Mallette PCR
Mallette PCR
Mallette PCR
Mallette « PCR »
Thermocycleur BIOER
Sommaire
Mallette « PCR »
Thermocycleur BIOER
Thermocycleur
Mais aussi : deux pipettes « PCR », une boîte de cônes, une micro-centrifugeuse pour microtubes
2 TECHNIQUE de PCR
2.1 Principe
Une de ces amorces est une copie du brin codant et l'autre, une copie du brin non codant.
Sous l'action d'une enzyme (ADN polymérase), chaque amorce est allongée dans le sens 5'-3'
d'une séquence exactement complémentaire du brin hybridé.
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UPMC -Biologie Moléculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier
- La séquence : les séquences des deux amorces du même couple doivent présenter le
maximum de divergences et plus particulièrement à l'extrémité 3', afin d'éviter leur
cohybridation. La teneur en G+C doit être d'environ 50 %. La richesse en GC améliore la
stabilité du duplex amorce-matrice.
- Le nombre de cycles : pour obtenir un signal détectable sur gel, il faut une amplification de
2n molécules dans les conditions optimales en n cycles. Il faut noter qu’un nombre de cycles
trop élevé provoque l'accumulation de produits non spécifiques.
Tm = 4 (G+C) +2 (A+T)
La première dénaturation de l'ADN matrice est importante. Il faut toutefois noter que
les temps de dénaturation très longs réduisent l'activité enzymatique (la demi-vie de l'enzyme
est supérieure à 2h à +95°C).
2.3.3 L’AMPLIFICATION
- 20 µM de chaque dNTP
- 10 µl de tampon 10X
Les échantillons sont déposés dans l'appareil (thermocycleur), où ils subissent une dénaturation de
x minutes avant de commencer le programme de 30 à 40 cycles standard comportant chacun :
x min ou s, à + 95°C
Hybridation
* une étape d'hybridation: Dénaturation des Elongation
amorces
On réalise une électrophorèse en gel d’agarose des amplifiats PCR, en comparaison avec des
marqueurs de taille (pb)
3 CONSOMMABLES ET REACTIFS
Liens académiques :
http://ww2.ac-poitiers.fr/biochimie/spip.php?article159
http://ww2.ac-poitiers.fr/biochimie/IMG/pdf/doc_mallette_electrophorese.pdf
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