Etude du polymorphisme moléculaire par AFLP d'accessions d'H.

coronarium en Tunisie
Marghali S., Trifi-Farah N., Ghariani S., Marrakchi M.
in
Ferchichi A. (comp.), Ferchichi A. (collab.).
Réhabilitation des pâturages et des parcours en milieux méditerranéens

Zaragoza : CIHEAM
Cahiers Options Méditerranéennes; n. 62

2004
pages 85-88

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Marghali S., Trifi-Farah N., Ghariani S., Marrakchi M. Etu de du polymorph isme molécu laire par
AFLP d' accession s d' H. coron ariu m en Tu n isie. In : Ferchichi A. (comp.), Ferchichi A. (collab.).
Réhabilitation des pâturages et des parcours en milieux méditerranéens . Zaragoza : CIHEAM, 2004. p. 85-
88 (Cahiers Options Méditerranéennes; n. 62)
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 Etude du polymorphisme moléculaire par AFLP d’accessions
d’H. coronarium en Tunisie

S. Marghali, N. Trifi-Farah, S. Ghariani et M. Marrakchi

Laboratoire de Génétique Moléculaire, Immunologie et Biotechnologie,
Faculté des Sciences de Tunis, Campus universitaire, 2092 El Manar, Tunis, Tunisie
e-mail : [email protected]

SUMMARY – "Study of molecular polymorphism in H. coronarium accessions by AFLP in Tunisia". The study of
genetic diversity in Hedysarum coronarium L. has been performed using AFLP analysis in individuals
representing two spontaneous local populations and one cultivar. We first showed that the technique can be used
efficiently with H. coronarium. A total of 178 bands were amplified, among which 150 revealed polymorphism.
Genetic relationships among different individuals were assessed based on a Nei and Li’s distance matrix using
the construction of UPGMA. The analyses show that there is an important genetic variability between these H.
coronarium populations examined with opposite geotropism. The results are discussed in the view of
implementing fodder improvement programmes aimed at limiting the erosion of genetic diversity of pasture land.

Key words: AFLP, Hedysarum coronarium, genetic diversity.

Introduction
Le genre Hedysarum renferme des espèces légumineuses papilionacées appartenant soit au
groupe des espèces Alpines, Arctiques et Asiatiques (2n=14), soit au groupe Méditerranéen (2n=16).
En Tunisie, parmi les espèces du groupe Méditerranéen, Hedysarum coronarium (légumineuse
papilionacée), appelée couramment Sulla ou Sainfoin d’Espagne, est la seule espèce cultivée au
Nord du pays pour la production de fourrage. Elle est préférentiellement allogame avec un faible
pourcentage d’autogamie (10%). A l'état spontané, cette espèce présente une large aire de répartition
géographique et pousse sur des sols argilo-marneux bien drainés. H. coronarium a déjà fait l’objet de
plusieurs travaux de recherche qui sont essentiellement axés sur l’étude de sa reproduction et
l’analyse de sa variabilité morphologique, iso-enzymatique et moléculaire par RFLP (Boussaïd et al.,
1995 ; Trifi-Farah et al., 2000). L’analyse de la variabilité morphologique a montré l’existence d’une
opposition entre les formes spontanées locales à tendance plagiotrope et les cultivars à tendance
orthotrope. De plus, il existe également en Tunisie, deux types de plantes naturelles locales ayant
une architecture opposée.

Dans le but d’améliorer cette espèce pour son utilisation comme plante de pâturage en Tunisie,
une analyse de la variabilité génétique des peuplements naturels et des cultivars paraît nécessaire
tant du point de vue fondamental que sur le plan appliqué afin de créer un nouveau matériel
synthétique qui servira à la mise en place d'une cartographie de cette espèce. Pour ce faire, nous
avons utilisé des marqueurs génétiques moléculaires AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) (Vos et al., 1995). Ces marqueurs ont déjà été exploités chez des espèces du genre
Hedysarum en vue d’analyser sa diversité interspécifique (Marghali et al., 2002).

Matériel et méthodes
Dans cette étude, nous avons considéré deux populations naturelles spontanées caractérisées par
des ports architecturaux opposés originaires de El Haouaria et Oued Zit, ainsi qu’un cultivar de la
région de Mateur. L’ADN a été extrait à partir de différents individus ayant atteint le stade 3 feuilles en
utilisant le kit Quiagen. Ainsi, l’analyse a concerné deux plantes correspondants au cultivar (S73 et
S75), cinq issus de la population d’El Haouaria (E30, E42, E63, E73 et E76) et quatre de la population de
Oued Zit (Z20, Z33, Z58 et Z74).

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 L’analyse du polymorphisme moléculaire par la technique AFLP a été établie à partir du « kit AFLP
system analysis » avec quelques modifications. La digestion de l'ADN génomique (250ng) est
réalisée à 37°C pendant 4h à l'aide des enzymes EcoRI et MseI. Après inactivation des enzymes de
restriction, les fragments de restriction sont ligués à des adaptateurs de séquence connue pendant 3
heures à 16°C. A la suite de la préamplification réalisée à l'aide d'amorces complémentaires aux
adaptateurs, l'amplification sélective est effectuée à l'aide de 5 combinaisons d'amorces ayant 3
nucléotides sélectifs du côté 3' (Tableau 1). La séparation des fragments amplifiés se fait par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 6% révélé au nitrate d’argent (Bassam et al.,
1991). Les profils d’amplification sont interprétés en attribuant le chiffre 1 si la bande est présente et
le chiffre 0 si elle est absente, ce qui permet de générer une matrice binaire des données. Cette
dernière est traitée par le programme GENEDIST (version 3.572c) pour estimer les distances
génétiques entre les individus. Ainsi sur la base de la méthode UPGMA, la matrice des distances
génétiques est utilisée afin d’établir les arbres phylogénétiques (Nei et Li, 1979).

Tableau 1. Variabilité des marqueurs AFLP chez Hedysarum coronarium L.

Amorces Nombre de bandes Nombre de bandes % de bandes
EcoRI MseI Observées clairement polymorphes polymorphes
AAC CAG 37 28 75,6
ACT CTG 35 30 85,7
AGC CTT 33 29 87,8
AAC CAA 39 31 79,5
AGC CAA 34 32 94

Résultats et discussion

Dans le but d’étudier le polymorphisme moléculaire de l’espèce H. coronarium et afin d'identifier

des marqueurs AFLP en relation avec l'architecture de la plante, nous avons choisi deux populations
spontanées de cette espèce à géotropisme opposé. Il s’agit de la population de El Haouaria qui est
caractérisée par des plantes à port rampant et celle de Oued Zit qui présente un certain
redressement du port. Le cultivar est caractérisé par un port érigé. Grâce à la technique AFLP,
plusieurs expériences ont permis d'analyser tout en les caractérisant les deux populations sus-
présentées ainsi que le cultivar. Dans ce contexte, les résultats révèlent une empreinte génétique
nette avec la présence d’un nombre important de bandes pour chaque ADN étudié. Les profils AFLP
ont été générés à l'aide de 5 combinaisons d'amorces (Tableau 1).

Une première approche de l’analyse de la variabilité génétique a consisté à estimer le nombre de

bandes polymorphes d’après les bandes révélées sur gel de polyacrylamide. L’analyse des résultats
observés nous a permis de recenser un total de 178 bandes dont 150 se sont montrées polymorphes.
D’où sur l’ensemble des populations analysées dans le présent travail, on remarque une importante
variabilité génétique avec un taux de bandes polymorphes égal à 84.4%. Par ailleurs, pour un même
ADN et en utilisant différentes combinaisons d'amorces, une variabilité des empreintes génétiques est
également obtenue. Le nombre total de bandes polymorphes trouvé dépend donc autant de la
complexité du génome étudié que du couple d'amorces utilisé. Le nombre de bandes polymorphes
par paire d'amorces exploitée varie de 28 pour la combinaison EAAC/MCAG à 32 pour le couple
EAGC/MCAA avec une moyenne de 30 bandes polymorphes par combinaison utilisée.

Concernant la caractérisation moléculaire, l’analyse de la matrice des distances génétiques

obtenue, basée sur les marqueurs AFLP (Tableau 2), nous montre que les distances génétiques
entre les différents individus varient entre 0.212 et 0.757. Il en découle qu’il existe une grande
diversité génétique au niveau moléculaire entre les 11 individus étudiés. Par ailleurs, la distance
génétique la plus faible d=0.212 se situe entre les individus Z58 et Z74 appartenant à la population de
Oued Zit. Par conséquent, ces deux individus présentent le maximum de similitudes au niveau de leur
ADN. D’autre part, la distance génétique la plus élevée d=0.757 se trouve entre l'individu Z58 de la
population de Oued Zit et l'individu E63 appartenant à la population de El Haouaria. Il en résulte que
ces deux individus sont les plus divergents au niveau de leur ADN.

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Tableau 2. Matrice des distances génétiques basée sur les marqueurs AFLP chez H. coronarium
Z58
Z74 0.212
Z20 0.618 0.502
Z33 0.622 0.510 0.236
E73 0.435 0.386 0.662 0.700
E30 0.520 0.619 0.444 0.456 0.662
E76 0.595 0.628 0.551 0.500 0.540 0.386
E42 0.570 0.637 0.437 0.503 0.516 0.385 0.539
E63 0.757 0.637 0.437 0.533 0.576 0.464 0.405 0.544
S73 0.590 0.564 0.397 0.436 0.708 0.543 0.625 0.471 0.471
S75 0.663 0.491 0.386 0.399 0.512 0.386 0.479 0.570 0.638 0.417

La matrice des distances génétiques a permis de schématiser les relations phylogénétiques entre
ces individus sous forme d'arbres phylogénétiques. La Fig. 1 représente l'arbre phylogénétique ainsi
obtenu. Elle révèle la séparation en deux embranchements témoignant de la divergence de deux
groupes, un groupe incluant deux individus Z58 et Z74 de la population de Oued Zit et un individu E73
de la population de El Haouaria; l'autre comprend tous les autres individus. Ainsi, afin de réaliser des
croisements entre individus les plus éloignés phylogénétiquement le choix a porté sur les individus
Z58 et E63 qui seront impliqués dans des croisements en vue d’analyser la ségrégation de la
descendance F1 et F2. Cette analyse complétée par les données morphologiques nous permettra
d’établir la carte génétique de H. coronarium L. et d’envisager un programme d'amélioration
génétique de l'espèce assistée par des marqueurs moléculaires.

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11

9
0.1

Fig. 1. Arbre phylogénétique regroupant les 11 individus analysés par AFLP (1: Z58; 2: Z74; 3: Z20; 4:
Z33; 5: E73; 6: E30; 7: E76; 8: E42; 9: E63; 10: S73; 11: S75).

Conclusions
La plupart des fragments AFLP correspondent à une position unique dans le génome, et de ce fait,
ils seront exploités en tant que point de repère ou marqueurs au niveau de cartes génétiques.

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Chaque fragment est caractérisé par sa taille et les amorces requises pour son amplification.
L'utilisation des marqueurs moléculaires AFLP semble, de ce fait, prometteuse pour la cartographie et
la détection de QTL liés à des gènes d’intérêt. Ainsi les croisements entre plantes parentales Z58 et
E63 spontanées opposées vis à vis de leur géotropisme, caractérisées d'un point de vue
morphologique et moléculaire, nous permettront de réaliser la création de matériel recombinant
amélioré. En effet, chez H. coronarium, la recherche de gènes impliqués dans le développement de la
plante (architecture) est importante pour l'exploitation agronomique par la création de matériel
amélioré et adapté aux conditions du milieu.

Remerciements

Nos remerciements s’adressent au Ministère de l’Enseignement Supérieur (Direction Générale de

la Recherche Scientifique et Technique), au Ministère de la Recherche Scientifique et de la
Technologie et à l’Agence de Coopération Culturelle et Technique. Ce travail a été réalisé grâce à
l’appui de la Coopération Scientifique Française (Institut Français de Coopération auprès de
l’ambassade de France en Tunisie).

Références
Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. (1991) Fast and sensitive silver staining of DNA in
polyacrylamide gels. Anal. Biochem., 196 : 80-83.
Boussaïd M., Ben Fadhel N., Trifi-Farah N., Marrakchi M. (1995) Mediterranean species of
Hedysarum genus. Genetic resources of forage and grass plants (I.N.R.A. and B.R.G. France
ed.) : 115-130.
Marghali S., Trifi-Farah N., Ghariani S., Marrakchi M. (2002) Exploration of the genetic diversity in
Hedysarum genus detected by AFLPs. Grassland Science in Europe volume 7.
Nei, M. and Li, W.S. (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction
endonuclease. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 76 : 5269-5273.
Trifi-Farah N., Chatti, W.S., Marrakchi, M., Pernes J. (1989) Analyse de la variabilité morphologique et
enzymatique des formes cultivées et spontanées de Hedysarum coronarium L. en Tunisie.
Agronomie, 9 : 591-598.
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot J.,
Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic
Acids Research, 23 : 4407-4414.

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