Travaux dirigés

Un génome double brin est isolé d’un virus dans les

selles d’un enfant présentant une gastroentérite. Dans ce
génome, on a trouvé 15% d’Uracile. Quel est le
pourcentage de guanine dans ce génome?

1. 15
2. 25
3. 35
4. 75
5. 85
Quelle est la structure indiquée ci-dessous

1. Nucleotide de purine
2. Purine
3. Nucleoside de purine
4. Nucléoside de pyrimidine
5. Deoxyadnosine
Nucléoside
Nucléotide
Une étudiante en pharmacie travaille dans un
laboratoire de génétique où son mentor lui demande la
composition d’un acide nucléique d’un échantillon. Les
résultats de son analyse ont montré: 10% d’adénine,
40% de cytosine, 30% de thymine, et 20% de guanine.
Quelle la source la plus probable de cet acide
nucléique?

1. Chromosome de bactérie
2. Plasmide de bactérie
3. Chromosome de mitochondrie
4. Chromosome nucléaire
5. Génome viral
Un étudiant en pharmacie a analysé une cellule et trouvé
qu’elle contient 6 centrosomes et des anomalies
chromosomiques. Quel est le stade du cycle cellulaire le
plus susceptible d’induire ces anomalies
chromosomiques?

1. G1
2. S
3. Duplication des centrosomes
4. G2
5. Transcription
6. Promeéaphase
7. Anaphase
ANALYSE CHROMOSOMIQUE
 INTRODUCTION
• La cytogénétique humaine (ou génétique
chromosomique) est une discipline qui a eu
son essor dans les années 1956 avec la
détermination du nombre exact de
chromosomes chez l'homme.
– En 1970, l'introduction des techniques de
marquage en bandes des chromosomes a
amélioré la résolution et la sensibilité de l'analyse
cytogénétique.
 INTRODUCTION
• Les techniques classiques de caryotypage offrent
une vue d'ensemble du génome mais avec une
faible résolution.
• Le développement de l' hybridation in situ
fluorescente offre beaucoup d'outils permettant
une étude plus fine et précise des chromosomes
et de leur structure.
• L'hybridation in situ apporte une plus grande
résolution, ce qui comble le fossé analytique
entre l'étude cytogénétique et moléculaire.
 CHROMOSOMES
• Les chromosomes sont constitués d'une
molécule d' ADN associée à de nombreuses
protéines (histones et non-histones) .
– Le nombre de chromosomes par cellule est une
caractéristique d'espèce.
– Les chromosomes ne sont visibles au microscope
que pendant une courte période du cycle cellulaire.
 CHROMOSOMES
• A l’interphase, l’ADN et la chromatine se
décondensent dans le noyau.
• Au moment d'une division cellulaire (aussi bien
mitose que méiose ), l’ADN et la chromatine se
condense et devient visible au microscope.
 CHROMOSOMES
• Pendant la métaphase , les chromosomes
apparaissent constitués de deux bras séparés
par une zone étranglée appelée centromère .
• Les bras ont une taille variable en fonction des
chromosomes, mais on reconnaît toujours un
bras court noté " p " et un bras long noté " q ".
• Chaque extrémité des chromosomes prend le
nom de télomère (il y a donc deux télomères
par chromosome).
d, which would and female conceptions are approximately equal (Figure 3.3).
critical length In fact, slightly more male babies are born than females,
ivide and thus although during childhood and adult life the sex ratio evens out
normal cellular at 1 : 1.
undergo more
mors, increased
e of abnormally

d according to Chromatides
Chromatids
d centrally, the
ocentric, and if Satellites
e chromosome Bras court
Short arm
chromosomes
satellites that Centromere
ell and contain
mal RNA.
Bras arm
Long long
position of the Telomere
ed on the three
mere, and the
of cytogenetics Metacentric Submetacentric Acrocentric
mes, or at least FIGURE 3.2 Morphologically chromosomes are described as
on the basis of metacentric, submetacentric, or acrocentric, depending on the
; D, 13–15; E, position of the centromere.
 CARYOTYPE
• Il existe des colorants qui permettent de
visualiser la chromatine grâce à leur affinité
pour l' ADN et/ou les protéines qui lui sont
associées.
– Le plus couramment utilisé est le Giemsa qui est
une association de trois colorants de base et qui
donne une coloration rose violacée de la
chromatine en lumière visible
 TECHNIQUES DE COLORATION
• Il existe également des colorants fluorescents
qui permettent de visualiser spécifiquement
l'ADN car ils s'intercalent entre les bases de la
double hélice:
– moutarde de quinacrine
– DAPI (4',6-diamino-2-phényl-indole)
– l'Iodure de Propidium .
and deletions by a rise or a fall compared to baseline, respectively
(although no one is proposing that short and long arms be renamed as left
and right!). Karyotypes are described according to a shorthand notation,
the International System of Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN
2016); an outline is given in Appendix B.

FIGURE 1–2 Chromosomes arranged as a formal karyotype, from a classical

cytogenetic study.

Chromosomal Structure
Coloration DAPI
Giemsa Moutarde de quinacrine Iodure de Propidium
 TECHNIQUES DE COLORATION
• Ces colorants fluorescents sont essentiellement
employés dans le cadre de la cytogénétique
moléculaire ( hybridation in situ de sondes
d'ADN sur une préparation chromosomique)
alors que le Giemsa est le colorant de base de
toutes les techniques de marquage en bandes
des chromosomes.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Les chromosomes n’étant visibles que pendant
la division cellulaire ( mitose ou méiose ),
toutes les techniques cytogénétiques visent
donc à obtenir un maximum de cellules
bloquées à ce stade.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Culture cellulaire
– Cellules en phase de multiplication active, soit
spontanément (cas des villosités choriales ou de certaines
cellules tumorales) soit par une culture préalable le plus
souvent (fibroblastes, tout type cellulaire capable de se
diviser) parfois associée à une stimulation (lymphocytes
sanguins).
• La durée de cette culture est variable en fonction du
type cellulaire considéré et de la quantité de matériel
biologique disponible au départ.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Blocage des cellules en mitose
– L'étape suivante consiste à bloquer les cellules en
métaphase afin de pouvoir observer les
chromosomes.
– Pour cela, on utilise un poison du fuseau de division
(classiquement c'est la Colchicine qui est utilisée ou
son équivalent synthétique la Colcémide) qui
empèche la progression de la mitose vers l' anaphase .
•
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Choc hypotonique
Les cellules sont alors plongées dans une solution
hypotonique ce qui entraîne leur gonflement. Cette
étape est indispensable à l'obtention d'un étalement
correct des chromosomes.

• Fixation - Etalement
Enfin, la dernière étape consiste en une fixation par un
mélange d'alcool et d'acide acétique. La préparation
est alors étalée en laissant tomber une goutte de la
suspension cellulaire sur une lame.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Coloration des préparations
– La coloration des préparations chromosomiques avec du
Giemsa donne les chromosomes avec un aspect rose
violacé, presque homogène sur toute leur longueur.
– Pour reconnaître spécifiquement chaque paire
chromosomique, on utilise donc des techniques de
marquage particulières qui permettent d'obtenir une
coloration inhomogène des chromosomes par le Giemsa et
l'apparition de bandes.
• C'est la succession de bandes sombres et claires le long
d'un chromosome, identique chez tous les individus
pour un chromosome donné, qui en permet
l'identification précise.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• Il existe deux principales techniques de marquage
en bandes des chromosomes ( banding ), utilisées
en routine :

– les bandes G , obtenues après traitement des

chromosomes par la trypsine
– les bandes R obtenues par un traitement à la chaleur .

• Dans les deux cas, les bandes ne deviennent

visibles qu'après une coloration avec le Giemsa.
 OBTENTION DE PRÉPARATIONS
CHROMOSOMIQUES
• D'autres techniques de marquage complémentaires
existent qui permettent d'analyser certaines régions
particulières du génome :
– Bandes C : cette coloration par le Sulfate de Baryium
permet de mettre en évidence l' hétérochromatine
constitutive, qui correspond à des régions non codantes du
génome comme les régions centromériques.
– NOR : cette technique consiste en un dépôt de nitrate
d'argent qui met en évidence les organisateurs
nucléolaires. Ces structures correspondent aux régions du
génome contenant les gènes qui codent pour les
ribosomes .
used, with certain modifications, are now universally em- individual chromosomes but G (Giemsa) banding is used most
ployed in cytogenetic laboratories to analyze the chromosome commonly. The chromosomes are treated with trypsin, which

Karyotype
Analyze ‘metaphase spread’

5 ml venous
blood

Digest with trypsin

and stain
Add phytohemagglutinin with Giemsa
and culture medium

Culture at 37°C Spread cells onto

for 3 days slide by dropping

Add colchicine and Cells fixed

hypotonic saline
FIGURE 3.4 Preparation of a karyotype.
 Préparation des chromosomes
Cellules de moelle 24 h Culture cellulaire Récolte cellulaire

Arrêt du cycle cellulaire

Choc hypotonique
Fixation cellulaire
Etalement

Marquage Prise d’images Caryotype

Digestion
Au moins 20 metaphases 20 metaphases
Coloration
8 Chromosomes and Cell Division

FIGURE 3.7 A G-banded metaphase spread. (Courtesy Mr. A. Wilkinson, Cytogenetics Unit, City Hospital, Nottingham, UK.)
and deletions by a rise or a fall compared to baseline, respectively
(although no one is proposing that short and long arms be renamed as left
Le caryotype: marquage en bande G
and right!). Karyotypes are described according to a shorthand notation,
the International System of Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN
2016); an outline is given in Appendix B.

FIGURE 1–2 Chromosomes arranged as a formal karyotype, from a classical

cytogenetic study.

Chromosomal Structure
 Classement des chromosomes
métaphasiques : le caryotype
• Les chromosomes métaphasiques sont
constitués d'un bras court (p) et d'un bras long
(q), reliés entre eux par le centromère qui
correspond à un étranglement situé à un
niveau variable du chromosome et qui sert de
point d'attache au fuseau de division pendant
la division cellulaire.
 Classement des chromosomes
métaphasiques : le caryotype
• Plusieurs critères vont permettre de reconnaître
et de classer les chromosomes :
*la taille
• Par convention, Il existe trois familles de
chromosomes :
– les chromosomes métacentriques dont les deux bras
ont une taille à peu près équivalente
– les chromosomes submétacentriques qui ont un bras
franchement plus petit que le bras long
– les chromosomes acrocentriques dont le bras court
est quasi inexistant.
 Classement des chromosomes
métaphasiques : le caryotype
*les bandes chromosomiques, qui sont
caractéristiques de chacune des paires.
– Le nombre de bandes visibles est variable d'une
mitose à l'autre et dépend du niveau de
condensation du chromosome.
– Plus les chromosomes sont condensés, moins on
peut observer de bandes et moins l'analyse
permet de dépister des anomalies de petite taille.
 These are specific for a particular single locus which can be
Classement des chromosomes métaphasiques :
used to identify submicroscopic deletions and duplications
(Figure 3.8) causing microdeletion syndromes (described in
stained with a DNA-
at gives each chromo-
le caryotype
tern of light and dark

quality chromosome
ands per haploid set.
age to approximately
megabases [mb]) of
chromosomes at an
se or prometaphase,
00 bands per haploid 1 2 3 4 5 X
lly. This involves first
h as methotrexate or
added to the culture
. Colchicine is then
higher proportion of
mosomes will not be
anding pattern.
6 7 8 9 10 11 12

nvolves first counting

specified number of
se spreads, followed
n of each individual 13 14 15 16 17 18

me is specific and can

karyotype known as
ist analyzes each pair
ctly by looking down 19 20 21 22 Y
 19 20 21 2
FIG 6-1 A banded karyogram (karyotype) of a normal
somes are arranged from largest to smallest.

Metacentric Submetacentric Acrocentric abno

indiv
Short Stalk Satellite some
arm p 14q3
Centromere long
decim
Long the th
arm q 18 21 Se
genet
was
2
band
FIG 6-2 Metacentric, submetacentric, and acrocentric chro-
micro
mosomes. Note the stalks and satellites present on the short
arms of the acrocentric chromosomes. band
stain
 La cytogénétique moléculaire
• La cytogénétique moléculaire constitue une
utilisation de la spécificité de l'appariement
base à base de la molécule d' ADN pour
identifier précisément un chromosome entier
ou même un simple fragment.
 Principe de la technique
• Le principe repose sur l'utilisation d'une sonde
moléculaire: petite séquence d'ADN (ou d' ARN )
dont l'emplacement normal est connu dans le
génome et qui est marquée chimiquement de
façon à pouvoir être repérée par la suite.
– Cette sonde est mise en contact avec les
chromosomes d'une mitose (ou de noyaux
interphasiques) et va s'hybrider (se fixer)
spécifiquement au niveau de sa séquence
complémentaire.
 Différents types de sondes sont
utilisées
• Sondes centromériques : elles s'hybrident au
niveau des centromères des chromosomes.
• Sondes de peinture chromosomique : elles sont
constituées d'un ensemble de sondes de petite
taille qui couvrent l'ensemble du chromosome.
• Sondes locus spécifique : comme leur nom
l'indique, ces sondes de petite taille permettent
d'identifier une région très précise du génome.
 Hybridation in situ fluorescence (FISH)
Principe ADN génomique
Sonde d’ADN

2 Dénaturation

3 Hybridation
Hybridation in situ en fluorescence (FISH)

Chromosome 9

Le gène ABL1
Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
FISH: Locus spécifique
FISH: Locus spécifique

FISH: 13, 18, 21, X, Y

FISH: Multicoleur

Samassekou el al.
Hybridation génomique comparative sur chromosome 7. Cytogénétique moléculaire

7. Cytogénétique moléculaire

e-figure 7.5
Principe de la CGH sur chromosome.
A. Principe de CGH-array sur chromosome.
Une!quantité!d'ADN!d'un!patient!est!marquée!avec!un!fluorochrome!(symbolisé!par!la!couleur!verte).!La!même!quantité!d'ADN!d'un!témoin!
e-figure 7.5
est!marquée!avec!un!fluorochrome!différent!(symbolisé!par!la!couleur!rouge-jaune).!Le!tout!est!mélangé!et!hybridé!sur!une!lame!sur!laquelle!
Principe de la CGH sur chromosome.
ont!été!étalés!des!chromosomes!d'un!témoin.
A. Principe
B. Interprétation de CGH-array
d'une CGH-array sursur chromosome.
chromosome.
Après!hybridation,!l'intensité!de!la!fluorescence!des!deux!sondes!est!numérisée!le!long!de!l'axe!longitudinal!de!chaque!paire!chromosomique!et!
Une!quantité!d'ADN!d'un!patient!est!marquée!avec!un!fluorochrome!(symbolisé!par!la!couleur!verte).!La!même!quantité!d'ADN!d'un!témoin!
un!rapport!d'intensité!des!deux!fluorescences!est!établi!après!traitement!informatique!des!données.!Ce!rapport!est!objectivé!sous!forme!d'une!
est!marquée!avec!un!fluorochrome!différent!(symbolisé!par!la!couleur!rouge-jaune).!Le!tout!est!mélangé!et!hybridé!sur!une!lame!sur!laquelle!
ligne!le!long!d'un!idéogramme!chromosomique.!Les!valeurs!sont!données!en!logarithme!de!base!2.!De!ce!fait,!la!valeur!0!représente!l'égalité!
ont!été!étalés!des!chromosomes!d'un!témoin.
parfaite!entre!les!intensités!des!deux!fluorescences.!On!considère!qu'il!y!a!une!perte!d'une!région!si!les!valeurs!d'intensité!au!niveau!de!cette!
B. Interprétation d'une CGH-array sur chromosome.
région!sont!inférieures!à!0,80!et!un!gain!si!les!valeurs!sont!supérieures!à!1,25.
Après!hybridation,!l'intensité!de!la!fluorescence!des!deux!sondes!est!numérisée!le!long!de!l'axe!longitudinal!de!chaque!paire!chromosomique!et!
un!rapport!d'intensité!des!deux!fluorescences!est!établi!après!traitement!informatique!des!données.!Ce!rapport!est!objectivé!sous!forme!d'une!
ligne!le!long!d'un!idéogramme!chromosomique.!Les!valeurs!sont!données!en!logarithme!de!base!2.!De!ce!fait,!la!valeur!0!représente!l'égalité!
parfaite!entre!les!intensités!des!deux!fluorescences.!On!considère!qu'il!y!a!une!perte!d'une!région!si!les!valeurs!d'intensité!au!niveau!de!cette!
région!sont!inférieures!à!0,80!et!un!gain!si!les!valeurs!sont!supérieures!à!1,25.
 Hybridation génomique comparative sur puce (array)
7. Cytogénétique moléculaire
7. Cytogénétique moléculaire

e-figure 7.6
Principe de la CGH-array.
A.!La!sonde!est!préparée!à!partir!d'une!même!quantité!d'ADN!d'un!patient!et!d'un!témoin!(comme!pour!la!CGH!sur!chromosome).!Le!mélange!
e-figure 7.6 est!hybridé!sur!des!lames!sur!lesquelles!sont!fixées!des!sondes!BAC,!PAC!ou!des!oligonucléotides.!B.!Hybridation!sur!une!lame!sur!laquelle!
ont!été!fixés!244!000!oligonucléotides!de!60!mers,!soit!environ!1!nucléotide!choisi!tous!les!10!000!paires!de!base!du!génome.!C.!Grossissement!
Principe de la CGH-array.
d'un!secteur!de!la!lame!d'une!magnitude!de!100.!Chaque!spot!fluorescent!est!le!résultat!de!l'hybridation!de!la!sonde!au!niveau!de!milliers!
A.!La!sonde!est!préparée!à!partir!d'une!même!quantité!d'ADN!d'un!patient!et!d'un!témoin!(comme!pour!la!CGH!sur!chromosome).!Le!mélange!
d'oligonucléotides!ayant!la!même!séquence!et!fixés!au!niveau!du!spot.!D.!Une!valeur!moyenne!du!rapport!de!fluorescence!est!établie!pour!
est!hybridé!sur!des!lames!sur!lesquelles!sont!fixées!des!sondes!BAC,!PAC!ou!des!oligonucléotides.!B.!Hybridation!sur!une!lame!sur!laquelle!
chaque!spot!d'oligonucléotides.!L'ensemble!des!valeurs!est!rapporté!en!regard!d'un!idéogramme!chromosomique.!Chaque!point!représente!
ont!été!fixés!244!000!oligonucléotides!de!60!mers,!soit!environ!1!nucléotide!choisi!tous!les!10!000!paires!de!base!du!génome.!C.!Grossissement!
la!valeur!du!rapport!entre!les!deux!fluorescences!au!niveau!des!spots.!Un!point!bleu!signifie!que!la!valeur!du!rapport!de!fluorescence!est!
d'un!secteur!de!la!lame!d'une!magnitude!de!100.!Chaque!spot!fluorescent!est!le!résultat!de!l'hybridation!de!la!sonde!au!niveau!de!milliers!
supérieure!à!0!;!un!point!rouge!que!ce!rapport!est!inférieur!à!0!(log!base!2).!Les!valeurs!normales!sont!comprises!entre!-1!et!0,5.!Ici,!on!considère!
qu'il!n'y!a!pas!de!déséquilibre!au!niveau!du!chromosome!2!(les!points!qui!sont!en!dehors!de!ces!valeurs!sont!des!artéfacts).
d'oligonucléotides!ayant!la!même!séquence!et!fixés!au!niveau!du!spot.!D.!Une!valeur!moyenne!du!rapport!de!fluorescence!est!établie!pour!
Images : hôpital Necker-Enfants malades.
chaque!spot!d'oligonucléotides.!L'ensemble!des!valeurs!est!rapporté!en!regard!d'un!idéogramme!chromosomique.!Chaque!point!représente!
la!valeur!du!rapport!entre!les!deux!fluorescences!au!niveau!des!spots.!Un!point!bleu!signifie!que!la!valeur!du!rapport!de!fluorescence!est!
supérieure!à!0!;!un!point!rouge!que!ce!rapport!est!inférieur!à!0!(log!base!2).!Les!valeurs!normales!sont!comprises!entre!-1!et!0,5.!Ici,!on!considère!
qu'il!n'y!a!pas!de!déséquilibre!au!niveau!du!chromosome!2!(les!points!qui!sont!en!dehors!de!ces!valeurs!sont!des!artéfacts).
Images : hôpital Necker-Enfants malades.
 Cytogenetic analysis and array CGH

Techniques Resolution Unbal. Balan. Marker Mosaicism Disease

Rearr. Rearr. Chr. (%) Monitoring

G-banding 5-8Mb + + Limited 1 +

LS-FISH 0.5kb + + + 1 +

M-FISH/SKY 2-3Mb +/- + + 10 +

Meta. CGH 3-10Mb + - + - Limited

Array CGH 1kb-1Mb + -/+ + 30 Limited

 L' interprétation du caryotype
• Il existe une nomenclature internationale
(ISCN : International System for Human
Cytogenetic Nomenclature) permettant de
définir précisément la constitution
chromosomique d'un sujet.
 Cytogénétique conventionnelle
• La formule chromosomique est le moyen
d'exprimer le résultat du caryotype et se
déchiffre de la façon suivante :
– "Nombre de chromosomes par cellule", "Liste des
chromosomes sexuels présents" ± , "Liste des
anomalies trouvées".
 Cytogénétique conventionnelle
• Exemples :
- caryotype masculin normal : 46,XY
- caryotype féminin normal : 46,XX
- trisomie 21 : 47,XY,+21
- syndrome de Turner : 45,X
- translocation : 46,XX,t(1;18).
 Cytogénétique conventionnelle
• Toutes les anomalies chromosomiques sont
identifiées par une abréviation, permettant de
les décrire dans la formule chromosomique ;
les points de cassure sont également indiqués
quand ils peuvent être identifiés.