TRAVAUX PRATIQUES – BIOCHIMIE GENERALE

Médecine-Dentisterie
2019-2020

Consignes importantes
• Rédiger 1 rapport de TP par binôme, canevas disponible sur eCmapus.
• Remettre le rapport sur eCampus, 7 jours camendrier après la séance de TP.
• A l’examen, les questions relatives au TP valent 15% de la note globale.
• Le rapport n’est pas noté, mais il sera votre support pour réviser pour l’examen.
Nous vous conseillons donc de le rédiger avec soin.

Pour la rédaction du rapport et la préparation aux questions d’examen, n’hésitez pas à

consulter les rappels théoriques (à la fin de ce document) et les capsules audiovisuelles
(eCampus).
 PARTIE 1 : pour bien commencer …
Volumes et masses
préfixe symbole Facteur Donc : 1 ml = 1000 μl ou 0.001 ml = 1 μl
milli m 10-3 1 mg = 1000 μg ou 0.001 mg = 1 μg
micro μ 10-6

Calcul de dilution
1) Lorsque l’on connait les concentrations (initiales et finales) : CiVi = CfVf
Exemple: Préparer 50ml d’une solution de NaCl 0.1M, à partir d’une solution de NaCl 5M.
ð Ci = 5M ; Cf = 0.1M et Vf = 50ml
ð Vi = CfVf / Ci = 0.1M x 50ml / 5M = 1ml
Il faudra donc prélever 1 ml de la solution NaCl 5M et y ajouter 49 ml d’H20 (Final 50ml).

2) Lorsque les concentrations sont inconnues : Vi = Vf / Facteur de dilution

Exemple: Diluer 2x votre solution de protéines, dans un volume final de 5ml.
ð Facteur de dilution = Ci/Cf = 2 et Vf = 5ml
ð Vi = Vf / Facteur de dilution = 5ml/2 = 2.5ml
an/llons$ Il faudra donc prélever 2.5ml de la solution de protéines et y ajouter 2.5ml d’H20 (Final 5ml).
NB : Cette formule est en réalité la même que dans l’exemple 1, où le facteur de dilution = Ci / Cf.
entra/on$inconnue)$
Mesure"d’Absorbance"
Absorbancedes"standards"et"des"
échan>llons"(A
L’Absorbance (ou Densité Optique))est une grandeur
595 "
physique, sans unité, qui mesure la capacité d’une
substance à absorber la lumière qui la traverse (à une A$=$
longueur d’onde donnée).
L’Absorbance est directement proportionnelle à la
Etablir"la"droite"étalon"et"son"équa>on:"
concentration de la substance en solution (en mol/l). Longueur$du$trajet$op7que$(cuve@e)$
Abs"(Y)"en"fonc>on"des"concentra>ons"(X)"
des$standards$ A$=$
Loi$de$Beer)Lambert:$$$$$ Concentra)on*

Droite étalon Coefficient$d’ex7nc7on$molaire$

La droite étalon est réalisée lorsqu’il existe une relation

(y27y1)' linéaire entre 2 grandeurs (par ex : l’absorbance en
on a=' (x27x1)' fonction de la concentration).
rtir
y2'

y1'
y=ax+b' En pratique, on réalise une série de solutions (les
standards) dont la concentration X est connue et on
a=pente'
b=ordonnée'à'l’origine' mesure leur Absorbance Y.
Chaque point (X ;Y) est reporté sur le graphique et la
x1' x2' droite est tracée.

Excel : fournit directement l’équation de droite.

Manuellement : Choisir 2 points représentatifs et calculer la pente a=ΔY/ΔX.
L’ordonnée à l’origine b a été mesurée, il s’agit de l’Absorbance quand X=0.
OBJECTIF : Pour un échantillon inconnu : si je mesure Y (Absorbance), je peux calculer X (sa
concentration) grâce à l’équation de la droite étalon.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 2

PARTIE 2 : utilisation des micropipettes

Au cours du TP, vous serez amenés à utiliser plusieurs types de micropipettes (voir tableau).
Chaque type de pipette s’adapte à un type particulier de pointes jetables (tips).

1 – choisir la pipette en fonction

du volume à prélever!

2 – Enfoncer le
Pipettes Volumes Pointes (tips) tips adéquat
prélevés adaptés
Pipette de 10 ml 1-10 ml Blancs - Large
Pipette de 5 ml 1-5 ml Blancs - Medium
Pipette de 2.5 ml 0,5 ml – 2,5 ml Blancs - Small
P1000 200-1000 µl Bleus
P200 20-200 µl Jaunes
P100 10-100 µl Jaunes
P20 2-20 µl Jaunes

piston! Ajuster le volume:!

Ne jamais régler:
Éjecteur de tips!
•  en-dessous du minimum
Roulette •  au-dessus du maximum!
(ajuster le
volume)!

Indicateur Lorsque l’affichage est vertical:

de volume •  Volume max de cette pipette ?!
•  Le 1er quadrant affiche l’unité
correspondant au volume max!

P1000 P100 P20

(100-1000µl) (10-100µl) (2-20µl)

Pointe ou Tips 1000 100 10

(à usage unique) MAX
100 10 1
10 1 0,1

Volume set: 720 µl 72 µl 7,2 µl

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 3

Prélever
Prélever Expulser
Expulser Ejecter'le')ps'

11erer$cran$
$cran$

22ème
ème$cran$
$cran$

1) Enfoncer$le$piston$jusqu’au$1
1) Enfoncer$le$piston$jusqu’au$1erer$cran$
$cran$ 1) Accoler$le$:ps$contre$la$paroi$du$tube$
1) Accoler$le$:ps$contre$la$paroi$du$tube$
2) Enfoncer$le$piston$jusqu’au$2
2) Enfoncer$le$piston$jusqu’au$2ème
ème$cran$
$cran$ Grâce'à'l’éjecteur'situé'près'du'
2) Plonger$le$:ps$dans$le$liquide$
2) Plonger$le$:ps$dans$le$liquide$ piston,'éliminer'le';ps'dans'la'
1) Hors'du'tube,'enfoncer'le'piston' 1) Accoler'le';ps'contre'la'paroi'intérieure'
3) Maintenez$le$piston$enfoncé$tout$en$
3) Maintenez$le$piston$enfoncé$tout$en$
3) laisser$le$piston$remonter$doucement$
3) laisser$le$piston$remonter$doucement$ 2) Enfoncer'le'piston'jusqu’au'2
re:rant$la$pipeBe$hors$du$tube$'cran'
ème
jusqu’au'1 'cran'
er
re:rant$la$pipeBe$hors$du$tube$ poubelle'de'table.'
2) Plonger'le';ps'dans'le'liquide' 3) Maintenez'le'piston'enfoncé'tout'en' Jamais'avec'les'doigts'…'
3) Remonter'doucement'le'piston' re;rant'la'pipeDe'hors'du'tube' (risque'de'contamina;on)'

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 4

 Procédure
! Chacun de vous doit faire la manipulation ! => Travail individuel
Ce n’est pas un travail de groupe. En fin de TP, vous pourrez comparer vos résultats.

Dès que vous avez effectué une étape du protocole, cochez la case
correspondante afin de savoir où vous en êtes.

☐ Entraînez-vous avec de l’eau :

Placer 1 tube eppendorf dans le portoir et y transférer un volume d’H2O compris entre 300 et 900 µl.
Recommencer pour de plus petits volumes, jusqu’à 10-20 µl.
Au moindre doute, n’hésitez pas à appeler un assistant.

☐ Remplir les tableaux ci-dessous :

Utiliser la formule de votre choix (basée sur Ci et Cf ou sur le facteur de dilution) pour connaître
les volumes de BSA (Bovine Serum Albumine) et d’H2O à mélanger pour obtenir les solutions de BSA diluées
reprises dans le tableau 1. La BSA fournie a une concentration de 5mg/mL (5000µg/mL).

Tableau 1
Diluer à partir de solution stock de
BSA = 5mg/ml = 5000μg/ml
concentration Volume Volume Volume
finale en µg/ml final BSA H20 (µl)
(µl)
2500 1ml
1500 1ml
1000 1ml

☐ Attention, les dilutions du tableau 2 se font à partir de la solution de BSA (1000µg/ml) que vous
venez de préparer.

Tableau 2
Diluer à partir de solution de
BSA = 1mg/ml = 1000μg/ml
concentration Volume Volume Volume
finale en µg/ml final BSA H20 (µl)
(µl)
400 1ml
150 1ml
60 1ml

☐ Préparer 6 tubes eppendorf sur un portoir et annotez-les grâce au

marqueur (inscrire la concentration sur le capuchon).

☐ Choisir la bonne pipette et enfoncer le tips adéquat pour préparer vos

dilutions de BSA.

☐ Fermer les tubes et mélanger au vortex.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 5

 Chaque étudiant, dispose de 3 colonnes de la plaque 96 puits pour y répartir ses dilutions de BSA en 3
exemplaires. Suivez le plan suivant (tableau 3):
Tableau 3 : plan de plaque 96 puits
Etudiant 1 Etudiant 2
A 5000 5000 5000 5000 5000 5000
B 2500 2500 2500 2500 2500 2500
C 1500 1500 1500 1500 1500 1500
D 1000 1000 1000 1000 1000 1000
E 400 400 400 400 400 400
F 150 150 150 150 150 150
G 60 60 60 60 60 60
H H2O H2O H2O H2O H2O H2O

☐ Répartir 20μl de BSA stock (5000µg/mL), en triplicat, dans les puits de la ligne
A de la plaque 96 puits (voir plan ci-dessus)

☐ Répartir 20μl de chaque dilution de BSA, en triplicat, dans les puits de la

plaque 96 puits (ligne B => G)

☐ Répartir 20μl d’H2O, en triplicat, dans les puits de la plaque 96 puits (ligne H)

☐ Ajouter 200µl de réactif de bradford à chacun de vos puits

☐ Passez la plaque à votre binôme pour qu’il répartisse ses échantillons

☐ Mesure de l’absorbance à 595nm (bleu) : rendez-vous, avec la plaque 96 puits, au spectrophotomètre. Un

assistant se chargera de la mesure et analysera les résultats avec vous.

Analyse des résultats

Nous vous fournirons un tableau reprenant, pour chaque dilution, la moyenne et le pourcentage de
variation. On considère généralement qu’une variation de 3 à 5% est acceptable. Est-ce le cas ?
Si oui : vous obtenez des résultats fiables et reproductibles – Bravo
Si non : la technique de pipetage n’est pas encore maîtrisée … les erreurs possibles sont:
o Mauvais choix de la pipette ou du tips.
o Mauvais réglage du volume.
o Ne pas s’arrêter au 1er cran avant de pipeter.
o Remonter trop vite le piston => présence de bulles d’air.
o Le tips n’est pas plongé dans le liquide à tout moment du pipetage.
o Ne pas aller jusqu’au 2ème cran lorsqu’on expulse le liquide.
o Après transfert, remonter le piston avant d’être sorti du tube => on récupère donc, par
aspiration, une partie du volume à transférer.

Pour chaque dilution de BSA, tous les étudiants doivent obtenir la même Absorbance à 595nm puisque
vous avez reçu la même solution stock et vous avez suivi le même protocole. Si ce n’est pas le cas, il y a 2
possibilités :
o Erreur de calcul pour réaliser la dilution (voir tableau)
o Erreur de pipetage de la BSA ou de l’H20 (cf. ci-dessus)
o Erreur de pipetage lors de l’ajout du réactif de bradford

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 6

PARTIE 3 : Mission QC
Nous avons procédé à la purification du lysozyme à partir de blanc d’œuf. Votre mission est
d’évaluer la qualité de cette procédure.
Vous devez donc déterminer le rendement et le facteur de
purification des différents échantillons générés au cours du
processus de purification.
Pour cela, vous devez mesurer :
1) la quantité de lysozyme présent (dosage d’activité
enzymatique du lysozyme) => calcul du rendement
2) la pureté en lysozyme (dosage de protéines totales par la
méthode de Bradford, à combiner avec les résultats obtenus lors du
dosage d’activité enzymatique) => calcul du facteur de purification
3) Ces 2 aspects pourront également être évalués au moyen
d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).

Plan global des expérimentations

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 7

3.1 Dosage d’activité enzymatique du lysozyme

Principe : le lysozyme est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse du peptidoglycan, et donc qui
détruit la paroi des bactéries.
Plus il y a de lysozyme dans une solution, plus la lyse des bactéries sera rapide => Vréactionnelle ì et
Activité enzymatique ì.

Les bactéries absorbent la lumière à 430nm => A430 est donc proportionnelle à la concentration en
bactéries. C’est grâce à la mesure d’A430 que vous évaluerez la concentration en bactéries à tout
moment de la réaction.

Procédure :
☐ Préparer 9 cuvettes avec 1 mL de substrat (Solution de bactéries Micrococcus lysodeikticus,
0.4 g/l dans du tampon phosphate à pH 6.2).
Cette solution de bactéries se trouve dans le bac à glace (tube de 50ml).

☐ Demander l’aide d’un assistant qui vous montrera comment procéder pour la suite.

☐ Placer la première cuvette dans le spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 430 nm. Cette
valeur sera votre point de départ, le temps 0 de la réaction (l’enzyme n’a pas encore été ajoutée).
Noter cette valeur dans le tableau 4 ci-dessous.

☐ Répéter cette opération pour les autres cuvettes.

L’Absorbance au temps 0 devrait être la même pour chaque cuvette puisqu’elles contiennent toutes
la même concentration de bactéries.

☐ Dans la 1ère cuvette, ajouter 40 µl de la 1ère solution de lysozyme. A l’instant où la solution entre en
contact avec le substrat – lancer le chronomètre …
Il ne vous reste que 10 secondes pour bien mélanger la cuvette et la placer dans le
spectrophotomètre pour lire l’Absorbance de la solution aux temps 10, 20, …, 60 sec.
Noter les valeurs obtenues dans le tableau 4 ci-dessous.

☐ Répéter cette étape pour les 8 autres échantillons.

N’hésitez pas à refaire le dosage une seconde fois (dans une nouvelle cuvette) si vous avez un doute.

Tableau 4 : Activité enzymatique

Temps Filtrat FT W1 W3 E1 E2 E3 E4 E5
(s)
0
10
20
30
40
50
60

☐ A votre avis, lequel de ces échantillons contient la plus grande concentration de lysozyme ?

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 8

3.2 Dosage de protéines totales (Méthode de Bradford)
3.2.1. Préparation d’un tampon phosphate

☐ Calculer les volumes nécessaires de KH2PO4 et de Na2HPO4 pour préparer :

50 ml de tampon Phosphate 0.1M à pH6.2 (0.082M KH2PO4 + 0.018M Na2HPO4 = 0.1M PO4 total), à
partir de solutions stock à 0.5 M.
Tableau 5 : Préparation du Tampon Phosphate
Concentration Concentration Volume Volume à
initiale (M) finale (M) final prélever
KH2PO4
50 ml
Na2HPO4

Volume d’H20 à rajouter = ……… ml

☐ Dans un petit berlin, mélanger le KH2PO4, le Na2HPO4 et l’H2O.

Pour mélanger correctement, plongez-y un barreau magnétique et faites-le tourner
sur l’agitateur magnétique.

☐ Vérifiez le pH de votre tampon phosphate.

NB : l’électrode du pHmètre ne peut pas rester « à sec » ! Elle est constamment plongée dans une
solution de KCl 3M.
ü Avant toute chose, vérifiez la fiabilité du pHmètre (calibration) :
- Allumer le pHmètre et rincer l’électrode grâce à la pissette d’eau désionisée.
Réaliser ce rinçage au-dessus de la petite cruche.
- Plonger l’électrode dans la solution de calibration à pH7.
Petit pot blanc à capuchon rouge sur l’étagère, au-dessus du pHmètre.
- Si le pHmètre indique une valeur entre 6.8 et 7.2 => OK, poursuivez.
Si non, appeler un assistant pour qu’il calibre lui-même l’appareil.
- Si vous n’êtes pas prêt avec votre tampon phosphate, rincer et replonger l’électrode
dans le KCl.

ü Vérifiez le pH de votre tampon phosphate :

- Rincer l’électrode et la plonger dans votre tampon.
Le pH doit être de 6.2 si vous avez correctement réalisé le tampon.
Si le pH n’est pas compris entre 6 et 6.4, il faudra le recommencer.
- Rincer l’électrode et la plonger dans le KCl 3M.
- Le tampon phosphate servira lors de la dilution des bactéries.

☐ Donner le tampon à l’autre binôme (nécessaire pour effectuer la partie 4)

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 9

 3.2.2. Dosage de Bradford

Principe : Le colorant Bleu de Coomassie (ou de Bradford)

est de couleur brune au départ, mais il vire au bleu lorsqu’il se lie
aux protéines. L’intensité du bleu reflète donc la concentration
en protéines totales.
L’intensité du bleu peut être quantifiée grâce à une lecture
d’Absorbance à 595 nm (longueur d’onde du bleu)
ð plus A595 est ì , plus la [protéines] est ì.
La réalisation d’une droite étalon vous permettra de calculer la
concentration en protéines totales de vos échantillons (filtrat, FT…). La droite étalon est réalisée à
partir des valeurs d’A595 pour différentes [protéines] connues (BSA).

Procédure :
☐ Calculer les volumes de BSA (protéine bovine, l’albumine sérique à 1 mg/ml ou 1000µg/ml) et d’H20
à mélanger pour réaliser les solutions suivantes (tableau 6) :

Tableau 6
Standards pour la droite étalon du Bradford
concentration en Volume Volume BSA Volume
BSA (µg/ml) final (µl) H20 (µl)
0 1ml
30 1ml
60 1ml
100 1ml
150 1ml
200 1ml
300 1ml
400 1ml

Les étapes suivantes sont individuelles !!

Chaque étudiant préparera ses dilutions de standards et de lysozyme
pour les déposer sur la plaque 96 puits.

☐ Annoter 8 tubes eppendorf pour réaliser les différentes dilutions de BSA (standards).

☐ Mélanger les volumes appropriés de BSA et d’H2O dans chacun d’entre eux (voir tableau 6).

☐ Fermez bien les tubes et mélangez-les au vortex.

☐ Annoter 2 nouveaux tubes pour réaliser la dilution des échantillons Filtrat et FT, voir tableau 7.

☐ Calculer les volumes d’échantillon et d’H20 pour réaliser les dilutions du tableau 7.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 10

 Tableau 7
Dilution des échantillons pour le Bradford
Echantillons Facteur de Volume Volume éch. Volume
dilution final (µl) H20 (µl)
filtrat 10x 500µl
FT 10x 500µl
W3 Non dilué
E1 Non dilué
E2 Non dilué
E3 Non dilué
E4 Non dilué
E5 Non dilué

☐ Bien fermer les tubes et mélanger au vortex.

☐ Répartir, en triplicat, 20 µl de chaque tube de la gamme étalon (standards) et de chaque échantillon

(Filtrat et FT dilués + mes autres échantillons non dilués) dans les puits de la plaque 96 puits (cf.
plan de plaque, tableau 8).

Tableau 8
Etudiant 1 Etudiant 2
Standards (µg/ml) Echantillons Standards (µg/ml) Echantillons
A 0 0 0 Filtrat Filtrat Filtrat 0 0 0 Filtrat Filtrat Filtrat
B 30 30 30 FT FT FT 30 30 30 FT FT FT
C 60 60 60 W3 W3 W3 60 60 60 W3 W3 W3
D 100 100 100 E1 E1 E1 100 100 100 E1 E1 E1
E 150 150 150 E2 E2 E2 150 150 150 E2 E2 E2
F 200 200 200 E3 E3 E3 200 200 200 E3 E3 E3
G 300 300 300 E4 E4 E4 300 300 300 E4 E4 E4
H 400 400 400 E5 E5 E5 400 400 400 E5 E5 E5

☐ Dans chaque puits, ajouter 200 µl de réactif de Bradford.

Si votre tips touche la solution de protéines, il vaudra mieux en utiliser un nouveau pour le pipetage
suivant (risque de contamination du réactif de Bradford, ce qui fausserait votre dosage).

☐ Une fois la plaque remplie, rendez-vous au spectrophotomètre (lecteur de plaques).

Avec l’aide d’un assistant, vous procéderez à la mesure d’A595 pour chacun des puits.
Vous utiliserez ces données d’Absorbance pour calculer la concentration en protéines totales.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 11

 3.3 Electrophorèse des protéines en gel dénaturant (SDS-PAGE)

Principe : L’électrophorèse SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) permet de

séparer les protéines en fonction de leur taille (masse ou poids moléculaire) dans un gel soumis à
un champ électrique. Plus les protéines sont petites, plus elles migrent rapidement à travers les
mailles du gel (vers le bas). Les protéines sont visualisées sous forme de fines bandes brunes suite
à une coloration dans une solution d’argent.

Procédure :
☐ Dans le canevas de votre rapport, vous trouverez des photos de résultats de l’électrophorèse SDS-
PAGE des différents échantillons obtenus lors de la purification du lysozyme à partir de blanc
d’oeuf. A vous de retrouver la photo qui correspond aux échantillons que vous aurez analysés lors
de ce TP.
Afin d’interpréter correctement ce que vous voyez sur gel, visualisez la capsule relative au SDS-PAGE
sur eCampus et lisez les notes aux pages 18 et 19.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 12

 PARTIE 4 : Mission RECHERCHE
A T° et pH donnés, chaque enzyme est caractérisée par ses
paramètres cinétiques Km et Vmax. Pour le lysozyme, vous devez les
déterminer expérimentalement.

Vmax, la vitesse maximale, est atteinte lorsque l’enzyme est saturée

en substrat (n’est plus disponible pour former de nouveaux
complexes Enzyme-Substrat).
Km reflète l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Ce paramètre
équivaut à la concentration en substrat nécessaire pour atteindre
une vitesse valant la moitié de Vmax (cf. courbe de Michaelis).

4.1 Déterminer Km et Vmax du lysozyme : cinétique pour différentes [S]

Principe : Déterminer expérimentalement
comment la vitesse réactionnelle initiale Vi
évolue en fonction de la concentration en
substrat [S] (pour une quantité fixe d’enzyme).

En réalisant une cinétique comme

précédemment, mais en faisant varier la
[bactéries] dans les différentes cuvettes, Vi sera
calculé pour chaque [S]. Vous pourrez conclure
sur l’effet de [S] sur Vi, et vous pourrez
également déterminer Km et Vmax.

Procédure :
☐ Calculer les volumes de substrat (bactéries à 0.4 g/l) et de tampon phosphate à pH 6.2 pour
réaliser les solutions suivantes :
Tableau 9
Dilution du substrat (Micrococcus lysodeikticus, 0.4g/l)
concentration Volume final Volume S Volume Tp
finale en g/l (µl) phosphate (µl)
0,04 2ml
0,05 2ml
0,06 2ml
0,08 2ml
0,10 2ml
0,15 2ml
0,2 2ml
0,3 2ml
0,4 2ml

☐ Dans les tubes à essai, sur le portoir métallique, préparer 2 ml de chacune de ces solutions et
mélanger (utiliser un parafilm comme capuchon).

☐ Placer 9 cuvettes sur le portoir et transférer 1ml de chaque solution par cuvette.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 13

☐ Mesurer l’absorbance à 430 nm pour connaître la valeur au temps 0.
Attention, puisque les cuvettes contiennent des concentrations différentes de bactéries, A430 sera
différente pour chaque cuvette …
Vérifiez que les valeurs de A430 augmentent lorsque la concentration en bactéries augmente.

☐ Dans la 1ère cuvette (bactéries à 0.04g/l), ajouter 40 µl de la solution de lysozyme commercial

fournie (solution d’enzyme), mélanger vigoureusement et mesurer A430 après 10, 20, 30 et 40
secondes de réaction.
Reporter vos mesures dans le tableau 10.

☐ Répéter la même opération pour les autres cuvettes.

Tableau 10

Temps (s) Substrat = bactéries (g/L)

0.04 0.05 0.06 0.08 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40
0
10
20
30
40

☐ Ces données expérimentales vous permettront de calculer Km et Vmax.

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 14

PARTIE 5 : Rappels Théoriques

Vous trouverez ci-dessous quelques notions fondamentales

en enzymologie ainsi que l’explication des techniques
utilisées lors de la séance de travaux pratiques en Biochimie.
Pour plus d’informations, veuillez bien entendu vous référer
au cours de Biochimie Générale.

5.1 ENZYMOLOGIE
DEFINITIONS

Enzyme (E): Protéine qui accélère la vitesse d'une réaction chimique (transformation du
substrat en produit), sans être altérée et sans modifier le sens de la réaction.
Substrat (S): Molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action
catalytique d’une enzyme.
Produit (P): Molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme.

Pour accélérer une réaction chimique, l’enzyme

interagit avec son substrat pour former un complexe ES. La
réaction est plus rapide en présence de l’enzyme, car
l’énergie d’activation nécessaire est diminuée (cf. ci-
contre). Plus le nombre de complexes ì, plus la vitesse ì.

La vitesse d’une réaction chimique (catalysée ou non)

est définie comme une variation de concentration du
produit par unité de temps.
Lorsque la concentration en produit évolue
linéairement en fonction du temps, cette phase de la
E"et"S"interagissent,"ils"forment"un"complexe" réaction s’appelle l’état stationnaire. La pente de cette
droite est égale à la vitesse initiale (Vi) de la réaction
(exprimée en µM/min si la [P] est exprimée en µM).
Avec le temps, l’accumulation de produit et la
raréfaction du substrat constituent des paramètres qui
ralentissent la réaction et la [P] formé atteint un plateau
(cf. ci-dessous).

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 15

A. DOSAGE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DU LYSOZYME

Le lysozyme est une petite enzyme (environ 15 kDa) qui permet d’hydrolyser les liens de
peptidoglycans (et donc de détruire la paroi des bactéries).
Dans ce TP, l’activité enzymatique du lysozyme sera évaluée en suivant la lyse des bactéries
Micrococcus lysodeikticus. La disparition des bactéries en solution peut être suivie par la lecture de
l’absorbance (à 430nm) au cours du temps. Ainsi, on ne mesurera pas directement l’apparition du
produit, mais la dégradation du substrat, ce qui revient au même.
Attention, cette méthodologie ne nous donne pas directement la concentration de l’enzyme
en mg/mL ou en M, mais permet de définir la concentration du lysozyme en unité arbitraire par mL
(u/mL). La définition d’une unité de lysozyme et le calcul à réaliser se trouvent dans la figure ci-
dessous.

Cette technique de dosage d’activité est quantitative (obtention d’une valeur

chiffrée) et elle est spécifique du lysozyme. En effet, aucune autre enzyme n’est
capable de détruire les bactéries en solution …

Notes de TP en Biochimie Générale – Bac1 Médecine - Dentisterie 16

B. CALCUL DU Km ET Vmax

La courbe de Michaelis et Menten nous indique que la vitesse initiale (Vi) varie en fonction
de la quantité de substrat [S] présente dans la réaction (formule en bleu, ci-dessous).

* Km reflète les constantes d’association et de dissociation du complexe intermédiaire ES et reflète

donc l’affinité de l’enzyme E pour son substrat S. On peut voir sur le graphe, que Km correspond
aussi à la concentration en [S] pour laquelle la vitesse réactionnelle vaut la moitié de Vmax.
* Vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la réaction enzymatique (lorsque l’enzyme est
saturée en substrat). Dans ces conditions, toutes les molécules d’enzymes sont déjà complexées
avec des molécules de substrat, et l’ajout de substrat supplémentaire ne changera rien à la vitesse
réactionnelle puisqu’il n’y a plus d’enzyme disponible.

Pour plus de commodité, on utilise la linéarisation de Lineweaver et Burk qui, comme son nom
l’indique, permet d’obtenir une évolution linéaire et donc une droite. Ainsi, l’équation est de la
forme y=ax +b avec la pente a correspondant à Km/Vmax et l’ordonnée à l’origine b valant 1/Vmax.

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5.2 DOSAGE DES PROTEINES (méthode de Bradford)

Au cours de la séance de TP, nous doserons la concentration en protéines totales des différents
échantillons par la méthode de Bradford. Cette technique utilise un colorant, le bleu de Coomassie
(Brillant Blue G250), qui se lie aux protéines en conditions acides. Le colorant, lorsqu’il se lie aux
protéines, change de couleur (il devient bleu) et on mesure par spectrophotométrie ce
changement de couleur, à une longueur d’onde de 595 nm.
Pour être quantitatif, il faut réaliser une droite étalon à partir de diverses solutions d’une protéine
commerciale, la BSA (Bovine Serum Albumine), de concentrations connues (appelées standards).
Elle servira de référence pour calculer la concentration protéique de nos échantillons.

standards$
Échan/llons$
BSA$ (concentra/on$inconnue)$
µg/mL" Mesure"d’Absorbance"
0" des"standards"et"des"
30" échan>llons"(A595)"
60"
100"
150"
200"
300" Etablir"la"droite"étalon"et"son"équa>on:"
400" Abs"(Y)"en"fonc>on"des"concentra>ons"(X)"
des$standards$

Déterminer la concentration
des échantillons (X) à partir
de leur A595 (Y)

Cette technique est quantitative, mais elle n’est pas spécifique d’une protéine
en particulier, elle dose toutes les protéines de l’échantillon. Elle ne quantifie
donc pas uniquement le lysozyme.

5.3 ELECTROPHORESE DES PROTEINES (SDS-PAGE)

Cette méthode permet de visualiser les diverses protéines présentes dans vos échantillons
et d’en évaluer la taille. Vous pourrez ainsi vérifier la présence potentielle de lysozyme (et son
abondance relative entre les différents échantillons) et évaluer le degré de pureté des échantillons
de lysozyme purifié.

Les protéines, quelle que soit leur charge intrinsèque, seront rendues artificiellement
négatives par l’ajout de SDS puis déposées sur un gel de polyacrylamide (SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis). Les solutions de protéines sont déposées dans des puits, présents dans le haut
du gel. Lors de l’électrophorèse, le courant parcourt ce gel et TOUTES les protéines migreront vers
la borne positive (ANODE !) qui se trouve au bas du gel. La distance de migration des protéines

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dépendra de la taille des protéines (les plus petites migrant plus rapidement). Après une coloration
à l’argent, les protéines sont visibles sur le gel (une bande horizontale brune représente plusieurs
protéines de la même taille, et donc vraisemblablement de même nature). Le marqueur de poids
moléculaire (MW) est un référentiel, comportant une dizaine de protéines différentes, de tailles
connues. En comparant la distance de migration des protéines présentes dans nos échantillons à
celles des protéines du marqueur de poids moléculaire, on peut en estimer la taille.
L’intensité de la coloration à l’argent (couleur brune) est proportionnelle à la quantité de
protéines présentes au même endroit dans le gel.
Si le lysozyme n’est pas correctement purifié, on observera plusieurs bandes en différents
endroits du gel, correspondant à différents types de protéines contaminantes.

Préparation des échantillons* Dépôt sur gel vertical* Electrophorèse*

Protéines*+*SDS*

Après*30;45*min*à*200V*

Dénatura0on*à*95°C*

MW*=*protéines**
Coloration du gel dans un bain d’argent de*tailles*connues*
(révélation des protéines)*

Cette technique est non-spécifique (coloration de toutes les protéines, pas

uniquement de notre protéine d’intérêt - le lysozyme)
Elle est semi-quantitative car on peut comparer l’abondance relative des bandes
entre différents échantillons (déposés dans des puits différents), mais sans
connaître la quantité exacte.

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