'échantillon. En utilisant cette méthode, on peut comparer la quantité de
séquences d'ADN ou d'ARN présentes dans un grand nombre d'échantillons. Cependant, il ne
fournit aucune information sur la taille des biomolécules. De plus, si deux molécules de tailles
différentes sont détectées, elles apparaîtront sous la forme de points (Tripathi, 2010; Dubey,
2014).
Chapitre IV :
Le séquençage de l’ADN
Introduction :
Le séquençage d’ADN est la détermination de la succession des nucléotides le composant.

C’est devenu un outil essentiel en biologie moléculaire tant en médecine que dans de
nombreuses autres disciplines des sciences de la vie. Le séquençage a été décrit il y a environ
30 ans par la méthode de Sanger et la méthode de Maxam et Gilbert, depuis cette période
cette technique n’a cessé d’évoluer. La méthode de détermination des chaines par un didésoxy
c'est-à-dire la méthode de Sanger a aujourd’hui surpassé la méthode chimique car elle est à la
fois plus efficace et plus facile à mettre en œuvre. C’est devenu une technique courante dans
les laboratoires de biologie moléculaire. Les connaissances acquises grâce à cette méthode et
la possibilité de séquencer des génomes de grande taille, tel que le génome humain, ont amené
les chercheurs à développer des techniques de séquençage de plus en plus sophistiquées
(Lamoril et al., 2008).
I. Séquençage 1ère génération : méthode de Sanger
Méthode mise au point par Frederick SANGER dans les années 1970, grâce à cette technique,
son équipe a identifié la première séquence complète d'un virus, celui du bactériophage phi
X174 (Sanger et al., 1977).
L’ADN à séquencer est appelé l’ADN matrice. Il doit être obtenu sous forme purifiée et être
homogène ; c’est-à-dire qu’il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même
séquence. On utilise couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR.
L’ADN utilisé dans cette méthode doit être simple brin afin d’être copié par l’ADN
polymérase. Il est produit par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un traitement
thermique ou alcalin. De nombreuses ADN polymérases sont utilisées pour la réaction de
séquençage. Les principales sont le fragment de Klenow (une partie de l’ADN polymérase I
d’E.coli), une ADN polymérase modifiée tirée du phage T appelée la Séquenase et la Taq
ADN polymérase, qui est aussi utilisée en PCR (Winter et al., 2000).
Toutes ces ADN polymérase on besoin d’une région d’ADN double brin pour pouvoir initier
la synthèse d’ADN à partir d’une matrice simple brin. Celle-ci est fournie par addition, dans
le milieu réactionnel d’amorces qui s’apparient à l’ADN matrice et déterminent ainsi le point
où commencera le séquençage (Figure 17).
Figure 17 : Point de départ pour le séquençage.
On prépare quatre milieux réactionnels différents, tous contiennent :
L’ADN matrice sous forme simple brin, de l’ADN polymérase, des amorces, les quatre
désoxynucléotide triphosphate (dNTP) nécessaires à la construction du nouvel ADN. Chacun
contient un nucléotide modifié différent, appelé un didésoxynucléotide (ddNTP). Il y a quatre
ddNTP qui correspondent aux quatre bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par l’absence de
groupe hydroxyle sur le carbone 3’du sucre (Figure 18). Ils sont incorporés à l’ADN en
croissance par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de former un
lien phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite. Ceci interdit de
poursuivre l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse. Les ddNTP jouent
ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN (Winter et al., 2000) .
Figure 18 : Deux types de nucléotides triphosphates.
Chacun des quatre milieux réactionnels préparés pour le séquençage contient un ddNTP
différent. Suivant le ddNTP qui est présent, la synthèse se termine à l’endroit où ce nucléotide
modifié est incorporé. Atout moment, durant la synthèse d’ADN, la polymérase peut
incorporer à la chaine en élongation soit un dNTP soit un ddNTP. Dans le premier cas, la
synthèse continue tandis que dans le second, la synthèse s’achève en cette position. L’effet
global est que dans chacune des quatre préparations, est produite une série de molécules
d’ADN de différentes longueurs qui se terminent en une position où dans la matrice est
présente la base complémentaire de celle dont la forme de didésoxynucléotide est présente
dans le milieu réactionnel considéré (Figure 19) (Winter et al., 2000).
Figure 19 : Séquençage par la méthode enzymatique de terminaison de la chaine par un

didésoxy (Voet et Voet, 2016).
A l’issue de la réaction de séquençage, les molécules d’ADN synthétisées sont séparées

suivant leur taille par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec les quatre préparations
versées sur quatre lignes parallèles du gel. Si on ajoute des dNTP contenant du phosphore ou
du soufre radioactif dans les préparations de séquençage, les ADN synthétisés deviennent
radioactifs ce qui permet de les détecter par autoradiographie. Lorsque le film est développé,
une série de bande est observée dans chacune des lignes du gel. La séquence de l’ADN
matrice peut être déterminée en identifiant les plus petites bandes et les bandes de plus en plus
grosses et associant la ligne dans le gel à la base terminale (Figure 20) (Winter et al., 2000).
Figure 20 : Motif en échelle obtenu après séquençage d’ADN et électrophorèse (Voet et

Voet, 2016).
Les didésoxynucléotides peuvent être marqué plutôt que les amorces, ce qui permet d’utiliser
un seul mélange au lieu de quatre. Chaque didésoxyribonucléotides est marqué par un
fluorophore spécifique. Les fragments d’ADN synthétisés portent ce fluorophore terminal. Ils
sont nommés des terminateurs d’élongation ou Big Dye terminators ou Dye-labeled
terminator. Cette adaptation a été proposée par Smith et al. nommer séquençage par arrêt de
synthèse à l’aide d’un terminateur marqué (deyterminator sequencing) (Smith et al., 1986).
C’est la technique actuellement utilisée dans certains séquenceurs automatisés.
II. Séquençage automatisé de l’ADN :
La méthode de Sanger a été développée durant ces 25 dernières années, et cela revient à
plusieurs avancées technologiques importantes :
 La mise au point de vecteurs de séquençage, comme le phage M13 développé par

Joachim Messing au début des années 1980(Messing, 1983)
 Le développement de la sythèse chimique automatisée des oligonucléotides qui sont
utilisés comme amorces dans la synthèse.
 L’introduction de traceurs fluorescents à la place des marqueurs radioactifs utilisés
initialement.
 L’adaptation de la technique PCR pour le séquençage.
 L’utilisation de séquenceurs automatiques de gènes
 L’utilisation de l’électrophorèse capillaire pour séparation et l’analyse
Les séquenceurs en gel plat et les séquenceurs capillaires ont permet une automatisation de la
techniques dans les laboratoires utilisant couramment le séquençage. La technique de Sanger
est celle qui est mise en œuvre dans les premiers séquenceurs automatiques (Le premier
séquenceur automatisé a été mis au point en 1987, par la compagnie applied Biosystem ABI).
L’automatisation du séquençage consiste l’emploi de :
 Système d’électrophorèse piloté par ordinateur,

 Marqueurs fluorescents de différentes couleurs qui sont révélés après excitation par
laser à l’aide d’une caméra CCD
 Des logiciels permettant l’analyse des signaux sortant de l’appareil et leur mise en
forme sous forme de résultats (électrophorégramme et séquence) (Figure 21)
 Un robot passeur d’échantillon permettant d’enchainer les échantillons les uns à la

suite des autres (passage de plaques de réaction à 96 puits).
Figure 21 : Exemple d’enregistrement obtenu à partir d’un séquenceur automatique (Voet et

Voet, 2016).
Chapitre V : La PCR et la RTPCR
V-1 La PCR
I. La réaction de polymérisation en chaine ou PCR :
Cette technique a été mise au point par le scientifique américain Karry Mullis en 1983 et
développée par le H.A. Herlich avec la collaboration du laboratoire Cetus Corp à Emery
ville, Californie en 1985 (Ronsin, 2005).
La polymérase chaine réaction ou PCR est une technique de réplication ciblée in vitro, Elle
permet d’obtenir à partir d’un échantillon d’ADN génomique complexe appelée séquence
cible de petite taille, d’importantes quantités d’ADN spécifique et de longueur définie. Le seul
impératif est de connaitre une partie de la séquence aux deux extrémités de la région à copier.
L’ADN cible est ainsi amplifié plus d’un million de fois et devient la molécule d’ADN
majoritaire dans le milieu réactionnel. La quantité obtenue finalement est suffisante pour
pouvoir manipuler le gène amplifié ou en faire des analyses détaillées (Winter et al.,
2000 ;Turner et al.,2000).
II. Eléments utilisés dans la PCR :
 L’ADN matrice : il contient la séquence d’ADN cible à amplifier.

 Amorces d’oligonucléotides : la PCR requiert une paire d’amorce oligonucléotides.
Ce sont des petites molécules d’ADN simple brin généralement 20 bases obtenues par
synthèse chimique. Les séquences d’amorces sont choisies sur la base d’appariement
complémentaire aux brins d’ADN opposés de chaque côté de la séquence qu’on désire
amplifier.
 Une ADN polymérase : L’enzyme communément utilisée est la Taq ADN
polymérase de Thermus aquaticus, une bactérie vivant dans des milieux chauds. Le
rôle de l’ADN polymérase en PCR est copier les molécules de l’ADN. L’enzyme en
présence d’amorces se fixe à l’ADN simple brin et synthétise un nouveau brin
complémentaire du brin d’origine.
 Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP) : Ces molécules représentent les
quatre bases de l’ADN (guanine, adénine, cytosine, thymine) nécessaire dans toute
PCR et qui sont utilisés par l’ADN polymérase pour la synthèse du nouvel ADN
(Winter et al., 2000).
III. Cycle de PCR :
La technique de PCR permet d'amplifier de manière exponentielle une région bien précise du
génome. Des oligonucléotides simple brin sont synthétisés et s'hybrident avec la région
homologue de l'ADN. La réaction de polymérisation s’effectue en trois étapes qui se
déroulent à différentes températures et aboutissent ensemble à la synthèse de l’ADN cible
(Figure 22) (Winter et al., 2000 ;Turner et al.,2000).
 Dénaturation :
La première étape s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation. À
cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est dénaturé
: les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80°C et
les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires) (Winter et
al., 2000 ;Turner et al.,2000).
 Appariement des amorces ou hybridation :
La deuxième étape s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 60°C, dite
température d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux liaisons
hydrogènes de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces,
courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à
amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel. Plus la
température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.
La température d’hybridation est déterminée par la séquence et le nombre de bases dans les
amorces (compter grossièrement +4 par G-C et +2 par A-T) (Winter et al., 2000 ;Turner et
al.,2000).
La température d’hybridation (Th) d’une amorce est en déduite à partir de la formule de
Wallace pour la Tm (température de fusion):
Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th= Tm – 5 en (°C)
 Elongation :
La troisième étape s’effectue à une température de72°C, dite température d’élongation. À
72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en
utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les
régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées (Winter
et al., 2000 ;Turner et al.,2000).
Un totale de 20 à 40 cycles est mené à bien, en fonction de l’abondance initiale de la séquence

cible. Afin de programmer les changements de températures nécessaires, la PCR se déroule
dans un bloc de chauffage contrôlé électriquement appelé cycleur thermique ou
thermocycleur.
Figure 22 : La réaction de polymérisation en chaine (PCR) (Tripathi, 2010).
IV. Quantification de l’amplicon :

Cette amplification a un caractère exponentiel puisque la quantité d’ADN obtenue à la fin de
chaque cycle est le double de celle présente au début du cycle. Ainsi, l’amplification, en tant
que nombre final de copies de la séquence cible, est exprimée par l’équation suivante:
N = (2n -2n) x
Où n est le nombre de cycles, 2n est le premier produit obtenu après le premier cycle et le
deuxième produit obtenu après le deuxième cycle avec une longueur indéfinie, et x est le
nombre de copies de la matrice originelle (Poitras et Houde, 2002).
V. Applications de la PCR :
La PCR est utilisé en routine comme outil de recherche et elle a permet d’amélioré la capacité
d’étude des gènes. En fait, de nombreuses études en génétique moléculaire impliquent
l’utilisation de la PCR à une étape au moins, normalement comme élément de la stratégie
globale et en association avec d’autres techniques. Par exemple, de l’ADN amplifié par PCR
peut être utilisé pour le séquençage, comme sonde dans du southern blot ou du northern blot.
La PCR est utilisée dans la plupart des domaines de la biologie et de la médecine, mais
également dans d’autres domaines exceptionnels, comme l’anthropologie ou l’archéologie.
C’est aussi un outil dans les industries des biotechnologies (Winter et al., 2000 ). La PCR a
apporté d’importantes contributions aux domaines suivant (Erlich ,1989 ; DennisLo et al.,
2006 ; Bustin, 2010) :
 les maladies héréditaires

 la recherche contre le cancer
 les sciences médico-légales
 les biotechnologies
V-2 La RT-PCR
I. Principe de la Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) :
La RT-PCR est une variante extrêmement utile de la PCR standard qui permet l'amplification
de transcrits d'ARNm spécifiques à partir de très petits échantillons biologiques. C’est la
méthode la plus sensible pour détecter les ARN messagers au niveau d’un organe, d’un tissu
ou d’une cellule.
Le principe consiste à extraire les ARN totaux des tissus étudiés et de les copier in vitro en
ADNc simple-brin, grâce à l’action de la transcriptase inverse. Les molécules d’ADN
obtenues servent de matrice à une réaction de PCR. Les fragments PCR obtenus après les
cycles de PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel (Figure 23). L’une des difficultés de
la technique est la contamination de la préparation des ARNs par l’ADN génomique ; en effet,
les amorces se fixeront tout aussi bien sur l’ADN simple-brin issu des ARNs que sur l’ADN
génomique contaminant. L’une des possibilités est de travailler à partir d’ARN polyadénylés
purifiés. Il est aussi possible d’éviter cet artéfact en traitant les échantillons d’ARN par une
désoxynucléase afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique (Tagu, 1999).
De manière pratique, les dNTP, le tampon, la Taq polymérase, les amorces

oligonucléotidiques, la transcriptase inverse (RT) et la matrice d'ARN sont ajoutés ensemble
dans le tube réactionnel. La réaction est incubé à 37 ° C, ce qui permet à la RT de fonctionner
et permet la synthèse d'une copie d'ADNc, une PCR standard est effectuée pour amplifier le
produit d'ADNc, conduisant à la synthèse du second brin, puis à un double brin. Le choix de
l'amorce pour la synthèse du premier brin dépend de l'expérience. Si une amplification de tous
les ARNm dans l'extrait cellulaire est nécessaire, alors une amorce oligodT qui hybriderait
toutes les queues poly A peut être utilisée. Si un ADNc spécifique est recherché, une amorce
spécifique à la région codante peut être utilisée avec succès, sinon une amorce aléatoire
(random primer) pourrait être ajoutée (Walker et Rapley, 2009).
Figure 23 : Principe de la RT-PCR (Tagu, 1999).
II. Application de la RT- PCR :
La Reverse Transcription-PCR constitue une technique très sensible dans laquelle un nombre
faible de copies de molécules d'ARN peut être détecté. Elle est largement utilisée dans le
diagnostic des maladies génétiques et, semi-quantitativement, dans la détermination de
l'abondance de différentes molécules d'ARN spécifiques dans une cellule ou un tissu afin de
mesure l'expression génique. Elle trouve aussi son application dans les domaines suivant :
 Méthodes de recherche : Par exemple, Lin et al. utilisé la qRT-PCR pour mesurer
l'expression des gènes Gal dans des cellules de levure (Lin et al., 2011).
 Insertion de gènes : La RT-PCR peut également être utilisé pour insérer des gènes
eucaryotes dans des êtres procaryotes. Elle est couramment utilisée dans l’étude des
génomes de virus à ARN, tels que le virus de l’influenza A et VIH (Quinlivan et al.,
2005;van der Kuyl et Berkhout, 2012) .
 Diagnostic des maladies génétiques : telles que le syndrome de Lesch-Nyhan(Nguyen
et al., 2012). Peut également être utilisé comme test pour la grippe aviaire - H7N9
(FAO, 2014)
 Détection et étude du cancer : utiliser la RT-PCR dans la détection du cancer pour
améliorer le pronostic et surveiller la réponse au traitement (Li et al., 2003; Li et
al.,2006; Bremnes et al., 2005).
Partie 2 [Génie génétique]
Chapitre 1 : Techniques de clonage
Introduction :
Le terme clone est utilisé pour la première fois en 1903 par le botaniste H.J. Webber en
désignant des plantes reproduites par multiplication asexuée. Ce mot sera ensuite réutilisé par
J.B.S. Haldane.
Le clonage désigne principalement le processus de multiplication d'un organisme, d'une

cellule souche ou d'un gène, en grand nombre d'exemplaires identiques. Depuis plus de vingt
ans, le clonage, ou la reproduction exacte de gènes particuliers et de types individuels de
cellules, est une technique employée en biotechnologie afin de produire des médicaments et
des vaccins pour traiter plusieurs maladies (Cottier et Guerry, 2000). On nomme ces deux
types de clonage :
 Le clonage cellulaire: On fait plusieurs exemplaires de la même cellule pour pouvoir

faire des recherches médicales.
 Le clonage moléculaire le quel on développera particulièrement dans ce chapitre.
I. Clonage moléculaire :
Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui permet de séparer des séquences
spécifiques d’ADN au sein d’autres séquences puis de les copier de sorte qu’on obtient des
quantités importantes permettant une analyse détaillée ou des manipulations. Une importante
utilisation du clonage de l’ADN est d’isoler de nouveaux gènes en leur permettant d’être
explorés et caractérisés.
Toutes les expériences de clonage de l’ADN reposent sur la construction de molécules

d’ADN recombinant. Ceci suppose de joindre ensemble différentes molécules d’ADN. La
molécule d’ADN à cloner est insérée dans une autre molécule d’ADN généralement
circulaire, appelée un vecteur. Le vecteur recombinant est introduit dans une cellule hôte,
généralement la bactérie E.coli, où il produit de multiples copies de lui-même. Lorsque la
cellule hôte se divise, des copies du vecteur sont ainsi produites et elles peuvent être purifiées
à partir des cultures de cellules hôtes et utilisées pour l’analyse de l’insert d’ADN étranger
(Winter et al., 2000 ;Tagu et Moussard ,2003 ; Walker et Raply, 2009).
II. Éléments nécessaires au clonage :
II.1. Les enzymes de restriction :
Généralités
Découvertes à partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître
spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils
permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site
désiré. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les
extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique : on parle
dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de
quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés: ils reconnaissent une
grande variété de sites de coupure.
Les enzymes de restriction sont utilisés pour établir une carte de restriction de toute molécule
d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction
le long de cette molécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule,
des fragments de tailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse.
Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des

enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur
d’un acide nucléique. Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la
molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).
Séquences d’ADN reconnues par les enzymes de restriction.
Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement
des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la
succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche-droite) pour le premier brin est
identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à3’). Ces
séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases. Il faut
remarquer que dans les ADN, on rencontre statistiquement des séquences reconnues par des
enzymes de restriction. Ainsi, la séquence GATC reconnue par l’enzyme Mbo I est présente
avec une fréquence statistique de 1 / 256 paires de bases (1/ 44). En effet, la fréquence de
coupure d’un ADN par une enzyme de restriction donnée peut être approchée statistiquement
en considérant le nombre de nucléotides de la séquence spécifique reconnue par l’enzyme.
Ainsi, par exemple, dans la séquence de six nucléotides: GGATCC reconnue par l’enzyme
Bam HI, on aura donc une fréquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les
4096 nucléotides.
Origine des enzymes de restriction.
Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries.
Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des
enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers. Pour éviter une
autodestruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de
restriction par une modification des sites de restriction correspondants.
Nomenclature des enzymes de restriction.
Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte
plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en
majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde
lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où
l’enzyme est extraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à
la souche bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de
caractérisation de ces enzymes.
Exemples:
Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC

Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG
Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G
Notion d’isoschizomères
Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les
appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique
des fragments dont les extrémités sont différentes.
Exemple :
Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et
l’enzyme Acc65 I:
Kpn I:
5’-G-G-T-A-C/C-3’
3’-C/ C-A-T-G-G-5’
Acc65 I:
5’-G/G-T-A-C-C-3’
3’-C-C-A-T-G/G-5’
Ces enzymes sont des isoschizomères, elles reconnaissent en effet la même séquence
nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrémités des fragments obtenus
diffèrent.
Types de coupures realisées par les enzymes de restriction.
Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs
et la coupure à bouts collants.
La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La

coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de
part et d’autre du centre de symétrie.
Les sites de restriction sont repérés dans l’ADN par l’enzyme de restriction qui coupe l’ADN
en principe autant que fois qu’il y a de sites de restriction. Ceci est valable pour une enzyme
de restriction donnée, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position différente sur
l’ADN. On voit tout de suite les possibilités considérables de ce type d’outils enzymatiques.
L’ADN est découpé en fragments variables et ceci aussi bien l’ADN circulaire des bactéries
ou des plasmides que l’ADN linéaire.
Les classes d’enzymes de restriction.
La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de

reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de
reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactéries possèdent d’autres types
d’enzymes de restriction.
Les enzymes de type I reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symétrie. Ces
enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000
paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de
reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.
Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction.
L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes
de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de
modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des
méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le
carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une
inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur
une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes
sont très spécifiques.
Utilisations des enzymes de restriction.
Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire. Par
exemple, elles permettent de fractionner l’ADN en multiples fragments susceptibles d’être
séparés par les techniques d’électrophorèse. Les enzymes de restriction peuvent être utilisées
pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) à être inséré dans un vecteur
comme un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher
des mutations dans le génome.
Les enzymes de restriction sont utilisées pour rechercher dans l’ADN des cellules eucaryotes
les méthylations de bases. Ces méthylations ont une signification complètement différente des
méthylations de bases observées chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des
modifications de l’expression des gènes des eucaryotes. La méthylation provoque le
verrouillage de l’expression de tel ou tel gène dans un tissu.
Les méthylations dans le génome des eucaryotes concernent les cytosines impliquées dans les
doublets dinucléotidiques CG. La recherche de ces doublets et de la présence ou non d’une
méthylation sur les cytosines est réalisée à l’aide de deux enzymes de restriction, une enzyme
insensible à la méthylation des cytosines et une autre enzyme sensible à la méthylation des
cytosines.
II-Les autres enzymes d’usage courant en génie génétique :
Les enzymes coupant l’ADN.
La DNase
La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. Il s’agit d’une
endonucléase qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à
des coupures ou « nicks » tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce
qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou
oligonucléotides) qui possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme
est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+).
La nucléase S1
Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas
en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN.
Les enzymes assurant la ligature.
Les ligases
Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement
phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent
effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou
extrémités cohésives). Elles sont extraites de bactéries. Il existe ADN et ARN ligases.
Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.
Enzymes enlevant des groupes phosphates

Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH
alcalin. Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN.
Elles sont extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Elles sont utilisées pour
préparer de l’ADN recombinant.
Enzymes ajoutant des groupements phosphates

Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette
molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe)
de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN
préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.
Les enzymes recopiant les acides nucléiques : les polymérases
Propriétés générales
Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales
suivantes:
- Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à3’.
- Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle.
- Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides

triphosphates (dNTPs).
Les enzymes recopiant un ADN en ADN

Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de
synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique.
Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes:

- Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre.
- La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’.
- La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.

Exemple1 L’adn polymérase I (extraite de E. Coli) et le fragment de klenow

Comme exemple-type d’ADN polymérase, nous citerons l’ADN polymérase I qui est extraite
d’E.coli. Cette enzyme possède des propriétés polymérasiques, mais aussi des propriétés
exonucléasiques. Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les
nucléotides un par un à partir d’une chaîne polynucléotidique avec une spécificité soit de
l’extrémité 5’ (coupure 5’à3’), soit de l’extrémité 3’ (coupure 3’à5’). L’ADN polymérase I
possède les deux activités exonucléasiques: 5’à3’ et 3’à5’. Cette enzyme est constituée par
une seule chaîne polypeptidique.
Au laboratoire, on utilise souvent une enzyme préparée à partir de l’ADN polymérase I qui est
appelée fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possède plus d’activité exonucléasique
5’à3’, il reste les propriétés polymérasiques et les propriétés exonucléasiques 3’à5’. L’activité
3’à5’ permet à l’enzyme au cours d’une synthèse d’un fragment d’ADN de contrôler si
l’appariement de la base qui vient d’être ajoutée est conforme aux règles de complémentarité.
Cette remarquable activité exonucléasique 3’à5’ est encore appelée la fonction d’édition de
l’enzyme.
Pour plus d’informations sur la DNA polymérase et sa mise en évidence voire le chapitre
synthèse in vitro de ce cours.
Exemple2 La Taq polymérase

La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources
chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures
usuelles (ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification génique et
également dans les réactions de séquençage de l’ADN. En principe, elle est dépourvue de
l’activité exonucléasique 3’à5’.
Les enzymes recopiant un ARN en un ADN

Exemple1 la rétrotranscriptase ou transcriptase inverse
Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer
à partir d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire d’un
mARN).
Elle possède les propriétés suivantes:
- C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’.
- Elle est ARN-dépendante.
- Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à5’, donc de fonction d’édition. Elle peut
donc insérer des bases par erreur.
- Elle a une activité RNAse.

Les enzymes recopiant un ADN en un ARN
Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des deux brins d’ADN en un brin
d’ARN. Elles sont extraites des bactéries. Ces ARN polymérases possèdent les propriétés
suivantes:
- Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à3’.
- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse (à la différence des ADN
polymérases).
- Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les
autres polymérases) des ions Mg2+.
- Elles sont dénuées d’activité d’édition.
- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent
démarrer la transcription que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique
correspondant.
II.2. Les vecteurs de clonage
1-Généralités sur les vecteurs
a) Définition et rôle
Rôle de transporteur du morceau d’ADN à cloner.
Permet le maintien de l’ADN dans la cellule hôte
Permet la sélection des cellules recombinantes
Permet la réplication autonome
b) Les différents types de vecteurs
Vecteurs de clonage
Destinés à l’isolement d’un fragment d’ADN, appelé « insert » et à amplifier dans une cellule
hôte.
Vecteurs d’expression
Dérivent des vecteurs de clonage. Destinés à isoler une séquence codante (gène ou partie d’un
gène) pour introduire dans une cellule-hôte appropriée afin de l’exprimer.
Différents vecteurs de clonage

1-Plasmides
Définition : molécule d’ADN circulaire capable de se multiplier de manière autonome dans

un organisme procaryote ou eucaryote.
Possède au minimum une origine de réplication et des gènes conférant un avantage à la
bactérie.
Les plasmides bactériens à l’état naturel :
- Réplication autonome grâce à l’origine de réplication
- Taille élevée (90 kb pour plasmide R1)
- Résistance aux antibiotiques souvent portée par des transposons (Tn3 pour plasmide R1)
- Nombre de copies variables suivant les plasmides :
Les plasmides utilisés comme vecteur en génie génétique sont des hybrides et ont été modifiés
par rapport aux originaux.
Les plasmides de synthèse :
Plasmide pBR322 = plasmide de 1e génération :
De Bolivar et Rodriguez 1979
Taille de 4361 pb :
- Origine de réplication provient de ColE1 (existe dans une bactérie à 15-20 copies)
- Segment avec résistance à l’ampicilline : plasmide R1 : 90 kb, 2 copies/cellule. Le gène de
résistance à l’ampicilline appelé AmpR : code une enzyme qui va hydrolyser le cycle beta-
lactame = bla.
- Gène de résistance à la tétracycline à partir du plasmide sauvage R6. TetR : induit l’efflux de
l’antibiotique.
-Les sites de restriction sont nombreux dont 2 qui ont été étudiés et utilisés : EcoR1 et BamH1
Figure 1 : Le plasmide pBR322

 Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire double brin de 4361 paires de bases. Par
convention le nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction EcoR I en
direction du gène tetr.
 Il contient une origine de réplication (2535), un gène de résistance à la tétracycline
(tetr 86-1276) et un gène de résistance à l’ampicilline (ampr 4153-3293). Le gène ampr
code pour une protéine (β-lactamase) de 286 acides aminés capable de cataboliser cet
antibiotique.
 Le plasmide contient de nombreux sites de restriction répartis sur toute la séquence.
Beaucoup de ces sites sont uniques, permettant de transformer l’ADN circulaire en
ADN linéaire. Exemple, le site BamH I (position 375) au début du gène tetr.
 La digestion par BamH I permet de recombiner le vecteur avec un fragment de
digestion par BamH I d’un ADN à cloner. La ligase du bactériophage T4 permet de
recirculariser l’ADN du plasmide. Les cellules transfectées avec un tel plasmide
recombinant feront la réplication du plasmide au cours de leur croissance. Elles
n’expriment plus le gène tetr, mais restent résistantes à l’ampicilline ce qui permet de
les sélectionner et d’isoler l’ADN du plasmide ainsi cloné.
Plasmides de 2e génération : ex du vecteur pUC

Contiennent :
- un fragment du plasmide pBR322 (AmpR)
- une origine ColE1 mutée dans le gène rop
- une partie de l’opéron lactose : gène Lac I, promoteur et opérateur de l’opéron, une partie du
gène lac Z (lac Z’ codant la partie N-ter de beta galactosidase)
- un site de polyclonage.
Figure 2 : La carte génétique de certain vecteur de type pUC dérivés de pBR322. Le site de
clonage multiple (polylinker) est introduit dans le gène lacZ, sans interrompre la fonction du
gène
2-Phages
Assemblage supramoléculaire constitué de protéines qui constituent l’ensemble de la capside
et la queue du phage, et à l’intérieur de la structure protéique, le génome phagique qui est de
l’ADN. Un phage va infecter une bactérie.
Les phages présentent deux intérêts essentiels par rapport aux plasmides :
- taille de l’insert entre 12 et 22 kb : on peut insérer des morceaux d’ADN plus longs
- infection spontanée de cellules bactériennes : il n’y a que le génome qui entre dans la
bactérie.
Vecteurs dérivés du bactériophage lambda :
- le phage lambda a un génome de 48 Kb
- sur les 50 gènes, beaucoup sont impliqués dans la recombinaison et la lysogénie et ne sont
pas essentiels à la multiplication du phage et au cycle lytique.
- les gènes non essentiels peuvent être éliminés et remplacés par de l’ADN étranger.
- les vecteurs dérivés de lambda qui sont utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de
part et d’autre de la partie qui peut être éliminée.
Figure 3 : vecteur dérivés du bactériophage lambda.
3- Les cosmides
Définition: Vecteurs artificiels constitués d’un plasmide auquel a été ajouté le site cos (permet
l’encapsidation du bactériophage lambda). Possède les avantages du plasmide d’une part et du
phage lambda d’autre part :
- gènes de résistance et origine de réplication du plasmide
- capacité à s’encapsider du phage lambda.
Intérêt : permettent le clonage de fragment d’ADN allant jusqu’à 45 kb.
Figure 4: Schéma d'un cosmide Dans le cosmide de la figure, dans le site multiple de clonage
on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des promoteurs phagiques afin de
pouvoir transcrire et traduire un gène de l'ADN étranger, qu'il soit inséré dans un sens ou
l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6kbp en moyenne et devant attendre de 38 à 54 kbp
pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.
II.3. Les étapes du clonage selon les vecteurs utilisés :
II.3.1. Plasmide :
Les plasmides forment le type le plus commun de vecteur de clonage. La procédure de

clonage peut être divisée en plusieurs étapes comme suit (Figure 05) (Winter et al., 2000 ;
Walker et Raply, 2009) :
 Le plasmide est digéré par une enzyme de restriction qui le coupe en un site unique et
transforme la molécule circulaire qu’il était en une molécule linéaire avec des
extrémités cohésives.
 L’ADN étranger à cloner est lui aussi digéré par la même enzyme de restriction pour
produire les mêmes bouts collants,
 Le plasmide et l’ADN étranger sont mixés, des molécules plasmides sont jointes à des
molécules d’ADN étranger via leurs extrémités cohésives communes et on obtient des
plasmides recombinants circulaires,
 L’ADN ligase est utilisé pour joindre de façon covalente les deux,
 Le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie hôte (généralement E. coli) par
un processus appelé transformation,
 Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur des plaques d’agar et les colonies
des bactéries composées de cellules ayant correctement intégré le plasmide
recombinant croissent,
 Des colonies individuelles sont séparées et cultivées en milieu liquide. De grandes
quantités de plasmides peuvent alors être purifiées à partir des cultures et on peut
récupérer l’ADN cloné pour l’analyse (Winter et al., 2000 ; Walker et Raply, 2009).
Figure 05 : Représentation schématique du clonage d’ADN via des plasmides (Pasternak,

2003).
II.3.2. Le phage lambda (λ) :
Le phage λ a été adapté à une utilisation comme vecteur de clonage. La portion centrale de
l’ADN de λ, qui n’est pas essentielle à l’infection, est détruite, laissant des fragments 5’ et 3’
appelés bras (Figure 21). La région ayant subi la délétion peut être remplacée par l’ADN
étranger pour produire un phage à ADN recombinant (Figure 06). Celui-ci est inséré dans les
capsides phagiques in vitro par un processus appelé empaquetage qui suppose de mélanger
l’ADN du phage recombinant avec un extrait d’empaquetage contenant les protéines de la
capside du phage et des enzymes nécessaires à la fabrication. Des particules de phages
recombinants sont produites et elles infectent E.coli avec une grande efficacité. Les cellules
infectées sont étalées sur une plaque d’agar et produisent un feuillet continu de bactéries
appelé une couche qui contient de petites zones de la taille d’une épingle à cheveux. Ces
zones correspondent aux plages de lyse produites par l’infection phagique. Des plages
individuelles peuvent être isolées et utilisées pour générer des quantités importantes d’ADN
cloné par infection de cultures fraiches d’E.coli (Winter et al., 2000 ;Tagu et Moussard
,2003).
Le principal avantage de λ en tant que vecteur de clonage est que la taille des fragments qui
peuvent y être insérés est bien supérieure à celle des inserts plasmidiques. Le phage λ peut en
effet héberger des fragments long jusqu’à 25Kpb, à comparer aux 10Kpbmaximales des
inserts dans les vecteurs plasmidiques. Cette possibilité de cloner de plus larges fragments a
conduit au développement de la principale utilisation de λ dans la construction de banques
d’ADN.
Figure 06 : (a) Le phage λ (b) Utilisation du phage λ comme vecteur de clonage (Winter et
al., 2000) .
II.3.3. Cosmides :
Ce type de vecteur combine des caractéristiques rencontrées chez les plasmides et le phage λ.
Les cosmides ont tous les trais normaux des plasmides, y compris un MCS et des gènes
conférant une résistance à des antibiotiques, mais ils incluent aussi des séquences issues de λ
appelées séquences cos. Elles sont situées aux deux extrémités de la molécule d’ADN de λ et
sont responsables de son insertion dans la capside du phage. Cloner avec des cosmides
combine des caractéristiques associés à l’utilisation de λ et de plasmides comme vecteur de
clonage (Figure 07). L’ADN des cosmides est clivé par une enzyme de restriction et lié à
l’ADN étranger. Le cosmide recombinant est ensuite empaqueté dans les capsides de λ et
utilisé pour infecter E.coli. Les cosmides ne contiennent ps tous les gènes de λ et ne forment
donc pas de plages après infection. Au lieu de cela, les cellules infectées sont cultivées sur de
l’agar contenant des antibiotiques et les colonies résistantes contenant des cosmides
recombinants sont isolées et peuvent être amplifiées de la même façon que des plasmides. Les
cosmides ont l’avantage d’être capable d’héberger de très gros inserts. Sachant que les
cosmides sont petits, typiquement 8Kpb et que la capside de λ peut accueillir 52Kpb, les
inserts cosmidiques peuvent mesurer jusqu’à 44Kpb (Winter et al., 2000; Tagu et Moussard
,2003).
III. Application du clonage de l’ADN :
Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui a apporté d’importantes contributions
dans de nombreux domaines de la recherche biologique, principalement :
 L’identification de gènes impliqués dans des maladies ;

 La cartographie des génomes ;
 La production de protéines recombinantes ;
 Les organismes génétiquement modifiés.
Figure 07 : Cloner avec des vecteurs cosmidiques (Winter et al., 2000).

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‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬

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Biologie moléculaire et génie

Destiné aux étudiants de 3emeannée Licence Microbiologie

Partie I : Biologie moléculaire

Chapitre 1 : Expression de l’information génétique: synthèse protéique (Transcription,

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Transcription de l’ADN procaryote

II) Transcription de l’ADN procaryote

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des combinaisons de 3 nucléotides, appelées codons. Chaque codon correspond à un seul

• La seconde étape de l'expression d'un gène, la traduction, se déroule dans le cytoplasme et

 Des ARN de transfert (ARNt) : petites molécules d'ARN comportant 2 sites de

c) La terminaison provoquée par l'arrivée du ribosome au niveau d'un codon-stop. Le

Schéma de la traduction d'un ARNm en chaîne polypeptidique

4. Quelles sont les conséquences de modifications de la structure d'un gène ?

• Le plus souvent, les mutations sont ponctuelles et concernent un ou plusieurs nucléotides.

 Une substitution de nucléotides : un ou plusieurs nucléotides situés à des sites précis

b) Conséquences de délétion ou d'insertion d'un ou plusieurs nucléotides

• Si le nombre de nucléotides perdus ou insérés n'est pas un multiple de 3, le cadre de lecture

• Si le nombre de nucléotides perdus ou insérés est un multiple de 3, les conséquences sont

Résumé de différentes mutations ponctuelles et leurs conséquences

• L'expression de l'information génétique se fait en deux étapes, la transcription et la

TRADUCTION CHEZ LES PROCARYOTES

3.2.2 Caractéristiques du code génétique

Figure 4 : Phase d’initiation

La fin de la traduction se produit lorsque le ribosome en avançant sur l’ARNm trouve un

Figure 5: Les étapes de la traduction

Savoir la notion de l‟opéron.

Pour répondre aux conditions

=Un moyen pour la cellule de développer des mécanismes

Deux modes de régulation de l’expression d’un gène cible

1- d‟une façon positive : l’interaction déclenche la transcription du gène

2- d‟une façon négative : l’interaction empêche la transcription du gène

La régulation génique doit prendre effet tôt

2 modes distincts de contrôle de l’initiation de la

Niveau de base de l‟initiation de la

Principe de base de la régulation de la

Facteur de transcription: protéine de régulation

Gène de structure : code une protéine

En vert : gène régulateur

Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérase ne peut plus

Lorsque le co-répresseur se fixe à la protéine répresseur cette dernière s’active et

Cas de la CRP associée à l’AMPc

Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour

Contrôle négatif : le répresseur inactive la

Opéron inductible: Opéron répressible:

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1961 : Jacob et Monod décrivent comment des gènes adjacents

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