2017LEMA1010

Amal EL ALAMI
Mémoire présenté en vue de l’obtention du

grade de Docteur de l'Université du Maine
sous le sceau de l'Université Bretagne Loire
/l’Université Sidi Mohamed Ben Abdellah –fsdm- Fès
Écoles doctorales : 3MPL-Le Mans /SMPI-Fés
Discipline : physique
Unité de recherche : IMMM-CNRS-UMR 6283, Le Mans, France/ LPS, équipe polymères et

nanomatériaux, Faculté des Sciences Dhar El Mehraz, B.P. 1796, Fès-Atlas, Fès, Maroc.
Soutenue le : 20/04/2017
Thèse N° : 2017LEMA1010
Mise en œuvre de biocapteurs en vue de la

détection de pesticides et polluants dans
l'eau par diffusion Raman exaltée
JURY
Rapporteurs : Jean-Louis MARTY, Professeur, Université de Perpignan (France)

Zouheir SEKKAT, Professeur, Université mohammed V Rabat (Maroc)
Abdellah REZZOUK, Professeur, Université Sidi Mohamed Ben Abdellah-Fès (Maroc)
Examinateurs : Anouar JORIO, Professeur, Université Sidi Mohamed Ben Abdellah-Fès (Maroc)
Directeur de Thèse : Philippe DANIEL, Professeur, Université du Maine Le Mans (France)
Co-directeur de Thèse : Mimouna BAITOUL, Professeur, Université Sidi Mohamed Ben Abdellah-Fès (Maroc)
Co-encadrant de Thèse : Fabienne LAGARDE, Maître de conférences, Université du Maine Le Mans (France)
Remerciement
Remerciement
Cette thèse s’inscrit dans le cadre d’une cotutelle entre l’Université du Maine
(Faculté des Sciences et Techniques du Mans) et de l’Université Sidi Mohamed Ben Abd
Allah (Faculté des Sciences Dhar El Mehraz Fés). Elle a été réalisée principalement à
l’Institut des Molécules et des Matériaux du Mans (IMMM) et au Laboratoire de Physique
de Solide (LPS) de FSDM-Fés.
Je souhaite remercier Monsieur Jean-Marc Grenèche, Directeur de l’IMMM ainsi que

Monsieur Laurent FONTAINE qui a pris sa relève en janvier 2009 et Monsieur
BENZAKOUR NAJIB directeur du LPS de m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire et
profiter des compétences qui s’y développent.
Je tiens également à remercier l’Office Méditerranéen pour la Jeunesse (OMJ) pour

avoir financé une partie de mes séjours au Mans. Je remercie également toute l’équipe des
Relations Internationales de l’Université du Maine pour la facilité de toutes les démarches y
compris le logement.
A l’Université du Maine pour sa contribution financière à travers l’aide à ma thèse en
cotutelle.
Je remercie aussi sincèrement mes directeurs et co-encadrant à savoir : Philippe

DANIEL, Mimouna BAITOUL, Fabienne LAGARDE pour avoir dirigé mes travaux. Je
souhaite les remercier pour leur investissement, leur enthousiasme et leurs conseils. Merci
pour tout ce que vous m'avez appris et donné durant ces quelques années!
Je suis très sensible à l’honneur que me font également Messieurs Jean-Louis

MARTY, Professeur à l’Université de Perpignan (France,) Zouheir SEKKAT, Professeur à
l’Université Mohammed V Rabat (Maroc) et Abdellah REZZOUK, Professeur à l’Université
Sidi Mohamed Ben Abd Allah-Fès (Maroc), en acceptant d’être les rapporteurs de ce travail.
Je leur adresse mes sincères remerciements.
Je tiens ensuite à remercier Monsieur Anouar JORIO, Professeur à l’Université Sidi

Mohamed Ben Abdellah-Fès (Maroc), de m’avoir fait l’honneur de présider ce jury de thèse
ainsi comme membre de comité de suivie de thèse.
Je remercie également Monsieur Antoine kather, Professeur à l’Université d’Angers

pour sa participation au comité de suivie de thèse.
Je voudrais remercier tous ceux qui de prés ou de loin ont participe à ce travail.
Je voudrais exprimer toute ma considération aux ingénieurs et techniciens qui ont

participé au bon fonctionnement de ce travail : Frédéric Amiard, Agnès Ranger, Francis
Chavanon, Alexandra Biget-Brebion…
[3]
Remerciement
Je remercie tout les enseignants des Département de Chimie et de Physique de la

Faculté des Sciences Dhar Mahraz-Fès qui ont participé à ma formation durant mon cursus
universitaire et également le laboratoire IMMM.
Un grand merci à tous les thésards avec qui j’ai passé de très bons moments et auprès
des quels j’ai trouvé du soutien et de l’amitié. Merci à Yueying, Ophélie, Kenza, Héloïse, Huy,
Romain, Fatima Zahra …
Je ne remercierai jamais assez ma mère, sans qui rien n'aurait été possible.
La thèse ne peut se faire sans des moments de stress, je tiens à remercier : Michéle
Houdusse, ma marraine, pour ses conseils intéressants et pour l’aide qu’elle m’a apportée et
Saida Menard, gestionnaire de l’IMMM pour le réconfort, et sa bonne humeur durant ces
moments de stress.
Je dédie ce manuscrit à ma mère, à l’âme de mon père, Sébastien Hérault, à toutes

mes sœurs et frères, ainsi qu’a chacun des membres de ma famille pour leurs
encouragements et leur soutien constant pendant ces années.
Amal EL ALAMI
[4]
-Articles ou proceedings publiés
 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to chemometrics for identification and

quantification of acetylcholinesterase inhibitorsŗ, Amal Eδ AδAεI, Fabienne
LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL (El-alami et al.).
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203116302375
 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to chemometrics for identification and

quantification of acetylcholinesterase inhibitorsŗ, Amal EL ALAMI, Fabienne
LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL ( proceeding template, SETAC
Nantes France 2016) .
http://www.setac.org/store/download.asp?id=DDF264C5-0CAE-4957-B0BB-F8C8A03F0C32
 ŖNew sensor for direct detection of pesticides in water by Raman spectroscopy

coupled with enzymatic functionalized nanoparticles Ŗ, Amal Eδ AδAεI, Fabienne
LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL (proceeding template,
NANOTECH France 2015).
http://www.setcor.org/files/papers/1475876746_NanotechFrance2015-ProceedingPapersConcate.pdf
-Articles en préparation
 ŖSensitive unmodified Gold Nanoparticle-based dynamic light scattering assay for

acetylcholine and acetylcholinesterase inhibitors detectionŗ. Amal EL ALAMI,
Fabienne LAGARDE, Qun HUO, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL.
 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to acetylcholinesterase activity for

identification of plastics as acetylcholinesterase inhibitorsŗ. Amal EL ALAMI,
Fabienne LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL.
-Communications à des colloques/congrès
 SETAC Nantes France 2016, 22-26 juin, Nantes, « Enhanced Raman spectroscopy
coupled to chemometrics for identification and quantification of acetylcholinesterase
inhibitors», Amal EL ALAMI, Fabienne LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe
DANIEL
 NANOTECH France 2015, 15-17 jiun, Paris, « New sensor for direct detection of
pesticides in water by Raman spectroscopy coupled with enzymatic functionalized
nanoparticles », Amal EL ALAMI, Fabienne LAGARDE, Mimouna BAITOUL,
Philippe DANIEL.
 Journées de lřécole doctorale, 18 et 19 juin 2015 à Université du Maine: « New sensor

for the detection of pesticides in water by enhanced Raman spectroscopy of
enzymatic activity »Amal EL ALAMI, Fabienne LAGARDE, Mimouna BAITOUL,
Philippe DANIEL.
[5]
-Présentations de posters
 SETAC Europe, 3-7 May 2015 en Centre Convencions Internacional de Barcelona

Espagne « New sensor for direct detection of pesticides in water by Raman
spectroscopy coupled with enzymatic functionalized nanoparticles » les auteurs :
Amal EL ALAMI, Fabienne LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL.
 Journées de lřécole doctorale, 1θ et 17 juin β014 à Université de Nantes, le titre du

poster : « New sensor for the detection of pesticides in water by enhanced Raman
spectroscopy of enzymatic activity » les auteurs : Amal EL ALAMI, Fabienne
LAGARDE, Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL.
 Les doctoriales 2013, 13-15 février 2013 à Université Sidi Mohamed Ben Abd Allah-
Fés (Maroc), le titre du poster : « Vers un model de détection des polluants et Virus
par la spectroscopie Raman » les auteurs : Amal EL ALAMI, Fabienne LAGARDE,
Mimouna BAITOUL, Philippe DANIEL.
[6]
Liste des abréviations
ACHE: Acétylcholinestérase
AgNPs: Nanoparticules d'argent
ACH: Acétylcholine
ACHCl: Le chlorure d'acétylcholine
AuNPs: nanoparticules d'or
CA: Carbaryl
CETAB: bromure de cétyltriméthylammonium
Dhm: diamètre hydrodynamique moyen
DLS: diffusion dynamique de la lumière
GC,LC: chromatographie en phase liquide et gazeuse
HPLC: Chromatographie en Phase liquide à Haute Performance
Idm: intensité de diffusion moyenne
LSPR: Résonance Plasmon de Surface Localisé
MET: Microscopie Eectronique à Transmission
NPs: Nanoparticules
OMS: Organisation Mondiale de la Santé
OPs: Organophosphorés
PO: Paraoxon
PP: Phosphate de Potassium
PPS: Plasmons Polaritons de Surface
SEM: monocouches autoassemblées
SERS: Spectroscopie Raman Exaltée de Surface
SPR: Résonance Plasmon de Surface
[7]
Table des matières
Introduction générale .................................................................................................................. 14
Partie A SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................... 17
I. Les pesticides ..................................................................................................................... 18
1. Bref historique .................................................................................................................. 19
2. Classification des pesticides ......................................................................................... 20
3. Utilisation des pesticides ............................................................................................... 21
4. Exposition aux pesticides .............................................................................................. 22
5. Effets sur la santé.............................................................................................................. 26
6. Limites réglementaires .................................................................................................. 28
7. Les pesticides organophosphorés et les carbamates .......................................... 30
7.1. Mécanismes d’inhibition ......................................................................................... 32
7.2. Organophosphorés................................................................................................... 33
7.3. Carbamates ................................................................................................................ 35
Conclusion ........................................................................................................................................ 36
II. Détection des organophosphorés et carbamates .......................................................... 37
1. Détection directe .............................................................................................................. 38
2. Détection par mesure de l’activité enzymatique .................................................. 40
3. Définition et principe du biocapteur ......................................................................... 42
3.1 Biorécepteurs enzymatiques pour la détection des pesticides. .......................... 43
3.1.1 Biorécepteurs catalytiques pour les pesticides .................................................. 44
3.1.2 Biorécepteurs basés sur l'inhibition par des pesticides....................................... 45
3.2 Les types de transducteurs ..................................................................................... 46
3.2.1 Capteurs électrochimiques........................................................................... 46
3.2.2 Capteurs thermométriques et calorimétriques ....................................... 46
3.2.3 Capteurs à effet piézoélectrique (ou mécaniques) .................................. 47
[8]
3.2.4 Les transducteurs optiques ............................................................................ 47
Conclusion ........................................................................................................................................ 48
III. La diffusion Raman .............................................................................................................. 49
1. Principe de la diffusion Raman.................................................................................... 50
2. Théorie de l’effet Raman ................................................................................................ 52
3. Des plasmons à la diffusion Raman Exaltée de surface (SERS) ........................ 56
4.1. Les plasmons de surface ......................................................................................... 57
4.2. Nature du plasmon de surface .................................................................................. 59
4.3. Plasmon de surface localisé dans les nanoparticules métalliques ................................ 60
5. La diffusion Raman Exaltée de surface ..................................................................... 62

5.1. L’Effet électromagnétique ...................................................................................... 63
5.2. L’effet chimique ........................................................................................................ 65
5.3. Types de substrat SERS actifs :............................................................................... 67
6. Techniques de fabrication de Substrats SERS : nanoparticules d’or .............. 68

Conclusion et résumé ................................................................................................................... 71
Objectifs de la thèse : .................................................................................................................... 73
Partie B M)SE EN ŒUVRE DE B)OCAPTEURS ET TEC(N)QUES DE
CARACTERISATION ....................................................................................................................... 74
IV. Protocoles expérimentaux .................................................................................................. 75
1. Synthèses des nanoparticules d’or ............................................................................. 75
1.1. Choix de la méthode de synthèse .......................................................................... 75
1.2. Mode opératoire ....................................................................................................... 76
1.3. Caractérisation des nanoparticules d'or synthétisées ..................................... 77
1.4. Elaboration de substrats pour la spectrométrie Raman SERS ........................ 78
2. Préparation des solutions: ............................................................................................ 79

2.1. Tampon phosphate de potassium ......................................................................... 79
2.2. Préparation/stockage de la solution de l’AC(E ................................................ 80
[9]
2.3. Préparation de la solution de l’acétylcholine ..................................................... 80
2.4. Préparation des solutions de pesticides .............................................................. 80
2.4.1. Paraoxon .......................................................................................................... 80
2.4.2. Carbaryl ............................................................................................................ 81
3. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E par la spectroscopie Raman

SERS ................................................................................................................................................. 81
3.1. L’AC(E non immobilisée ......................................................................................... 81
3.1.1. Activité de l’AC(E en absence de pesticides ............................................. 81
3.1.2. Activité de l’AC(E en présence de pesticides ........................................... 82
3.1.3. Activité de l’AC(E en présence de plastiques avec additifs ................... 83
3.2. L’AC(E )mmobilisée sur la surface d’or ............................................................... 84
3.2.1. Modification de la surface d’or .................................................................... 86
3.2.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E ............................................. 88
4. Mesure de l’activité de l’AC(E par la diffusion de lumière DDL ...................... 88

V. Techniques de caractérisation. .......................................................................................... 90
1. Spectrométrie Raman ..................................................................................................... 90
2. Diffusion dynamique de la lumière (DDL) .............................................................. 92
3. Electrochimie ..................................................................................................................... 94
4. Autres techniques............................................................................................................. 95
4.1. Spectrométries d’absorption UV‐Visible ............................................................. 95
4.2. Microscopie électronique en transmission (MET) ............................................ 95
Conclusion ......................................................................................................................................... 96
Partie C RESULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................... 97
VI. Biocapteur optique basé sur le Raman SERS et ACHE non immobilisée ....... 98
1. Caractérisation des nanoparticules d’or par TEM et UV-visible ...................... 98
2. Diffusion Raman Exaltée de Surface (SERS) : Détection directe des
pesticides ........................................................................................................................................ 100
[10]
2.1 Détection du carbaryl ............................................................................................ 100
2.2 Détection du Paraoxon .......................................................................................... 102
3. Détection des inhibiteurs de l’AC(E par mesure de son activité

enzymatique couplée à la spectroscopie Raman SERS. .................................................. 104
3.1 Détection de l’AC(. ................................................................................................. 104
3.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E en absence de pesticides ....... 106
3.3. Optimisation de paramètres d’élaboration du biocapteur. ........................... 108
3.3.1. Optimisation de la concentration de temps de contact. .............................. 109
3.3.2. Optimisation de la concentration de l’AC(E ........................................... 110
3.3.3. Interactions NP-Molécules ......................................................................... 112
3.3.4. Conditions optimales retenues .................................................................. 114
3.4. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E en présence de pesticides ..... 114
3.5. Détection du paraoxon .......................................................................................... 115
3.5.1. Optimisation du temps de contact PO&ACHE ......................................... 115
3.5.2. Limite de détection ...................................................................................... 116
3.6. Détection du Carbaryl............................................................................................ 117
3.7. Identification des pesticides ....................................................................................... 119
3.8. Mesure de l’activité de l’AC(E en présence d’échantillons d’eaux naturelles .

.................................................................................................................................... 121
4. Perspectives : mesures d’autres polluants émergeants plastiques .......... 122

Conclusion ...................................................................................................................................... 126
VII. Biocapteur optique basé sur le Raman SERS@ACHE immobilisée ............... 128
1. )mmobilisation de l’AC(E en vue d’une réutilisation. ...................................... 128
1.1. Modification de la surface d’or ...................................................................... 128
1.2. )mmobilisation de l’AC(E ............................................................................... 130
2. εesure de lřactivité enzymatique de lřACHE. .......................................................... 134
[11]
3. Détection du paraoxon ................................................................................................. 134
Conclusion ...................................................................................................................................... 135
VIII. Autres résultats : Détection de pesticides par mesure de l’activité
enzymatique de l’AC(E couplée { la diffusion dynamique de la lumière. ............... 137
1. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E par la DLS. ................................... 137
1.1. Effet de la taille des nanoparticules.................................................................... 137
1.2. Optimisation du temps d’incubation .................................................................. 140
1.3. Optimisation de la concentration en ACHE et ACH .......................................... 141
2. Discussion ......................................................................................................................... 143

2.1. Formation du couple ACH@NPs. ......................................................................... 143
2.2. Formation des agrégats de nanoparticules. ...................................................... 145
3. Détection du paraoxon ................................................................................................. 147

Conclusion ...................................................................................................................................... 149
Conclusion générale et perspectives .................................................................................... 150
Résumé ......................................................................................................................... 168
Abstract ......................................................................................................................... 168
[12]
Introduction générale
Les organophosphates (OP) et les carbamates sont actuellement connus en tant que
composés chimiques utilisés principalement dans l'agriculture en raison de leur très grande
efficacité insecticide. Les organophosphorés sont utilisés depuis les années 70 et les
carbamates depuis les années 40. La neurotoxicité de ces composés en a fait une arme
chimique redoutable employée dans plusieurs conflits militaires et civils, ce qui a entraîné des
dommages très importants.
Aujourdřhui, de nombreux produits issus de ces insecticides sont commercialisés pour

le traitement des plantes, des animaux et même des êtres humains (contre les poux, les mites,
le paludisme). Leur toxicité n'est pas seulement limitée aux espèces cibles à éradiquer. En
effet, du à une utilisation massive, ces contaminants sont retrouvés dans l'environnement
aquatique notamment et peuvent donc être ingérés par l'homme.
L'empoisonnement provoqué par ces pesticides à fortes doses peut être mortel par
asphyxie due à l'atonie grandissante des muscles respiratoires. Certains OP prescrits dans la
lutte contre le varron chez les vaches et contre les oestres chez le mouton ont été suspectés
dřêtre responsables de la maladie de la vache folle ou de la tremblante du mouton. A faibles
concentrations d'exposition, l'empoisonnement chronique conduit à des atteintes
neurologiques en raison de leur toxicité élevée pour les enzymes cholinestérases
érythrocytaires (acétylcholinestérases ou cholinestérases vraies) et plasmatiques (pseudo
cholinestérases).
δřacétylcholinestérase (ACHE) est la principale cible physiologique de ces

neurotoxiques. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans le cerveau en permettant la
transmission de lřinflux nerveux au niveau central et périphérique. Son inhibition peut
entraîner la mort par arrêt cardio-respiratoire. Par conséquent, le développement de moyens
de protection et de détection contre ces neurotoxiques est important.
Les techniques utilisées actuellement pour la détection des inhibiteurs de l'ACHE,

telles que la chromatographie en phase gazeuse ou liquide et la spectrométrie de masse,
impliquent des procédés de prétraitement d'échantillons délicats et complexes. De plus, la
plupart d'entre elles sont spécifiques à chaque polluant et nécessitent habituellement de
longues périodes d'analyse. Diverses techniques de biodétection basées sur l'activité
enzymatique des cholinestérasiques associées à différents types de transduction
[14]
(électrochimie, fluorescence, sondes colorimétriques, etc.) ont également été conçues pour
fournir des méthodes plus rapides, simples et sélectives permettant la surveillance de la
toxicité dans les domaines alimentaire, environnemental ou militaire. Cependant, ces
techniques présentent plusieurs inconvénients, tels qu'une mauvaise sélectivité, une
complexité de préparation, et enfin, un manque de stabilité limitant leurs applications.
Ces dernières années, la Spectroscopie Raman Exaltée de Surface (SERS) a été

développée pour diverses applications telles que l'identification et la détection de nombreux
types d'analytes. δřeffet SERS correspond à la signature vibrationnelle Raman associée à
une amplification importante d'intensité, par l'association de l'analyte à des nano-surfaces ou
des nanoparticules métalliques (telles que l'or ou l'argent). Cette technique, en raison de sa
sensibilité, a été mise en œuvre dans de nombreux domaines de recherche tels que la science
des matériaux, la chimie analytique, la biologie ou même des disciplines plus éloignées
comme lřart. δa combinaison entre lřinhibition de lřACHE et la spectroscopie Raman SERS
peut donc être applicable à la conception dřun dispositif de type biocapteur, destiné à la
détection, sensible et spécifique de ces pesticides.
Ce manuscrit décrit le travail de thèse mené sur lřoptimisation dřun biocapteur simple,
rapide, sensible, non sélectif et à faible coût.
En préambule, une étude bibliographique exhaustive traite de lřutilisation des

pesticides, de leur toxicité et structure, de leur mécanisme dřinhibition de lřactivité
enzymatique de lřACHE. δe principe de la spectroscopie Raman, lřorigine de lřeffet SERS
ainsi que quelques techniques de fabrication des nanostructures sont ensuite présentés dans ce
mémoire. Nous aborderons, en deuxième partie, les protocoles expérimentaux pour le
développement du biocapteur enzymatique. Dans ce but, le processus dřélaboration de
substrat SERS actif est présenté pour lřapplication à la détection des pesticides ainsi que les
étapes pour la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE. Une brève description des
techniques de caractérisation utilisées a été exposée.
En troisième partie, nous avons caractérisé les nanoparticules dřor ayant servi de
substrat SERS actif puis nous avons vérifié leur effet SERS, par la détection directe de
pesticides (sans mesure de lřactivité de lřACHE). Après avoir constaté que les NPs seules
non modifiées nřont pas permis la détection de pesticides à très faible concentration, le
développement dřun biocapteur utilisant lřACHE est proposé. Pour cela, une optimisation de
différents paramètres (concentration dřenzyme et de son substrat, temps dřincubation) a été
réalisée avant de les appliquer pour la détection de pesticides. Le biocapteur développé à
[15]
partir de la mesure de lřactivité de lřACHE et les nanoparticules synthétisées a été validé avec
succès pour la détection de paraoxon (à titre dřexemple de composé organophosphorés) et du
carbaryl (au titre des carbamates). Au-delà de la simple détection, nous avons également
utilisé la chimiométrie pour leur identification. Après la validation du biocapteur (avec
lřACHE non immobilisée), nous lřavons utilisé pour la détection dřautres inhibiteurs
émergeants (par exemple micro-plastiques). Afin de se rapprocher dřune problématique de
transfert technologique nous avons également immobilisé lřenzyme sur une surface dřor pour
rendre possible sa réutilisation.
Nous avons aussi étudié la diffusion dynamique de la lumière (DLS) comme nouvelle
technique optique pour la détection qualitative des pesticides. La DLS nous a permis la
mesure du diamètre hydrodynamique des nanoparticules dřor en mesurant lřactivité
enzymatique de lřACHE.
[16]
Partie A
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
[17]
Partie A SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUES
I. Les pesticides
Les pesticides (du latin cida, tuer et de lřanglais pest, nuisible) sont des substances
chimiques minérales ou organiques de synthèse utilisées à vaste échelle pour lutter contre des
organismes nuisibles aux cultures, les animaux nuisibles et les agents vecteurs dřaffections
parasitaires ou microbiologiques de lřhomme et des animaux domestiques (figure 1) (OMS,
2016).
Figure 1 : Les cadres réglementaires distincts régissent la mise sur le marché des pesticides (la directive
91/414/CEE abrogée par le règlement (CE) n°1107/2009 pour les produits phytopharmaceutiques, la directive
98/8/CE abrogée par le règlement (UE) n°528/2012 pour les produits biocides et les directives 2004/27/CE et
2004/28/CE pour les produits antiparasitaires à usages humains et vétérinaires) (ORP, 2016).
En Europe (UE, 1991), avant la mise en œuvre de la Directive λ1/414/CE, 800

substances actives dřorigine végétale, minérale ou de synthèse pouvaient être utilisées en tant
que pesticides (Thiollet-Scholtus, 2014). La révision des substances actives a permis le retrait
progressif de nombreux produits et la plupart de celles utilisées aujourdřhui sont de nature
organique dont un petit nombre est extrait ou dérivé de plantes. En 2005, 489 substances
actives, appartenant à environ 150 familles chimiques différentes, sont encore disponibles et
se répartissent en fonction de leurs sensibilités selon les utilisateurs (EU law; Miquel). Ces
substances actives sont formulées et commercialisées sous forme de préparations ou produits
commerciaux : 6 000 substances environ sont homologuées, mais environ 2 500 sont
réellement distribuées.
[18]
Il faut également souligner lřexistence des « biocides », une large famille de

substances destinées à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en
prévenir lřaction ou à les combattre, par une action chimique ou biologique (Anses, 2016).
Ces substances présentent également les mêmes actions de destruction ou de contrôle dřun
organisme cible. Alors que les pesticides sont utilisés principalement dans l'agriculture pour
protéger les végétaux, les biocides quant à eux , sont réservés à des usages domestiques non
agricoles tels que lřentretien des espaces publics, des infrastructures de transport et des jardins
des particuliers (Encyclo-ecolo 2016; Anses 2013).
1. Bref historique
δřagriculture moderne est le secteur qui consomme le plus de pesticides (Carvalho et

al.). On trouve des traces dřutilisation du soufre en Grèce antique (1000 ans avant J.-C)
comme agent de fumigation. De la même manière, Pline l'Ancien, naturaliste romain du Ier
siècle, recommandait dans ses écrits l'usage de l'arsenic comme insecticide. Cependant, les
pesticides ont été employés de façon plus intensive, avant la guerre 39-45, mais surtout après,
avec le développement de la chimie organique. C'est à cette époque quřapparaît un grand
nombre de composés organiques (notamment la grande famille 10 des organophosphorés)
(Apfelbaum). Ensuite dans les années 50, des insecticides comme le
dichlorodiphényldichloroéthane (DDD) et le dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT) sont
utilisés en grandes quantités en agriculture (élimination du doryphore) et en médecine
préventive (pour détruire le moustique responsable de la malaria) (Alvarez et al.). D'autres
biocides sont mis au point pour l'industrie textile et du bois, pour les usages domestiques
(aérosols tue-mouches), pour l'entretien des routes et pour une utilisation en médecine. La
seconde moitié du XXème siècle a vu la généralisation de l'utilisation des pesticides au niveau
mondial, avec des variations locales quant aux quantités et aux types de pesticides utilisés (de
1945 à 1985, la consommation de pesticides a doublé tous les dix ans). Ils jouent donc un rôle
économique et social important notamment par le biais de la politique agricole commune qui
vise entre autre à accroître les rendements pour atteindre lřautosuffisance. Dans ce sens, les
pesticides jouent un rôle important dans l'accessibilité à un approvisionnement alimentaire
abondant pour lřensemble de la planète, puisqu'ils contribuent à protéger les cultures vivrières
et fourragères contre les organismes nuisibles (insectes, mauvaises herbes et maladies
fongiques) (Apfelbaum et al.). Par ailleurs, lřaugmentation des rendements des terres
[19]
agricoles a permis de limiter la déforestation, ainsi les experts estiment que leur utilisation, en
50 ans, a permis de préserver 50 % de la surface de la forêt actuelle (Schiffers et al.).
2. Classification des pesticides
Les pesticides peuvent être classés selon deux critères principaux : par famille
chimique ou par cible (WHO, 2009). Selon le classement par cibles, on distingue 4 grandes
familles de pesticides:
 Les insecticides : destinés à la lutte contre les insectes. Ils interviennent en les tuant ou
en empêchant leur reproduction. Ce sont souvent les pesticides les plus toxiques et
cřest dans cette famille que lřon trouve la plupart des polluants organiques persistants,
dont le DDT et le lindane. Les familles les plus rencontrées sont les organophosphorés
(malathion), les carbamates insecticides (carbaryl), les pyréthrinoïdes (deltaméthrine)
et les organochlorés (endosulfan).
 δes herbicides μ destinés à limiter lřinstallation dřespèces végétales qui entrent en
concurrence avec les plantes cultivées (sélectifs ou totaux). δeur mode dřépandage est
différent puisquřils sont déposés directement sur le sol, tandis que les autres pesticides
sont plutôt pulvérisés sur la plante en croissance. Les herbicides constituent
aujourdřhui la famille la plus importante en nombre de molécules et la plus utilisée.
 Les fongicides : destinés à éliminer les moisissures et parasites fongiques des plantes.
 Le quatrième groupe est celui des molluscicides et autres pesticides : les molluscicides
sont destinés à éliminer les escargots et les limaces. Les rotenticides agissent contre
les rongeurs. Les anticoagulants représentent 85% du marché. Quelques produits de
gazage sont encore utilisés. Les nématicides agissent sur les nématodes.
Le classement par structure chimique comprend :

 Les pesticides carbamates : fongicides et insecticides ;
 Les pesticides organochlorés : parmi les plus anciens et les plus persistants, surtout
utilisés comme insecticides en agriculture et dans les métiers du bois ;
 Les pesticides organophosphorés : insecticides ;
 Les urées substituées μ herbicides et fongicides, (nom avec le suffixe Ŗuronŗ) ν
 Les pesticides organoazotés : herbicides principalement, repérables par le suffixe
Ŗzineŗ ν
 Les pesticides sulfonylurées : herbicides.
[20]
3. Utilisation des pesticides
Lřutilisation des pesticides dans le monde entier ne cesse de croître et

particulièrement dans le secteur agricole qui en consomme de plus en plus ; la prise de
conscience des risques quřils présentent pour la santé et lřenvironnement sřen trouve tout
autant développée. Le marché mondial des pesticides représentait environ 40 milliards de
dollars en β00λ dřaprès lřUnion des Industries de la Protection des Plantes (UIPP, β00λ), la
part de lřAfrique est estimée à 4% (soit 1,η milliard de dollars) du marché mondial. 30% des
pesticides vendus dans les pays en développement ne se conforment pas aux normes
mondiales, selon lřOrganisation mondiale de la santé (OεS). δřEurope et les États Unis sont
respectivement le premier et deuxième consommateur mondial (Figure 2). La France,
premier producteur agricole en Europe et deuxième consommateur de pesticides derrière
lřEspagne, montre pourtant des rendements, qui ne progressent plus μ céréales, oléagineux,
poires, pommes ou betteraves sont moins productifs quřen β009 (Anses, 2016).
Figure 2: Parts de marché des pesticides en 2009 au niveau mondial (UIPP, 2009).
 Les pesticides au Maroc en particulier:

δa grande majorité des pesticides fournis au εaroc vient de lřétranger. En β00η, le
Maroc a importé 12.000 tonnes de produits phytosanitaires, principalement des insecticides
(39% du total), suivis des fongicides (35%), des herbicides et nématicides (11% chacun) puis
des acaricides et divers (7%) (ONSSA,2016).
[21]
4. Exposition aux pesticides
δes personnes travaillant dans lřagriculture sont potentiellement les plus exposées aux
pesticides. Autant de dangers qui pèsent potentiellement sur ceux qui habitent dans ces zones
exposées. L'exposition de la population générale aux pesticides se caractérise par des
expositions inégales et à diverses doses répétées dans le temps liées au contact avec des
milieux contaminés (sol, air extérieur et intérieur, poussières, surfaces, etc.). En effet ces
substances peuvent pénétrer dans l'organisme par contact cutané, par ingestion et par
inhalation (Augustijn-Beckers et al.; Schiavon et al.; Apfelbaum et al.).
δes pesticides sont aujourdřhui considérés comme une source importante de pollution
(Mostafalou et al.). Ils sont connus pour leur impact dans tous les secteurs de
lřenvironnement μ pollution des sols, de lřair, de lřeau et responsables dřémissions de gaz à
effet de serre (figure 3) (εinistére de lřenvironnement de lřenergie et de la mer. β014).
Effectivement, les pesticides sont présents dans tous les compartiments de lřenvironnement et
par conséquent dans notre alimentation.
Figure 3 : Devenir et transformation des pesticides dans l’environnement (Fredon).
[22]
 Les milieux aquatiques :

Des recherches sur la contamination des eaux de surfaces et les eaux souterraines, en
France, sont réalisées pour contrôler les niveaux de contamination par les pesticides. Le
Service de lřObservation et des statistiques du εinistère chargé de lřécologie évaluait que 90
% des points de mesures de la qualité des eaux superficielles en 2006 mettaient en évidence la
détection dřau moins un pesticide, et γ7 % des points exploitables montraient une qualité
moyenne à mauvaise vis-à-vis du paramètre pesticides avec la détection de 235 substances
actives. Dans les eaux souterraines, on a retrouvé au moins un pesticide dans 47 % des points
de mesures, et 25 % des points exploitables montraient une qualité moyenne, à mauvaise, vis-
à-vis du paramètre pesticide, avec la détection de 116 substances actives (SOes) :
[23]
δes milieux marins et littoraux ne bénéficient dřaucune obligation réglementaire de

contrôle et donc sont probablement aujourdřhui lřun des compartiments de lřenvironnement
les moins bien renseignés (Le bris et al.; Paulsson et al.).
Maroc :
La qualité des eaux au Maroc est gravement menacée. Les eaux superficielles
constituent lřévacuateur des déchets de tous genres. Ces rejets sřamplifient et menacent le
milieu aquatique. δes eaux souterraines ne sont pas à lřabri de cette pollution due
essentiellement à lřutilisation abusive des fertilisants et des pesticides en agriculture dont une
partie est lessivée par les eaux de ruissellement (Miras et al.; Debbarh et al.; Eddaya et al.).
δa surveillance des contaminants dans les eaux au εaroc nřest pas bien renseignée. Jusquřà
présent il nřexiste pas de données sur des contrôles de la qualité des eaux.
[24]
 L’air
En β00β, les associations agréées pour la surveillance de la qualité de lřair en France,
ont réalisé des mesures sur la présence de pesticides dans lřair. Près de 100 000 mesures ont
été réalisées depuis. Environ 12 % de ces mesures ont permis de détecter un pesticide. 114
substances actives différentes ont été ainsi retrouvées dans lřatmosphère. δes résultats
montrent une saisonnalité de la présence de pesticides dans lřair. δes concentrations
observées, et notamment les plus élevées, sont largement corrélées avec les périodes
dřutilisation agricole des pesticides (printemps et en automne). δřexposition par la voie
aérienne des populations intervient principalement dans les milieux fermés. Les traitements
des matériaux, lřutilisation de produits insecticides ou antiparasitaires et lřusage domestique
constituent autant de sources dřexposition. Selon lřORP, la contamination des environnements
intérieurs, peut-être quelques fois plus élevée que le milieu extérieur.
 Les sols
Peu dřétudes sont disponibles sur la présence des pesticides dans les sols. Toutefois une
étude pilote conduite par lřINRA, en France, a permis de réaliser des mesures sur des
échantillons de sols collectés par le Réseau de mesures de la qualité des sols (RMQS). Les
premiers résultats ont permis de relever que pratiquement 100 % des 200 échantillons
analysés contenaient du lindane (insecticide organochloré).
 Les denrées alimentaires et l’eau distribuée

En France, pour garantir la sécurité des consommateurs, la législation impose le
respect des critères de qualité des eaux distribuées et des limites maximales de résidus dans
les denrées. Les données produites dans le cadre des plans de surveillance et de contrôle sont
nombreuses. εais cette exigence nřest pas forcement appliquée pour les denrées
alimentaires. Une analyse, effectuée par la DGCCRF en 2006 sur 4 749 échantillons de fruits
et légumes frais ou transformés, de céréales et de produits végétaux issus de lřagriculture
biologique analysés, a montré un taux de non-conformité de 6,0 %.
Un rapport de lřAssociation WEDFOCUS sur les pesticides au εaroc a affirmé que

ces derniers sont très mal utilisés dans la majorité des cas, fréquemment sans respect des
doses et des rythmes dřapplications (plusieurs au cours du même cycle de culture). Les délais
[25]
avant récolte ne sont pas davantage respectés, ce qui induit une pollution accrue des
différentes composantes de lřenvironnement (nappe phréatique, sol, air, etc.) et laisse surtout
des quantités énormes de résidus de pesticides dans les fruits et légumes, dřoù des risques
graves pour la santé des consommateurs (INRA,2016).
5. Effets sur la santé
Les effets de l'exposition peuvent aller d'une légère irritation cutanée jusqu'à des
pathologies beaucoup plus graves :
 dérèglement du système hormonal : diabète de type 2, obésité, cancers

hormonodépendants (sein, prostate, thyroïde) (Multigner et al.; Namer et al.) ,
 troubles neurologiques (Baldi et al.; Parrón et al.; Hayden et al.; Blanc-Lapierre et
al.) avec des conséquences sur les capacités cognitives et des troubles
comportementaux (troubles de lřattention, hyperactivité, etc.), lřautisme ou les
atteintes au développement du cerveau,
 les maladies congénitales, des tumeurs, des modifications génétiques, des troubles
sanguins, pouvant aller jusquřà la mort.
-Unique exposition aiguë à très haute

dose : Suicides et empoisonnements aiguës
formulateurs, mélangeurs, applicateurs et
cueilleurs
-Chronique, exposition à très

haute dose: Fabricants de
pesticides, formulateurs, mélangeurs, ap
plicateurs et cueilleurs
-Chronique, exposition
à faible dose: Population
générale
Figure 4 : Groupes de populations liés au risque de l’exposition des pesticides (WHO, Public Health Impact of
Pesticides Used in Agriculture).
De manière générale, nombre de pesticides sont classés CMR ŕ cancérogènes,

mutagènes (toxique pour lřADN) ou reprotoxiques (nocifs pour la fertilité). δa maladie de
[26]
Parkinson, enfin, a été reconnue en 2012 maladie professionnelle en lien avec les pesticides
(Rugbjerg et al.).
Une faible quantité de pesticides peut modifier les fonctions et le développement du
système nerveux, chez le fœtus, lřenfant et lřadulte (Andersen et al.; Greenlee et al.; Rauh et
al.). Dřautres études montrent que les effets neuro-cognitifs des pesticides organophosphorés
sur les populations exposées professionnellement se manifeste par des troubles de la mémoire,
anxiété, irritabilité et dépression (J.M. Saïssy et al.).
La figure 4 représente une description, selon lřOrganisation εondiale de la santé

(OMS), des catégories exposées aux pesticides et le risque lié à chaque cas. La surface de
chaque partie du cercle indique approximativement la taille du groupe exposé et le degré des
dangers. En France, la Mutualité Sociale Agricole (MSA), qui a en charge la médecine du
travail et la prévention des risques professionnels des salariés agricoles, a relevé des effets
indésirables chez β0 % des manipulateurs lors dřenquêtes portant sur une année dřutilisation
professionnelle de pesticides (Direction génerale du travail).
Le 20 mars 2015 le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) relevant

de lřOrganisation εondiale de la Santé (OεS), a publié les conclusions dřun groupe de
travail sur lřévaluation de la cancérogénicité de cinq matières actives pesticides (glyphosate,
malathion, diazinon, tetrachlorvinphos et le parathion). Malgré cela le glyphosate est encore
autorisé en France et le malathion lřest au εaroc (Source ONSSA 2012- Office national de
Sécurité Sanitaire des produits Alimentaires et WHO 2015).
Selon un rapport de lřOεS, le nombre annuel dřintoxications par pesticides est estimé
entre 1 et η millions, dont plusieurs milliers de cas mortels. Au εaroc, bien que peu dřétudes
aient mis lřaccent sur la place des pesticides dans la pathologie toxique, certaines dřentre elles
ont montré quřils constituent une cause dřintoxication loin dřêtre négligeable.
Selon une étude rétrospective réalisée sur une série de η00 malades admis à lřhôpital
pour enfants de Rabat, les pesticides étaient responsables de 38 % des cas dřintoxication
aiguës. Une autre étude a montré quřils étaient impliqués dans β8,η % des intoxications
traitées aux urgences de lřhôpital Ibn Rochd de Casablanca (Rhalem et al.). En effet, la non
[27]
vigilance requise pour lřutilisation et la commercialisation des pesticides fait du εaroc lřun
des pays où les intoxications aiguës par pesticide (IAP) occupent la 4ème position après
celles provoquées par les médicaments, les produits industriels et les aliments. Cependant ,
elles restent faibles par rapport à dřautres pays, tels que la Chine et le Sri δanka où
lřintoxication aux pesticides est un problème particulier (Figure η ) (FAO 2016; Kabbaj et
al.).
Figure 5 : Classe chimique de pesticides impliqués dans les intoxications, unité d’information toxicologique,
Centre Antipoison du Maroc, 1992–2007 (Rhalem et al.).
6. Limites réglementaires
En 1991, la première Directive européenne (91/414) concernant la mise sur le marché

des pesticides agricoles a été publiée et mise en application en 1993. Le cadre relatif à
lřhomologation des pesticides a été complété par des dispositions législatives et
réglementaires. La Convention de Rotterdam est une convention internationale engagée par le
Programme des Nations unies pour l'environnement (PNUE). Cette convention, parfois
appelée Convention Pic (pour prior informed consent) ouverte aux signatures le 10 septembre
1λλ8, offre la possibilité pour un pays de décider du choix des produits afin dřassurer la
sécurité dans le domaine sanitaire (rejet des produits considérés trop dangereux). Elle
[28]
encourage le partage des responsabilités et la coopération entre les pays signataires dans le
domaine du commerce international de certains produits chimiques très dangereux dont
notamment certains pesticides et certains produits chimiques industriels.
Les « douze vilains » (en anglais : Dirty Dozen) représentent une catégorie de
polluants organiques persistants (POP) qui sřinscrivent parmi les contaminants organiques les
plus répandus et les plus nocifs pour lřenvironnement. « The dirty dozen », est en fait
composé de 17 produits qui sont, pour la plupart, des pesticides et des insecticides : 2,4,5-T
(un composant de l'agent orange), aldicarbe, aldrine, chlordane, chlordimeform, DBCP, DDT,
dieldrine, DBE, heptachlore, HCH, lindane ( -HCH), parathion méthyl (méthylparathion),
dichlorure de paraquat, parathion éthyl (parathion), PCP, toxaphène. La convention de
Rotterdam demande aux états signataires de les interdire. La Convention de Stockholm
complète la dirty dozen avec les produits suivants: binapacryl, toxaphène, oxyde d'éthylène,
dichlorure d'éthylène, parathion éthyl, parathion méthyl et monocrotophos. Dans les pays du
sud comme lřAfrique, des textes législatifs et réglementaires ont été élaborés au niveau
régional concernant la gestion, lřutilisation, lřagrément et le contrôle des pesticides, en
conformité avec les exigences et recommandations de lřOεS et de la FAO. Différentes
actions ont été menées par certains pays en vue de contrôler l'importation et l'utilisation de
pesticides contenant des matières actives dangereuses.
La directive n° 91/414/CEE du Conseil de l'Union européenne a fixé les limites

maximales de résidus (LMR). Elles correspondent aux niveaux supérieurs de concentration
de résidus de pesticides autorisés légalement sur les denrées alimentaires et les aliments
destinés aux animaux. Elles sont fondées sur les bonnes pratiques agricoles et visent à garantir
le niveau dřexposition le plus faible possible pour les consommateurs. Pour les ressources en
eau en France, la limite maximale de résidus dans lřeau est éditée par le code de la santé
publique sur la base des directives européennes 98/83/CE et 75/440/CEE retranscrites en
droit français le 11 janvier 2007 au journal officiel dans les articles R.1321-1 à R1321-66 (EU
Law; MEEM).
Pour les pesticides, les limites de qualité (LQ) sont fixées :
 pour chaque pesticide : à 2µg/L dans les eaux brutes et à 0.1µg/L dans les eaux du
robinet (sauf pour lřaldrine, dieldrine, heptabhlore et heptachloroépoxyde la δεR est
de 0.03µg/L)
[29]
 pour le total des substances mesurées: à 5µg/L dans les eaux brutes et à 0.5µg/L pour
les totaux des substances mesurées dans lřeau du robinet (ORP, ŖObservatoire Des
Résidus de Pesticidesŗ).
7. Les pesticides organophosphorés et les carbamates
Les carbamates et les organophosphorés (insecticides) représentent les deux classes

majeures de pesticides utilisés comme : herbicides, insecticides et fongicides (Fukuto et al.).
Ils sont généralement utilisés pour contrôler les insectes dans les récoltes, notamment celles
des pommes de terre, du maïs, du blé et du riz. Ces deux familles de pesticides agissent sur
lřenzyme et entraînent la phosphorylation des estérases incluant les cholinestérases
érythrocytaires (acétylcholinestérases ou cholinestérases vraies) et les cholinestérases
plasmiques (pseudocholinestérases) (Lauwerys etb al.; Thabet et al.). Ils opèrent en bloquant
lřactivité enzymatique de lřacétylcholinestérase, essentielle aux transferts nerveux chez les
insectes, les humains, ainsi que chez la plupart des animaux. δa capacité à bloquer lřactivité
enzymatique de lřacétylcholinestérase (et donc la toxicité) peut varier de façon importante
dřun composé à lřautre.
Le tétraéthyl-pyrophosphate, premier insecticide organophosphoré (OP) synthétisé en

Allemagne dans les années 1λγ0, sřest rapidement avéré trop toxique pour les mammifères et
trop instable pour une utilisation phytosanitaire à grande échelle. Parallèlement, des
recherches conduites pour développer les OPs comme arme chimique aboutissent à la mise au
point du tabun et du sarin. Cřest en 1λ44 quřapparaît le parathion, premier composé largement
employé en agriculture pour la prévention des vecteurs de maladies. Les maladies à
transmission vectorielle, sont des maladies pour lesquelles l'agent pathogène (virus, bactérie
ou parasite) est transmis d'un individu infecté (un hôte vertébré : homme ou animal) à un autre
par l'intermédiaire d'un arthropode (insecte, tique) hématophage (Turdean et al.).
Les insecticides organophosphorés (OPs) se sont développés comme une alternative

intéressante aux pesticides organochlorés persistants, au début des années 1970, dont la
production mondiale a décuplé entre 1955 et 1985. Ils constituent une grande classe de
substances chimiques organiques avec plus de η0 000 congénères. Aujourdřhui, environ β00
OPs sont vendus sur le marché sous forme de milliers de produits différents (Tableau 1).
[30]
Tableau 1 : exemple des produits phytosanitaires à base d’organophosphorés et leur utilisation (SAgE
pesticides).
Nom du Substance Toxicité Ecotoxicité Usage

produit active
DIAZINON 50 diazinon -Nocif si avalé, hautement toxique Insecticide utilisé pour la lutte contre
W inhalé ou absorbé pour les oiseaux, les plusieurs insectes et acariens dans
par la peau. poissons et les autres diverses grandes cultures, fruitières,
-Cause une animaux sauvages. légumières et ornementales.
irritation
modérée des
yeux.
- inhibiteur de la
cholinestérase
-Malathion 50 Malathion -insecticide hautement toxique largement utilisé, dans les
EC inhibiteur de la pour les poissons et programmes d'éradication de
- Fyfanon cholinestérase les insectes non moustiques en santé publique, dans
Insecticide -très toxique par ciblés l'agriculture et lřhorticulture pour
50% EC exposition à long contrôler les insectes sur les fruits et
- Malathion terme légumes et sur les plantes
(Dust, EC, WP ornementales.
ULV
Formulas)
- Orthene 75% Acéphate - inhibiteur de la toxique pour les -Utilisé pour les arbres et Arbustes
- Acecap 97 cholinestérase poissons, les oiseaux ornementaux pour contrôler les
-très toxique par et hautement toxique Arpenteuses, cercope, chenille,
exposition à long pour les insectes non cicadelle, enrouleuse à bandes
terme ciblés obliques, lymantride, mineuse du pin,
mouche à scie, percerameau du pin,
puceron, pyrale des cônes de
l'épinette, spongieuse, tordeuse.
-Chlorpyrifos Chlorpyrifos- - inhibiteur de la Toxique pour -principalement utilisé pour le
48% EC éthyl cholinestérase lřenvironnement contrôle des coléoptères, diptères,
- Pyrinex ME lépidoptères Homoptera du riz, du
-Makhteshim coton, des arbres fruitiers, les plantes
Agan ornementales en serre et en plein air,
les arbres à thé, les gazons et tous les
légumes à l'exception des
cucurbitacées. également utilisé pour
le contrôle des parasites domestiques,
moustiques adultes et larves.
PRIODERM Malathion -Irritation, Produit très toxique Médicament utilisé pour détruire les
rougeur en cas de pour les insectes poux et leurs œufs (lentes)
contact avec les utiles (les
muqueuses. coccinelles,
-nausées, chrysopes,
vomissements, aphidoletes...)
maux de tête.
Les insecticides carbamates se sont développés vers la fin des années 1940 et
présentent les mêmes caractéristiques que les organophosphorés. On trouve aujourd'hui une
cinquantaine de molécules actives qui font des carbamates des insecticides en constante
progression (Tableau 2).
[31]
Tableau 2: exemples des produits phytosanitaires à base de carbamates et leur utilisation (SAgE pesticides).
Nom du Substance Toxicité Ecotoxicité Usage

produit active
-Sevin Carbaryl -Nocif si hautement carbamate insecticide systémiques à large
T&O avalé, inhalé toxique pour les spectre, inhibiteur de la cholinestérase agissant
-Chipco ou absorbé par poissons et pour par contact et par ingestion, permet de
Sevin la peau. les insectes contrôler une grande variété d'insectes. Il est
T&O - irritation des utiles. approprié pour une utilisation dans les jardins
yeux. potagers, l'agriculture commerciale et la
-Carbaryl - inhibiteur de sylviculture. Efficace comme molluscicide et
85 WP la acaricide, Carbaryl 85 WP peut également être
-carbacha cholinestérase utilisé pour traiter les infestations de ravageurs,
-SuperTox comme celle due à des espèces de poux sur le
bétail, la volaille et les animaux de compagnie.
- Témik Aldicarbe - Mortel en cas Très toxique pour Les seules utilisations
d'ingestion les organismes agricoles du produit encore autorisées
- Toxique par aquatiques, concernent uniquement la vigne et la betterave
contact cutané entraîne des
- Mortel par effets néfastes à
inhalation long terme
- Curater Carbofuran -inhibiteur de Dangereux pour - carbamate utilisé en agriculture pour lutter
G1 (non la la faune sauvage. contre une grande variété d'insectes
- Furadan autorisée cholinestérase défoliateurs et fouisseurs qui s'attaquent à de
en France) -très toxique nombreuses cultures fruitières et maraîchères.
par exposition
à long terme
7.1. Mécanismes d’inhibition
Près de 85% des insecticides sont neurotoxiques. En effet, le système nerveux central
des insectes est lřune de leurs cibles primordiales (Nauen et al.).
Figure 6 : Cibles des insecticides neurotoxiques (Modifié d’après, Phillips McDougall, 2006, www.fao.org).
AChE : Acétylcholinestérase, nAChR : récepteur cholinergique de type nicotinique, GABAR : récepteur à l’acide
gamma aminobutiryque(Aly) .
[32]
δes insecticides agissent sur les canaux ioniques dépendants du potentiel dřaction (le
canal sodium), touchant ainsi la genèse de lřactivité nerveuse, sur les systèmes enzymatiques
synaptiques et extra-synaptiques (Acétylcholinestérase) et sur les récepteurs ionotropes
(Récepteur de lřacétylcholine de type nicotinique μ nAChR, récepteur à lřacide gamma
aminobutiryque : GABARs), altérant la transmission synaptique, relais nécessaire de
lřinformation nerveuse (Figure θ).
7.2. Organophosphorés
Les insecticides organophosphorés sont des composés organiques se caractérisant par

une structure chimique proche (contenant du phosphore) μ amides ou des esters dřacides
phosphoriques, phosphonique, thiophos-phorique et thiophosphonique (dérivés de lřacide
phosphorique) et un mode dřaction identique. Ces composés organophosphorés existent sous
forme dřinsecticides (parathion, glyphosate, malathion, formation, phosalone…) ou sous
forme de neurotoxiques de guerre (figure 7). Ils sont peu solubles dans l'eau, peu volatils,
mais très liposolubles (Saïssy et al.).
S O
║ ║
X- P - O - R1 X- P - O - R1
│ │
R2 R2
Insecticides neurotoxiques de guerre
Figure 7 : Structure chimique des insecticides et des neurotoxiques de guerre. X : déterminant majeur des
classes qui est soumis à l’hydrolyse ; R1 et R2 : groupement diméthoxy, diéthoxy, autre dialkoxy, diamino,
chloré ou autre dialkoxy substitué, trithioalkyl, triphényln éventuellement substitué, constituant mixte.
δe substituant X est celui qui sera soumis à lřhydrolyse ν selon sa valeur, les OPs sont
classés en quatre groupes de toxicité décroissante (Tableau 3).
Tableau 3: Classification des insecticides organophosphorés en fonction de leur toxicité (Saïssy et al.; Thabet et
al.).
Groupement de X Toxicité Domaine d’utilisation

Ammonium quaternaire aiguë Non utilisés en agriculture
F aiguë Gaz de combat (tabun). peuvent être aussi utilisés en
agriculture : (comme le diméthoate et le fenthion, le
dichlorvos)
CN, OCN, SCN ou un Intermédiaire Certains sont utilisés comme gaz de combat (exemple :
halogéne autre que F sarin)
Autre substituant Modérée Regroupent la plupart des produits utilisés en agriculture
[33]
 Mode d’action toxique:

Les OPs, très lipophiles, franchissent facilement toutes les barrières biologiques,
cutanées, digestives et respiratoires. Ensuite, ils créent une lésion biochimique aux
cholinestérases que ce soit les acétylcholinestérases du système nerveux central, des muscles
et des globules rouges ou les pseudocholinestérases du système nerveux central et
plasmatiques. Ce sont des inhibiteurs irréversibles de lřACHE, lřenzyme nřest alors plus
fonctionnelle et nřest pas ré-activable (Thabet et al.).
Tableau 4 : Effets de l’intoxication par les OPs sur l’ACHE (Testud et al.).
Système Récepteurs Organe ou Action Effet clinique

tissu
Parasympathique Muscariniques -Œil -Contraction de lřiris et du -Vision trouble, myosis
muscle ciliaire
-Glandes -Sécrétion -Larmoiement,
lacrymales, salivation, hypersudation
salivaires et
sudoripares -Sécrétion -Rhinite, bronchorrhée,
-Cellules à œdème pulmonaire,
mucus des vomissements, diarrhée
voies
respiratoires et
du tube digestif
Sympathique Muscariniques -Bronches et -Contraction du muscle -Bronchospasme,
tube digestif lisse nausées, crampes et
douleurs abdominales
-Anus et vessie -Relaxation du muscle -Incontinence fécale et
Cœur lisse sphinctérien urinaire
Dépression du nœud Bradycardie, arythmies,
sinusal et augmentation de bloc auriculoventriculaire
la période réfractaire au
niveau du nœud
auriculoventriculaire
Jonction Nicotiniques -Muscles -Contraction -Fasciculations, crampes,
neuromusculaire squelettiques paralysies du diaphragme
et des muscles
respiratoires
-Cœur -Excitation -Tachycardie,
hypertension
-Œil -Relaxation de lřiris -Mydriase
Système nerveux Nicotiniques -Cerveau -Excitation initialement, -Céphalées, malaise,
central puis dépression confusion mentale,
ataxie, tremblements,
coma, convulsions,
dépression des
δřenzyme acétylcholinestérase permet la transmission de lřinflux nerveux à travers

lřorganisme par lřhydrolyse de lřacétylcholine, le neurotransmetteur excitateur le plus
[34]
répondu chez les insectes, les humains, ainsi que chez la plupart des animaux (Dvir et al.).
δřinhibition de lřactivité de cette enzyme par des neurotoxiques entraîne une accumulation du
neurotransmetteur dans lřorganisme. Cette accumulation est responsable des effets
nicotiniques et muscariniques (Tableau 4) et peut conduire jusquřà la tétanie musculaire et à
la mort (Baldi et al.).
7.3. Carbamates
δes carbamates inhibiteurs de lřACHE sont des insecticides qui regroupent les dérivés
de lřacide carbonique. Cependant il ne faut pas les confondre avec les herbicides carbamates
qui ne sont pas des inhibiteurs de lřACHE (Ŗδes Insecticides Chimiquesŗ). Les carbamates
sont des dérivés du N-methylcarbamate. Leur formule chimique est la suivante :
Figure 8 : Formule chimique de carbamates
La toxicité des insecticides carbamates comme celle causée par les OPs, est due à leur
capacité de bloquer lřactivité enzymatique de lřACHE. Par contre dans le cas des carbamates,
cette inhibition est réversible (Eckert et al.). En effet, après phosphorylation par un carbamate,
lřACHE est capable de se réactiver spontanément plus ou moins rapidement selon la
molécule. Parmi les carbamates les plus utilisées, on trouve le carbofuran et le carbaryl. Du
fait de sa toxicité, le carbufuran est interdit en France depuis 2008 (Testud et al.).
Les carbamates ne se transforment pas très vite dans la nature. Ils sont plus stables et
ont une durée dřaction moins courte comparée à celle des organophosphorés. Le tableau 5
représente une comparaison entre ces deux types dřinhibiteurs de lřacétylcholinestérase.
Tableau 5 : comparaison entre la toxicité des carbamates et celle des organophosphorés
Organophosphorés Carbamates
Dérivation Dérivation très vite Moins dérivable
Toxicité Aiguë Modérée
Durée d’action Très longue Courte
Inhibition de l’ACHE Irréversible Réversible
[35]
 Autre inhibiteurs de l’ACHE : Les pyrèthroïdes utilisés comme insecticide dans les
produits domestiques sont des inhibiteurs potentiels de l'activité enzymatique de la
cholinestérase. Il y a aussi les triazines et le paraquat (herbicides puissants agissant sur
les processus de respiration et de photosynthèse des végétaux), certaines toxines
algales et les métaux lourds (comme pour toutes les enzymes, la conformation de la
molécule d'ACHE est modifiée par la présence de métaux) (Encyclo-ecolo,
ŖPesticidesŗν Testud et al.).
Conclusion
Plusieurs pesticides sont utilisés aujourd'hui dans des domaines différents. Ceux-ci
sont transportés loin de la zone dřépandage grâce à lřair et au ruissellement des eaux et
contaminent ainsi les eaux souterraines, les rivières et le sol. Ces pesticides ne sont donc pas
seulement toxiques pour les organismes cibles mais aussi pour lřenvironnement, incluant les
humains. Dans de nombreux cas, la toxicité n'est pas aiguë, mais lřexposition répétée à
faibles doses, peut exercer un effet toxique sur de nombreuses années. La contamination des
eaux est devenue un problème mondial, notamment à cause de la persistance dans
l'environnement de ces pesticides qui peuvent s'accumuler dans la chaîne alimentaire.
Un manque de données pour la surveillance des pesticides ne nous permet pas

actuellement de mesurer l'ampleur du problème de la contamination, en particulier dans les
pays émergents. Par voie de conséquence la prévention et des mesures correctives ne
peuvent pas être prises pour réduire le risque pour l'environnement et les humains en
particulier. Il en résulte un intérêt immédiat dřêtre en mesure de développer un outil
susceptible dřapporter des informations sur la contamination de milieu aquatique par une
grande variété de pesticides, organophosphorés et carbamates.
[36]
II. Détection des organophosphorés et carbamates
En raison de leur toxicité et de leur accumulation dans lřenvironnement, il est

important de pouvoir détecter et quantifier rapidement ces molécules dans les milieux
naturels. Pour cela, différentes techniques analytiques classiques sont employées, comme la
chromatographie en phase liquide ou gaz (GC, GL), la spectrométrie de masse (MS), la
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) ou le coulage entre plusieurs
de ces techniques pour la détection des pesticides et de leurs résidus dans l'environnement.
Cependant, lřutilisation de ces techniques de détection nřest pas toujours facile en raison de
leur coût élevé, de durée d'analyse parfois longues, et de l'exigence de main-d'œuvre qualifiée
(Selim et al.; Su et al.; Dijkman et al.).
δe développement de biocapteurs, dřimmunocapteurs, de senseurs chimiques ou de

capteurs électrochimiques est une alternative souvent plus simple et moins coûteuse aux
techniques de détection précédemment citées (figure 9).
méthodes utilisant la détection par les nanomateriaux

Techniques de (Florescences, SERS, SPR)
détection en
dévelopement Techniques de détection par des polymères à
empreintes moléculaires
Techniques de Techniques de Techniques de détection électrochimiques

détections des détection
pesticides alternatives Biocapteurs
Spectroscopie RMN
techniques de
détection GC/MS
analytiques
HPLC/MS
Figure 9. Techniques de détection des pesticides.
Le développement de capteurs très sensibles, rentables, miniatures nécessite une

technologie de pointe couplée avec des connaissances fondamentales en chimie, biologie et
sciences des matériaux (Yan et al.; Simonian et al.; Anandhakumar et al.; Q. Li et al.; S. Liu
[37]
et al.). Un système de détection durable et efficace repose en grande partie sur les
caractéristiques suivantes :
 une gamme de détection adaptée vis-à-vis du type d'échantillon, la sensibilité, la
température, le pH, et la spécificité
 un temps de réponse rapide,
 une utilisation simple sur le terrain,
 une analyse qualitative et quantitative,
 un rapport coût-qualité concurrentiel
 l'acquisition de modes supplémentaires pour la transduction du signal.
Une comparaison entre les différentes techniques dřanalyses les plus utilisées est
représentée au tableau 6.
Tableau 6 : Comparaison entre les différentes techniques de détection de pesticides (Kumaret al.).
Type de la Techniques de biocapteurs Capteurs Capteurs à Capteurs

technique chromatographie optiques base de électrochimiques
/spectroscopie polymère à
empreinte.
Manipulation difficile intermédiaire facile facile facile
Coup +++ ++ + ++ +
d’analyse
sensibilité excellente excellente excellente excellente excellente
sélectivité excellente excellente excellente excellente excellente
précision excellente bonne bonne bonne excellente
reproductibilité Grande Bonne Bonne Très bonne Très bonne
application Très répandue Pas Très Pas Très Répandue répandue
répandue répandue
1. Détection directe
Pour la détection des organophosphorés et carbamates, il existe de nombreuses

techniques directes sans passer par les mesures de lřactivité enzymatique. On peut citer des
techniques dřanalyse comme la chromatographie en phase liquide et gazeuse (GC, δC), et des
techniques de détection avec couplage chromatographique, la spectrométrie de masse
technique directe la plus utilisée (environ 9000 publications concernant les pesticides en 35
ans) et ensuite la chromatographie sur couche mince (1844 publications ) (tableau 7) (Cotton
et al.).
[38]
Tableau 7 : Exemples d’analyses effectuées pour la détection des pesticides avec des systèmes de détection
complexe (nécessitant un couplage ou plus) avec leur limite de sensibilité.
Système analytique employé Matrice La molécule cible Sensibilité Réf.
analysée (ng/L)
HPLC-MS/MS Huile 256 pesticides 1000- (Stachniuk et al.)

essentielle 10000
de lavandin
UPLC-MS/MS Eau de 50 produits 1-100 (Angela et al.)
surface et dřhygiène
de STEP personnelle et
composées
pharmaceutiques
GC-MS/MS ET HPLC-MS/MS Urine Pesticides polaires et 10-3000 (Ye et al.)
(Milieu non polaires
agricole)
UHPLC-MS Eau STEP 84 pesticides et 10-100 (Gerónimoa et al.)
produits
pharmaceutiques
UHPLC-MS Eau brute et 72 pesticides et 30-300 (Primel et al.)
traitée médicaments
El-Saeid et Selim (Selim et al.) ont déterminé les paramètres de base tels que le temps
de rétention, la limite de quantification et le mode de balayage pour détecter différents types
de pesticides par GC-MS. Le temps de rétention varie de 7minutes pour le dichlorvos à 58
minutes pour la deltaméthrine et environ 85% de l'analyse a pris plus de 20 minutes pour
détecter les 86 pesticides qui ont été quantifiés. La limite de quantification était comprise
entre 0,01 mg / kg et 0,10 mg / kg, alors que dans 92% des cas, elle était inférieure à 0,05 mg
/ kg (Selim et al.). Ainsi ces techniques chromatographiques couplées à la spectrométrie de
masse sont incapables de détecter lřensemble des organophosphorés et carbamate : par
exemple le «fenchlorphos » pour les OPs et « chlorpropham » pour carbamate) (Alder et al.).
La spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) a montré un bon potentiel

dřapplication dans la détection de diverses molécules chimiques et biologiques. Depuis
plusieurs années, différents types de substrats SERS actifs sont développés, la plupart sont
utilisés pour la détection de molécules spécifiques (selon leur natures chimiques) ou quelques
types de pesticides seulement (Dulkeith et al.; Saha et al.). Le tableau 8 illustre des exemples
de surfaces SERS actifs utilisées pour la détection des pesticides.
[39]
Tableau 8 : Exemples de surfaces SERS actives utilisées pour la détection des pesticides avec leur limite de
sensibilité.
Pesticides Substrat SERS actif Limite de détection Réf
Carbaryl nanofils de Si recouvert de Inférieure à 10−7 M (X. T. Wang et

nanoparticules dřargent (0.02 ppm) al.)
Carbaryl Klarite recouvert dřor 0.5 mg g-1 dans les (Fan et al.)
pommes
Carbaryl Nanoparticules dřargent sur 5.0 × 10−7 M (Qu et al.)
cotons-tiges
Paraoxon et thiram Nanocubes dřargent Inferieru à 5 x 10-8 (Wang et al.)
mol/L
Organophosphorés: Polystyrène/Ag 96 nM (0.026 ppm) et (P. Li et al.)
paraoxon et sumithion nanoparticules 34 nM (0.011 ppm).
La morphologie de la surface SERS active et le type des molécules cibles influencent

la performance de la spectroscopie Raman SERS. En effet si les molécules cibles sont
modifiées, il est nécessaire de changer le substrat SERS actif. Pour cette raison, la détection
des molécules individuelles ou à faible concentration par la spectroscopie Raman exaltée de
surface reste limitée.
Cependant, ces procédés analytiques basés sur la spectroscopie restent très intéressants
mais ils ne reflètent pas réellement la toxicité potentielle. Des techniques moins ciblées et
plus rapides peuvent sřavérer aussi intéressantes. Par conséquent, lřintérêt à développer un
dispositif portable plus approprié pour la mise en œuvre sur le terrain, avec une analyse
directe, rapide, avec une limite de détection plus faible et à coût restreint préoccupe de plus en
plus les chercheurs et le milieu industriel.
2. Détection par mesure de l’activité enzymatique
Au cours des dernières années, de nombreuses recherches ont été menées afin de
développer des biocapteurs enzymatiques, en utilisant différents types dřenzymes. Dans un
but de faire état de manière quantitative des travaux actuels, nous avons réalisé, une recherche
bibliographique au sein de la base de données « PubMed » sur mots clés, pour chaque enzyme
utilisée pour la détection de pesticides. Pour cette recherche, nous avons sélectionné les mots
clés «pesticide » et « détection » ainsi que le nom de chaque type dřenzyme (Note :
recherches au niveau du résumé et du titre). Les résultats sont illustrés dans la Figure 10. Les
chiffres trouvés ne sont bien évidemment pas exhaustifs mais permettent de rendre compte de
la « popularité » des différentes enzymes.
[40]
350
300
Nombres de publications
250
200
150
100
50
Figure 10: Distributions des enzymes les plus utilisées pour la détection des pesticides.
De nombreux biocapteurs utilisés pour la détection des pesticides sont basés sur
l'inhibition de lřactivité de l'enzyme cholinestérase par des pesticides (Dyk et al.).
Il existe aussi dřautres biocapteurs utilisés pour la détection d'autres types de

polluants comme les métaux lourds, les toxines et les médicaments. Ils fonctionnent selon le
même principe que les biocapteurs pour la détection des pesticides, mais cependant ils
utilisent dřautres types dřenzymes (par exemple le glucose oxydase pour les métaux lourds
(Malitesta et al.) et la tyrosinase pour l'acide benzoïque (Brisolari et al.).
δřacétylcholinestérase (ACHE) est amplement utilisée pour la détection enzymatique

des pesticides dans l'environnement, comme le montre la Figure 10. Dans la majorité des cas,
elle est utilisée dans les biocapteurs pour la détection des pesticides organophosphorés et
carbamates (Dyk and et al.; Vimala et al.; Turdean et al.).
Il est clair que les méthodes enzymatiques pourraient jouer un rôle important dans le
dépistage rapide et in situ d'un grand nombre de pesticides, à bas prix. δřACHE est la plus
adaptée pour la détection dřune vaste gamme de pesticides, spécifiquement
organophosphorés et carbamates.
[41]
3. Définition et principe du biocapteur
Un biocapteur est un système utilisé pour la détection, lřanalyse et la synthèse dřun

composé en utilisant des composants biologiques qui sont utilisés comme récepteurs
biologiques. Ce biorécepteur est associé à un transducteur (électromagnétique, calorimétrique,
électronique, acoustique ou piézoélectrique) (Paddle et al.). Le mot biocapteur est utilisé
même si il ne contient pas un dispositif biologique.
Le biocapteur est constitué de trois éléments essentiels :
 Le biorécepteur, élément biologique (enzyme, anticorps, microorganisme,

antigène, ADN, tissus, acide nucléique, …etc.) représentant lřélément de
reconnaissance moléculaire dans le biocapteur.
 Le transducteur, jouant le rôle de convertisseur, permet de transformer la réaction
biochimique en un signal physique (optique, électrique, magnétique, thermique ou
massique).
 Le transducteur est lui-même associé à un élément électronique qui permet
lřamplification, lřaffichage, lřenvoi, ou lřimpression du signal transmis et du
stockage sous forme de fichier ou base de données (voir figure 11).
Figure 11 : Principe de fonctionnement d’un biocapteur
δřefficacité de ce dispositif dépend de lřefficience du processus de reconnaissance en

termes de temps de réponse, rapport signal / bruit (S / N), sélectivité et limite de détection.
Une bonne combinaison du choix du biorécepteur et du transducteur est nécessaire. Le choix
[42]
du biorécepteur dépend de sa spécificité de réponse ainsi que de sa stabilité opérationnelle et

environnementale. Pour le transducteur, ce choix dépend du type de résultat obtenu par les
réactions de lřanalyste avec le biorécepteur ainsi que du domaine dřapplication de ce
dispositif (Mehrotra et al.).
3.1 Biorécepteurs enzymatiques pour la détection des pesticides.
Un inhibiteur enzymatique est une molécule qui ralentit l'activité d'une enzyme, tandis
qu'un activateur de cette enzyme lřaccélère. De nombreux médicaments et poisons sont des
inhibiteurs enzymatiques.
Les biocapteurs utilisant l'inhibition enzymatique sont développés en se basant sur les
mécanismes dřinteraction entre le composé à détecter, lřanalyte, et lřenzyme. Pour ce type de
biocapteur, la génération de signal de la réaction catalysée par lřenzyme est la partie la plus
importante. Son principe de fonctionnement est basé sur le suivi de la variation de la
concentration des composés (c'est-à-dire, des réactifs et des produits) et lřévaluation de
l'activité de l'enzyme (inhibée ou activée, selon le type d'enzyme employée). De plus,
l'activité d'une enzyme est modulée par diverses autres molécules.
Le Tableau 8 récapitule quelques exemples de biocapteurs enzymatiques, à base de

nanomatériaux, utilisés pour la détection des pesticides ainsi que leurs limites de détection
(Mehta et al.; Amine et al.; Viswanathan et al.; Kumar et al.) .
δes enzymes aussi peuvent être classées en deux catégories selon leur mode dřaction
sur les pesticides :
 La première classe regroupe les enzymes qui catalysent la réaction de transformation ou

de dégradation des pesticides (comme pour le substrat acétylcholine), donc lřenzyme est
toujours active en présence de pesticides.
 La deuxième classe contient les enzymes qui se lient (réversiblement ou
irréversiblement) avec les pesticides mais sans les transformer, donc en présence de ce
type de pesticides, lřactivité de lřenzyme est bloquée (pas de transformation du substrat
comme acétylcholine).
[43]
Tableau 8 .exemples de biocapteurs à base d’enzymes pour la détection des organophosphorés et carbamates.
Enzyme/ Analyte cible Type de substrat Nanomaterieles Limite réf.

biomarqueurs de
détection
ACHE Paraoxon Electrode en CNT-NH2 0.08 nM (Yu et al.)
carbone vitreux
ACHE Paraoxon Electrode en MWCNT- 0.5 µM (Y. Zhang et
carbaryl carbone vitreux (PEI/DNA)2/OPH 1 µM al.)
ACHE monocrotophos Electrode Au-PDDA-PB 0.8 pg/ml (S. Wu et al.)
(amperimetrique)
ACHE-CHO* Sarin Test Fe(3)O(4) 1 nM (Liang et al.)
methyl- cholorimetrique 10 nM
paraoxon 5 µM
Acéphate
OPH* Paraoxon Test de Structure en Ŗcore- 5x10-6 (Khaksarinejad
fluorescence shellŗ en nano-silice µM et al.)
OPH Paration- Test de CdTe QDs 18 (Yan, Li,
methyl fluorescence ng/mL Wang, et al.)
ACHE Carbofuran Membrane de AuNPs 2 nM (Kestwal et al.)
Oxamyl fenugrec hydrogel- 21 nM
Methomyl agarose- 113 nM
carbaryl acetylcholinesterase 236 nM
ACHE Paraoxon Electrode en CdSe@ZnS/graphene 10-14 M (X. Li et al.)
dichlorvos carbone vitreux nanocomposite 10-6 M
BCHE Paraoxon dispositif à base de Fe3O4@TiO2, 0.01 Nm (Ge et al.)
bande de test HRP/Ab-GNPs
BCHE Paraoxon Bille magnetique QDs 0.5nM (Du et al.)
*CHO: choline oxidase ; *OPH: organophosphorés hydrolase
3.1.1 Biorécepteurs catalytiques pour les pesticides
Ce type de biocapteur, est basé sur la transformation ou la destruction des pesticides.

En effet, les enzymes de la première classe sont utilisées c'est-à-dire les enzymes catalytiques
pour les pesticides. δřAryldialkylphosphatase (ou les organophosphorés hydrolase (OPH))
est l'enzyme capable de cliver les liaisons P-F, P-O et P-S des organophosphorés
(Mulchandani et al.). La réaction de catalyse est la suivante:
�(�) �(�)
∣∣ �� ∣∣
��⎯ � ⎯� + �2 � ⎯⎯⎯⎯⎯ ��⎯ � ⎯�� + ��
∣ ∣
��
��
Des chercheurs ont pu contrôler cette réaction, en effectuant le suivi des produits
générés par des capteurs électrochimiques (par exemple, potentiométrique et ampérométrique)
[44]
(Mulchandani et al.; Mulchandani et al.). Ce type de biocapteurs est typique pour les OPs. Ils
peuvent être utilisés pour identifier les organophosphorés en cas de présence de carbamate
plus précisément. Ils sont donc employés pour distinguer les OPs en utilisant
organophosphorus acide anhydrolase (OPAA) (Hill et al.).
3.1.2 Biorécepteurs basés sur l'inhibition par des pesticides
Les cholinestérases (acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase) (Pohanka et al.)

sont les deux principaux types d'enzymes constituant la deuxième classe des enzymes
inhibées par les pesticides.
-δřacétylcholinestérase est la principale enzyme du genre cholinestérase. Cette famille

dřenzymes de cholinestérases transforme lřacétylcholine (pour réduire sa neurotoxicité), en
choline et acide acétique. Cette réaction est nécessaire pour permettre aux récepteurs
cholinergiques de revenir à leur état de repos après activation.
- butyrylcholinestérase catalyse l'hydrolyse de butyrylcholine (BCH) en choline et acide

butyrique (Hoštálková et al.). BCH fonctionne de la même façon que lřacétylcholine (ACH),
mais c'est une enzyme synthétique. De même lřacétylcholine n'est pas la seule molécule
utilisée comme substrat pour lřACHE puisquřil existe lřacetylthiocholine comme substrat
alternatif. Cette dernière se décompose en thiocholine, utilisée par exemple pour le cas de la
réaction dřoxydation en raison de ses propriétés électroactives (tandis que la choline en est
dépourvue) (Liu et al.). Elle est aussi utilisée pour comparer les biocapteurs mono-
enzymatiques et bi-enzymatiques.
Les réactions catalysées par les cholinestérases sont:

��
�� + �2 � ⎯⎯ �� + ��
��
�� + �2 � ⎯⎯ �� + ��
δes biocapteurs à base dřenzymes cholinestérases sont utilisés comme biocapteurs à

inhibition par les pesticides. Pour ce type de détection, les sites de reconnaissances (ou sites
de liaisons au substrat) de l'enzyme pour lřACH sont bloqués par des pesticides (Chatonnet et
al.). D'autres enzymes, en plus des organophosphorés hydrolase et cholinestérases, sont
utilisées comme composants biologiques dans des biocapteurs pour pesticides. Les
[45]
phosphatases acides sont des enzymes présentes dans la prostate, les os, les globules rouges,
les globules blancs et les plaquettes sanguines, les poumons, le foie, les reins, la rate, le
pancréas et le liquide séminal. Ce sont aussi des enzymes utilisées pour mesurer lř'inhibition
par des carbamates et des OPs, mais avec un mécanisme dřinhibition réversible (Mazzei et
al.). δ'activité enzymatique se régénère après la détection sans ajout dřautres produits
chimiques supplémentaires (Marty et al.).
3.2 Les types de transducteurs
Les transducteurs servent à mesurer les changements physico-chimiques des

interactions entre lřanalyte et le biorécepteur. Il existe plusieurs types de transducteur. Ils sont
caractérisés selon leur type de transduction et le paramètre à détecter. Ils servent aussi de
connexion entre le générateur de signal (Composante bio) logique et la sortie. Ils peuvent être
classés en quatre grandes familles notamment optique, électrochimique, calorimétrique et à
effet piézoélectrique (Arduini et al.).
3.2.1 Capteurs électrochimiques
La détection électrochimique se base sur la transformation chimique qui provient des

réactions dřoxydoréduction de lřélément à détecter. δřanalyse se fait par mesure de la
variation de tension (potentionmétrique) (Mulchandani et al.), variation du courant
(ampérométrique) (Mulchandani et al.) ou par mesure de la variation de conductivité
(conductimétrique) (Mulchandani et al.).
3.2.2 Capteurs thermométriques et calorimétriques
Le capteur calorimétrique est basé sur le contrôle du changement de température

pendant une réaction catalytique, qui est généralement exothermique. La cellule de référence
est utilisée pour éliminer la variation de chaleur produite autre que celle produite par la
réaction spécifique dans la cellule enzymatique. La conception simple et la détection rapide
de ce type de capteur le rendent pratique pour la détection in situ. Zheng et al. (2006) ont créé
un biocapteur calorimétrique par injection du flux de résidus de dichlorvos. Ils ont utilisé
lřestérase du foie de volaille au lieu de CHE ou OPH, en tenant compte du coût d'OPH et de la
stabilité de CHE. δřintroduction du dichlorovos inhibe lřactivité de l'estérase, ce qui entraîne
le blocage partiel de la réaction catalytique dřorigine et par conséquent la quantité de chaleur
libérée se trouve réduite. δřactivité de l'enzyme dans ce cas est influencée spécialement par
deux facteurs : le débit du flux et le temps d'incubation.
[46]
3.2.3 Capteurs à effet piézoélectrique (ou mécaniques)
Les transducteurs mécaniques ou piézoélectriques mesurent de façon très sensible la

variation de masse lors dřune interaction moléculaire.
δřeffet piézoélectrique direct se traduit par la naissance dřune polarisation électrique

(potentiel électrique) à cause dřune modification mécanique (variation de la masse). δřeffet
piézoélectrique indirect se manifeste par apparition dřun effet mécanique lors de lřapplication
dřun potentiel électrique.
Ce type de transducteur est composé généralement par un cristal de quartz. Pour

lřinsertion de ces capteurs dans les biorécepteurs, on sřintéresse à lřeffet piézoélectrique
direct. Cřest-à-dire, on détecte la variation de masse par un changement dans le potentiel
électrique appliqué sur le cristal. Ce dispositif a plusieurs applications, il peut être utilisé
comme biocapteur pour la détection des pesticides et des métaux lourds dans les eaux par
inhibition de lřactivité enzymatique. L'enzyme est immobilisée sur la surface du cristal de
quartz. Quand l'interaction entre le substrat et l'enzyme a lieu, on obtient une variation de
fréquence de résonance du cristal; ensuite, la variation de masse ou des propriétés
superficielles du cristal sera enregistrée en temps réel (Scarano et al.; Mehta et al.).
Il y a quatre types de transducteurs : mécanique, microbalance à quartz (QCM), micro-leviers

et le transducteur à ondes acoustiques de surface (SAW).
3.2.4 Les transducteurs optiques
Les biocapteurs optiques sont devenus de plus en plus sophistiqués. On les trouve dans
des domaines très diversifiés (médecine, industrie, agroalimentaire…etc.). δa détection et
lřanalyse sřeffectuent grâce à une transformation des phénomènes optiques (réflexion,
absorption, ..) en un signal électrique. Parmi les transducteurs optiques, on trouve:
l'absorption UV, la fluorescence, lřabsorption infrarouge (IR), la diffusion Raman et la
résonance plasmonique de surface (SPR) (Bi et al. 2016; Convertino et al. 2016; Jin et al.
2004; Matuszczak et al. 2016; Qi et al. 2016; B. Wang et al. 2014). La détection de
fluorescence est la plus populaire (Ji et al. 2016; H. Li et al. 2016; Toma et al. 2016), tandis
que la spectroscopie UV est limitée à la recherche académique en raison de sa faible
sensibilité et la difficulté dřanalyser des échantillons complexes. Ce type de dispositif est
utilisé dans divers domaine : la photographie, l'imagerie spatiale, la reconnaissance de forme,
[47]
la mesure de déplacement et de déformation, dans le domaine industriel (automatisation des

procédés industriels) et militaire pour la détection et lřanalyse.
Ces dernières années, la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) est

développée pour de nombreuses applications telles que l'identification et la détection des
molécules individuelles et de nombreux types d'analyte à faible concentration (Laariedh et al.;
Gill et al.). La SERS correspond à la signature Raman vibratoire associée à une augmentation
importante d'intensité, par l'association de l'analyte à des nano-surfaces métalliques (telles que
l'or ou l'argent) ou des nanoparticules. Cette technique optique, en raison de sa sensibilité, a
été mise en œuvre dans de nombreux domaines de recherche tels que la biologie, la science
des matériaux, l'art et la chimie analytique (Temiz et al.; Saha et al.).
Conclusion
Les biocapteurs enzymatiques non seulement empêchent l'effet d'interférence

(élimination des résidus par rinçage si lřenzyme est immobilisée), mais offrent aussi de
meilleures limites de détection. δ'ACHE est lřenzyme la plus utilisée dans les biocapteurs
pour la détection des pesticides organophosphorés et carbamates pour les raisons suivantes :
 δřACHE est la principale cible de plusieurs types de pesticides μ organophosphorés,

carbamates, …
 δřacétylcholinestérase est la principale enzyme du genre cholinestérase.
 δřimmobilisation de lřACHE est facile.
 Les réactions impliquées dans le fonctionnement des biocapteurs à cholinestérases
permettent une grande sensibilité (biocapteurs ampérométriques)
 Elle permet une bonne sélectivité, sensibilité.
Les biocapteurs optiques sont très sensibles et offrent plusieurs avantages : ils sont
stables, non-destructifs. En particulier, la spectroscopie Raman exaltée de surface est une
technique très sensible beaucoup utilisée pour la détection des molécules individuelles.
[48]
III. La diffusion Raman

Le phénomène de diffusion inélastique des photons (ou diffusion Raman) par des
molécules en solution et sous forme gazeuse (éther, amyléne) a été découvert par le chercheur
indien Chandrasekhara Venkata Raman et K. S. Krishnan en 1928 (Barbillat et al.). Cřest en
1930 que ce phénomène est reconnu (effet Raman) et que C.V.Raman obtient un prix Nobel
de physique, dřoù le nom « diffusion Raman ».
Plusieurs phénomènes peuvent se produire lorsquřune lumière éclaire un matériau. La

majeure partie du faisceau lumineux est réfléchie ou transmise à travers l'échantillon et une
faible quantité est diffusée (environ 0.1% diffusée élastiquement : diffusion Rayleigh, et
environ 0.0001% diffusée inélastiquement : diffusion Raman) (figure 12). Le signal Raman
est le résultat d'une interaction inélastique entre la lumière incidente (la plupart du temps une
lumière monochromatique) et la molécule irradiée.
Lumière incidente Lumière réfléchie
Lumière diffusée : exemple Raman
Lumière absorbée
Lumière transmise
Figure 12 : Différents phénomènes produits dans l’interaction lumière-matière.
Pour que la spectroscopie Raman soit utilisée plus couramment , il a fallu attendre le
développement de sources monochromatiques tels les lasers dans les années 60 et des
détecteurs CCD dans les années 80 (Yao et al.). Actuellement la spectroscopie Raman est une
technique de caractérisation très utilisée dans les laboratoires. Les informations sur la
[49]
structure chimique de lřéchantillon quřelle livre, la flexibilité en termes de taille et de

diversité dřéchantillons analysables et le caractère non-destructif sont autant de points forts
qui expliquent la popularité de cette technique dans divers champs disciplinaires (Colthup et
al. 1975). δa figure 1γ illustre les résultats obtenus, sur lřutilisation de la spectroscopie
Raman, par une recherche sur la base de données « PubMed », avec les mots clés : « Raman
spectroscopy » OR « Raman scattering » OR « Raman», afin dřy associer un nombre de
publications. Les chiffres trouvés ne sont bien évidemment pas exhaustifs mais permettent de
rendre compte de lřévolution de lřutilisation de la technique.
4500
4000
3500
Nombre de publications/an
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1990
2016
2014
2012
2010
2008
2006
2004
2002
2000
1998
1996
1994
1992
1988
1986
1984
1982
1980
1978
1976
1974
1972
Années
Figure 13 : Evolution du nombre de publications utilisant la spectroscopie Raman comme technique de

caractérisation.
1. Principe de la diffusion Raman
La spectroscopie Raman apporte une information sur les propriétés

vibrationnelles des matériaux. δors de lřinteraction entre un rayonnement incident
monochromatique avec une molécule, la molécule peut atteindre un état d'énergie
[50]
virtuel correspondant à un état excité, puis un photon peut être diffusé. La longueur
d'ondes de ce photon est la plupart du temps de même énergie que la lumière
incidente. Ce phénomène de diffusion élastique est nommé diffusion Rayleigh. De
manière plus rare cette interaction peut se traduire par une diffusion inélastique de la
lumière, cřest lřeffet Raman (voir figure 14).
Etats
excités
Etats
Virtuels
Excitation laser
� � − � � + �
�
Etats E0+ ��1

Vibrationnels E0
Diffusion Diffusion Diffusion anti-
Rayleigh stokes stokes (Raman
(élastique) (Raman inélastique)
inélastique)
Figure 14 : Schéma descriptif de la diffusion Raman.
Deux cas de diffusion inélastique de la lumière peuvent apparaître :
 Le premier, le plus favorable, appelé la diffusion Raman Stokes, correspond à

l'excitation de la molécule à l'état fondamental avec la lumière incidente et l'émission
d'un photon pour atteindre un état d'énergie supérieur correspondant à un état de
vibration caractéristique de la molécule excitée. La différence entre la longueur
d'ondes incidente et celle émise est appelée le déplacement Raman (on lřexprime
généralement en cm -1). La différence dans ce cas est positive.
 Le deuxième cas, moins probable, est appelé diffusion Raman anti-Stokes. Dans celui-
ci, la molécule est toujours sur un état de vibration avant l'excitation par la lumière
[51]
incidente. Alors, le photon émis permet dřatteindre l'état fondamental de la molécule

ou un état inférieur de vibration. Dans ce cas, le déplacement Raman est négatif.
δe changement de longueur dřonde observé lors de la diffusion dřun photon
(diffusion Stokes ou anti-Stokes) est attribué aux niveaux énergétiques correspondant
aux énergies de vibration dřune molécule (Figure 15) (Slusher et al. 1975).
Figure 15 : Spectre (théorique) de diffusion Rayleigh et Raman (Stokes et anti-Stokes).
2. Théorie de l’effet Raman
δorsquřune molécule est placée dans un champ électrique, son nuage électronique se
déforme relativement au noyau chargé positivement. La molécule présente donc un moment
électrique dipôlaire (Barbillat et al.). Dans le cas où le champ électrique est faible, le moment
dipolaire induit P est proportionnel au champ électrique E.
P = [α]E
Dans un cas général le coefficient de proportionnalité entre P et E, appelé

polarisabilité nřest pas un scalaire mais un tenseur de rang β. Dřoù lřéquation suivante dans
un trièdre orthonormé Oxyz :
Si lřon projette sur les axes oxyz dřun trièdre direct, il vient :
��

�� = ��
��
[52]
� est le tenseur de polarisabilité de la molécule. Soit E le vecteur du champ

électrique associé à lřonde électromagnétique du photon μ
� = �0 cos 2��0 �
Où E0 est lřamplitude du champ électrique, t le temps et �0 la fréquence du photon.
δorsque ce photon interagit avec une molécule, le moment dipolaire quřil induit
oscille à la même fréquence �0 . Ce moment dipolaire induit va émettre un photon à la même
fréquence (ν0 ), cřest la diffusion Rayleigh. Pour chaque liaison moléculaire vibrant à une
fréquence particulière , on peut écrire μ
� = � cos 2πν t
Q représente la variation de la position du centre de masse de la molécule par rapport à

la position d'équilibre (coordonnée normale). Si les mouvements de la molécule entraînent
une variation de la polarisabilité et si on suppose que ces variations sont de faible amplitude,
on admet que le tenseur de polarisabilité dépend de la position des électrons qui tournent
autour du noyau. Si la position est caractérisée par la coordonnée Q, la position ne reste pas
constante au cours du temps parce que la molécule vibre ; la variation du tenseur de
polarisabilité se traduit donc par :
�[α]
� = [α0 ] + .
�� =0
Le moment dipolaire induit sřécrit alors μ
�[α]
� = [α0 ]. � + . �. �
�� =0
Il est fonction de la coordonnée normale. Le dipôle oscillant induit par une excitation
monochromatique réémet un rayonnement électromagnétique polychromatique. Donc
lřéquation du moment dipolaire peut être écrite comme:
1 �[α]
� = [α0 ]. �0 cos 2��0 � + . �0 . �0 cos2� �0 + � � + cos 2� �0 − � �
2 �� =0
�� −��
��
[53]
Donc selon cette équation, pour un mode normal de vibration de fréquence � le dipôle
induit donne naissance à trois émissions différentesμ δe premier terme de lřéquation décrit
lřoscillation du dipôle générée par la diffusion Rayleigh, tandis que le second terme décrit les
oscillations de dipôle générées par la diffusion Raman.
La diffusion Raman contient 2 composantes :
 une diffusion anti-Stokes (à la fréquence (�0 +� ), gain dřénergie pour le photon.

 une diffusion Stokes (à la fréquence (�0 -� )) perte dřénergie pour le photon. Ces deux
composantes ont une énergie fixe (±� ) par rapport à la longueur dřonde dřexcitation.
Cette énergie est propre à chaque molécule.
Lřapproche ondulatoire classique de la diffusion Raman explique bien l'existence ou

lřabsence de raies de part et d'autre du pic de diffusion Rayleigh. L'écart avec ce pic central
est égal aux fréquences de vibration de la molécule. Par contre, elle ne justifie pas les
intensités relatives des deux raies Raman (raies Stokes et Anti-Stokes) que seul le traitement
par la mécanique quantique permet dřobtenir.
Nous allons maintenant situer cet effet dans le diagramme énergétique issu de la
théorie quantique qui fait appel à un niveau virtuel pour rappeler que le phénomène de
diffusion est le résultat dřune interaction photon-molécule hors des conditions de résonance. Il
importe en effet de bien différencier le mécanisme dřexcitation moléculaire tel quřil apparaît
ici de celui mis en jeu lors de lřabsorption dřun photon car les deux phénomènes nřobéissent
pas aux mêmes lois.
Si la fréquence de la lumière incidente est proche d'une fréquence de vibration de la

molécule, on observe un phénomène d'absorption, c'est le cas de la spectroscopie infrarouge.
Si, comme en spectroscopie Raman, la fréquence de la lumière incidente est très grande par
rapport aux fréquences de vibrations de la molécule ( �0 >> �� ), le phénomène le plus
probable est une diffusion dont on peut décrire le mécanisme de manière très schématique de
la façon suivante:
- Lors de l'excitation par le photon incident d'énergie h ν, la molécule transite dans un état
appelé virtuel car l'énergie du photon est très importante.
[54]
- Puis elle redescend sur un niveau réel. On peut montrer que seuls les niveaux ν-1, ν et ν+1
sont possibles. On retrouve ainsi les 3 types de diffusions rencontrées dans la description
classique de la spectroscopie Raman.
On remarque que la diffusion Rayleigh est la plus probable alors que les diffusions
Stockes et Anti-Stockes sont très peu favorisées. De plus, à une température donnée, le
remplissage des niveaux d'énergie est donné par une loi de distribution de type Maxwell-
Blotzmann qui prédit que les niveaux excités (ν+1, ν+2...) sont très peu peuplés par rapport
aux niveaux d'énergie fondamentaux (ν). Or la diffusion Anti-Stokes ne concerne que les
molécules se trouvant dans un état excité (transition ν+1 →ν) ce qui explique sa faible
intensité par rapport à la diffusion Stokes.
On exprime alors le rapport des intensités selon la relation suivante :
I Anti stokes   0   v   h 
   . exp   v 
I Stokes  0  v   kBt 
On voit donc que les raies anti-Stokes seront toujours moins intenses que les raies
Stokes correspondantes. Elles deviennent inobservables dès que lřécart de fréquence par
rapport à la fréquence incidente devient important et/ou que la température sřabaisse. δa
mesure de leur rapport permet de déterminer la température absolue dřun échantillon soumis
au rayonnement monochromatique laser.
Il faut ainsi noter que lřactivité Raman est étroitement liée à la modification de la,
polarisabilité sous lřaction dřun champ électrique. Il en résulte quřune molécule centro-
symétrique est active en diffusion Raman (à lřinverse de la spectroscopie Infrarouge).
Limites de la spectroscopie Raman :
Comme nous lřavons déjà évoqué précédemment, la spectroscopie Raman est un outil
de caractérisation appliqué dans plusieurs domaines, notamment dans le domaine
fondamental de lřétude structurale et dynamique de la matière et ainsi comme technique
dřanalyse (mesures de pollution, process en ligne,..). Elle apporte des informations
complémentaires à la spectroscopie Infrarouge.
Bien quřapplicable dans de très nombreuses domaines, comme toute technique la

spectroscopie Raman se révèle parfois inadéquate. La diffusion Raman représente environ 1
photon pour 108 photons incidents (Everall et al.). Ce phénomène est particulièrement
[55]
remarqué pour des molécules non-résonantes, ce qui est le cas de la majeure partie des
molécules biologiques. La lumière diffusée est donc très faible, ce qui rend le spectre Raman
très peu intense et donc peut adapter au dosage de molécules à lřétat de traces. A titre
comparatif la section efficace de la diffusion Raman est de 108 à 1010 fois inférieure par
rapport à lřabsorption infrarouge ou la fluorescence (Rubim et al.).
De plus dans le cadre dřune étude de matériau sous microscope, la résolution est
nécessairement liée au critère dřAbbe qui définit la résolution optique maximum de tout
système optique. Ce critère exprime la distance minimale de distinction entre 2 points par un
système otique, en lřoccurrence dans notre cas un microscope, et sřexprime de la manière
suivante :
. .
� = =
2 n × sin 2 × ON
Avec :
 μ longueur dřonde de la lumière ;

 n : indice de réfraction du milieu,
 θ : le demi-angle du cône lumineux incident
 ON : ouverture numérique (de lřobjectif de microscope).
En pratique, cela signifie que dans lřair la meilleure résolution quřon puisse obtenir
avec un spectromètre Raman conventionnel couplé à un microscope confocal est de lřordre de
βη0 nm pour une longueur dřonde de 400 nm. C'est la raison pour laquelle l'utilisation d'une
surface métallique destinée à lřexaltation de signal par la résonance de plasmon de surface
localisée, est nécessaire.
2. Des plasmons à la diffusion Raman Exaltée de surface (SERS)
δřeffet SERS (Surface Enhanced Raman Scattering), cřest-à-dire lřexaltation de

surface de la diffusion Raman, se produit lorsque les molécules de lřespèce à caractériser sont
adsorbées à la surface dřun substrat métallique. Lřeffet SERS a tout dřabord été observé par
Fleischman et al. en 1974 (Fleischmann et al 1974), puis découvert quasi parallèlement par
[56]
Jeanmaire et Van Duyne (Jeanmaire et al 1977) et Albrecht et Creighton en 1977 (Albrecht et

al 1977).
En 1λ74, Fleischman et al. ont réalisé lřexpérience dřune amplification considérable

de lřintensité des pics du spectre Raman de la pyridine adsorbée à la surface dřune électrode
dřargent. Albrecht et Creighton (Albrecht et al 1977) ont conclu que lřeffet dřexaltation
résulte du substrat métallique, responsable de lřélargissement des niveaux électroniques de la
molécule adsorbée et induisant la diffusion Raman résonante grâce à lřinteraction avec les
plasmons de surface. Parallèlement, Jeanmaire et Van Duyne identifièrent les facteurs
responsables de lřexaltation de lřintensité Raman (lřétat de surface de lřélectrode ; la
concentration de la solution de pyridine ν la nature et la concentration dřanions électrolytes ; le
potentiel de lřélectrode) (Jeanmaire et al 1977).
Les deux communications de Jeanmaire et Van Duyne (Jeanmaire et al 1977)et de

Albrecht et Creighton (Albrecht et al 1977) ont mis en évidence une inadéquation entre
lřimportance de lřexaltation du signal Raman et lřaugmentation de la surface spécifique de
lřélectrode métallique après réduction. Dès lors, la communauté scientifique sřaccorde sur le
fait que les propriétés de surface du substrat métallique interviennent dans le processus
dřexaltation. En effet, lřexaltation de la diffusion Raman dépend de lřétat de surface du
substrat métallique, mais aussi de sa nature (seuls quelques métaux comme lřargent, le cuivre
et lřor produisent une exaltation importante (D.-Y. Wu et al.; Kneipp et al.)). De plus, suivant
la longueur dřonde dřexcitation utilisée, lřamplification du signal varie sensiblement.
4.1. Les plasmons de surface
Les plasmons de surface (PSs) sont les oscillations collectives des électrons
délocalisés existant à l'interface entre un matériau où la partie réelle de la fonction
diélectrique change de signe à travers l'interface (par exemple une interface entre un métal, tel
l'argent, et un milieu diélectrique comme le vide ou l'air). Cette onde (assimilable à des
vagues qui parcourraient la surface du métal) est produite, dans certaines conditions, par une
onde lumineuse incidente. On obtient une interaction résonante entre la lumière et le plasmon
(Raether et al. 1988). L'existence de plasmons de surface a été d'abord prouvée en 1957 par
[57]
Rufus Ritchie (Ritchie et al. 1957). Ces ondes sont principalement exploitées en (bio)
physique et en (bio) chimie au travers de la résonance de plasmon de surface.
Ces ondes de surface sont appliquées dans plusieurs domaines tels que lřémission de la
lumière et les guides dřondes. Plus généralement, on distingue les « plasmons de volume » et
les « plasmons de surface » suivant la localisation des oscillations dans un métal. Pour
quantifier ces oscillations, nous pouvons nous rapporter à la fonction diélectrique qui dépend
du matériau et de la radiation excitatrice de fréquence angulaire ω, et sřécrit μ
� � = �1 � + ��2 � (1)
δa constante diélectrique (ω) permet de décrire les propriétés optiques du métal,

notamment ses coefficients dřabsorption et de diffusion ainsi que sa fréquence plasma. Sa
dépendance en fréquence peut être obtenue en utilisant le modèle de Drude (Drude et al.
1900). Ce modèle décrit les mécanismes dřinteraction des électrons à lřintérieur du métal.
Brièvement dans le modèle de Drude, le métal est assimilé à un réseau ionique baigné dans un
nuage dřélectrons libres (les électrons de conduction). δa direction de propagation dřune onde
plane monochromatique est définie par un vecteur dřonde � parallèle à lřun des trois axes (x,
y ou z) et par la pulsation ω. δe mouvement des électrons libres est alors modélisé en
considérant le champ électrique � appliqué, la masse effective des électrons, leur vitesse et
leur charge, ainsi quřune constante dřamortissement Γ, décrivant les interactions inhomogènes
des électrons comme les collisions inélastiques des électrons libres mais aussi le couplage
phonon-électron, les défauts, les impuretés, etc. On obtient alors la relation de dispersion de la
fonction diélectrique dans le domaine visible (� > Γ) selon lřexpression de Drude μ
� �2 � �2
� � = �1 � + ��2 � = �� − +� Γ (2)
�2 �3
�� 2
Où �� = �0 � �
est la fréquence plasma métallique avec n μ le nombre dřélectrons de charge
e et de masse effective me et �0 : la permittivité du vide.
[58]
Dans les cas des métaux, r (la partie réelle de la constante diélectrique, est la
permittivité relative du milieu incluant la contribution des électrons de liaison à la
polarisabilité) est négative et prend une valeur égale à 1 si, seuls, les électrons de la bande de
conduction, contribuent à la fonction diélectrique.
4.2. Nature du plasmon de surface
Comme nous lřavons déjà vu précédemment, les plasmons de surface sont à la fois une
excitation collective des électrons et une onde électromagnétique de la surface confinée
vérifiant la relation �(�) < 0. Cette dernière condition est vérifiée entre un diélectrique ( d >
0) et un métal ( m < 0). On parle parfois de plasmons polaritons de surface (PPS) pour faire
référence à cette nature hybride (Raether et al. 1988). Ils apparaissent donc à des fréquences
différentes de celles des plasmons de volume qui eux doivent remplir la condition � � = 0.
λ�� Y
�
Diélectrique (εd>0)
��
X
Métal (εm<0)
Figure 16 : Schéma de la propagation d’une onde de densité électronique à l’interface entre un métal de
constante diélectrique εm et un milieu diélectrique de constante εd. Les oscillations de la densité de charge et les
champs électromagnétiques associés, constituent les ondes plasmon-polariton de surface. La décroissance
exponentielle de l’intensité du champ électromagnétique perpendiculairement à l’interface est montrée à droite.
Considérons lřinterface entre un métal de constante diélectrique m et un milieu

diélectrique de constante d. δřintensité du champ associé à lřonde électromagnétique se
propageant entre ces deux surfaces est maximale à lřinterface. δřintensité du champ associé à
cette onde décroît exponentiellement dans les directions perpendiculaires à la surface dans les
deux milieux suivants, ce qui est une caractéristique des ondes de surface (Figure 16). Il
[59]
existe des modes optiques longitudinaux dans ce plasma dřélectrons libres qui correspondent
à des oscillations de la densité dřélectrons se propageant dans le métal avec un vecteur dřonde
� dirigé dans le même sens que les modes dřoscillation.
Les conditions dřexistence dřun plasmon de surface à lřinterface entre un diélectrique

et un métal peuvent être exprimées en utilisant la continuité des équations de Maxwell à
lřinterface, dans des conditions au limites appropriés ( m d<0) et en négligeant le terme
dřamortissement présent dans lřexpression de la constante diélectrique du métal donnée par le
modèle de Drude (Eq. 2) (Han et al. 2013). La relation de dispersion des plasmons
(polaritons) de surface se propageant à lřinterface selon un vecteur dřonde propagatif est
donnée par la relation de dispersion (Eq. 3), qui relie la fréquence angulaire � et le vecteur
dřonde �0 = 2�/ (où est la longueur dřonde du rayonnement) (Dionne et al.):
d m
k pps = k 0 (3)
d+ m
La distance de propagation des plasmons est inversement proportionnelle à la partie

imaginaire (Im) de k pps et sřécrit :
1
�� = (4)
2�� (k pps )
4.3. Plasmon de surface localisé dans les nanoparticules métalliques
Une nouvelle technique de caractérisation basée sur les nanoparticules métalliques et

plus spécifiquement leurs propriétés optiques à cette échelle : la Résonance Plasmon de
Surface Localisé (LSPR pour Localized Surface Plasmon Resonance), basée sur les plasmons,
est apparue. Différents types de résonances plasmons peuvent être excités selon le type de
surface métallique (film continu ou non). Les films continus ne peuvent maintenir que
dřéventuelles résonances plasmons délocalisées, alors que pour une surface rugueuse les
résonances plasmons de surface localisées et délocalisées peuvent apparaître. Lorsque la taille
de la surface métallique est petite devant la longueur dřonde (R〈〈 ), les propriétés optiques
[60]
des nanoparticules métalliques, assimilées à des sphères, sont dominées par lřoscillation
collective des électrons de conduction (plasmon de surface localisé) induite par lřinteraction
avec un rayonnement électromagnétique (Ritchie et al. 1973). En effet, le champ
électromagnétique entraîne la polarisation du métal constituant les sphères et induit la
formation dřun dipôle dans la nanoparticule (Figure 17).
Figure 17 : Image du champ électrique et la distribution de la densité de charges d’une nanoparticule

métallique sphérique (Adapté de (Juluri et al.)).
Nanoparticule
Champ métallique
Electrique
++ + - - - +++
Onde
lumineuse
- - - ++ + ---
Figure 18 : Diagramme schématique de la résonance des plasmons de surface localisés dans les particules
métalliques sphériques. Le couplage entre le champ électrique et les nanoparticules métalliques incite les
oscillations collectives des électrons de particules.
δe champ électrique dřune radiation provoque la conduction des électrons qui, par la
suite, se mettent à osciller collectivement. Le métal est considéré comme étant composé
[61]
dřions positifs formant un réseau régulier et dřélectrons de conduction les plasmons de surface
se déplaçant librement à travers le réseau ionique. En conséquence, localisés résultent de la
vibration électronique de nanoparticules métalliques comme indiqué sur la (Figure 18).
La fréquence plasmon de résonance est déterminée par la force de rappel des électrons
de conduction du métal, laquelle dépend de plusieurs paramètres dont la nature du métal, la
taille et la forme des nanoparticules (Chen et al.), mais également du milieu dans lequel se
trouvent les nanoparticules (plus particulièrement de lřindice de réfraction.) (Figure 1λ)
(Mock et al. 2003) . Cette fréquence change si le milieu est modifié ou si des molécules se
lient à la surface du métal. Dřautre part, la δSPR exalte le champ incident, et peut ainsi être
utilisée pour exalter la diffusion Raman, ainsi que dans de nombreuses autres applications.
A) B)
Figure 19: Coefficient d’extinction en fonction de la longueur d'onde de la lumière incidente pour : A) une
nanoparticule cubique d'argent immergée dans deux milieux différents (vide : n=1 et le silicium : n=1.47, les
six principales résonances de plasmons de surface sont indiquées) et B) pour le décaèdre régulier et ses
morphologies tronquées (pour une polarisation parallèle de la lumière) (Noguez et al.).
5. La diffusion Raman Exaltée de surface
Dans ce qui précède, nous avons exposé les avantages de la spectrométrie Raman. Son
avantage principal réside dans sa capacité à fournir des informations très riches sur la
structure moléculaire de lřanalyte. Pourtant, la faible intensité du signal Raman peut limiter
lřutilisation de cette technique dans le cas de très faibles concentrations dřespèces diffusantes
et/ou de molécules avec très faibles sections efficaces de diffusion.
[62]
Depuis la découverte de lřeffet SERS en 1974 par (Fleischmann et al 1974), un regain

dřintérêt pour la spectroscopie de diffusion Raman a été observé. Une exaltation de 10 14 a été
obtenue, sous des conditions de résonances appropriées, dans les travaux de Nie et al (Nie et
al.) et Kneippe et al (Kneipp et al.). Ceci a permis lřouverture de perspectives dřutilisation de
la spectroscopie Raman en tant que technique disposant dřune grande sensibilité de détection.
Lřeffet SERS reste un phénomène complexe dont son facteur dřexaltation peut être
compris comme le produit dřune contribution simultanée de deux types de mécanisme : de
lřamplification électromagnétique (Campion et al.) et de lřamplification chimique (Garrell et
al. 1989).
5.1. L’Effet électromagnétique
δřinteraction dřun champ électromagnétique avec une surface métallique, peut exciter
les plasmons de surface localisés, induisant l'amplification du champ électromagnétique
proche de la surface du métal (Zayats et al 2005). En effet, lřexaltation du signal Raman
observée est associée à lřamplification de l'intensité du champ électrique incident et diffusé.
Cette exaltation est principalement due à une résonance localisée des plasmons de surface. Ce
concept a servi de modèle important dans la compréhension du mécanisme
électromagnétique de lřeffet SERS (Pockrand et al 1981).
Figure 20: simulations théoriques de l’amplification du champ électromagnétique autour des nanoparticules
d'argent de différentes formes : (a) une nanoparticule triangulaire (700 nm), (b) un dimère de nanoparticules
sphériques (520 nm), et (c) une nanoparticule ellipsoïdale (695 nm). L'échelle d'intensité en (a) applique
également à (b) (Haynes et al 2005).
[63]
Des études théoriques ont permis de décrire lřeffet électromagnétique impliqué dans
lřexaltation SERS, dans le cas de différentes morphologies du substrat, de la forme la plus
simple (particule sphérique) à la plus complexe (colloïdes fractals) afin dř améliorer le
facteurs dřamplification de lřeffet SERS (Zeman et al 1987). Ce facteur augmente
considérablement, peut atteindre 1010 à 1012, si on ne considère non plus une, mais deux
particules à une distance de quelques nanomètres lřune de lřautre. Alors quřil est seulement de
lřordre de 106 dans le cas dřune sphère métallique isolée (Figure 20).
En spectroscopie Raman, lřintensité diffusée est proportionnelle au carré du champ

appliqué à la molécule, E0 (McCreery et al 2000). En effet le facteur dřamplification
électromagnétique du SERS peut être donné approximativement pour chaque molécule, par la
relation suivante (Cotton et al 1986):
�� (� ) 4
�= (6)
�0 (� )
1
Avec El ω =
∈ ω +2
E0 : est le champ électrique local à la fréquence incidente ω et
∈ ω est la constante diélectrique totale du métal à la fréquence ω.
E0 (ω) : Le champ électrique incident. Nous comprenons alors que lřamplification du signal
Raman de la molécule dépend du champ électrique perçu par la surface métallique.
δřamplitude de lřexaltation SERS dépend de la distance entre la molécule et la surface

métallique. Il nřexige pas que lřadsorbat soit en contact direct avec la surface mais dans un
certain volume de détection. δřintensité dépend de la distance surface-matériau selon la
relation suivante :
�+� −10
�� = ( ) (7)
�
Où ISERS est lřintensité Raman, a le rayon de courbure de la fonction de rugosité sur la

surface, et r représente la distance entre la surface et l'adsorbat.
[64]
δřeffet géométrique (ou effet dřantenne) qui est relié aux propriétés géométriques de
la surface métallique (L. Chen et al.), contribue aussi à lřexaltation électromagnétique. En
présence de champ électromagnétique, les charges positives et négatives se déplacent à la
surface du métal (comme dans le cas de la déformation du nuage électronique dřune
molécule) ce qui conduit à lřapparition dřun moment dipolaire induit. Ces charges se
localisent en particulier sur les régions de fortes courbures présentes sur la surface et donc sur
les excroissances et les interstices. Il en résulte un champ électromagnétique à la fois très
intense mais aussi très localisé dans ces régions.
5.2. L’effet chimique
Selon Moskovits (Moskovits et al. 1985), lřeffet chimique fait intervenir la

modification du tenseur de polarisabilité Raman résultant de lřinteraction des nuages
électroniques de lřanalyte avec la surface métallique. Ce changement peut, selon les cas, soit
diminuer (« quenching ») lřintensité du signal Raman, soit lřexalter.
Le transfert de charge (électrons ou trous) est le plus exploité pour expliquer le

changement de polarisabilité dans la théorie et l'expérience de SERS. Kerker (Kerker et al.
1991), E.C.Le Ru et P.G.Etchegoin (Le Ru et al. 2008) ont étudié en détails ce mécanisme de
transfert de charge entre la molécule et la surface métallique. Il y a un transfert de charge, soit
du métal vers la molécule, soit de la molécule vers le métal (Lombardi et al.), ce transfert peut
être résumé selon deux types de mécanismes:
a) la perturbation de la structure électronique de la molécule, en présence du métal, par

transfert d'électrons, à partir du niveau de Fermi du métal, à une orbite moléculaire
non occupée de la molécule sonde ou vice versa (Arenas et al.), ensuite une
modification du tenseur de polarisabilité sřopère. Dans une telle situation la molécule
nřétablit pas de liaison covalente avec le métal. Dans les cas les plus favorables, la
création de tels niveaux peut placer le système dans des conditions proches du Raman
résonant.
b) la production de la diffusion Raman résonante par les complexes métalliques formés

avec la molécule adsorbée. Ce phénomène est obtenu lorsque la différence dřénergie
[65]
entre le niveau de Fermi du métal et lřorbitale la plus haute occupée (HOεO) ou la

plus basse inoccupée (LUMO) est proche de celle de la lumière excitatrice. Dans ce
cas, le niveau de Fermi peut servir de canal. En effet, un électron peut être transféré
entre de lřHOεO vers un niveau inoccupé du niveau de Fermi (ou dřun niveau occupé
en dessous du niveau de Fermi vers la LUMO) (Figure 21). Le transfert de charge du
métal vers les matériaux adsorbés est abouti pour le cas des molécules chemisorbées
sur le substrat du métal (par effet tunnel en cas de physisorption, et par hybridation
pour les molécules chimisorbées).
Figure 21: Diagramme d'énergie illustrant l'énergie de bandes de la nanostructure du métal et l'espace HOMO-
LUMO de la molécule adsorbée.
La molécule peut être chimiquement adsorbée sur la surface métallique, donc former
une nouvelle liaison chimique qui se manifeste par lřapparition de nouveaux pics
caractéristiques, des changements de fréquences des modes habituellement observées ou bien
des modifications dans les intensités relatives des pics, avec amplification sélective de
certaines vibrations dans le spectre SERS (Figure 22). En effet, cette différence entre les
spectres Raman classique et les spectres Raman SERS rend parfois lřinterprétation des
spectres SERS difficile, due au fait des orientations moléculaires à la surface du substrat
SERS. Les excitations par transfert des charges entre le métal et les molécules adsorbées
peuvent provoquer une exaltation de lřordre de 102 (Persson et al 1981).
[66]
Figure 22 : Spectre SERS de l’acide benzoïque (C6H513COOH) greffé sur un film d’argent rugueux. Apparition
de la bande Ag-Cl à 214 cm-1 (Imai et al 1998).
5.3. Types de substrat SERS actifs :
Pour obtenir une amplification optimale, une résonance entre le laser et la surface
métallique est nécessaire. La taille et la forme sont des facteurs importants pour
lřamplification du signal Raman. δřeffet SERS varie avec le métal utilisé. Il existe plusieurs
substrats SERS actifs qui sont classés selon leur :
 Nature des métaux (Au, Ag, Cu, Pt, Pd)

 méthodes de fabrication des surfaces μ εétal Ŗdépoliŗ, dépot sur lames, surfaces
métallisées après photogravure, gravure chimique (solutions colloïdales : Argent, Or),
Sol-gels…
 formes μ Surface, feuilles, solutions colloïdales (sphère, cube, étoiles…) couches
minces…
δes colloïdes dřor ou dřargent sont largement utilisés pour lřobtention dřun effet SERS
significatif, soit en solution (mélange avec la molécule cible) ou bien déposés sur des
substrats (plans, poreux, rugueux, nanostructurés, fonctionnalisés.).
Les nanoparticules d'or (AuNPs) possèdent des propriétés physiques et chimiques qui
en font d'excellents éléments pour lřélaboration de nouveaux capteurs chimiques et
biologiques(Jain et al 2007; Saha et al. 2012) :
 synthétisables de façon simple et leurs solutions colloïdales sont très stables.
[67]
 possédant des propriétés optoélectroniques uniques, elles fournissent un grand rapport

surface/volume avec une excellente biocompatibilité en utilisant des ligands
appropriés.
 ces propriétés peuvent être facilement ajustées en faisant varier leur taille, leur forme
et le milieu environnant. Par exemple, l'existence dřune de liaison entre l'élément de
reconnaissance et l'analyte peut altérer les propriétés physico-chimiques des AuNPs,
telles que la bande de plasmon de résonance, la conductivité, les propriétés redox, etc.
 Elles offrent aussi une plateforme adéquate pour la multifonctionnalisation avec une
large gamme de ligands organiques ou biologiques formant des liaisons sélectives
pour la détection de molécules et de cibles biologiques.
 Le rendement de la luminescence des nanoparticules est supérieur à celui du métal
massif (de lřordre de 10-10) tout en restant faible (de lřordre de 10-4-10-5).
6. Techniques de fabrication de Substrats SERS : nanoparticules d’or
Nous avons montré précédemment lřimportance de lřétat de surface sur les

mécanismes dřamplification de la diffusion Raman. Compte tenu de la diversité des substrats
élaborés, leur classement nřest pas toujours aisé et plusieurs manières de procéder sont
possibles. De nombreuses méthodes de synthèses, chimiques ou lithographiques (Wiley et
al.), se sont développées pour lřélaboration de ces substrats « SERS-actifs ». Ces surfaces sont
souvent élaborées à partir de métaux nobles (or ou argent, ou même parfois un mélange des
deux).
L'utilisation des nanoparticules d'or (AuNPs) date depuis des siècles en raison de leurs
propriétés optiques et décoratives. Tandis que le concept de nanoparticules est beaucoup plus
récent, εichael Faraday fut le premier à étudier la formation de colloïdes dřor (Michael et al.
1857). Ainsi, l'intérêt pour les nanoparticules d'or est extrêmement lié à l'exploitation de leurs
propriétés plasmoniques. Ces nanoparticules dřor qui ont lancé les nanotechnologies, suscitent
encore un vif intérêt aujourdřhui et représentent une grande partie des travaux rapportés
notamment dans le domaine des applications telles que la détection, lřoptique, la catalyse, la
détection des molécules uniques (Lamy et al. 2013). Leur large gamme de taille leur
confèrent une bonne biocompatibilité et biodisponibilité. Elles sont utilisées dans plusieurs
domaines et particulièrement dans les applications biologiques. La propriété intrinsèque la
plus remarquable des nanoparticules dřor reste toutefois la SPR qui leur procure des
propriétés applicables dans les techniques de diffusion de la lumière. Les solutions
[68]
colloïdales dřor disposent dřune bande plasmon autour de ηβ0 nm. En effet, leurs possibilités
dřapplications sont non seulement liées aux propriétés intrinsèques de leur cœur métallique
mais aussi et surtout à leurs énormes capacités de fonctionnalisation (et de
multifonctionnalisation) en surface par greffage de molécules soufrées (notamment
biologiques). Dřoù lřintérêt croissant pour des stratégies de fabrication de nanostructures en or
faciles à mettre en œuvre et peu coûteuses.
δa méthode la plus utilisée pour la synthèse des nanoparticules est la réduction dřions
AuCl4 - par différents types de réducteurs. Cřest une méthode facile qui permet dřobtenir des
particules dřor monodisperses entre 3 et 160 nm, de morphologies différentes. Cette réduction
aisée dřAu (III) ou Au (I) sous forme de sels (HAuCl4, AuPC6H5CH2NH2 (Bartlett et al.
1978)) en Au (0) par différents types de réducteurs (NaSCN+K2CO3, phosphore blanc, acide
ascorbique + K2CO3, PPh, NaBH4, citrate de sodium (Horisberger et al. 1983; Hu et al.
2015; Roth et al. 1982)) est due au fait que lřor est le plus électronégatif des métaux de
transition. δes différentes méthodes de synthèse de colloïdes dřor sont basées sur le contrôle
de la réduction de lřAu (III) en Au (0). δřacide tétrachloroaurique (HAuCl4) est le sel dřor le
plus utilisé dans ces méthodes. La taille (variant de 2 à 200 nm), la forme (cubes, des lignes
finies, sphères ou des triangles (Tsuji et al.; Sun et al.; Ahmed et al.)) et le taux dřagrégation
des nanoparticules (Faulds et al.), dépendent considérablement des paramètres physiques
(concentration, température et vitesse dřagitation), de la nature du réducteur et de lřordre de
lřaddition des réactifs.
Figure 23 : Structure des nanoparticules d’or.
[69]
δes colloïdes dřor ont une charge négative attribuée aux ions ��2− adsorbés sur la
surface du noyau dřor pur (0). Ces ions protègent de lřagrégation par répulsion électrostatique
(Figure βγ). Toutes les synthèses de colloïdes dřor sont sensibles à lřanion
(chlorure>bromure>iodure) qui assure leur stabilisation (Munro et al.) en compressant la
double couche ionique et réduisant donc les répulsions électrostatiques. La déstabilisation du
système aboutit à une agrégation qui sřaccompagne dřun changement de couleur de la
solution et éventuellement dřune sédimentation de lřor (Saha et al.). Les thiols sont des types
de stabilisant employés pour les nanoparticules dřor de nřimporte quelle taille du fait de la
plus grande force de la liaison Au-S. La stabilisation de AuNPs par des thiols fut pour la
première fois publiée en 1993 par Mulvaney et Giersig (Giersig et al 1993) qui démontraient
la possibilité dřutiliser des thiols de chaînes carbonées de différentes longueurs. Mais cette
méthode rend les nanoparticules moins sensibles en comparaison aux autres substrats SERS,
ceci étant dû à la présence des ligands thiolés à la surface. Ce ligand rend les nanoparticules
très stables, en conséquence, pour les utiliser, il faut une seconde fonctionnalisation (obtention
des structures complexes), ce qui induit une augmentation de la distance entre la molécule et
la nanoparticule (moins de sensibilité SERS). Ainsi, ils sont également) peu solubles dans
lřeau (agrégation dans les milieux aqueux) car leur solubilité dépend du pH (Simard et al.).
Par exemple, les AuNPs fonctionnalisées par des molécules porteuses de groupements amines
sont solubles en solution acide, tandis quřavec une fonction acide carboxylique, elles sont
solubles en milieu basique.
Il existe encore une autre méthode utilisée de nos jours, pour lřélaboration des
nanoparticules stables : la synthèse par réduction dřun dérivé dřor au degré dřoxydation III
(HAuCl4) en présence de citrate de sodium dans lřeau, si lřon excepte la réduction en présence
de NaBH4. δe citrate et le produit de son oxydation (le dicarboxylate dřacétone) agissent
comme des agents protecteurs. Cette méthode ne nécessite donc aucun recours à dřautre
stabilisant, comme cřest souvent le cas. Comparée à dřautres, telles que la stabilisation par des
thiols, elle se révèle plus intéressante pour certaines applications, comme la spectroscopie
Raman exaltée de surface. Elle a été mise au point, pour la première fois, par Turkevich en
1λη1, les nanoparticules obtenues ont un diamètre de lřordre de 10 à β0 nm (Turkevich et al
1951). Et en 1973, Frens (Roth et al 1982) reprend ce procédé, en modifiant le rapport citrate
de sodium/or, pour obtenir des nanoparticules de taille variant de 16 à 147 nm. Ceci a permis
[70]
à ce procédé dřêtre plus performant pour la préparation de matériaux AuNP-ligand exigeant

une quantité contrôlée de ligands en surface.
Il existe aussi dřautres ligands contenant du soufre utilisés pour stabiliser des AuNPs,
tels que des xanthates, des disulfures et des di-, tri-et tétrathiols (Saha et al.). δřacétone aussi
a été utilisée comme agent réducteur au lieu du citrate pour la synthèse des nanoparticules
dřor. Ces nanoparticules sont stables en présence de BH4 - ou dřHCl ( Li et al. 2003). δřiode
peut aussi remplacer les ions citrate à la surface des nanoparticules dřor par addition de KI,
menant ainsi à la formation de superstructures (Cheng et al 2003).
Au-delà des synthèses de nanoparticules par voie chimique évoquées ci-dessus, celles-
ci peuvent être obtenues par des méthodes physiques, telles que les techniques lithographiques
(photolithographie, la lithographie à faisceau dřélectrons (EBδ pour Electron Beam
δithography) et la lithographie par faisceau dřions focalisés (FIB), les techniques
microscopiques (à effet tunnel, à force atomique ou optique en champ proche) ou le dépôt par
ablation laser (Marinakos et al 1999). Ces méthodes servent à fabriquer des nanostructures de
taille, forme et espacement contrôlés mais sur de petites surfaces. Néanmoins, la plupart des
méthodes de synthèse physique demande la nécessité dřune enceinte expérimentale
appropriée, plus difficile à mettre en œuvre surtout si dřautres techniques de caractérisations
in situ sont couplées avec le dispositif. Donc le coût élevé et la production en série restent de
sérieux défis pour de gros volumes industriels (par exemple EBδ et la FIB). Dřautre part, pour
les techniques microscopiques, les particules sont obtenues sous forme de films, ce qui limite
leur utilisation. En effet, pour le cas des méthodes chimiques, la synthèse des nanoparticules
est plus facile puisquřelle se base en général sur lřassociation de flux de réactifs en présence
dřune solution.
Conclusion et résumé
La spectroscopie Raman se base sur le phénomène de diffusion inélastique de la

lumière (échange dřénergie) lors de son interaction avec la matière. Elle permet dřobtenir des
informations très fines (empreinte) sur la nature chimique des matériaux. La diversité des
échantillons analysables (liquides, gazeux ou solides) ainsi que son caractère non-destructif,
expliquent sa large diffusion dans des domaines scientifiques divers et variés (physique,
chimie, biologie, médecine, archéologie etc.).
[71]
Cependant, cette technique dřanalyse présente quelques limites (résolution spatiale, signal
faible) qui doivent être surpassées (exalter la diffusion Raman). Ceci est possible en utilisant
la diffusion Raman exaltée de surface ou SERS qui a lieu lorsque la molécule est très
proche, voire adsorbée sur une surface métallique rugueuse.
δřeffet SERS est capable dřaugmenter lřintensité du signal Raman dřun facteur de
lřordre de 106 et pouvant atteindre 1014 à 1015. Le SERS a pour origine deux types
dřexaltation, électromagnétique mettant en jeu les propriétés optiques inhérentes aux métaux
que sont les plasmons et chimiques qui met en jeu
interaction chimique entre la molécule et la surface métallique (transfert de charge entre le
métal et la molécule.).
Dans un premier temps, nous nous sommes donc attachés à développer des
nanoparticules dřor non fonctionnalisées afin de détecter les pesticides directement par la
spectroscopie Raman.
Les surfaces SERS actives ont différentes tailles, formes et types. Les surfaces actives
à base de colloïdes dřor présentent plusieurs avantages. Dřautre part, Il existe plusieurs
méthodes pour les fabriquer. δes méthodes chimiques sont les plus facile à mettre en œuvre,
moins coûteuses puisquřelles se basent en général sur lřassociation de flux de réactifs en
présence dřune solution.
[72]
Objectif de la thèse
Objectifs de la thèse :
Vu le manque de données pour la surveillance des pesticides, il est indispensable de

développer un outil simple, sensible, non ciblé, plus rapide et moins coûteux capable
dřapporter des informations sur la contamination des eaux par toute une variété de pesticides,
organophosphorés et carbamates. La spectroscopie Raman, qui est une technique facile,
simple, non destructive, rapide et moins coûteuses, peut être un bon outil pour la détection et
la quantification des molécules organiques comme les polluants et plus précisément les
pesticides. Cependant, pour une limite de détection trop élevée (analyse de traces) il est
nécessaire dřamplifier le signal Raman. Cette amplification est rendue possible par
lřutilisation de nanoparticules métalliques au sein notamment de colloïdes. Elle dépend non
seulement du type, de la taille et du milieu environnant des colloïdes mais aussi de la nature
de la molécule cible.
δřACHE est la principale cible de plusieurs types de pesticides (organophosphorés,

carbamates, pyréthrôides, triazines, le paraquat…). δe couplage entre lřactivité enzymatique
de lřACHE et la spectroscopie Raman exaltée de surface peut être utilisé pour la détection de
tous les polluants inhibant son activité (pesticides en grande partie) tout en respectant
lřobjectif de notre travail μ lřélaboration dřun outil de détection simple, rapide, non ciblé,
moins coûteux.
Cřest dans ce contexte, que notre étude, sur la diffusion Raman exaltée de surface,
pour la détection des pesticides par le suivi de lřactivité enzymatique de
lřacétylcholinestérase, sřest inscrite et sřest tournée vers lřutilisation de nanoparticules dřor en
solution.
[73]
Partie B
M)SE EN ŒUVRE DE
BIOCAPTEURS ET
TECHNIQUES DE
CARACTERISATION
[74]
Partie B MISE EN ŒUVRE DE BIOCAPTEURS ET TECHNIQUES DE CARACTERISATIONS
δřobjectif de cette partie est de présenter les protocoles expérimentaux utilisés pour les
différents systèmes étudiés dans le cadre de cette thèse, et les dispositifs expérimentaux
employés.
IV. Protocoles expérimentaux
1. Synthèses des nanoparticules d’or
1.1.Choix de la méthode de synthèse
Comme nous lřavons précédemment rappelé les nanoparticules dřor peuvent être
élaborées par un large panel de méthodes quřelles soient physiques ou chimiques. Pour notre
travail, nous nous sommes focalisés sur les méthodes de synthèse chimiques. Selon toutes les
approches, la préparation des colloïdes dřor stables, nécessite la réduction dřun sel dřor en
présence dřun stabilisant. δa réduction par le borohydrure de sodium (Brust) et la réduction
par le citrate de Turkevich produisant des nanoparticules aux caractéristiques différentes sont
les méthodes les plus répandues. Nous allons maintenant les développer pour expliciter les
raisons de notre choix.
La réduction par le NaBH4 mène donc à des nanoparticules de différentes tailles et

formes, mais elle présente des désavantages tels que la perte dřaccessibilité des sites de
greffage, après la réduction du métal. La méthode utilisant le citrate de sodium permet
dřobtenir des particules de diamètre plus grand dřenviron β0 nm. δa reproduction de ces deux
types de synthèse, nous a permis, dans les deux cas, dřobtenir des particules de tailles
différentes et dispersées. Cependant, la voie citrate est plus adaptée à la réaction avec
différents ligands sur la surface des particules. Avec la voie NaBH4, la quantité de thiols en
solution est généralement en large excès par rapport à celle des greffés, de telle sorte que le
greffage dépend dřune réaction dřéchange dynamique entre les thiols en excès en solution et
les thiols greffés en surface. Dans ce cas, la quantité de molécules adsorbées peut varier très
significativement de celles qui sont en solution. δe contrôle de lřinteraction de la
nanoparticule avec dřautres molécules devient alors très difficile. Ce problème est moins
probable pour la voie citrate, car le citrate de sodium agit à la fois comme agent réducteur et
comme agent stabilisant lors de la synthèse, limitant ainsi au maximum le nombre de réactifs.
Cřest la raison pour laquelle, la méthode par la voie citrate a été choisie.
[75]
Cette voie mène cependant à des solutions moins concentrées. Ceci ne présente aucun
problème dans les mesures où les applications biologiques ne nécessitent que de faibles
concentrations. δes nanoparticules dřor utilisées sont donc obtenues par la synthèse suivant la
méthode or/citrate.
L'avantage de cette méthode est lřutilisation de citrate de sodium agissant, à la fois

comme agent réducteur et comme agent stabilisant lors de la synthèse, limitant ainsi au
maximum le nombre de réactifs. Il est ainsi possible dřobtenir des particules de tailles très
variées, monodisperses, avec une forme sphérique. Cette technique présente un autre
avantage, à savoir que l'agent stabilisant en surface des nanoparticules (le citrate de sodium)
est une molécule facile à éliminer (plasma cleaner) ou à remplacer car de nature organique est
liée aux particules par une simple attraction électrostatique.
1.2. Mode opératoire
Comme nous lřavons expliqué précédemment, dans le cadre de notre étude, les
nanoparticules d'or utilisées pour la spectroscopie Raman SERS, sont synthétisées selon la
méthode « bottom up » de Turkevich et al. (Turkivich et al 1951) dont il existe de nombreuses
variantes (Aiken et al 1999; Bönnemann et al 2001; Chu et al. 2009; Lee et al 1982). Cette
méthode est basée sur la réduction in situ de sels dřor en présence de citrate de sodium. De
plus les molécules de citrate et ses dérivés, vont se fixer sur la surface des particules en
formation, jouant le rôle de stabilisant et stoppant ainsi la croissance du métal à une échelle
nanométrique. En jouant sur le ratio sel métallique/citrate, il est donc possible d'obtenir des
nanoparticules de tailles diverses. δřutilisation de citrate de sodium qui agit à la fois comme
agent réducteur et comme agent stabilisant lors de la synthèse, limite au maximum le nombre
de réactifs et rend cette méthode plus avantageuse. La figure 24 présente le montage à reflux
employé pour la synthèse des nanoparticules dřor.
 La verrerie est tout d'abord nettoyée à l'eau régale (HNO3 1:3 HCl) afin d'éliminer
toutes les impuretés qui risqueraient de servir de point de germination et
dřagglomération des particules en formation.
 Synthèse par la voie citrate μ Dans un ballon de η00 mδ équipé dřune colonne
réfrigérante, 500 ml d'une solution de 0,01% dřacide tétrachloroaurique trihydrate
[76]
(HAuCl4, 3H2O) est chauffé à reflux. Lorsque l'ébullition est bien effective, une
quantité ajustée d'une solution à 7,5 ml de citrate de sodium (C6H5Na3O7) à 1% est
rajoutée dans le milieu réactionnel. Le mélange est agité magnétiquement à vitesse
modérée et chauffé à reflux durant 20 minutes puis refroidi à température ambiante.
La solution initialement jaune change progressivement de couleur pour devenir
rouge-bordeaux indiquant ainsi la formation de colloïdes dřor.
Figure 24 : Montage à reflux utilisé pour la synthèse de nanoparticules.
1.3. Caractérisation des nanoparticules d'or synthétisées
Nous avons utilisé deux méthodes d'analyse pour caractériser la suspension de

nanoparticules dřor synthétisées μ la microscopie électronique à transmission (TEε) et la
spectrométrie dřabsorption UV-Visible. Pour amplifier le signal Raman, les nanoparticules
obtenues ont été centrifugées pour une durée de 20 min à 8000 tours/min. Ensuite le
surnageant a été éliminé et les nanoparticules restantes sont placées quelques minutes dans le
bain à ultrasons (Fisherbrand, S-LINE, 37 kHz).
[77]
1.4. Elaboration de substrats pour la spectrométrie Raman SERS
Pour les mesures SERS, plusieurs paramètres ont été optimisés pour lřobtention de
lřamplification du signal Raman SERS de lřanalyte.
 types de nanoparticules : bâtonnets ou sphères synthétisées par la méthode NaBH4

ou la méthode citrate.
 optimisation des volumes des nanoparticules : pour optimiser le pourcentage des

nanoparticules ajoutées pour lřeffet SERS, nous avons essayé les NPs sans
centrifugation et après centrifugation (temps, volume, lavage). Les conditions
optimales retenues sont : un volume initial de NPs de 1mL centrifugé pendant une
durée de β0 min à 8000 tours/min, ensuite lřélimination de λ00µδ de surnageant.
 type de couplage : couplage par des dépôts de couches successifs (goutte de NPs
après séchage + goutte dřanalyte +une goutte de NPs) ou couplage par mélange de
nanoparticules avec lřanalyte avant dépôt sur la lame. δe deuxième couplage est
retenu car il nous a permis une bonne amplification due à lřinteraction des NPs avec
lřanalyte.
 l’analyte en solution ou après séchage : après chaque mesure en solution, lřanalyte

exposé au faisceau laser se sèche et la goutte nřest pas stable. Avec le séchage
lřéchantillon est stable, donc nous avons travaillé avec séchage des gouttes. Nous
avons aussi testé la vitesse de séchage de la goutte (changement de la température), le
séchage à γ7°C sřest révélé optimal parce que nous travaillons avec des enzymes
(sensibles à la température).
 le type de lame utilisée comme support de l’analyte : sur lame de verre normale, la
goutte sřétale sur la surface et on obtient une inhomogénéité de la dispersion des
nanoparticules. Sur lame de verre fonctionnalisée par une molécule hydrophobe (le
groupement silane est connu pour réagir avec les groupes hydroxyles présent à la
surface du verre et donner les propriétés hydrophobes au substrat) , la
fonctionnalisation empêche lřinteraction de la solution avec la surface (Cras et al.). Par
conséquent, la ségrégation de la surface vis-à-vis de la solution, provoque une grande
agrégation des nanoparticules et donc un manque dřhomogénéité des nanoparticules
[78]
avec lřanalyte. Sur surface d’aluminium utilisée à la fois comme support et comme
substrat métallique, la goutte est plus homogène grâce à lřinteraction de lřanalyte avec
les nanoparticules et de plus cette surface métallique permet la réflexion de la lumière
(Figure 25).
Figure 25: Exemple des images microsocpique (x50) d’une goutte de solution deposée sur la lame. De gauche à
droite : lame de verre normale, lamme de verre fonctionalisée, surface en aluminium.
2. Préparation des solutions:
2.1. Tampon phosphate de potassium
Nous avons préparé la solution tampon pour conserver lřenzyme en réalisant un

mélange entre un acide faible et sa base conjuguée. La solution a été tamponnée à un pH égal
au pKa du couple. Pour notre cas, nous avons choisi le tampon phosphate de potassium qui
ne contient pas de sel parce que la présence du sel dans le tampon va provoquer lřagrégation
des nanoparticules lors des mesures SERS.
 Mode opératoire :
- Solution I : 0.5L de 1M phosphate de potassium monobasique (H2KO4P) à 147.18
g/mol-1
- Solution II : 0.5L de 1M phosphate de potassium dibasique (HK2O4P) à
136.09g/mol-1
- Mélanger 6 mL de solution I (H2KO4P) à 94 ml de solution II (HK2O4P. Compléter
à 1 δ avec de lřeau distillée pour une solution mère de 0.1 ε à pH = 8. Nous avons
dilué la solution mère avec de lřeau distillée pour obtenir le tampon phosphate à
(0.01M) et pH=8 à 25°C.
[79]
2.2. Préparation/stockage de la solution de l’AC(E
δřACHE provenant dřElectrophorus electricus (η00U / mg) a été achetée auprès de

Sigma-Aldrich. Nous avons préparé une solution de cette enzyme dans le tampon phosphate
(0.01ε, pH=8) comme précédemment décrit. Ensuite le volume de 10 U dřACHE a été mis
dans un micro-tube et conservé à -20°C. Pour une utilisation ultérieure, nous décongelons un
micro-tube et nous le diluons dans le tampon.
2.3. Préparation de la solution de l’acétylcholine
δřacétylcholine (ACH) est le neurotransmetteur choisi comme substrat pour la mesure

de lřactivité de lřacétylcholinestérase (ACHE).
δřACH se trouve à lřétat solide sous forme de chlorure dřacétylcholine (ACHCl),

bromure dřacétylcholine (ACHBr) ou iodure dřacétylcholine (ACHI).
δa molécule de lřACH peut être obtenue à partir de la dissociation de ces produits

dans une solution aqueuse. Cette dissociation permet dřavoir le cation ACH+ (le même pour
tous les produits) qui sera utilisé comme substrat biologique.
Le chlorure d'acétylcholine (ACHCl) a été dissout dans le tampon pour obtenir la

solution de lřacétylcholine (ACH). La concentration molaire des solutions a été calculée selon
�
la formule chimique suivante : � = [M] ; avec n : le nombre de moles et V : volume de
�
solution (L). La solution de lřACH a été conservée à 4°C durant lřutilisation sachant quřelle
ne peut être conservée plus de 3h.
2.4. Préparation des solutions de pesticides
δes inhibiteurs dřenzyme utilisés dans notre étude sont : le paraoxon et carbaryl ainsi
que les matières plastiques.
2.4.1. Paraoxon
δřhuile de paraoxon-ethyl utilisée est de pureté ≥λ0% (Figure 26). La dilution de ce

pesticide a été faite dans le tampon et conservée à 4°C pendant 6 mois.
[80]
Figure 26 : Structure de la molécule de paraoxon-ethyl
2.4.2. Carbaryl
La solution mère du carbaryl a été obtenue à partir du carbaryl en poudre (Figure 27)
dissout dans lřéthanol. Ensuite cette solution a été diluée dans le tampon, la dilution de
lřéthanol par dix nous permet dřéliminer son effet sur lřenzyme.
Figure 27 : Structure de la molécule de carbaryl
Les pesticides utilisés et le neurotransmetteur ACH ont été également achetés chez
Sigma-Aldrich.
3. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E par la spectroscopie

Raman SERS
3.1. L’AC(E non immobilisée
δřactivité de l'ACHE est mesurée par la spectrométrie Raman afin de

déterminer les conditions optimales requises pour la détection de ces inhibiteurs.
3.1.1. Activité de l’AC(E en absence de pesticides
En absence des inhibiteurs, la molécule de lřacétylcholine se transforme en acide

acétique et choline en présence de lřenzyme ACHE, selon la réaction suivante (Figure β8) :
[81]
O O
CH3 CH3
ACHE + H2O
N+ + N+
O CH O- HO
CH3 CH3 CH3
3
CH
Acetylcholine acide acetique choline CH3
3
Figure 28: Réaction d’hydrolyse de l’ACH par l’ACHE
La choline sera détectée par la spectroscopie Raman en amplifiant son signal par la
présence des nanoparticules d'or. δřactivité de lřenzyme est mesurée à partir de la présence
des bandes de la choline dans le spectre Raman SERS de lřanalyte (Figure βλ).
Figure 29: Schéma de l’expérience SERS sur l’échantillon de la choline obtenue par l’hydrolyse de l’ACH en
présence de l’ACHE non inhibée.
 Mode opératoire : 5 l de la solution dřACHE a été ajouté à η µδ de la solution de

l'ACH dans PP. Après la durée dřincubation choisie, les spectres SERS du mélange
résultant ont été enregistrés après addition des NPs.
3.1.2. Activité de l’AC(E en présence de pesticides
En présence des pesticides, lřacétylcholine se dégrade par blocage de lřactivité

enzymatique de lřACHE. Notre objectif est de détecter les pesticides en se servant de ce
changement dřactivité de lřACHE. En présence des pesticides, lřacétylcholine ne subit pas de
transformation et donc son spectre sera caractérisé par effet Raman SERS (Figure 30).
[82]
Figure 30 : Schéma de l’expérience SERS sur l’échantillon de l’ACH non transformé par l’ACHE inhibée.
 Mode opératoire : 5 l de la solution de lřACHE a été ajouté à 5µl de la solution de

pesticide. Après inhibition, 5 µL de 1 mM d'ACH dans PB ont été ajoutés à 5 µL de ce
mélange. Les spectres SERS du mélange résultant ont été enregistrés après addition
d'ACH.
3.1.3. Activité de l’AC(E en présence de plastiques avec additifs
Le biocapteur a été testé pour la détection de potentiels inhibiteurs contenus dans les
matières plastique. En effet, tous les polymères plastiques utilisés dans la vie de tous les jours
contiennent de nombreux additifs mais avec des compositions qui sont rarement connues.
Pour ce teste dřinhibition, nous avons mesuré lřactivité de lřACHE en présence des formes
suivantes de plastiques :
 Le PE-HD ou polyéthylène à haute densité : plastique très utilisé pour la fabrication

des bouteilles de lait. Il a une très bonne compatibilité avec lřusage alimentaire. Le
morceau testé dans notre étude est un morceau de récipient de stockage, type bidon
transparent.
 Le PEBD ou LDPE : ou polyéthylène basse densité, plus souple que le PEHD, il est
utilisé pour emballer les sacs de pain, les aliments congelés, les tasses destinées à
contenir des aliments chauds. Les différents échantillons testés ici sont 1) un sachet
alimentaire commercial et 2) un film extrudé par le Centre de Transfert et de
Technologie du Mans à partir de granules PE pur d'origine bio-sourcée, sans additifs.
[83]
 Le PP : encore appelé polypropylène, employé pour les gourdes ou les barquettes

plastiques micro-ondables. Il serait compatible pour les usages alimentaires mais il se
dégrade au fil du temps et peut relarguer des molécules de dégradation dans les
aliments. Les trois PP testés sont des emballages commerciaux domestiques différents
(un sachet, une bouteille, un film).
δřenzyme a été incubée avec des morceaux de plastiques, ensuite son activité a été
mesurée en ajoutant le neurotransmetteur ACH à cette enzyme. Les mesures par la
spectroscopie Raman SERS sont réalisées par la suite.
 Mode opératoire μ 100 l de 1 U ml-1 dřACHE a été ajouté à β0 mg de chaque forme

de plastiques (PP, PEHD, PE, PELD et PELD-Bio), dans 0,01 M PB (pH 8) 37 ° C,
pendant plusieurs jours (0-11j). Ensuite, 5 µL de l'ACH dans PP ont été ajoutés à 5 µL
de ce mélange. Les spectres SERS du mélange résultant ont été enregistrés après
addition d'ACH.
Remarques : aucune des compositions des polymères d'origine commerciale nřest connue à
lřexception du film en PELD bio-sourcé qui est pur, sans aucun additif.
3.2. L’AC(E )mmobilisée sur la surface d’or
δes enzymes sont immobilisées en sřappuyant sur des méthodes physico-chimiques de

confinement de la biomolécule au sein dřédifices à β ou γ dimensions. Elles doivent être
suffisamment stables, tout en conservant leur propriétés structurales; bien entendu, la
cinétique, la sélectivité et la réactivité des enzymes peuvent être altérées et donc lřefficacité
catalytique également. Avec tout cela, le confinement des biocatalyseurs doit permettre
lřaccès du substrat au site actif ou au site de reconnaissance de lřenzyme. Diverses techniques
dřimmobilisation des enzymes ont été développées ces vingt dernières années (Kumar et al.
2009). On distingue plusieurs techniques dřimmobilisation des bioéléments sur le
transducteur μ lřencapsulation, le greffage sur monocouches auto-assemblées, lřadsorption
(physisorption), la réticulation, la formation dřun lien covalent et les assemblages
supramoléculaires...
Le tableau λ expose une comparaison entre les principales méthodes dŘimmobilisation

des biorécepteurs utilisées. Nous nous intéresserons à la technique dřimmobilisation par
couplage covalent pour mettre en œuvre notre biorécepteur. Cřest la technique qui permet une
forte immobilisation de lřenzyme à faible coût.
[84]
Tableau 9 : Comparaison entre les différentes techniques d’immobilisation des biorécepteurs.
Technique Avantages Inconvénients

d’immobilisation
Adsorption -Simple -désorption possible
(liaison réversible) -rapide -perte à chaque lavage
-bon rendement (1g/g)
Liaison covalente -plus stable -Coût élevé
-Résistance après lavage -difficile à mettre en œuvre
-irréversibilité de la liaison covalente
-faible rendement
Incubation -simple -dénaturation de lřenzyme pour le gel
-protège les propriétés de inorganique
lřenzyme en cas de gel -limitation à des substances de faible poids
organique moléculaire
-la sensibilité du gel à des agents complexes
Encapsulation -fiable -complexe

-accessibilité des polluants
δřor est le substrat le plus utilisé pour fabriquer des biocapteurs par auto-assemblage
des multicouches ou des monocouches. En effet, les substrats en or possèdent différents
avantages :
 Ils permettent une biocompatibilité qui facilite lřallongement de la durée de vie des
protéines immobilisées à leur surface.
 Ils possèdent une grande surface spécifique favorisant lřadsorption dřune grande
quantité de protéines à la surface.
Grâce à leur conductivité, ils se comportent comme des électrodes. Leurs propriétés
physiques et optiques leur permettent dřêtre utilisés dans différentes techniques analytiques
(SPR, QCM). Ils sont aussi souvent utilisés pour augmenter la sensibilité des mesures dans les
biocapteurs (SERS).
δa modification de surface dřor se fait essentiellement par des monocouches

autoassemblées (SAε). Une grande partie des SAε formés sur des surfaces dřor se fait avec
des thiols car lřor peut former aisément des liaisons covalentes avec des atomes de soufre.
[85]
3.2.1. Modification de la surface d’or
δa surface dřor a été modifiée en formant une couche active par lřélectro-greffage
dřune molécule organique sur électrode métallique en or. δřélectro-greffage, caractérise une
réaction électrochimique permettant la formation dřune couche organique sur la surface
conductrice via une liaison covalente (Bélanger and Pinson). Cependant, la surface de
lřélectrode est modifiée par la formation dřune liaison covalente très résistante avec le radical
formé. Il existe une grande variété de voies électrochimiques et de molécules permettant
lřélectro-greffage (par voie oxydante, réductrice,…, amine, vinyle, etc ). Nous avons choisi de
fonctionnaliser la surface dřor par réduction électrochimique des sels dřaryldiazonium, en
nous inspirant des travaux de Kengne-Momo et al. (Kengne-Momo), pour maintenir lřobjectif
de notre projet, à savoir lřélaboration dřun biocapteur sensible, facile à mettre en œuvre et peu
coûteux.
Cette méthode met en jeu le greffage covalent dřun radical dřacide sulfonique à la
surface dřor. Ce radical est formé par la réduction électrochimique des sels de diazonium
aromatiques en présence de nitrite de sodium, en solution dans dřacide chlorohydrique, selon
la réaction suivante (figure 31):
 Formation des sels aryldiazonium :

NaNO2 + HCl NaCl + HNO2
� + �� − H2O + +� = O + �� −
�
∣
R-Ar-�H2 + +�O → R- Ar-� − +� = O → � + + R-Ar-�H-�O R-Ar-�=�-OH
∣
�
+� +
R-Ar-�=�-OH → R-Ar-N=N-�+ H2 → H2O + R-Ar-�=� + �� −
R-Ar-�=� + R-Ar-N+≡N
-Formation du Radical par application dřun potentiel réducteur :
R-Ar-�2+ �� − + + 2e + 2H+→ R-Ar• + H• + N2 + HCl
Figure 31 : Préparation et réaction pour l’obtention d’aryles radicalaires à partir d’un composé de
type R-Ar-NH2
[86]
Il a été démontré que la modification de lřélectrode par une couche organique selon ce
procédé se fait de façon irréversible et passive (au sens dřun greffage homogène) (Mathieu et
al 2007). Nous avons utilisé une molécule R-Ar-NH2 ayant pour radical le chlorure de
sulfonyle (-SO2Cl) afin quřelle puisse se transformer, par la suite, en sel dřaryldiazonium
dont le groupement R est réactif à ŔOH, molécule très réactive avec les enzymes et al 1998).
δřactivation de la surface Ar-SO3H en Ar-SO2Cl, a été réalisée en se basant sur des travaux
précédemment effectués au sein du laboratoire de chimie de l řIεεε (Chen et al. 2008;
Esnault et al. 2013; Kengne-Momo et al 2011). La formation de cette couche permet la
réaction avec lřenzyme et donc la fonctionnalisation de la surface de lřélectrode. δa figure γβ
résume les étapes de la modification de la surface dřor utilisée, pour lřélaboration du
biocapteur.
Figure 32: Représentation schématique de la modification de la surface d’or utilisée.
[87]
3.2.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E
Nous avons développé un biocapteur qui nous permettra la détection de lřactivité

enzymatique de lřACHE en solution (en présence et absence des inhibiteurs de lřACHE),
selon la réaction décrite dans la Figure β8. δřACH est utilisé comme substrat pour mesurer
lřactivité de lřACHE par la spectroscopie Raman SERS (Figure γγ).
Figure 33: Mesure de l’activité de l’ACHE immobilisée sur la surface d’or en solution.
L'eau utilisée pour la préparation des solutions et pour le nettoyage approprié est de
l'eau Milli Q® ultrapure.
 Mode opératoire : lřenzyme immobilisée sur la surface dřor est trempée dans 2 ml de
la solution de pesticide (pour le cas dřune inhibition) ou conservée dans PP. Ensuite,
cette surface est rincée avec du PP, et nous avons ajouté 5 µL de l'ACH sur cette
surface. Après la réaction de lřACH avec la surface, nous avons récupéré lřanalyte
pour les mesures Raman SERS (Figure 33).
4. Mesure de l’activité de l’AC(E par la diffusion de lumière DDL
Pour cette étude, nous avons utilisé des nanoparticules dřor et argent (β0 ; 40 et
80nm), revêtues de citrate dans lřeau, achetées auprès de la société BBI-Solutions (Tableau
10).
[88]
Tableau 10. Concentration et potentiel Zeta des nanoparticules utilisées.
Diamètre des particules Nombre de particules/ml Nombre de particules Potentiel Zeta en (mV)
(nm) utilisés en
suspension/ml
20 (Au) 7.00x1011 7x1011 -41.4
40 (Au) 9.00x1010 45x109 -44.0
80 (Au) 1.10x1010 1.1x109 -52.8
Ag 40 et 80 1.10 x 109 1.1x108 -
Ag 20 7.00 x 1010 7x1010 -
Nous avons étudié lřeffet de lřactivité enzymatique de lřACHE sur la stabilité des
nanoparticules. δes nanoparticules sont soumises à un phénomène majeur dřinstabilité
(lřagrégation), susceptible de nous permettre de distinguer les deux cas (absence et présence
de paraoxon). Le principe de notre mécanisme de détection est représenté dans la figure 34.
Comme le montre ce schéma, en absence d'inhibiteurs, l'ACH ajouté à la solution d'enzyme
ACHE a été totalement hydrolysé pour produire de la choline et de l'acide acétique. Lorsque
les AuNPs non modifiées sont ajoutées à cet analyte, elles sont instables et sřagrègent en
présence de la choline. Mais en présence d'un pesticide tel que le paraoxon, l'activité
enzymatique de lřACHE est bloquée et l'ACH ne peut pas être transformé en choline. Les
AuNPs ajoutées ne subissent pas dřagrégation, leur taille reste inchangée. Cette réaction,
couplée à la diffusion de lumière (DLS), a été utilisée pour mesurer l'activité de lřACHE et la
détection de pesticides.
Figure 34 : L'illustration schématique du biocapteur avec les AuNPs non modifiées.
[89]
V. Techniques de caractérisation.
Ces travaux sont essentiellement basés sur l'utilisation de la spectroscopie Raman.

Nous avons utilisé dřautres techniques pour caractériser les nanoparticules comme la diffusion
dynamique de la lumière, la spectrométrie d'absorption UV-Visible, la microscopie
électronique en transmission (MET) et la Microbalance à Cristal de quartz pour la
fonctionnalisation de la surface dřor.
1. Spectrométrie Raman
Le spectromètre Raman utilisé pour la partie expérimentale de cette étude est un

TM
modèle Xplora commercialisé par la société Horiba Ŕ Jobin Yvon (figure 35). Ce
spectromètre micro-Raman est équipé dřune platine motorisée assurant un déplacement dans
le plan (x, y) avec une précision micrométrique, une lampe blanche pour l'éclairage en
transmission et réflexion et une caméra pour faciliter lřobservation.
Figure 35 : Spectromètre Raman utilisé pour la partie expérimentale de cette étude.
L'excitation et la collection du signal Raman sont réalisées dans le domaine visible

entre 100 à 3500 cm-1. Le spectromètre dispose de trois diodes laser à une longueur dřonde de
ηγβ nm, θγ8 nm ou 78η nm. δe faisceau laser est guidé par le système optique jusquřà
lřéchantillon, en traversant la roue à filtres pour densités neutres à 6 positions (0.1 ; 1 ; 10 ;
25 ; 50 ; 100%) qui est contrôlée par le logiciel « Labspec6 ». Ces filtres permettent
lřajustement de lřintensité parvenant à lřéchantillon. Le microscope confocal focalise le spot
[90]
laser incident sur la surface de lřéchantillon, via lřobjectif approprié (trois objectifs de
microscope : x10, x50, x100) permettant à la fois de focaliser le laser sur l'échantillon et de
collecter la lumière diffusée. Ensuite les photons diffusés sont dirigés vers un système
optique permettant de distinguer la diffusion Raman de la diffusion Rayleigh à travers un
filtre « Edge ». Les photons ainsi diffusés entrent dans le monochromateur par une fente/trou
dont lřajustement permet de régler le volume focal analysé et dřaffiner la résolution spectrale.
Après dispersion spectrale du signal, au moyen dřun réseau holographique (à θ00,

1200, 1800 ou 2400 traits/mm), la détection est alors assurée par un détecteur de type CCD
1024x256, refroidi par Peltier à air et contrôlé par USB. Un système dřalignement
automatique permet lřalignement optimal du dispositif à chaque changement de configuration.
Finalement, lřacquisition et lřexploitation des spectres sont réalisées avec le logiciel δabspec
6 (Jobin-Yvon Horiba)
 Protocole de l’analyse spectroscopique :

Tous les spectres Raman et SERS présentés dans ce travail ont été enregistrés selon
les paramètres dřacquisition suivants μ ouverture du trou confocal à 100 m ν réseau
θ00 traits/mm ν puissance laser à lřéchantillon dřenviron 4mW ν objectif x50 ; soit une
résolution spatiale de 1 m et une résolution spectrale de 4 cm-1 pour une longueur dřonde
dřexcitation de θγ8nm respectivement.
Pour collecter les spectres SERS, 2 µl de la solution d'analyte et 2 µl de solution

AuNPs ont été mélangés avant le dépôt sur une lame en aluminium. Pour toutes les analyses,
les spectres SERS ont été acquis à 5 positions différentes. Les spectres ont été enregistrés
avec le temps d'acquisition de 6 s avec 5 accumulations. Ces conditions d'acquisition ont été
optimisées afin d'éviter la dégradation de l'échantillon. Pour lřanalyse statistique (analyse en
composantes principales), le logiciel Unscrambler® X a été utilisé.
δe protocole dřéchantillonnage pour lřétude des SERS est le suivant μ
Une goutte de η δ de la solution est déposée sur une lame en aluminium. Ce substrat sert de
miroir afin de collecter davantage de lumière diffusée en provenance de l'échantillon. La
surface étant un peu hydrophobe, ceci permet de former une goutte localisée et d'éviter ainsi
une adsorption trop rapide des molécules à la surface du substrat. Dans notre cas, grâce à cette
hydrophobicité, plutôt que s'étaler sur la surface, la solution va former une goutte dans
[91]
laquelle il sera plus aisé de focaliser le faisceau laser. Par ailleurs, avec une goutte bien
formée, il est possible d'obtenir un volume de solution suffisant pour lřanalyse avec un
minimum de suspension (η δ). Pour focaliser le laser dans cette goutte, un objectif x50
longue distance de travail est utilisé. Sa grande distance focale lui permet de rester à une
distance suffisante de la goutte d'échantillon pour une grande facilité dřexpérimentation.
2. Diffusion dynamique de la lumière (DDL)
Les techniques de diffusion de la lumière sont des techniques d'analyse

spectroscopique non destructives, très répandues dans le domaine de la physico-chimie car
elles permettent dřextraire une grande variété de données caractéristiques du système étudié et
ici plus précisément, elles permettent d'accéder à la taille de particules en suspension dans un
liquide de 1 à 500 nm. Le principe de base est simple: L'échantillon est éclairé par un faisceau
laser, le champ électrique de lřonde incidente interagit avec le nuage électronique des
molécules en provoquant la polarisation oscillante des électrons qui se comportent alors
comme des sources secondaires qui émettent une radiation lumineuse diffusée (Schurr). Cette
lumière diffusée, détectée à un angle de diffusion , va être mesurée en fonction du temps et
définie par un détecteur de photons rapide (Figure 36).
Figure 36 : Principe de la diffraction Laser
[92]
δa variation de lřintensité diffusée dans le temps vient du fait que les particules dans
un liquide sont soumises au mouvement brownien dû à l'agitation thermique. Ce mouvement
Brownien des particules modifie les interférences entre les ondes diffusées par chaque
particule. Cette variation sera différente selon la taille des particules puisquřune petite
particule bouge plus vite quřune grosse (εorrison, et al. 2002). La comparaison entre
l'intensité du signal à temps t avec l'intensité d'un temps (t + t), nous permet de calculer la
fonction de corrélation. δřexemple illustre bien cette corrélation : plus les particules sont
petites, plus leur fonction de corrélation diminue rapidement (Figure 37).
Figure 37: La fonction d’auto-corrélation pour des nanoparticules de différents diamètres (Saint-Petersburg
State University and Center for optical and laser materials research).
La taille des particules est donnée en termes de diamètre hydrodynamique: le diamètre

d'une sphère ayant le même coefficient de diffusion translationnel que celui de la particule.
Ce diamètre est calculé par la relation de Stokes-Einstein, qui est donnée ci-dessous dans sa
forme la plus couramment employée dans l'analyse granulométrique.
��
�� =
3��
Avec :
 kB : constante de Boltzmann
 μ est la viscosité dynamique
[93]
4πn θ
 T : température absolue (T = �� . q2 = Dt . sin ; nμ indice de réfractionν μ
λ 2
l'angle entre le laser et le photomultiplicateur).

 Dt : le coefficient de diffusion translationnel, mesuré à partir de la fonction de
corrélation (G(t)= exp(-T.t) ) par diffusion dynamique de la lumière .
Nous avons utilisé un équipement Malvern ZetaSizer Nano S (Malvern Instruments),

pour mesurer la taille des nanoparticules. Le système utilise un laser à gaz He-Ne polarisé
verticalement (longueur d'onde 633 nm dans le vide). La puissance du laser peut être
atténuée, par des filtres gris neutre à 11 niveaux différents d'intensité, de sorte que
lřatténuateur puisse augmenter ou diminuer la lumière qui traverse lřéchantillon, afin
dřajuster lřintensité lumineuse diffusée par ce dernier. Deux positions du détecteur sont
possibles dans la série Zetasizer Nano, soit un angle de 173° soit de 90° par rapport à la
direction de lřonde incidente. Nous avons travaillé avec lřangle de 17γ°.
Le porte-échantillon comporte un élément de Peltier utilisé pour maintenir la

température de l'échantillon à une valeur fixe entre 0 ° C et 120 ° C (25°c dans notre cas). Des
cuvettes jetables en polystyrène de dimensions 10 x 10 x 45 mm (Cuve macro en PMMA,
Plastibrand) sont utilisées pour les mesures. Le volume d'échantillon par mesure est d'environ
1 ml, et la durée de lřéquilibration de la température est de β min.
Après la préparation des nanoparticules, la dilution a été faite par le tampon pour
obtenir le même volume final de 1 ml.
3. Electrochimie
La voltamétrie cyclique à trois électrodes est, la technique électrochimique, utilisée au

cours de notre travail pour lřélectro-greffage. Cette technique nécessite de contrôler le
potentiel appliqué et de mesurer le courant résultant. Dans un système à trois électrodes,
lřélectrode de travail (ET) est celle sur laquelle on applique une différence de potentiel (ddp)
et par conséquent où auront lieu les réactions électrochimiques. La ddp est appliquée par
rapport à une électrode de référence (ER) (dans notre cas Ag/AgCl) permettant alors de
contrôler constamment le potentiel au cours des différentes expériences. Ceci est difficile avec
un système à deux électrodes car le fait dřimposer une tension et de mesurer un courant entre
ces mêmes électrodes va engendrer une chute ohmique. δe courant arrivant sur lřélectrode de
travail suite à lřapplication de la ddp est mesuré via une contre-électrode (CE) inerte (platine)
[94]
(figure 38). Dans le cadre de notre travail, nous avons utilisé un quartz recouvert dřun film
dřor, comme électrode de travail, pour les expériences de QCε, à usage unique.
Potentiostat
V
A
A
CE ET ER
Figure 38: Montage d’une cellule électrochimique à 3 électrodes connectée sur un potentiostat.
Les mesures de voltammétrie cyclique (VC), ont été réalisées avec un potentiostat
EG&PAR modèle VMP2/Z-40 piloté par le logiciel EC-Lab V9.2, relié à une cellule
thermostatée à trois électrodesν une électrode de référence (fil dřargent plongé dans un
compartiment isolé contenant une solution de nitrate dřargent 0,1 M et un compartiment
inferieur comportant lřacétonitrile Ag/AgCl), une électrode auxiliaire en platine et une
électrode de travail dřun cristal de quartz ACHut λ εHz recouvert dřor.
4. Autres techniques
4.1. Spectrométries d’absorption UV‐Visible
La spectrométrie d'absorption UV-Visible nous a permis de caractériser les

nanoparticules synthétisées grâce à leur bande résonance plasmon. Le spectromètre UV-
Visible utilisé est un Carry η0 bio travaillant sur une gamme de longueurs dřondes de γ00 à
700 nm.
4.2. Microscopie électronique en transmission (MET)
La taille et la forme des nanoparticules ont été déterminées par lřutilisation dřun
microscope électronique en transmission de type microscope JEOL 2100 HR. La résolution
point à point peut atteindre 0,23nm. Les échantillons étaient supportés par une grille de cuivre
recouvert de carbone.
[95]
Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons présenté la méthode d'élaboration des nanoparticules

dřor, la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE et sa manipulation par la spectroscopie
Raman SERS pour la détection de ces inhibiteurs. Nous avons exposé la méthode de
fonctionnalisation de la surface dřor dans le but de développer un biocapteur pour la détection
des pesticides ainsi que la méthode de détection de paraoxon par la diffusion dynamique de la
lumière par mesure de lřactivité de lřACHE. Ce chapitre a permis de présenter également
toutes les techniques utilisées au cours de nos travaux.
[96]
Partie C
RESULTATS ET
DISCUSSIONS
[97]
Partie C RESULTATS ET DISCUTIONS
Dans cette partie, nous présentons les résultats obtenus pour lřélaboration dřun
biocapteur par un nouveau procédé, basé sur la spectroscopie Raman exaltée de surface. Le
biocapteur est utilisé pour la détection qualitative et quantitative des pesticides en mesurant
lřactivité enzymatique de lřacétylcholinestérase (ACHE). Pour cette raison nous présentons
également les résultats obtenus pour la synthèse des nanoparticules d'or (AuNPs), qui ont été
utilisés comme substrats SERS.
VI. Biocapteur optique basé sur le Raman SERS et ACHE non

immobilisée
Afin de tester notre protocole, nous avons commencé avec les enzymes ACHE sans
immobilisation. Dans un premier temps, lřamplification du signal Raman des molécules
individuelles par les nanoparticules synthétisées a été vérifiée, en sřassurant que ces
nanoparticules ont bien les propriétés plasmoniques nécessaires pour lřeffet SERS. Ensuite
la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE a été effectuée pour optimiser le protocole
expérimental. Nous nous sommes basés sur ce procédé pour la détection des pesticides.
1. Caractérisation des nanoparticules d’or par TEM et UV-visible
Pour étudier les spectres Raman, et en particulier lřutilisation de lřeffet SERS pour la
détection des pesticides, nous avons travaillé initialement sur trois types de nanoparticules
dřor μ une première série obtenue par la méthode NaBH4 (Brust), avec des nanoparticules de
différents diamètres, une deuxième série (avec des nanoparticules sous forme de nano-
bâtonnet (deux bandes dřabsorption UV-visibles) et une troisième série (la méthode de
Turkevich) où leur diamètre avoisinait les 15 nm .
Nous avons constaté que pour obtenir de bons résultats SERS, la taille des
nanoparticules joue un rôle important ainsi que le type de surfactant. En particulier, nous
avons rapidement éliminé la première et la deuxième série à cause de lřexcès en bromure de
cétyltriméthylammonium (CTAB), malgré les tentatives de purification (centrifugation et
lavage), ces dernières ne donnant pas les fortes exaltations recherchées. Cřest pour cette
raison que tous les résultats présentés dans cette partie concernant lřexaltation du signal
[98]
Raman (SERS) sont obtenus en utilisant des nanoparticules dřor synthétisées par la méthode
de Turkzvich.
δřimage obtenue par microscopie électronique à transmission (εET) des NPs non
fonctionnalisées est présentée dans la figure 39.
Figure 39 : Image de microscopie (MET).
La figure 39 montre lřimage (εET) des NPs dřor, préparées par la voie citrate. Ces
images nous permettent de mesurer la taille moyenne ainsi que la polydispersité en taille des
AuNPs préparées. δes nanoparticules sont sphériques (légèrement facettées), dřune taille
moyenne dřenviron 1η nm de diamètre.
Nous avons aussi effectué une analyse par spectroscopie UV-visible (Figure 40), qui
est une technique de choix pour lřétude des dispersions aqueuses de nanoparticules dřor, due
à la bande de résonance plasmon de surface (SPR). Cette bande est sensible à la taille, à la
forme et à lřenvironnement local des nanoparticules dřor (Moores et al 2006; Peng Wang et
al. 2010).
δe spectre dřabsorption UV-visible obtenu est caractéristique de la dispersion de

nanoparticules dřor dans une solution aqueuse de phosphate de potassium à 0.01ε. δe
spectre a été réalisé à température ambiante. Les AuNPs présentent en solution, une bande
de résonance plasmon de surface intense avec un maximum à ~516 nm, qui est
caractéristique des nanoparticules dřor sphériques, dispersées individuellement dans une
gamme de taille de 3 à 50 nm (Jain et al 2007).
[99]
La figure 40 : Le spectre UV-visible des NPs sphériques dans une solution aqueuse de PP (0.01M).
Il apparaît donc que la synthèse par réduction chimique permet dřobtenir une
solution de nanoparticules dřor en grande quantité dont la morphologie est assez bien
maîtrisée. En effet, les images TEε et le spectre dřabsorption dans lřUV-visible sont
concordants et permettent de confirmer la distribution en taille et la morphologie des
nanoparticules dřor ainsi que la position de leur bande de résonance plasmon de surface.
2. Diffusion Raman Exaltée de Surface (SERS) : Détection directe des

pesticides
δřexaltation des signaux Raman des paraoxon et carbaryl comme pesticides a été
évaluée afin de quantifier le potentiel SERS des nanoparticules synthétisées. Ce protocole
pourrait constituer une méthode alternative directe pour la détection des pesticides
directement sans passer par la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE ni par une
fonctionnalisation de ces dernières.
2.1 Détection du carbaryl
Pour détecter les pesticides directement par la diffusion Raman exaltée de surface, à
faible concentration, nous avons utilisé les nanoparticules dřor sans aucune modification.
Les échantillons ont été préparés en déposant des nanoparticules dřor mélangées avec
différentes concentrations de pesticides, sur une surface dřaluminium. Les gouttes sont
laissées à sécher avant les mesures Raman. Le spectre Raman de carbaryl en poudre et le
[100]
spectre Raman SERS, que nous avons obtenus pour ce pesticide en solution dans le
phosphate de potassium (0.01M), sont représentés dans la figure 41. Ces spectres sont en
bon accord avec la littérature (Fan, Lai, Barbara A Rasco, et al.; Qu et al.; X. T. Wang et al.)
et montrent un pic à 1576 cm-1 attribué à lřélongation de la liaison C-C, les modes
dřoscillation du C-H à 1432 cm-1, vibrations symétriques de cycle à 1374 cm-1 et les
vibrations de la liaison C-C à basse fréquence à 464, 546 cm-1.
Intensité Raman (u.a.)
(b)
(a)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 41 : (a) Spectres diffusion Raman du carbaryl en poudre et (b) le spectre de diffusion Raman SERS de
carbaryl en solution (10-4 M) dans PP (0.01M). Paramètres d’acquisition: λ= 638 nm et temps d’acquisition
6s.
δes nanoparticules dřor nous ont donc permis, avec un protocole très simple, la
détection de Carbaryl, par la diffusion Raman SERS, à une concentration de 10-1 mM. Ce
même substrat SERS-actif a été utilisé pour la détection de Carbaryl à différentes
concentrations. La figure 42 représente la diminution de l'intensité du spectre diffusion
Raman SERS du Carbaryl avec la diminution de la concentration de celui-ci. La limite de
détection de cet inhibiteur pourrait être inférieure ou égale à 10-4 mM. Cette valeur est
comparable avec les résultats des autres recherches : 10-4 mM (X. T. Wang et al.; Qu et al.)
sachant que nos nanoparticules dřor sont utilisées sans aucune modification.
[101]
1378
1570
460
Intensité Raman (u.a.) 710
1030 1438
947 2x10 mM
-1
-2
2x10 mM
-3
2x10 mM
-4
2x10 mM
PP
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 42 : spectres de diffusion Raman SERS de carbaryl en solution, à différentes concentrations (2x10-4-
2x10-1mM), et le spectre de diffusion Raman SERS de PP (0.01M).
2.2 Détection du Paraoxon
Le spectre Raman de paraoxon pur (sous forme liquide) a été enregistré pour servir
de comparatif aux spectres SERS de ce pesticide. La figure 43 présente le spectre de
diffusion Raman SERS du paraoxon comparé avec le spectre Raman du paraoxon pur
(huile), avec l'excitation de 638 nm pour une région spectrale comprise entre 400 à 1800
2,5
cm-1.
2,0
1,5
Intensité Raman (u.a.
1,0
(b)
0,5
0,0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

(a)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 43 : (a) : Spectre Raman du paraoxon pur et (b) : spectre SERS de paraoxon (10-6 M).
[102]
Le spectre Raman de la solution de paraoxon pur reporté en figure 43 est similaire

au spectre Raman reporté dans la littérature (Wang et al.; P. Li et al.) . En effet, en plus des
bandes de vibration du groupement phényl à 1592 cm-1 et lřélongation asymétrique de NO2
à 1524 cm-1, nous pouvons observer les bandes à 1448, 1348, 1231, 1164, 1110, 857, 732 et
629 cm-1 (tableau 11). Les mêmes bandes se retrouvent dans le spectre Raman SERS de
paraoxon (figure 43). La différence marquée entre les positions des bandes dans le spectre
Raman et le spectre Raman SERS du paraoxon est due à lřinteraction de la molécule avec les
nanoparticules dřor (P. Li et al. 2014b; Wang et al 2014). δřadsorption de lřanalyte sur les
NPs métalliques peut entraîner une modification du spectre.
Tableau 11: Interprétation du spectre Raman du pararoxon (Fathi et al.).
Déplacement Mode de vibration

Raman (cm-1)
619 vibration or du plant
636 NO2 élongation symétrique, CC déformation
732 NO2 élongation symétrique, CC déformation
857 NO2 élongation symétrique (ArŔNO2)
1110 CŔH déformation (dans le plan)/NO2 élongation asymétrique
1164 CŔH déformation (dans le plan)/NO2 élongation asymétrique, vibration dans le plan du
para-nitrophenol + translation (C14, C12 ŔH) + élongation (C15,C13ŔH) + T(OŔC14
ou 12-C15 ou 13 ŔH)
1231 P=O élongation
1348 élongation symétrique NO2
1448 déformation du cycle
1524 élongation asymmetriqueNO2
1592 vibration du cycle Phenyl
Comme le montre la figure 43, lřutilisation des nanoparticules dřor sans aucune
modification, permet une bonne capacité dřamplification du signal Raman de pesticides. δa
limite de détection est de 1x10-7 M, sans aucune modification des nanoparticules dřor. Celle-
ci est comparable avec les résultats des autres recherches: 96 nM (P. Li et al.,
ŖPolystyrene/Ag Nanoparticles as Dynamic Surface-Enhanced Raman Spectroscopy
Substrates for Sensitive Detection of Organophosphorus Pesticidesŗ), 0.5 nM (Wang et al
2014) et 10 nM (Fathi et al.) .
Comme nous lřavons déjà vu précédemment, la toxicité aiguë des pesticides résultant
dřun usage à dose importante est connue. En Europe, les valeurs limites des pesticides dans
l'eau destinée à la consommation sont fixées par le décret 2001- 1220 du 20 décembre 2001.
Les références de qualité applicables aux eaux destinées à la consommation humaine sont
les suivantes : 0,1 µg/l par substance individualisée, voir moins (0.03 µg/l) pour un résidu
[103]
particulièrement toxique et 0,5 µg/l pour le total des pesticides quantifiés. Ces seuils
s'appliquent aux eaux destinées à la consommation humaine et non aux eaux brutes, pour
lesquelles les seuils sont de 2 µg par substance et 5µg pour le total (OεS, ŖNormes de
lřOεS Sur δřeau Potableŗ). Une proposition de modification visant à adapter les seuils de
référence a été proposée (Sénat).
Cette étude préliminaire nous a donc permis de démontrer que lřutilisation des
nanoparticules dřor pour la détection directe des pesticides était réalisable. Cette étude a
ainsi évalué les limites de détections de ces insecticides à 1x10-7 M pour le paraoxon, ce qui
correspond à 28 µg/δ (valeur supérieure à la valeur fixée par lřOεS) et 1x10-7 M pour le
carabaryl qui correspond à 0.5 µg/L (valeur comparable à celles fixées par lřOεS).
La détection directe des pesticides par la spectroscopie de diffusion Raman SERS

des pesticides est possible mais la quantification reste propre à chaque pesticide et pour
atteindre des limites de détection faibles (convenables) la surface SERS-active doit être
modifiée selon la molécule cible. Dans la suite de ce travail nous avons privilégié une
détection non ciblée via la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE.
3. Détection des inhibiteurs de l’AC(E par mesure de son activité

enzymatique couplée à la spectroscopie Raman SERS.
Pour connaître lřactivité dřune enzyme, on peut suivre la réaction quřelle provoque.
Par exemple, le suivi de la transformation du substrat de cette enzyme (ACH dans notre cas)
ou encore la formation du produit (choline). δa réaction enzymatique de lřACHE est la
suivante :
��
�� + �2 � ⎯⎯ �� + ��
3.1 Détection de l’ACH.
Pour lřoptimisation de notre protocole expérimental, lřamplification du signal Raman

de lřACH utilisé comme substrat de lřACHE a été dřabord effectuée. δes figures suivantes
représentent le spectre Raman de l’iodure de l’acétylcholine (ACHCl) poudre et le spectre
de diffusion Raman SERS de lřACH (10-6 M) en PP (0.01 M).
[104]
(a)
(b)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 44: Spectre Raman de l’iodure de l’acétylcholine (a) et spectre SERS de ACH (10-3 M) (b).
δe spectre de diffusion Raman SERS de la solution de lřACH dans le PP, reporté en

figure 44 est similaire au spectre Raman de ACHCl. Les bandes à 639 cm-1 et 1735 cm-1
correspondent aux vibrations du groupement acide acétique de la molécule dřACH, nous
observons également des bandes à 714, 865, 950, 1267, 1164, 1438 cm-1 caractéristiques des
vibrations du groupement choline de cette molécule (tableau 12).
Tableau 12. Interprétation du spectre Raman de l’ ACH (De Cheveigne et al.; Siek et al.).
Déplacement Raman Modes de vibrations

(cm-1)
639 C-C déformation (groupement acide acétique)
714 N-C4 élongation tétraédrique symétrique
865 N-(CH3)3 élongation symétrique
950 déformation(CH3)N/ élongation (C-N)
1267 translation du groupe méthyle
1438 mouvement de déformation symétrique
1736 C=O déformation (groupement acide acétique)
δes spectres SERS de lřACH dans une gamme de concentration allant de 10-3 M à
10-15 ε, mélangée à une solution de colloïdes dřor sont présentés à la figure 45. Les bandes
de vibration caractéristiques de cette molécule sont notamment celles situées à 639,714,
1736 cm-1 (Tableau 1β). Evidemment, lorsque la concentration de lřACH diminue, le signal
[105]
SERS correspondant diminue également. Notre limite de détection correspond à une

concentration de 10-11 M.
714
639 1736
-3
10 M
-11
10 M
-12
10 M
-13
10 M
-14
10 M
-15
10 M
PP
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 45 : Spectres SERS de solutions de l’ACH de concentration 10-3M à 10-15M.
Ces différents résultats montrent la possibilité dřamplifier le signal Raman du

neurotransmetteur dans PP, avec les nanoparticules dřor sans modification. Ce qui permettra
dans la suite le suivi de la réaction de lřactivité enzymatique de lřACHE. Cette
amplification peut être utilisée aussi en biologique pour la détection des neurotransmetteurs
à très faible concentration, par exemple.
3.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E en absence de

pesticides
Notre objectif est de mettre en place un protocole de détection de tous les

inhibiteurs (organophosphorés, carbamates …) de l'ACHE en manipulant son activité par la
spectroscopie de diffusion Raman SERS. Par exemple, le paraoxon est un agent
neurotoxique qui inhibe irréversiblement l'enzyme, tandis que le carbaryl est un inhibiteur
[106]
réversible de l'ACHE. Les pesticides organophosphorés forment des complexes très stables
avec lřACHE, alors que dans le cas des carbamates, l'ACHE est facilement réactivée.
Nous avons commencé par lřanalyse de lřactivité de lřACHE par

spectroscopie Raman SERS (en absence des inhibiteurs) afin dřévaluer ses propriétés
catalytiques et dřoptimiser les conditions de détection de cette inhibition. En absence
dřinhibiteurs, lřACHE catalyse la réaction dřhydrolyse de lřacétylcholine en acide acétique
et choline. En effet, en présence de lřACHE, lřACH est totalement transformé en choline et
acide acétique. La figure 46 représente la superposition des spectres de diffusion Raman
SERS de μ la choline produite par hydrolyse de lřacétylcholine en présence de lřenzyme
ACHE ν lřacétylcholine et lřACHE.
Acétylcholine
Choline
Acetylcholinesterase
600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde [cm ]
Figure 46 : Spectres de diffusion Raman SERS de solutions de : l’acétylcholine (10-3M), choline produite par
hydrolyse de l’acétylcholine en présence de l’enzyme ACHE et l’ACHE.
Après lřajout des AuNPs à la solution d'analyte (ACHE + ACH), lorsque lřenzyme
est active, on obtient un signal Raman très intense (Figure 46, choline) correspondant au
spectre de diffusion Raman SERS de la choline, avec les bandes de vibration à 714, 865,
950, 1267 et 1438 cm-1 caractéristiques de cette molécule (Tableau 12 ; § VI-3) (Siek et al.;
De Cheveigne et al.). Pour comparaison, nous avons aussi représenté le spectre de
diffusion Raman SERS de lřACH et lřACHE (Figure 46). Nous observons bien les
[107]
différences entre les spectres de diffusion Raman SERS de lřACH et de la choline. Les
bandes à 639 et 1735 cm-1 sont caractéristiques de la partie acide acétique de la molécule
ACH. Leur disparition dans le spectre d'hydrolyse de ce neurotransmetteur est directement
liée à la transformation de lřACH, comme affirmation de l'activité de lřACHE.
714
Intensit?Raman (u.a.)
-3
10 M
-13
10 M
-14
10 M
-15
10 M
-16
10 M
PP
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 47: Spectres Raman SERS de solutions de la choline produite par hydrolyse de lřACH, de
concentration 10-3, 10-13, 10-14, 10-15 et 10-16ε, en présence de lřACHE et le spectre Raman SERS de PP
(0.01M).
Comme la choline est le produit de la réaction de lřactivité enzymatique de lřACHE

et que sa présence indique quřelle est non bloquée, nous nous sommes intéressés à la mesure
de la choline produite par la transformation de lřACH à différentes concentrations. Les
spectres SERS de la choline produite par hydrolyse de lřACH, dans une gamme de
concentration allant de 10-3 M à 10-15 ε, en présence de lřACHE, sont présentés à la figure
47. Nous observons les bandes de vibration de la choline situées à 714, 865, 950, 1267 et
1438 cm-1 (Tableau 12). Nous pouvons détecter la choline, produite par transformation de
lřACH, à une très faible concentration.
3.3. Optimisation de paramètres d’élaboration du biocapteur.
δes nanoparticules dřor non fonctionnalisées nous ont permis lřamplification du

signal Raman de lřACH et la choline, cela est dû aux propriétés plasmoniques des
[108]
nanoparticules et aussi à lřattraction électrostatique entre les nanoparticules non

fonctionnalisées chargées négativement et le groupement quaternaire ammonium de ces
molécules chargées positivement (Mautner, 1964). Cela nous permet de nous poser la
question : quelle molécule allons-nous utiliser comme indicateur pour lřélaboration de notre
biocapteur enzymatique ? Cřest pour cette raison que nous nous sommes intéressés à
lřoptimisation de notre biocapteur en variant tous les paramètres expérimentaux :
concentration de lřACH, lřACHE et le temps dřincubation.
3.3.1. Optimisation de la concentration de temps de contact.

Nous avons étudié lřeffet de lřenzyme, à des concentrations différentes, sur la
transformation de lřACH (0.001 ε). δa variation de la concentration de lřenzyme se traduit
par la quantité de lřACH transformé. Sur la figure 48, une disparition des bandes de
vibration du groupement acide acétique lors de lřaugmentation de la concentration de
lřenzyme ajouté signifie la transformation presque complète de lřACH en choline.
639 1735
(b)
(a)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 48 : Spectres Raman SERS de solutions de μ (a) δřACH non transformé par lřACHE (1x10-1U/mL) et
(b) la choline produite par hydrolyse de lřACH en présence de lřACHE (1.5U/mL).
δa variation de lřintensité de la bande de vibration Raman à θγλ cm-1 en fonction de

la concentration de lřACHE est exposée sur la figure 49-A. Une disparition de la bande de
vibration à 639 cm-1 apparaît clairement dès que la concentration d'enzyme augmente
(1U/mL). Nous avons suivi aussi la transformation de lřACH en présence de lřACHE pour
des durées de contact différentes. δřintensité de la bande de vibration à θγλ cm -1 diminue
et disparaît après environ 30 min de contact (Figure 49-B).
[109]
A)
I639 (u.a.)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

[ACHE]/U.mL
B)
I639 (u.a.)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Temps de contact/min
Figure 49: Courbe d'étalonnage montrant l'effet de : (A) la variation de la concentration de l’ACHE (1x10 -2-
2 U/mL) et (B) du temps de contact (0-45min), sur l’intensité de la bande de vibration à 639 cm -1.
δa transformation de lřACH (0.001M) peut donc être effectuée complètement en 30

min de contact avec lřACHE (1U/mδ).
3.3.2. Optimisation de la concentration de l’AC(E
δes résultats obtenus pour la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE

confirment la possibilité de son utilisation pour lřélaboration dřun biocapteur enzymatique à
[110]
base de lřACHE. Sachant que notre objectif est la détection de faibles concentrations de
pesticides, une faible concentration dřenzyme sera donc idéale. Pour cette raison, nous
avons également mesuré lřactivité enzymatique de lřACHE à une concentration de 1x10 -1
U/mδ avec différentes concentrations de lřACH. Nous avons constaté quřà haute
concentration de lřACH non transformée nous obtenons le signal Raman SERS de lřACH,
mais pour la choline produite par une transformation de lřACH (0.0001M) en présence de
lřACHE le signal Raman était faible ou inexistant. La figure 50 expose la différence entre le
spectre Raman SERS de la choline produite par la transformation de lřACH (0.0001M) en
présence de lřACHE (1U/mδ) et le spectre Raman SERS de lřACH (0.0001M).
On compare ces résultats avec ceux obtenus précédemment (Figure 48). δřabsence
du signal Raman de la choline en présence dřune faible concentration de lřACHE (Figure
50) (alors quřon lřobserve à haute concentration (figure 48)), peut être expliquée par le fait
que la choline provoque lřagrégation des nanoparticules et que celles-ci précipitent (faible
signal Raman). Au contraire en présence dřune forte concentration dřenzyme, cette dernière
se lie avec les nanoparticules et les protège de lřagrégation (signal Raman SERS de la
choline) (Liron et al 2011).
(a)
(b)
600 1200 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 50 : Spectres Raman SERS des solutions de : (a) l’ACH (10-4M) et la choline produite par hydrolyse de
l’ACH (10-4M) en présence de l’ACHE ((b) 1x10 -1 U/mL).
[111]
3.3.3. Interactions NP-Molécules
Pour confirmer ces hypothèses une étude par la diffusion dynamique de la lumière
est effectuée. La stabilité des NPs est essentielle pour comprendre les phénomènes en jeu
lors des interactions avec les molécules.
22
AuNPs
20 AuNPS@ATC
18 AuNPs@ACHE
AuNPs@ATC@ACHE (mixés 30min)
Intensité de diffusion (kcps)
16 AuNPs@ATC@ACHE (mixés 0min)

14
12
10
-2
10 100 1000 10000
Dh (nm)
Figure 51 : Distribution en intensité du diamètre hydrodynamique des nanoparticules d’or : (a) seul ; (b) en
présence de l’ACH (10-4M) ; (c) l’ACH non transformé et l’ACHE ; (d) mixés avec l’ACHE : 2x10-1 [u/ml] et
(e) en présence de la choline produite par l’hydrolyse de l’ACH catalysée par l’ACHE. Les suspensions sont
préparées dans le PP (0.01M).
Nous avons tracé sur les Figure 51 la distribution en intensité du diamètre

hydrodynamique des nanoparticules : seules ν en présence de lřACH (10-4 M) ; incubées
avec lřACHE et en présence de la choline produite par lřhydrolyse de lřACH catalysée par
lřACHE successivement. En première observation, nous apercevons une grande
augmentation du diamètre hydrodynamique des nanoparticules en présence de la choline
produite par lřhydrolyse de lřACH catalysée par lřACHE. δe diamètre hydrodynamique des
nanoparticules, dans les différentes suspensions, est donné dans le tableau 13. Ces résultats
confirment, comme attendu, que les nanoparticules commencent à sřagréger en présence de
la choline.
[112]
Tableau 13 : distributions de taille des AuNPs dans différentes suspensions.
Taille et intensité des NPs Z-average

(d.nm)
AuNPs 36
AuNPs@ ACH 52
AuNPs @ ACH non tranformée @ACHE 30

AuNPs @ ACHE 36
AuNPs @choline obtenue par l’hydrolyse de l’ACH en présence de 150

l’ACHE
La légère augmentation du diamètre hydrodynamique des nanoparticules en présence

de lřACH est due à la liaison de lřACH sur la surface des nanoparticules par interaction
électrostatique. Le diamètre des nanoparticules donné par la DLS reste inchangé par rapport
à leur diamètre initial en présence de lřACH non transformé par lřenzyme, mais les
nanoparticules dřor sont devenues monodisperse car lřenzyme recouvre la surface des
nanoparticules qui deviennent plus stables. Cela correspond à la disparition de la deuxième
bande dans la distribution en intensité du diamètre hydrodynamique des nanoparticules en
présence de lřACHE sur la figure 51 (Li H et al. 2004). Ces expériences nous indiquent que
lřACH, peut raisonnablement être considérée comme un bon ligand pour les nanoparticules
mais elle peut être rapidement remplacée par dřautres ligands, comme lřACHE par exemple
(Lim et al. 2008 ; Levchenko et al. 2011).
Par contre, les nanoparticules dřor sřagrègent en présence de la choline (Figure η1).
δřagrégation des nanoparticules apparaît dès le contact, soit instantanément lors de
lřintroduction des nanoparticules dans lřanalyte. Ceci est probablement dû au fait quřen
forte concentration, la choline diminue le potentiel électrostatique des NPs (C.-W. Liu et
al.). La molécule de la choline contient le groupement quaternaire ammonium ainsi que le
groupement ŔOH qui sont capables de se lier à la surface dřor (Okumura et al.). Le composé
(nanoparticules dřor et ACHE) peut être utilisé comme un composé négatif pour attirer
dřautres molécules positives, car le point isoélectrique de lřACHE se trouve aux environs
dřun pH=η, or nous avons un pH=8. Ceci permet aux NPs de se lier à dřautres molécules
par absorption électrostatique (Hou et al.).
[113]
3.3.4. Conditions optimales retenues
La transformation de lřACH (0.001 M) peut être effectuée complètement en

γ0 min de contact avec lřACHE (1U/mδ). Nous avons utilisé ces valeurs comme conditions
optimales pour la suite de nos tests de mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE. Cela
nous garantira une fiabilité des résultats en cas de faible concentration de lřACHE. Dans la
suite de notre travail, nous avons mesuré lřactivité enzymatique de lřACHE, par mesure de
la variation de lřintensité de la bande de vibration Raman à θγλ cm-1. Cette bande
caractérise la vibration du groupement acide acétique et sa disparition est caractéristique de
lřactivité de lřACHE (transformation de lřACH en choline).
3.4. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E en présence de

pesticides
δa spectroscopie Raman SERS, a permis de quantifier la transformation de lřACH

par lřACHE. Notre objectif est de détecter des pesticides en nous servant du changement
dřactivité de lřACHE, sachant quřen absence de pesticides lřacétylcholine se transforme en
acide acétique et choline. En présence de pesticides lřacétylcholine ne sřhydrolyse pas, à
cause du blocage de lřactivité enzymatique de lřACHE.
714
826
1277
865
639
950
1438
1220
1735
1110
intensité Raman (u.a.)
1325
inhibition par PO
1585
-5
(4x10 M)
inhibition par CA
1378
-5
(4x10 M)
ATC contrôle
1800 1600 1400 1200 1000 800 600

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 52 : Spectres Raman SERS de : l’acétylcholine (ACH) seul et ACH (non transformé) observés à cause
de l'inhibition de l'activité de l'ACHE par le carbaryl (4x10 -5 M) et le paraoxon (4x10-5 M).
[114]
Dans un premiers temps, les spectres Raman SERS de lřactivité enzymatique de

lřACHE en absence de pesticide et en présence de deux types de pesticides : carbaryl (4x10
-5
M) et paraoxon (4x10-5 M) sont représentés sur la figure 52. Le spectre de diffusion
Raman SERS de la choline est obtenu, en absence dřinhibiteurs. En présence des
pesticides, nous obtenons bien un spectre identique à celui de lřACH.
3.5. Détection du paraoxon
3.5.1. Optimisation du temps de contact PO&ACHE
Différents temps dřincubation avec différentes concentrations de pesticides ont été

testés afin dřoptimiser la limite de détection de ce pesticide.
Figure 53 : εesure de lřactivité de lřACHE inhibée par le paraoxon à différentes concentrations μ (ж) 0 M ,
(×) 4x10-10 ε, (▲) 4x10-9 ε, (■) 4x10-7 ε, (♦) 4x10-3 ε et différentes durées dřincubation (0-5h). La courbe
est exprimée par mesure de lřACH transformé (intensité de la bande Raman à 639cm-1).
δ'inhibition de l'ACHE est observée dès le contact de lřACHE avec les pesticides.
La figure 53 illustre lřeffet du paraoxon, à différentes concentrations (4x10-10 M, 4x10-9 M,
4x10-7 M, 4x10-3 M), sur l'activité de lřACHE au cours du temps dřincubation. A partir de
ces résultats, une durée de contact, entre l'ACHE et l'inhibiteur avant l'analyse SERS, de 30
min a été choisie pour la quantification de l'inhibition de lřenzyme par les polluants. On
considère que la disparition de la bande de vibration Raman à 639 cm -1, en absence de
pesticides, correspond à 100% dřactivité de lřACHE.
[115]
3.5.2. Limite de détection
Afin de mesurer la limite de détection de notre biocapteur, basé sur la spectroscopie

Raman SERS, différentes concentrations de paraoxon ont été testées (figure 54) avec une
durée optimisée dřincubation de γ0 min. δa concentration de paraoxon varie de 4x10 -9 à
4x10-15 mol.L-1 (figure 54-A).
A)
639
1735
(a)
Intensit?Raman (u.a.)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Nombre d'onde (cm )
B)
Intensité de la bande à 639 cm (u.a.)
-1
-14 -12 -10 -8
Log [PO/M]
Figure 54 : (A) Spectres Raman SERS de l'acétylcholine après incubation avec l'acétylcholinestérase
mélangée avec différentes concentrations de paraoxon: (a) 4x10 -9; (b) 4x10-10; (c) 4x10-11 ; (d) 4x10-12 ; (e)
4x10-13 ; (f) 4x10-14 et (g) 4x10-15 M respectivement. (B) Courbe d'étalonnage de la variation de l'intensité de
la bande à 639 cm -1 en fonction de la concentration de paraoxon.
[116]
Comme le montre la figure 54-A, l'intensité des bandes à 639 cm-1 et 1735 cm-1 croît
lorsquřon augmente la concentration de pesticides, montrant ainsi lřaccumulation de lřACH
due à lřinhibition progressive de l'activité enzymatique de l'ACHE. δ'intensité de la bande à
-1
639 cm en fonction de la concentration du paraoxon (exprimée en log) est représentée
-1
dans la figure 54-B. Cette figure montre que lřintensité de la bande à θγλ cm est
directement proportionnelle à la concentration de Paraoxon avec une limite de détection
dřenviron 4x10-14 M.
3.6. Détection du Carbaryl
Nous avons également étudié lřeffet du carbaryl sur lřactivité enzymatique de

lřacétylcholinestérase. Pour cette raison, différents temps dřincubation avec différentes
concentrations de ce pesticide ont également été testés.
Figure 55 : Mesure de l’activité de l’ACHE inhibée par le carbaryl à différentes concentrations : (ж) 0M,
(×) 4x10-9 M, (▲) 4x10-8 M, (■) 4x10-6 M, (♦) 4x10-4 M et différentes durées d’incubation (0-5h). La
courbe est exprimée par mesure de l’ACH transformé (intensité de la bande Raman à 639cm-1).
δřinhibition de lřactivité de lřACHE par le carbaryl, à différentes concentrations

(4x10-10 M, 4x10-9 M, 4x10-7 M , 4x10-3 M ) et après 0 min, 30 min, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h de
temps dřincubation , est illustrée à la figure 55. Nous avons observé le même effet du
carbaryl sur lřactivité de lřACHE que celui du paraoxon. δřactivité de l'ACHE est inhibée
directement après l'exposition de cet enzyme aux pesticides. Nous avons utilisé la même
durée dřincubation (carbaryl&ACHE) que celle choisie pour le paraoxon (30 min).
δes spectres Raman SERS de lřactivité enzymatique de lřACHE inhibée par une
gamme de concentrations de carbaryl, allant de 4x10-5 à 4x10-10 M, apparaissent sur la figure
[117]
56-A. De façon analogue à l'inhibition avec le paraoxon, l'intensité de la bande de vibration

-1
à 639 cm sřamplifie lorsque la concentration de l'inhibiteur augmente, ce qui montre que
lřactivité de l'enzyme est bloquée. δa variation de l'intensité de la bande de vibration à 639
cm-1, en fonction du logarithme de la concentration de carbaryl, est donnée en figure 56-B.
δřintensité de cette bande est directement proportionnelle à la concentration de carbaryl avec
une limite de détection dřenviron 1.9 x 10-9 M.
A)
639
Inte nsité Raman (u.a.)
1735
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
B)
I639 (a.u.)
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
Log [CA/M]
Figure 56 (A) Spectres Raman SERS de l'acétylcholine après incubation avec l'acétylcholinestérase mélangée
avec différentes concentrations de paraoxon: (a) 4x10-5; (b) 4x10-6; (c)4x10-7; (d) 4x10-8; (e) 4x10-9 et (f)
4x10-10 M respectivement. (B) Courbe d'étalonnage de la variation de l'intensité de la bande à 639 cm -1 en
fonction de la concentration de carbaryl.
[118]
La différence entre la limite de détection du carbaryl et celle du paraoxon peut être

expliquée par le fait de la différence de leur mode d'inhibition. Le complexe ACHE-
paraoxon est plus stable dans le temps que lřACHE-carbaryl (Jeon et al.). Les insecticides
organophosphorés (par exemple le paraoxon) forment des complexes très stables avec
l'ACHE par phosphorylation du groupe hydroxyle sérine. L'enzyme phosphorylée est à peine
réactivée, ce qui entraîne une perte pratiquement irréversible de l'activité enzymatique. En
revanche, l'enzyme inhibée par des carbamates (comme carbaryl) via la carbamylation se
régénère spontanément en enzyme active (Bartolini et al 2007; Eckert et al. 2006;
Kretschmann et al. 2012). En résumé, ces différents résultats montrent que ce biocapteur
peut être utilisé pour la détection des pesticides, dans les deux cas d'inhibition de l'ACHE
(réversible et irréversible). Ce biocapteur est non sélectif, avec une limite de détection
inférieure ou égale aux résultats obtenus par dřautres techniques (Tableau 14).
Tableau 14 : Comparaison de la méthode présentée dans ce document avec des méthodes classiques pour la
détection de différents pesticides.
Method Materials Recognition Target Detection Reference

element analyte limit
electrochemical pralidoxime on - OP 6.8 pM (Dong et al.
sensor GQDs modified pesticides 2015)
glassy carbon
electrode
electrochemical microelectrod array ACHE OP 33 nM (J. Wang,
sensor pesticides Suzuki, and
Satake 2014)
optical sensor Eu(III)Ŕ - Azinphous 0.35 µM (Azab, Orabi,
Bathophenanthroline ethyl and Abbas 2015)
probe Malathion
and
Heptachlor
potentiometric the IrOx pH-sensing ACHE OP 3 µM (J. Wang et al.
sensor electrode pesticides 2015)
Biosensor Immobilization of ACHE OP 0.08 nM (Yu et al. 2015a)

AChE onto amino pesticides
functionalized
carbon nanotubes
Biosensor AuNPs ACHE OP and 4*10-2 This method
CA pM
pesticides
3.7. Identification des pesticides
Nous pouvons identifier les pesticides (à forte concentration) directement sur les
spectres Raman SERS en mesurant lřactivité de lřACHE. Sur les spectres Raman SERS
de lřactivité enzymatique de lřACHE inhibée par le paraoxon (4x10-5 M), nous observons
[119]
des bandes de vibrations caractéristiques de ce pesticide : 826, 1110, 1277, 1325, 1585
cm -1. De même, en présence de carbaryl (4x10-5 M), nous obtenons une bande spécifique
de cet inhibiteur à 1370 cm-1 (Figure 57)
714
826
1277
865
639
950
1438
1220
1735
1110
intensité Raman (u.a.)
1325
inhibition par PO
1585
-5
(4x10 M)
inhibition par CA
1378
-5
(4x10 M)
ATC contrôle
1800 1600 1400 1200 1000 800 600

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 57: Spectres Raman SERS de : l'acétylcholine (ACH) et ACH (non transformé) observés à cause de
l'inhibition de l'activité de l'ACHE par le carbaryl (4x10 -5 M) et le paraoxon (4x10-5 M).
δřétude de la variation de l'intensité de la bande à θγλ cm-1, en présence de pesticides

à très faible concentration, nous a permis une quantification de l'inhibition de l'ACHE.
Cependant, ces mesures ne nous ont pas permis l'identification de ces inhibiteurs. Celle-
ci peut être réalisée en analysant les spectres par des méthodes statistiques telles que
lřanalyse en composante principale (ACP) qui est une méthode statistique multivariée
utilisée en spectroscopie analytique. Cette approche consiste à trier les spectres, en
différentes catégories, en fonction de leur degré de similarité. La classification des
familles de spectres indépendants permet de mieux les identifier. δřACP applique des
transformations linéaires spécifiques pour convertir un ensemble de variables
éventuellement corrélées en un ensemble de valeurs de variables linéairement non
corrélées appelées composantes principales (Almaviva et al.).
δa courbe de lřACP obtenue concernant les deux premières composantes principales

des spectres Raman, est illustrée sur la Figure 58. Les échantillons contenant du carbaryl
[120]
apparaissent nettement séparés des échantillons contenant du paraoxon. Ils se sont

agglomérés de manière satisfaisante en groupes distincts (Figure 58). De plus, les
échantillons, dont la concentration de paraoxon est élevée (4x10-7 M), sont séparés des
échantillons contenant des concentrations moindre (de 4x10-9 à 4x10-15 M). Cela peut être
expliqué, par la présence de bandes intenses du paraoxon sur le spectre Raman SERS qui
sřajoute aux bandes de vibration de l'ACH non transformé (Figure 57).
4
PO(0,1µM)
3 PO(0,1µM)
PO(0,1µM)
PO
PO(0,1µM)
2
)%
PO
9 PO PO
1( PO
1 CA
CA CA
2
- PO CA
PO
C PO CACA
P
PO PO CA CACA CA
0 PO PO
CACA
PO POPO CA CA
PO PO CA CA CA CA
POPO PO PO
-1 CA
CA
CA
CA
-2
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
PC-1 (48%)
Figure 58 : Courbe ACP des répartitions des deux premières composantes principales pour les spectres
Raman SERS obtenues par la réaction de l'acétylcholine avec l'acétylcholinestérase inhibée par le carbaryl
(4x10-6 – 4x10-9 M) et le paraoxon (4x10-7 – 4x10-14 M).
Ces résultats montrent des différences significatives dans les spectres Raman SERS
observables pour les deux pesticides. Outre la quantification par la spectroscopie Raman
SERS, l'utilisation d'une technique dřanalyse chimiométrique simple, comme l'ACP, permet
une identification et une distinction rapide et fiable du paraoxon et du carbaryl.
3.8. Mesure de l’activité de l’AC(E en présence d’échantillons d’eaux

naturelles.
Nous avons réalisé des tests avec notre biocapteur sur des échantillons dřeau
naturelle, prélevés dans des fermes utilisant des pesticides. Nous avons mesuré lřactivité
enzymatique de lřACHE, dans trois échantillons dřeau conservés à 4°C. δřactivité de
lřACHE a été mesurée chaque jour pour tous les échantillons y compris le témoin avec
lřACHE seul. Nous avons remarqué une inhibition de lřactivité de lřenzyme après le dixième
jour de contact. Cependant, nous nřavons pas constaté dřinterférence entre le spectre
dřACH et les composés ciblés et non ciblés dans lřeau. Cette inhibition peut être expliquée
[121]
soit par la présence dřautres inhibiteurs dans les échantillons dřeau (autres que les
pesticides), soit par la présence dřune faible concentration de ceux-ci : le moment de notre
prise dřéchantillons au εaroc ne correspondant pas à la période de traitement des cultures,
nous avons testé de lřeau de puits (peu profonds), utilisée pour lřusage quotidien (traitée
pour être potable). Nous nřavons pas eu lřoccasion dřeffectuer dřautres mesures afin
dřanalyser la qualité et la composition de nos échantillons pour confirmer les résultats.
4. Perspectives : mesures d’autres polluants émergeants

(plastiques)
Chaque année dans le monde, plusieurs dizaines de millions tonnes de matières

plastiques sont produites pour une très large gamme d'utilisation industrielles et
domestiques. En raison de leur faible coût et de nombreux avantages (durabilité, facilité de
mise en oeuvre, légèreté...), les quantités produites sont en constante augmentation. Mais de
nombreux usages des matières plastiques sont des usages de courte durée (emballages
notamment) et (Jambeck et al.) ont récemment estimé que pour la seule année 2010, entre
4,8 et 12,7 millions de tonnes de déchets plastiques sont entrés dans les océans et une forte
tendance à la hausse pour les années à venir est attendue. Après moins d'un siècle
d'existence, les plastiques représentent jusqu'à 80 % des déchets marins dans les zones les
plus contaminées (Cózar et al.).
Le terme "plastiques" représente en fait l'ensemble des polymères thermodurcissables

produits industriellement. Les plus utilisés sont le polyéthylène (PE, existe sous deux
formes: haute densité PEHD et basse densité PELD), le polypropylène (PP), le polyvinyl
chloride (PVC), le polystyrène (PS) et le polyéthylène téréphtalate (PET). Ces 5 polymères
représentent environ 90% de la production totale (Andrady). Ce sont des matériaux de haut
poids moléculaire, non biodégradable et donc extrêmement persistants dans l'environnement
où ils s'accumulent depuis plusieurs décennies. Ils y subissent différents processus de
dégradation - exposition aux UV, oxydation, très lente biodégradation par des micro-
organismes marins, abrasion mécanique du sable et des marées - qui conduisent à leur
fragmentation en particules de petites tailles, appelées microplastiques (Andrady et al 2011;
Costa et al. 2010). Cette nouvelle pollution omniprésente dans tous les compartiments
océaniques soulève de nombreuses questions. Les plastiques contiennent notamment de
nombreux additifs permettant d'allonger leurs durées de vies et pour leur conférer une
meilleure résistance à la chaleur, l'oxydation et aux mécanismes de dégradation (anti-
[122]
oxydants, anti-UV,...) (Browne et al.). Tous les additifs utilisés dans l'industrie des
plastiques ne sont pas parfaitement identifiés mais certains (nonylphenol, polybrominated
diphenyl ethers, phthalates, bisphenol A) sont connus comme des composés genotoxiques et
toxiques pour la reproduction (perturbateurs endocriniens) (Talsness et al.; Teuten et al.).
Une étude suggère même que certaines formulations pourraient inhiber l'activité de l'ACHE
(Oliveira et al.) sans que les composés en cause aient pu être identifiés. Tous ces additifs
sont incorporés dans les polymères en concentrations variées et peuvent être relarguées dans
l'environnement aquatique à différentes périodes au cours du vieillissement en
fonction des paramètres physico-chimiques ambiants (température par exemple) (Teuten et

al.). Bien que leur toxicité soit fortement suspectée même à faibles concentrations, il y a, à
l'heure actuelle, peu de méthodologies permettant de doser tous ces additifs, la plupart du
temps non identifiés car les compostions sont rarement connues, dans les polymères
commerciaux. Et surtout, doser un à un ces additifs relève d'une méthodologie analytique
complexe.
Nous avons donc testé la potentialité de notre protocole non sélectif pour détecter la
présence d'éventuels inhibiteurs de l'ACHE dans plusieurs polymères commerciaux dont
nous ne connaissions pas la composition.
Dans la figure 59-A, nous avons tracé la variation de lřactivité enzymatique de

lřACHE, en fonction de la durée dřincubation avec le plastique à 37°C. Pour cette phase
d'optimisation du protocole, nous avons travaillé sur un seul polymère, un PELD
commercial. δa Figure ηλ indique son effet au cours du temps sur lřactivité enzymatique de
lřACHE. δřactivité est quantifiée en fonction de la quantité de lřACH non transformée,
c'est-à-dire la variation de l'intensité de la bande de vibration à 639 cm-1. En effet, nous
avons remarqué que cette activité diminue après le neuvième jour de contact. La
superposition des spectres Raman SERS de lřactivité enzymatique de lřACHE μ en absence
dřinhibiteur et incubée avec le plastique à 4 et γ7°C après neuf jours, est représentée sur la
figure 59- B.
[123]
A) 100%
90%
80%
70%
% ACHE activity
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1 6 8 9 10
Incubation time (Days)
B)
639
Intensité Raman(u.a.)
1735
(c)
(b)
(a)
600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 59 : (A)- l’activité de l’ACHE déterminée par le taux d'hydrolyse de l’ACH (intensité de la bande à
639 cm -1). Les données sont exprimées en pourcentages de l'activité de l’ACHE testé selon différents temps
d'exposition (0-10j) à 37 ° C: (♦) incubée avec PELD2 (20 mg); (■) Contrôle sans inhibiteur. (B) spectres
Raman SERS de l’activité enzymatique de l’ACHE incubée avec le plastique (20mg de PELD2), après neuf
jours, à différentes températures : (a) contrôle sans PELD2; (b) à 4°c et (c) à 37°c.
Comme le montre la figure 59 en présence de 20mg de PELD2 et à γ7°C, lřactivité

de lřACHE est inhibée après le dixième jour mais pour le même échantillon conservé à 4°C
nous nřavons pas observé dřinhibition. Nous avons refait les mêmes mesures pour une
période de 11jours, mais après le onzième jour lřactivité de lřACHE sans inhibiteurs a été
également bloquée par accumulation de lřACH. Nous avons réalisé le même test avec des
morceaux de plastiques récupérés dans différents endroits.
[124]

639
(f)
(e)
(d)
(c)
(b)
(a)
600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 60 : Les spectres Raman SERS d'acétylcholine après incubation avec l'acétylcholinestérase en
présence de 20 mg de plastique: (a) 0; (b) PP1 ; (c) PP2; (d) PEHD; (e) PELD1 et (f) PELD2.
δa figure θ0 montre les spectres Raman SERS de lřACH après incubation avec
lřACHE en présence de différentes formulations commerciales de plastiques (PP1, PPβ,
PP3, PEHD, PELD1, PELD2 et PELD-Bio). En effet, en absence de plastique, l'ACHE reste
active jusquřau dixième jour, tandis que pour la même période dřincubation, l'inhibition de
l'ACHE par les plastiques (PP1, PP2, PEHD, PELDl et PELD2) est très clairement mise en
évidence par la présence de bandes de vibrations dřACH accumulé, dans les spectres Raman
SERS (figure 60 : b ; c ; d ; e et f). On constate, quřen présence de certains plastiques (5 sur
7), l'activité de lřACHE est bloquée et l'ACH n'est pas hydrolysé. Nous n'avons pas observé
d'inhibition, dans les mêmes conditions pour une des formes de PP et pour le PELD-Bio, qui
est un polyéthylène sans additifs.
Pour la comparaison entre la toxicité des plastiques et celle de pesticides (paraoxon),

nous avons tracé l'étalonnage de la variation de l'intensité de la bande à 639 cm-1 en
fonction du logarithme de la concentration de paraoxon (4x10-3 Ŕ 4x10-14 M) (Figure 61).
Comme nous lřavons déjà vu, lřintensité de la bande à θγλ cm-1 augmente en augmentant la
concentration de paraoxon. Elle atteint sa limite à environ 1x10-8 M, après cette
concentration nous observons une légère diminution due à lřinterférence des bandes de
[125]
paraoxon avec celles de lřACH. δřintensité de la bande de lřACH en présence de 1x10-8 M

de paraoxon est considérée comme une inhibition complète de lřenzyme.
Par ailleurs, nous avons mesuré lřintensité de la bande dřACH à 639 cm-1 pour
lřinhibition de lřenzyme avec les plastiques étudiés. Nous avons observé que le taux
d'inhibition de l'ACHE par 5 sur 7 des plastiques étudiés est d'environ 29 % ± 4, ce qui est
équivalent à une inhibition par une concentration de PO d'environ 10-13M. Nous avons donc
montré le potentiel de notre protocole pour détecter la présence d'inhibiteurs de l'ACHE,
même s'ils sont non identifiés, dans des matrices autres quřaqueuses. On peut supposer que
dans le cas des plastiques, un temps de contact de plusieurs jours avec l'enzyme a été
nécessaire car les inhibiteurs, piégés dans une matrice solide, n'étaient pas immédiatement
en contact avec l'enzyme comme c'est le cas lorsque les polluants sont an phase liquide. Pour
gagner du temps, une phase d'extraction des additifs pourrait être réalisée. Mais ces résultats
préliminaires, obtenus de façon assez simple, illustrent déjà les perspectives d'utilisation d'un
tel biocapteur.
Intensité de pic (u.a.)
-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2

Log(PO/M)
Figure 61: Courbe d'étalonnage de la variation de l'intensité de la bande à 639 cm -1 en fonction de Log de la
concentration de paraoxon (4x10-3 Ŕ 4x10-14 M).
Conclusion
δes synthèses de nanoparticules dřor ont été réalisées avec la méthode de Turkevich.
Les observations effectuées notamment par microscopie électronique en transmission ont
[126]
montré la formation de nanoparticules de taille moyenne de 15 nm avec une bande de

résonance plasmon à ~516 nm.
Ces nanoparticules non transformées ont permis, dřune part, lřobtention dřune
exaltation du signal Raman (SERS) du paraoxon et du carbaryl ainsi que de lřACH et
dřautre part, leur détection à très faible concentration. Pour cela, un système simple et
efficace dřéchantillonnage a été mis en place en mélangeant une goutte de nanoparticules
centrifugées avec la molécule cible, puis en déposant une goutte de cette solution sur un
substrat réfléchissant et hydrophobe (surface en aluminium).
A partir de lřeffet SERS obtenu par ces nanoparticules, un nanobiocapteur sensible a

été développé pour mesurer lřactivité enzymatique de lřACHE et détecter ces inhibiteurs.
δe principe de ce biocapteur est basé sur la spectroscopie Raman SERS couplée à lřactivité
enzymatique de lřACHE.
Ce protocole sřest révélé très sensible, très simple et peu coûteux, pour la mesure de
l'activité enzymatique de l'ACHE en présence de concentrations extrêmement faibles de
pesticides. Notre technique ne nécessite aucun processus compliqué, elle ne nécessite pas de
modification de lřACHE ni de prétraitement des nanoparticules. δa quantification de la
détection de pesticides a été obtenue par le contrôle de la quantité du neurotransmetteur
ACH non transformé. Pour cela la variation de lřintensité de la bande caractéristique de
lřACH à 639 cm-1 a été contrôlée. La variation de la concentration du paraoxon ou du
carbaryl est apparue linéairement proportionnelle à la variation de lřintensité de cette bande.
Nous avons constaté quřavec cette méthode, leur limite de détection est nettement plus basse
que celle obtenue par détection directe avec la spectroscopie Raman SERS.
Dans toutes les conditions, les spectres enregistrés se sont avérés très reproductibles
avec un écart type inférieur ou égal à 6% de l'intensité moyenne à 639 cm-1.
Comme perspectives, notre biocapteur peut être utilisé dans lřanalyse de nouveaux
polluants. Les différents résultats obtenus montrent que ce « nanobiocapteur » pourrait être
employé, à l'avenir, pour la détection rapide de tous les types d'inhibiteurs de lřACHE
(identifiés ou non), en milieu aqueux ou dans des échantillons plus complexes, avec une
excellente sensibilité et une bonne reproductibilité pour une détection non sélective,
qualitative ou quantitative.
[127]
Partie C RESULTAS ET DISCUTIONS
VII. Biocapteur optique basé sur le Raman SERS@ACHE

immobilisée
Le coût des enzymes étant non négligeable, il peut être envisagé de les utiliser pour
plusieurs dosages. Pour cela, une autre méthodologie a été testée μ immobiliser lřenzyme sur
une surface dřor.
1. )mmobilisation de l’AC(E en vue d’une réutilisation.
Dans ce travail, nous allons utiliser un biorécepteur enzymatique, immobilisé sur une
surface dřor, en vue dřélaborer un biocapteur optique en résonnance de plasmon de surface
pour la détection des pesticides. La fonctionnalisation permet la fixation de lřenzyme utilisée
et rend le biorécepteur souvent réutilisable.
1.1. Modification de la surface d’or
Nous avons fonctionnalisé la surface dřor avec le chlorure de benzènesulfonyle, en

nous basant sur des travaux précédemment effectués au sein du laboratoire de chimie de
lřIεεε (J. Chen et al. 2008; Kengne-Momo et al 2011; Squillace et al 2016). Pour cela,
nous avons préparé la solution dřacide pour la réduction des sels dřaryldiazoniumμ (10mε)
NaNO2 + (10mM) H2N-Ar-SO3H dans HCl (10 mL, 1 M)), et ensuite nous avons introduit les
électrodes dans la solution. La présence de NaNO2 en milieu acide permet de former
rapidement une amine en sel dřaryldiazonium. δřélectrode est modifiée en maintenant le
potentiel à +2.21 V pendant 5s, -0.14 V pendant 10 s puis en cyclant 10 fois entre -0.2 V et
0.2 V à une vitesse de 100 m V .s-1. La préfonctionalisation de la surface avec des fonctions
Ar-SO3H sřopère selon le schéma réactionnel suivant :
R-Ar-NH2 + NaNO2, HCl R-Ar-�2+�� − CV R-Ar• Au R-Ar-Au
Schéma 1 : Schéma réactionnel de lřélectro -greffage des sels dřaryldiazonium pour former la fonction Au-Ar-
SO3H.
Les résultats obtenus sur la pré-fonctionnalisation des électrodes par le radical Ar-
SO3H sont représentés dans les figures 62 et 63.
0,0
-0,2
-0,4
I (mA))
-0,6
-0,8
-1,0
-1,2
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3
E(v)
Figure 62: Voltampérogrammes cycliques de modification de la surface d'or, V= 100mVs -1 au cours de 10

cycles.
-50
- Delta f (Hz)
-100
-150
-200
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012

Temps (s)
Figure 63: Suivi gravimétrique de la modification de la surface d’or.
Sur les voltammogrammes cycliques enregistrés (Figure 62), lřintensité du courant au

premier balayage de potentiel représente un pic de réduction à 0.14 v/(Ag/AgCl) qui
correspond à un courant de réduction de -1.02 mA. Cette intensité diminue de façon très
significative à partir du deuxième balayage et varie ensuite peu. Ce phénomène révèle la
modification presque totale de la surface au premier balayage par la passivation de
lřélectrode. Cette passivation entraîne une forte diminution de lřintensité du courant qui est
directement reliée à la quantité de matière réduite à la surface. Elle caractérise la réduction
irréversible des sels dřaryldiazonium en aryle radicalaire et la formation dřune monocouche
[129]
de chlorure de benzènesulfonyle à la surface de lřor, par une liaison covalente. Cette première
vague est corroborée par une prise de masse nette sur le signal de la microbalance à cristal de
quartz (QCM) (Figure 63). La QCM utilise les propriétés piézoélectriques du quartz afin de
mesurer de faibles variations de masse et de viscosité proches de la surface du cristal. Au
premier balayage, nous avons une grande prise de masse et ensuite une stabilité pour les
autres balayages de potentiel. Ce qui signifie que la surface dřor est totalement modifiée dès
le premier balayage avec une prise de masse qui peut correspondre à un recouvrement total.
δa variation globale de fréquence observée pendant la fonctionnalisation de la surface dřor est
de lřordre de 170 Hz et correspond à une variation de masse de lřordre de 180 ng. Cette prise
de masse a été calculée grâce à la relation de Sauerbrey suivante (Babacan et al.):
−2�02
∆� = ∆�
� µ� ��
Avec :
 Δf = variation de la fréquence de résonance du cristal de quartz
 Δm = variation de la masse du cristal de quartz
 f0 = fréquence de résonance propre du cristal de quartz
 A = surface active (métallisée) du cristal de quartz
 q = module de cisaillement du cristal de quartz (2,947. 1011g.cm-1/s2)
 ρq = densité du cristal de quartz (2,648g/cm3)
1.2. )mmobilisation de l’AC(E
Pour lřimmobilisation de lřACHE sur la surface de lřélectrode modifiée Ar-SO3H,

lřélectrode a été nettoyée par lřeau distillée et séchée. Nous avons trempé lřélectrode
modifiée dans une solution de dichlorométhane (CH2Cl2) contenant 5mM de PCl5, pendant 3
min, pour obtenir une couche organique de type Ar-SO2Cl.
δřélectrode nouvellement modifiée est ensuite séchée afin de pouvoir déposer

lřenzyme. δřimmobilisation a été suivie par la microbalance à cristal de quartz (QCε). La
surface dřor fonctionnalisée (Au- Ar-SO2Cl) est montée dans une cellule électrochimique et
connectée à la microbalance. θ00 δ de solution de tampon PP sont introduits initialement
dans la cellule pour assurer la stabilisation du signal de la microbalance.
[130]
Ensuite des injections de β0 l de solution dřenzyme se sont succédées. δa surface est enfin
démontée de la cellule électrochimique puis lavée et séchée, et ensuite conservée dans le
tampon PP à 4°C. Le mécanisme de la réaction est présenté ci-dessous :
PCl5/ CH2Cl2 QCM

Au-Ar-SO3H Au-Ar-SO2Cl Au-Ar-SO2-ACHE
δes cinétiques correspondantes à la modification de la surface dřor par lřenzyme sont

présentées sur la Figure 64.
100
-100
-delta f (HZ)
-200
-300
-400
0 500 1000 1500 2000

Temps (s)
Figure 64 : Suivi gravimétrique de l'immobilisation de l’enzyme ACHE
À partir de la courbe de suivi gravimétrique qui présente une variation de la fréquence

de résonance du cristal de quartz en fonction du temps, on remarque que lřinjection de
lřenzyme entraîne une variation de la fréquence de résonance du cristal de quartz de lřordre
de 400 Hz. Cette variation de fréquence correspond à une variation de masse de lřordre de 4γθ
ng (relation de Sauerbrey). On observe sur cette courbe, un dépôt graduel de masse sur la
surface. Ce qui laisse penser à une réaction thermodynamiquement stable de lřenzyme avec la
surface fonctionnalisée. Pour sřassurer du couplage covalent entre lřenzyme et la surface dřor,
les tests de la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE ont été réalisés en se servant de la
réaction catalytique de lřACH, en acide acétique et choline, en présence de lřACHE.
[131]
Nous avons vu précédemment que, en présence de lřACHE non inhibée, lřACH est
totalement transformée en choline et acide acétique (disparition de la bande de vibration
Raman à 639 cm-1). Nous avons déposé 5 µδ dřACH à 0.0001ε sur la surface dřor modifiée
et les mesures Raman ont été réalisées (Figure 65).
Figure 65 : Mesure de l’activité de l’ACHE immobilisée sur la surface d’or.
Avant la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE, lřélectrode est rincée dans la

solution tampon ayant servi pour la conservation de lřenzyme afin de supprimer les enzymes
adsorbées non spécifiquement sur la surface modifiée, ainsi que les autres molécules (Figure
65 μ étape 1). Notre objectif étant la réutilisation du biocapteur en vue dřun bon rendement
sensibilité-coût, nous avons utilisé la surface dřor modifiée comme support dřenzyme pour la
transformation de lřACH. δřanalyse directe de la surface dřor modifiée par lřACHE, par la
spectroscopie Raman, peut provoquer sa dégradation. Cřest pour cette raison que nous avons
conservé la surface à 4°C et récupéré lřanalyte de la surface après la réaction (Figure θ5 :
étape β). δřamplification du signal Raman de lřanalyte a été accomplie par les
nanoparticules dřor utilisées au cours des mesures précédentes (Figure θ5 : étape 3). La figure
66 ci-dessous représente le spectre Raman SERS du : résultat de la réaction de lřACH avec la
surface dřor modifiée par lřACHE et de lřACH seul.
[132]
Choline
ATC
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 66: Spectres Raman SERS de : la choline observés suite à la transformation de l’ACH en présence de
l'ACHE immobilisée sur la surface et (0.0001M) ACH (pour comparaison).
Après lřajout des AuNPs à la solution d'analyte (obtenue par la réaction de lřACH
avec la surface modifiée par lřACHE), on obtient un signal Raman peu intense (Figure θ6,
choline) correspondant au spectre de diffusion Raman SERS de la choline, avec les bandes de
vibration à 714, 865, 950, 1267 et 1438cm-1 caractéristiques de cette molécule (Tableau 12).
Pour comparaison, nous avons aussi représenté le spectre de diffusion Raman SERS de
lřACH (Figure 66). Nous remarquons bien la différence entre le spectre de diffusion Raman
SERS de lřACH et celui de la choline. Les bandes de vibration à 639 et 1735 cm-1 sont
caractéristiques de la partie acide acétique de la molécule ACH. Leur disparition dans le
spectre d'hydrolyse de ce neurotransmetteur est directement liée à la transformation de
lřACH, comme affirmation de lřimmobilisation de lřACHE sur la surface dřor.
δorsquřon compare les spectres Raman SERS de la choline et de lřACH, on observe

une amplification des bandes de vibration de lřACH beaucoup plus importante que pour la
choline. Cela confirme notre hypothèseμ en présence de la choline, les nanoparticules dřor
sřagrègent et se précipitent, par conséquent nous nřobtenons pas une amplification importante
du signal Raman de cette molécule.
[133]
2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E.
Nous avons suivi la transformation de lřACH en présence de lřACHE immobilisée

pour différentes durées de contact La figure 67 illustre la superposition des spectres obtenus
pour la mesure de lřactivité de lřACHE immobilisée.
714
639
(c)
(b)
(a)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 67 : Spectres Raman SERS de l'acétylcholine (ACH0.0001M) en fonction du temps :

(a)10 min et (b) 60 min : ACH non transformée par ACHE, (c)3h transformation de l’ACH en présence de
l'ACHE
δřintensité de la bande de vibration à θγλ cm-1diminue et disparaît après environ 3h
de contact (Figure 67). Nous pouvons en conclure que la transformation de lřACH (0.0001M)
peut être effectuée complètement à 4°C en γh de contact avec lřACHE immobilisée. Nous
avons utilisé ces valeurs comme conditions optimales pour la suite de nos tests de mesure de
lřactivité enzymatique de lřACHE.
3. Détection du paraoxon
Après la confirmation de lřimmobilisation de lřACHE sur la surface dřor nous avons

utilisé ce biocapteur pour la détection du paraoxon, en nous basant sur le même principe de
mesure. δa solution de pesticide est préparée comme nous lřavons vu précédemment. δa
surface dřor modifiée et portant lřenzyme est introduite dans la solution de pesticides (1mδ)
pendant γ0 min puis lavée au tampon et séchée. Ensuite une solution de lřACH (0.0001M)
[134]
est déposée sur cette surface. Pour les mesures Raman nous avons suivi le même protocole
décrit ci-dessous (figure 65) pour la mesure de lřactivité enzymatique de lřACHE immobilisée
sur la surface dřor. Après la réaction de lřACH avec la surface dřor modifiée par lřACHE
(inhibée par le paraoxon), nous avons récupéré lřanalyte pour les mesures SERS.
639 (b)
1736
(a)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure 68: Spectres Raman SERS de : (a) l'acétylcholine (ACH) et (b) ACH (non transformé) observés à cause
de l'inhibition de l'activité de l'ACHE par le paraoxon (4x10-13 M).
Comme prévu, en présence du paraoxon (4x10-13 M), nous avons obtenu le spectre de
lřacétylcholine (Figure 68) qui est un indicateur de lřinhibition de lřactivité enzymatique par
le paraoxon.
Conclusion
Comme alternative, nous pouvons proposer un deuxième système de détection Raman

SERS couplée à la mesure de lřactivité de lřACHE. δřimmobilisation de lřACHE sur une
surface dřor fonctionnalisée, permit dřobtenir un biocapteur très performant et réutilisable.
δřimmobilisation de lřACHE sur la surface a été vérifiée par la technique QCM et par mesure
de lřactivité enzymatique de lřACHE immobilisée.
Ce système basé sur la détection Raman SERS est plus sensible que les tests Raman
permettant de détecter lřactivité de lřACHE sans immobilisation. δe fait que lřenzyme soit
immobilisée sur la surface, permet facilement une inhibition par une faible concentration de
pesticides. δe signal Raman SERS de lřACH ou la choline, résultante de la mesure de
[135]
lřactivité de lřACHE, est facilement identifiable à cause de lřabsence dřinterférence du signal

Raman avec dřautres molécules dans lřanalyte (pesticides, enzyme,…).
En comparaison avec les résultats obtenus dans la littérature pour la limite de

détection, à savoir :
6.5x10-10 mol/L (H. Zhang et al.), 9,6x10-10 mol/L (P. Li et al.), la limite de détection est
inférieure à 5 10-8 mol/L (Wang et al 2014), 0.22µM (May et al.), 0.212µ mol/L (Turan et al.),
notre biocapteur que apparaît plus sensible puisque nous avons un seuil de détection à 4x10-13
mol/L .
Ces différents résultats montrent que ce « nanobiocapteur» pourrait être employé, à

l'avenir, pour la détection rapide de tous les types d'inhibiteurs de lřACHE, en milieu aqueux,
avec une excellente sensibilité et une bonne reproductibilité pour une détection non sélective.
δřintérêt principal par rapport à lřutilisation de lřACHE non immobilisée est la réutilisation
possible de la surface.
[136]
VIII. Autres résultats : Détection de pesticides par mesure de

l’activité enzymatique de l’AC(E couplée { la diffusion
dynamique de la lumière.
δes nanoparticules dřor (AuNPs) et dřargent (AgNPs) possèdent des

propriétés physico-chimiques très distinctes qui les rendent intéressantes pour la fabrication
de nombreux biocapteurs. La taille et la forme des nanoparticules déterminent ces propriétés
qui présentent une excellente biocompatibilité en utilisant des ligands appropriés (Xiangmin
et al. 2013). Les nanoparticules d'or (AuNPs) sont parmi les nanoparticules métalliques les
plus utilisées et les plus employées dans lřélaboration des biocapteurs optiques en raison de
leurs propriétés physiques et chimiques stables.
La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est une technique de diffusion de lumière

quasi élastique utilisée pour déterminer le diamètre hydrodynamique moyen et la distribution
de taille des nanoparticules, des polymères et des protéines (Huang et al.). Les AuNPs sont
utilisés comme amplificateurs de diffusion de la lumière dans les biocapteurs établis par la
DLS (Esfahani et al.; Ramanaviciene et al.). Les biocapteurs associés à la DLS sont
développés en se basant sur l'agrégation des AuNPs induite par lřanalyte. δa mesure du
changement de la taille des AuNPs provoqué par la liaison avec lřanalyte a permis la détection
de très faibles concentrations dřanalyte, tels que les protéines, l'ADN et les ions métalliques
toxiques (Gao et al. 2011; X. Liu et al. 2009; Xiang-min Miao et al. 2012; Xiong et al. 2012)
Cette étude est consacrée au développement dřune nouvelle méthode sensible pour la
détection des inhibiteurs de l'acétylcholinestérase en utilisant la diffusion dynamique de la
lumière couplée à lřactivité enzymatique de lřACHE. Nous montrons que les paramètres
physico-chimiques (stabilité, agrégation et dissolution) des nanoparticules dřor en particulier
dans le milieu de contact, sont fortement influencés par lřactivité enzymatique de lřACHE.
1. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E par la DLS.
Pour garantir l'adéquation du biocapteur pour la détection des inhibiteurs de l'ACHE,

un test de mesure de lřactivité de cette enzyme est réalisé.
1.1. Effet de la taille des nanoparticules.
L'efficacité des nanoparticules (NP) pour absorber et diffuser la lumière dépend

fortement de leur taille et de leur forme ainsi que des propriétés diélectriques de
[137]
l'environnement (Kolwas et al. 2009). Pour étudier l'effet de la taille des nanoparticules sur la
sensibilité du biocapteur, des AuNPs non modifiées (trois diamètres différents) et des AgNPs
non modifiées (trois diamètres différents) sont incubés avec la choline produite dans les
conditions optimales μ lřhydrolyse de lřACH (1x10-3 M) mélangé, pendant 30 min à 37 ° C,
avec ACHE (2x10-2 U.mL-1). La concentration des nanoparticules choisie a été ajustée pour
obtenir un Count Rate dřenviron β00 kcps avec la plus faible concentration en Nps. Un signal
DLS stable a été obtenu en fixant les concentrations de particules à 35x109, 4,5x109 et 55x107
particules / ml pour des diamètres de 20, 40 et 80 nm AuNPs respectivement, et 35x109
particules / mL pour les AgNPs, et ces concentrations ont été désignées comme étant
optimales pour la stabilité de diamètre hydrodynamique moyen (Dhm) et lřintensité de
diffusion moyenne (Idm).
La figure 69 représente la variation du Dhm et Idm des nanoparticules en présence de

choline produite par l'hydrolyse de l'acétylcholine en présence de lřACHE. δa production de
la choline induit lřagrégation de toutes les nanoparticules. Le Dhm des NPs a accru en choline
pour atteindre approximativement le même Dhm (≈1γ0 nm ± 10) (figure 69ŔA). Les
complexes choline@AuNPs (20 nm) présentent une intensité de diffusion de la lumière
beaucoup plus forte que les autres groupes de choline-NPs (figure 69ŔB).
Aux mêmes concentrations de la choline, la même surface de nanoparticules a été

occupée. A cause de lřexcès en choline dans la solution, les nanoparticules se sont agrégées
et le Dhm augmente. Nous savons que l'intensité de diffusion de la lumière est proportionnelle
à la taille des particules, les nanoparticules les plus grandes ont une diffusion de la lumière
beaucoup plus forte que les plus petites. Alors que dans notre cas, même si le Dhm des amas
des nanoparticules agrégées est presque le même (≈1γ0 nm ± 10), nous constatons que lřIdm
des AuNPs (40 et 80 nm) est plus faible que celle des AuNPs (20 nm). Ce qui implique que
les agrégats des AuNPs (20 nm) ne présentent pas la même forme que celles des AuNPs 40 et
80 nm et donc que pour des concentrations élevées en choline, le couple choline@AuNPs (40
et 80 nm) se lie à un autre couple, formant ainsi une grappe qui précipite.
[138]
A)
Dhm AuNPs@ATC@ACHE
160
Dhentre Dhm AuNPs@ATC@ACHE et AuNPs
140
120
100
Dhm (nm)
80
60
40
20
0
AuNPs(20nm) AuNPs(40nm) AuNPs(80nm) AgNPs(20nm) AgNPs(40nm) AgNPs(80nm)
B)
1400 Idm AuNPs@ATC@ACHE

Idm entre Idm AuNPs@ATC@ACHE et AuNPs
1200
1000
Idm (kcps)
800
600
400
200
0
AuNPs(20nm) AuNPs(40nm) AuNPs(80nm) AgNPs(20nm) AgNPs(40nm) AgNPs(80nm)
Figure 69 : Effet des nanoparticules sur la sensibilité du biocapteur. (A) variation du diamètre hydrodynamique
moyen des nanoparticules (ΔD), seul et en présence de choline produite par l'hydrolyse de l'acétylcholine avec
l'ACHE. (B) (ΔI) correspondante.
Les AuNPs et AgNPs se lient facilement à la choline par des interactions

électrostatiques, ce qui nous a permis de mesurer lřactivité enzymatique de lřACHE par la
DLS. La sensibilité de cet essai dépend fortement de la taille et du type des NPs. Pour
obtenir une bonne sensibilité, il faut avoir un changement de diamètre et dřintensité le plus
[139]
important possible. Les AuNPs (20 nm) sont choisies pour la suite de notre travail, parce
quřelles sont les plus sensibles.
1.2. Optimisation du temps d’incubation
Pour mesurer lřactivité de lřACHE par le biocapteur, une dispersion contenant des
AuNPs revêtues de citrate de dimensions 20 nm est utilisée. La concentration massique d'or
dans toutes les dispersions contenant des nanoparticules dřor (β0 nm) est dans la gamme de
7,00 x 1010 particules / mL. Les solutions des nanoparticules sont préparées par dilution dans
le tampon PP à partir de solutions mères de particules.
Nous avons commencé à mesurer lřactivité de lřACHE en fonction de temps. δes

AuNPs sont incubées dans la choline produite par l'hydrolyse de l'ACH (1x10-3 M) en
présence de lřACHE (2x10-2 U/mδ) en fonction du temps d'incubation. δřACHE et lřACH
sont mixés et conservés durant le temps dřincubation à γ7°C pour une transformation rapide
de lřACH. Lorsque ces NPs sont ajoutées à la choline ainsi produite, la liaison entre la
choline et les AuNPs devrait provoquer l'agrégation des nanoparticules (Po Wang et al.).
Le Dhm et lřIdm des AuNPs en fonction de la concentration en choline, produite à

différents temps d'incubation de l'ACH et de l'ACHE, sont tracés sur la figure 70. Comme le
montre cette figure, la taille des agrégats des nanoparticules et lřintensité lumineuse
augmentent en fonction de la quantité de choline produite. A faible concentration de choline
produite (avant 1η min dřincubation) il nřy a pas dřagrégation des particules. Par contre, un
fort accroissement de taille à 30 min a été observé. Après 30 min on observe un plateau,
indiquant un état d'équilibre qui correspond à la transformation totale de lřACH en choline.
Le temps de γ0 mn a donc été choisi comme temps dřincubation optimal de lřACH avec
lřenzyme avant les mesures DδS.
[140]
1400
140
1200
120
100 1000
80
Idm (kcps)
Dhm (nm)
800
60
600
40
400
20
0 200
0 10 20 30 40 50
Temps d'incubation (min)
Figure 70 : Effet de la choline produite à différents temps d'incubation (0-100 min) de l'ACHE (2x10-2 U.mL-1)
avec l’ACH (1x10-3 M), sur la réponse du biocapteur (la variation de D hm et Idm des AuNPs).
1.3. Optimisation de la concentration en ACHE et ACH
L'effet de la concentration de l'ACHE sur la réponse du biocapteur a également été

étudié (Figure 71). Nous remarquons que le Dhm et lřIdm des AuNPs croissent avec
l'augmentation de la quantité d'ACHE et atteignent le maximum à 2x10-2 U.mL-1, indiquant
un état dřéquilibre. δes résultats sont en accord avec les précédents, en augmentant la
concentration de lřACH, la quantité de la choline produite croît. Ceci confirme que la forte
concentration de la choline est capable dřagréger les nanoparticules et de diminuer leur
potentiel électrostatique (C.-W. Liu et al.). Ainsi, nous avons choisi 2x10-2 U.mL-1 d'ACHE
comme concentration d'enzyme optimale pour le biocapteur.
160 1400
140
1200
120
1000
100
Idm (kcps)
Dhm (nm)
800
80
600
60
400
40
20 200
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
-2
Concentration de l'ACHE [x10 u/ml]
Figure 71 : Effet de lřajout de différentes concentrations de l'ACHE à lřACH (1x10-3 M) pendant 30 min à 37 °
C, sur la réponse du biocapteur.
[141]
Ces résultats indiquent qu'en présence de choline et d'enzyme ACHE, l'ACH n'a pas
d'effet sur le Dhm et lřIdm des AuNPs et la concentration élevée en choline induit l'agrégation
des AuNPs.
Des expériences d'optimisation de la concentration de lřACH sont réalisées dans une

plage de concentration de (0 à 2) x 10-3 M (Figure 72). La Figure 73-A montre le changement
de couleur en fonction de la concentration (la couleur des solutions est passée du rouge au
violet progressivement), ce qui a été encore confirmé par le changement de Dhm et de lřIdm.
Avec l'augmentation de la concentration d'ACH, la concentration de choline produite
augmente induisant lřagrégation des nanoparticules.
Le Dhm et lřIdm des AuNPs sont représentés en fonction de la concentration d'ACH

(Figure 72-B). Le Dhm et lřIdm des AuNPs augmentent lorsque la concentration de lřACH
croit, et le maximum est atteint à 1x10-3 M, indiquant un état d'équilibre. La valeur optimale
pour la concentration d'ACH dans le présent essai était d'environ 1x10-3 M. L'accroissement
du Dhm et de lřIdm des AuNPs avec la concentration d'ACH à faibles doses correspond à une
augmentation graduelle de la couverture de surface des AuNPs par la choline produite.
D'autre part, à des concentrations supérieures à l'état d'équilibre, le même degré dřagrégation
des nanoparticules est induit lorsque la surface est complètement recouverte de choline. Le
degré d'agrégation des AuNPs dépend de la concentration de choline, où des concentrations
plus élevées de choline induisent une agrégation complète des nanoparticules.
A)
B)
160
1400
140
1200
120
1000
100
Idm (kcps)
Dhm (nm)
800
80
600
60
40 400
20 200
1E-4 1E-3
Concentration de l'ATC [M]
Figure 72 : Etude de la sensibilité du biocapteur à l'ACH : A) Changement de couleur des

nanoparticules d’or avec l'augmentation des concentrations d'ACH, de gauche à droite (0-2,0x10-3 M); B) le
diamètre hydrodynamique moyen et l'intensité de diffusion moyenne des nanoparticules d’or incubées avec la
choline produite par l’ACH à différentes concentrations en présence de l’ACHE. La concentration en ACHE est
de 2x10-2 U.mL-1, et le temps d'incubation est de 30 min à 37°C.
[142]
2. Discussion
2.1. Formation du couple ACH@NPs.
δa complexité de lřétude des interactions entre des molécules et des nanoparticules

nécessite dřétudier lřeffet de chaque molécule en mélange et isolée. Pour cette raison, nous
avons aussi étudié le comportement des nanoparticules au contact de lřACH en mesurant leur
diamètre hydrodynamique moyen (Dhm) et leur intensité (Idm). Les mesures par DLS de
l'agrégation des NPs d'or sont effectuées directement après incubation des AuNPs non
modifiées avec différentes concentrations dřACH. Tous les échantillons ont été dispersés dans
du PP 0,01 M (pH 8) pour un volume final de 1,0 mL. Nous avons tracé sur la figure 73 la
distribution de tailles en intensité des nanoparticules seules et en présence de lřACH (3x10-4
M).
22
20
18
AuNPs
16 AuNPs@ATC
14
Id (kcps)
12
10
0
16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192
Dh (nm)
Figure 73: Distribution de tailles en intensité des nanoparticules seules et en présence de l’ACH
((3x10-4 M).
Comme le montre la figure 73, le diamètre hydrodynamique moyen des AuNPs@ACH

varie légèrement. Ceci montre quřil y a liaison de la molécule ACH, contenant le groupement
quaternaire ammonium (chargé positivement), avec les nanoparticules (chargées
négativement) par attraction électrostatique (Mautner et al. 1964). Nous avons remarqué aussi
une légère augmentation de l'intensité de diffusion moyenne (Idm) (Tableau 15).
[143]
Tableau 15: distributions de taille et d’intensité des nanoparticules
Taille et intensité des NPs Dh moyen (nm) Intensité de diffusion

moyenne (kcps)
AuNPs (35x1010 particules/ml) 33 233
AuNPs dans ACH (3x10-4 M) 55 340
En faisant évoluer la concentration en ACH, il est possible dřétudier les interactions

physico-chimiques entre les nanoparticules et lřACH en incubant ces dernières dans
différentes concentrations de ce neurotransmetteur (de 0 à 4x10-3 M) (figure 74).
1000
1400
1200
1000
800
600
Dhm (nm)
100
400
10 200
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040
Concentration of ATC [M]
Figure 74: Effet de la concentration d'ACH (0-4x10-3 M) sur le diamètre hydrodynamique moyen et l'intensité de
diffusion moyenne des AuNPs. L’erreur a été obtenue à partir de trois mesures indépendantes.
Comme le montre la figure 74, le Dhm du mélange d'AuNPs et d'ACH (de 0 à 4x10-4
M) est presque inchangé mais nous observons une amplification de l'intensité de diffusion
moyenne. Celle-ci peut rendre lřACH amplificatrice de lřintensité des nanoparticules
individuelles sans agrégation. Le Dhm et lřIdm augmentent par addition d'ACH de 3x10-4 à
2x10-3 M. Lřagrégation des AuNPs est due à la diminution des répulsions interparticules
(Liron et al 2011). Pour une concentration dřACH supérieure à 2x10-3 M nous observons un
début de précipitation des nanoparticules correspondant à lřaugmentation de la taille des
agrégats et à la diminution de lřintensité de diffusion.
[144]
Ces résultats révèlent lřinstabilité des nanoparticules chargées négativement qui peut
être induite par la présence dřACH provoquant leur agrégation. En outre, la sensibilité de la
DLS aux agrégations des nanoparticules est significativement plus élevée que celle aux
nanoparticules individuelles. Cette sensibilité est attribuable au fait que l'intensité de diffusion
de la lumière est proportionnelle à la taille des particules (Liu et al 2009).
Toutes les molécules contenant le groupement thiol peuvent facilement être absorbées
sur la surface des nanoparticules par la liaison ŔS (Ghosh et al 2007; Liu et al. 2012), qui est
capable dřagréger les nanoparticules. En effet, lřACHE se lie à la surface des nanoparticules
et les protège en présence de lřACH, et celui-ci est incapable de lřécarter de la surface ni de se
lier avec eux comme une molécule chargée négativement (pas dřagrégation en présence de
lřACH non transformé).
La molécule de la choline contient le groupement quaternaire ammonium capable de

réagir avec la surface dřor et aussi le groupement ŔOH capable de se lier à la surface dřor
(Okumura et al.), en induisant une agrégation des nanoparticules. Elle peut éliminer la
molécule de lřACHE de la surface dřor induisant leur agrégation à forte concentration (D. Liu
et al.), où le composé AuNPs@ACHE peut être utilisé comme un composé négatif pour
attirer dřautres molécules positives (choline), puisque le point isoélectrique de lřACHE se
trouve aux environs dřun pH=η (nous avons un pH=8). Ce qui leur permet de se lier à
dřautres molécules par absorption électrostatique (Hou et al.).
2.2. Formation des agrégats de nanoparticules.
Pour étudier la formation des agrégats des nanoparticules, trois solutions d'AuNPs et
trois suspensions des nanoparticules d'argent (AgNPs) ont été utilisées pour l'analyse DLS en
présence de lřACH.
La figure 75 représente la variation du Dhm et Idm des AuNPs (20, 40 et 80 nm) et des
AgNPs (20, 40 et 80 nm) introduites dans lřACH (2x10-3 M).
[145]
280 1400
260 Dhm 1200

240 Idm
1000
220
200 800
(kcps)
(nm)
180 600
160
hm
400
dm
140
D
I
200
120
100 0
80 -200
60
-400
AuNPs (20nm) AuNPs (40nm) AuNPs (80nm) AgNp (20nm) AgNp (40nm) AgNp (80nm)
Figure 75 : Sensibilité des nanoparticules à l’ACH (2x10-3 mol/L). (ΔDhm) Variation du diamètre
hydrodynamique moyen et (ΔIdm) la variation de l’intensité de diffusion moyenne des nanoparticules d’or (20,
40, 80nm) et argent (20, 40, 80nm).
Le ΔDhm et la ΔIdm des AuNPs (20 nm) sont plus grands que ceux des autres
nanoparticules, ces nanoparticules sřagrègent dans lřACH et leur intensité augmente. Pour
les AuNPs (40 nm), nous constatons une grande variation de lřIdm mais la variation du
diamètre est faible par rapport à celle des AuNPs (20 nm). Pour les autres nanoparticules,
lřIdm décroît pour une forte agrégation. Cette dissemblance est due à la différence du
mécanisme dřagrégation (Lucas et al 2011; Meakin et al. 1986).
δřagrégation consiste à former des structures plus grandes à partir de particules isolées
ou dřagrégats plus petits. Il y a plusieurs processus dřagrégation possibles. Dans notre cas,
cřest lřagrégation limitée par diffusion (DδA) où les particules, avant de se coller, étaient
soumises à un mouvement brownien au hasard et enfin lřagrégation par réaction se fait par
contact, comme une épidémie ou un feu qui se propage (Cugniet et al 2003).
δes ions présents dans lřélectrolyte sont soumis dřune part au potentiel électrostatique
développé par la surface et dřautre part au mouvement Brownien des particules et des
agrégats. δors des premiers instants, lřagrégation mettra en jeu des particules primaires
sphériques. Cependant, ultérieurement, les collisions auront lieu entre agrégats.
[146]
Dans les solutions moins concentrées, les agrégats suivent des trajectoires déterminées
au hasard (= mouvement Brownien) mais ne s'accrochent pas à chaque fois qu'ils viennent en
contact. Au lieu de cela, ils continuent leur chemin et de nombreuses collisions sont
nécessaires avant que deux agrégats ne s'accrochent ensemble. Ce comportement est le
résultat d'une barrière d'énergie due au potentiel répulsif d'une paire particule - particule qui
doit être franchie avant que les forces attractives de courte portée puissent s'exercer.
Dans le cas de solutions plus concentrées, les collisions agrégat Ŕagrégat sont plus
probables dřoù la forte probabilité que les paires dřagrégats s'accrochent lorsqu'elles entrent
en contact et se précipitent.
La taille de l'agrégat ne dépend pas de la densité en nombre de nanoparticules mais

dépend de la densité massique des nanoparticules: plus les nanoparticules sont légères plus on
a la possibilité de former des agrégats de plus grande taille et inversement. On peut avoir des
agrégats plus grands mais moins intenses (faible nombre de particules, par exemple), ce qui
va leur permettre de ne pas se précipiter et de diffuser plus de lumière et inversement.
Dans le cas des AuNPs β0 nm , il nřy a pas précipitation (car amplification de lřIdm )
malgré la grande taille les agrégats.
3. Détection du paraoxon
Ce biocapteur enzymatique est utilisé pour la détection du paraoxon. Les mesures DLS
sont effectuées directement après incubation des AuNPs (20 nm) avec lřanalyte.
Premièrement lřACHE est mixée avec différentes concentrations de paraoxon (de 4x10-3 à
4x10-11 M ) pendant 30 min à température ambiante et ensuite l'ACH est ajoutée, lřanalyte est
conservé pendant 30 min à 37°C.
Les résultats de détection du paraoxon sont représentés sur la figure 76. Comme on
pouvait s'y attendre, le Dhm et lřIdm des AuNPs non modifiées augmentent en diminuant la
concentration de paraoxon. En réduisant la quantité du paraoxon, nous avons plus d'enzymes
non inhibées donc plus de choline produite. Le changement de couleur des AuNPs en
fonction de la concentration de pesticides est représenté sur la figure (76-A). La couleur des
solutions a viré progressivement du violet au rouge en augmentant la concentration de
[147]
paraoxon, ce qui est la conséquence du changement du diamètre hydrodynamique moyen des

nanoparticules. Comme le montre la figure 76-B, le Dhm et lřIdm diminuent avec
l'augmentation de la concentration de paraoxon. Cependant les AuNPs non modifiées sont
stables en présence de forte concentration de paraoxon en raison de l'inhibition de l'activité de
l'ACHE, et sřagglomèrent en présence dřune faible concentration en pesticides.
A)
B)
160 1400
140 1200
120
1000
100
Dhm (nm)
800
Idm kcps
80
600
60
400
40
200
20
0
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Concentration de PO /log[M]
Figure 76 : Effet de l'inhibition de l'ACHE par différentes concentrations de paraoxon (4x10 -3 à 4x10-11 M) sur :
(A) la couleur des AuNPs et (B) le Dhm et Idm des NPs.
1,2
1,0
DhAu/DhAu&PO
0,8
0,6
0,4
0,2
-10,5 -10,0 -9,5 -9,0 -8,5 -8,0 -7,5

Concentration of PO /log[M]
Figure 77: Courbe d'étalonnage de la variation du rapport des AuNPs, seul (D hm) et des incubés dans l’analyte
(Dhm Au@PO), en fonction de la concentration du Paraoxon.
[148]
Nous avons tracé la variation du rapport entre le Dhm des AuNPs, seules et les AuNPs
en présence de lřanalyte, en fonction de la concentration du paraoxon (de 4,η x 10-8 à 4,5 x 10-
11
M) sur la figure 77. En conséquence, le rapport de diamètre est directement proportionnel à
la concentration de paraoxon.
Conclusion
En conclusion, nous avons développé pour la première fois (selon nos connaissances)
un biocapteur enzymatique, à base de la DLS en utilisant des AuNPs (20 nm), pour mesurer
lřactivité de lřACHE et détecter ces inhibiteurs. δa réponse de ce biocapteur est obtenue en
surveillant la variation de Dhm et Idm en fonction de la concentration de la choline.
Les nanoparticules sont instables dans la choline, le Dhm croit en augmentant la

concentration de la choline produite par hydrolyse de lřACH en présence de lřACHE. δřIdm
des AuNPs (20 nm) sřamplifie significativement en augmentant le degré dřagrégation des
nanoparticules, contrairement aux AuNPs (40 et 80 nm) et AgNPs (20, 40 et 80 nm qui se
précipitent en accroissant leur taille.
Nous nous sommes servis de cette variation pour le contrôle de la perte d'activité de
l'ACHE en présence de faibles concentrations de paraoxon.
Ce protocole optimisé est sensible, très simple. Il ne nécessite aucun processus

compliqué, de modification ou prétraitement des AuNPs. La limite de détection pour ce
biocapteur pourrait être améliorée en changeant quelques paramètres, telles que l'utilisation
dřun volume plus élevé d'échantillons ou lřutilisation des nanoparticules avec une intensité de
diffusion plus élevée.
Cependant, il est probable que lřutilisation de ce biocapteur pour tester des

échantillons réels soit compliquée sans traitement de ces échantillons. La présence de
certaines substances peut interagir en plus du composé cible, pour donner lieu à des réponses
faussement positives ou faussement négatives. Nous espérons néanmoins que d'autres études
sur cette approche contribueront à améliorer la limite de détection des inhibiteurs de
lřacétylcholinestérase en utilisant la DδS basée sur AuNPs.
[149]
Conclusion générale et perspectives
Ce manuscrit résume le travail de ma thèse qui a consisté au développement dřun

biocapteur sensible, reproductible et spécifique pour la mesure de lřactivité enzymatique de
lřACHE couplée à la diffusion Raman exaltée de surface.
Dans un premier temps, nous avons testé la détection directe des pesticides à lřaide de
nanoparticules non fonctionnalisées en nous basant sur la résonance de plasmons de surfaces
pour amplifier le signal Raman. Ce système a permis la détection des pesticides mais la limite
de détection du paraoxon ne correspondait pas à la valeur fixée par lřorganisation mondiale de
la santé. En effet, pour atteindre des limites de détections plus faibles, il aurait fallu changer le
type de substrat SERS actif pour un substrat propre à chaque type de molécule cible. Ceci
nous a alors amené à conduire un travail sur la conception dřun biocapteur en mesurant
lřactivité enzymatique de lřACHE permettant ainsi de détecter tous les potentiels inhibiteurs
de cette enzyme. Nous avons privilégié des nanoparticules sphériques et non fonctionnalisées
dont le but d'optimiser lřintensité du signal Raman SERS de la réaction enzymatique, afin que
celle-ci soit reproductible, et dřéliminer lřinterférence du surfactant dans le spectre Raman.
Nous avons démontré que les nanoparticules dřor, synthétisées par la méthode de
Turkevich assurant un excellent contrôle des paramètres géométriques des nanostructures,
permettent la détection du neurotransmetteur ACH pour des concentrations de lřordre de 10-11
ε. Nous avons mené des études pour lřoptimisation du protocole de mesure de lřactivité de
lřACHE, afin dřobtenir une limite de détection minimale, tout en gardant un bon niveau
dřintensité SERS et une bonne reproductibilité de cette intensité. Cette approche a par ailleurs,
permis de comprendre les types dřinteractions entre les nanoparticules et lřanalyte contenant
lřACHE, lřACH et la choline produite par la transformation de cette dernière. Nous avons
également constaté que, la sensibilité mais surtout la spécificité du biocapteur sont
dépendantes de la réaction du catalyse de lřACH.
Nous avons montré quřune transformation de lřACH par lřACHE est visualisable par
la disparition de ses bandes sur les spectres Raman SERS, et lřapparition des bandes de la
choline produite. Dans la même étude, nous avons démontré que notre système de biocapteur
[150]
est spécifique, que le suivi et la détection de la choline produite, par différentes concentrations
de lřACHE, de lřACH (jusquřà 10-15 ε) et par différents temps dřincubation, est possible.
Cette technique est envisageable pour la conception dřun biocapteur permettant la détection
d'un grand nombre de pesticides. Par ailleurs, cette technique utilise des nanostructures faciles
à synthétiser pour de faibles coûts, ce qui ouvre la porte à une application à grande échelle.
δe biocapteur a été mis au point pour la détection dřorganophosphorés (exemple le

paraoxon) et carbamates (exemple le carbaryl) avec des limites de détection inferieures aux
valeurs fixées par lřorganisation mondiale de la santé (environ 4.0 x 10-14 M pour le Paraoxon
et 1.9 x 10-9 ε pour le carbaryl). Dans la suite, ce biocapteur a pu être testé pour lřanalyse des
échantillons plus difficiles à caractériser contenant d'autres types de polluants émergeants
comme les additifs dans les plastiques commerciaux.
Ces derniers résultats démontrent la possibilité dřutiliser ce biocapteur à des fins

environnementales ou médicales pour la détection des inhibiteurs de lřACHE. Par ailleurs,
lřétablissement dřune courbe de calibration a indiqué une relation linéaire entre le log de la
concentration de pesticides et lřintensité de la bande de vibration Raman à θγλ cm -1 de
lřACH.
En plus dřun fort niveau de sensibilité assurant la détection de pesticides en faible

concentration par le suivi de lřactivité de lřACHE en solution, nous avons proposé une
méthode alternative pour le même objectif par immobilisation de cette enzyme sur une surface
dřor. Cette immobilisation a été vérifiée par la QCε et par la mesure de son activité
(transformation de lřACH) par spectroscopie Raman SERS, dans l'objectif de rendre le
biocapteur et les enzymes en particulier, réutilisables. Pour les mesures Raman, nous avons
isolé lřanalyte (solution de lřACH ajoutée à la surface fonctionnalisée), ce qui a facilité
lřobtention du signal Raman par absence dřinterférence dřautres molécules dans le spectre.
Cette interférence a notamment été éliminée en lavant la surface avant et après chaque
interaction. En effet, nous avons montré quřen absence dřinhibiteurs (forte concentration de la
choline) nous obtenions un faible signal Raman parce que la choline provoque lřagrégation
des nanoparticules suite à des interactions électrostatiques. Par contre, nous avons pu obtenir
un signal Raman intense de lřACH en présence de pesticides.
[151]
Enfin, des mesures de lřactivité de lřACHE, par une technique optique de diffusion de
la lumière (DδS) utilisant des nanoparticules dřor (β0 nm) ont été testées. δa réponse est
obtenue en surveillant la variation de diamètre hydrodynamique moyen (Dhm) et lřintensité de
diffusion moyenne (Idm) en fonction de la concentration de la choline produite. Les
nanoparticules sont instables dans la choline, leur Dhm croit lorsque la concentration de la
choline produite par hydrolyse de lřACH en présence de lřACHE augmente. δřIdm des AuNPs
(20 nm) sřamplifie significativement en augmentant le degré dřagrégation des nanoparticules.
En effet, la taille des nanoparticules augmente en diminuant la concentration de pesticide
(paraoxon). Nous avons présenté ci-dessous une comparaison entre les trois biocapteurs
développés.
Comparaison entre les trois biocapteurs développés
Type de durée de réutilisation Interférence Fiabilité Identification sensibilité coût

biocapteurs traitement d’autres des pesticides
molécules
ACHE non ++ non oui non non ++ ++

immobilisée
@DLS
ACHE non + non Oui à oui oui + +
immobilisée haute
@SERS concentrati
on
ACHE +++ oui non oui non +++ ++
immobilisée
@SERS
Ce travail constitue une première approche de la détermination de lřactivité de lřACHE

et de la détection dřinhibiteurs paraoxon et carbaryl choisis comme modèle, avec un
biocapteur optique. Cette méthode basée sur un mode de détection optique est rapide, sensible
et reproductible. De plus, lřutilisation de la DδS pour le suivi de lřactivité enzymatique ou
lřinhibition dřenzyme, est une stratégie originale car, à notre connaissance, elle ne figure pas
actuellement dans la littérature. Les perspectives de ces travaux sont nombreuses.
Nos travaux se sont limités à la détection de lřactivité de lřACHE dans un milieu

tamponné. Il faudrait poursuivre lřétude en présence dřautre types de pesticides, notamment
en mélanges, afin dřappliquer notre stratégie dans un but dřanalyse dřéchantillons
environnementaux. Nous avons par exemple montré qu'il était possible de détecter des
[152]
substances inhibitrices dans des plastiques après quelques jours de contact avec les enzymes,
substances assez difficiles à détecter et quantifier par ailleurs. Et les résultats ont montré que
selon les compositions, une inhibition était présente, montrant le relargage possible de
substances toxiques par ces matériaux.
Nous pouvons aussi optimiser encore le protocole en utilisant dřautres types de

nanoparticules permettant éventuellement une amplification meilleure que celle que nous
avons obtenue. Nous savons aussi que la mesure de lřactivité de lřACHE nřest pas seulement
utilisée comme indicateur de présence de pesticides mais aussi pour des diagnostics en
médecine. Dans ce cas, notre système optique basé sur la mesure de lřactivité enzymatique
pourrait être adapté à des échantillons plus complexes. En effet, les interférences liées aux
molécules présentes dans les milieux biologiques pourraient être évitées par lřutilisation de
lřACHE immobilisée. Pour le biocapteur basé sur la DδS, la détection de pesticides est
possible, néanmoins, ce mode de détection doit être optimisé et les échantillons doivent être
traités avant les mesures, pour ne pas avoir dřinterférences, car la sensibilité reste faible par
rapport aux biocapteurs basés sur lřeffet SERS. εais la facilité d'utilisation d'une telle
stratégie ouvre des perspectives importantes.
Enfin, la poursuite de ce travail sur la détection dřinhibiteurs de lřACHE, pourrait être

envisageable par la miniaturisation et lřautomatisation du système.
[153]
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[166]
Amal EL ALAMI
Mise en œuvre de biocapteurs en vue de Implementation of biosensors for the
la détection de pesticides et polluants detection of pesticides and pollutants
dans l'eau par diffusion Raman exaltée in water by exalted Raman scattering
Résumé Abstract
La diffusion Raman exaltée de surface (SERS) est Surface-enhanced Raman scattering (SERS) was
utilisée pour la mise au point d’un biocapteur capable de used to develop a biosensor for the detection of pesticides
detecter des pesticides dans l’eau, en se basant sur le suivi through the monitoring of the enzymatic activity of
de l’activité enzymatique de l’Acétylcholinestérase (ACHE). acetylcholinesterase (ACHE). Gold nanoparticles (AuNPs)
Les nanoparticules d’or sont utilisées comme substrats were used as an active SERS substrate.
SERS actifs. The enhanced Raman signal of the analyte is
optimized by testing several types of nanoparticles.
Le signal Raman exalté de l’analyte est optimisé en Raman SERS allowed the direct detection of Paraoxon
testant plusieurs types de nanoparticules.Le Raman SERS (PO) and carbaryl (CA) pesticides and the possibility of
a permis la detection directe du Paraoxon (PO) et du follow-up of the activity of the ACHE. In the absence of
carbaryl (CA) et la possibilité de suivi de l’activité de inhibitors, the acetylcholine (ACH) is transformed into
l’ACHE. En absence d'inhibiteurs, la molécule acetic acid and choline by the enzyme ACHE. The
d’acétylcholine (ACH) est transformée en acide acétique et measurement of ACHE activity is performed through the
en choline par l’enzyme ACHE. La mesure de l’activité de monitoring of ACH concentrations because its
l’ACHE repose sur le suivi des concentrations en ACH car transformation is inhibited in the presence of pesticides.
sa transformation est inhibée en présence de pesticides. Il a Results showed a linear correlation between the
été ainsi possible d’établir une relation linéaire entre la concentration of pesticides and the SERS signal of the
concentration de pesticides et l’exaltation du signal Raman untransformed ACH. The method was optimized for the
de l’ACH non transformé. La méthode a permis la detection quantification of paraoxon and carbaryl with a limit of
du PO et du CA, avec une limite de detection beaucoup plus quantification much lower than the one obtained with a
faible que la detection directe. Ce biocapteur basé sur direct detection. Their identification was also possible
l’activité de l’ACHE a ensuite été utilisé pour l'évaluation using chemometrics. This biosensors, based on the ACHE
d’autres polluants (inhibiteurs d’ACHE) comme les additifs activities, was applied to the evaluation of emergent
contenus dans les plastiques notamment. pollutants: additives of commercial polymers. Our results
suggested that most of the tested polymers contained
Enfin, nous avons développé une seconde molecules that act as inhibitors of the ACHE.
approche qui consistait à mesurer l’activité de l’ACHE en Finally, we propose another very simple approach
utilisant la diffusion dynamique de la lumière. En effet, nous to measure the ACHE activity using dynamic light
avons montré que les paramètres physicochimiques scattering measurements. We found that the
(agrégation) des AuNPs en contact avec certaines physicochemical parameters (aggregation) of AuNPs were
molécules, sont fortement influencés par l’activité strongly influenced by the enzymatic activity of ACHE
enzymatique de l’ACHE. C’est ce phénomène d’instabilité when in contact with specified molecules, allowing to
qui nous a permis de distinguer entre les deux cas : detect the presence of PO.
absence et présence de PO.
Key Words:
Mots clés
Gold nanoparticles, Surface Enhanced Raman Scattering,
Nanoparticules d’or, diffusion Raman exaltée de surface,
biosensors, acetylcholinesterase, Dynamic Light Scattering,
biocapteurs, acétylcholinestérase, diffusion dynamique de la
pesticides.
lumière, pesticides.
L’Université Bretagne Loire/ l’Université Sidi Mohamed

Ben Abdallah – Fès

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Amal EL ALAMI

Mémoire présenté en vue de l’obtention du

Unité de recherche : IMMM-CNRS-UMR 6283, Le Mans, France/ LPS, équipe polymères et

Mise en œuvre de biocapteurs en vue de la

Rapporteurs : Jean-Louis MARTY, Professeur, Université de Perpignan (France)

Directeur de Thèse : Philippe DANIEL, Professeur, Université du Maine Le Mans (France)

Je souhaite remercier Monsieur Jean-Marc Grenèche, Directeur de l’IMMM ainsi que

Je tiens également à remercier l’Office Méditerranéen pour la Jeunesse (OMJ) pour

Je remercie aussi sincèrement mes directeurs et co-encadrant à savoir : Philippe

Je suis très sensible à l’honneur que me font également Messieurs Jean-Louis

Je tiens ensuite à remercier Monsieur Anouar JORIO, Professeur à l’Université Sidi

Je remercie également Monsieur Antoine kather, Professeur à l’Université d’Angers

Je voudrais exprimer toute ma considération aux ingénieurs et techniciens qui ont

Je remercie tout les enseignants des Département de Chimie et de Physique de la

Je dédie ce manuscrit à ma mère, à l’âme de mon père, Sébastien Hérault, à toutes

 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to chemometrics for identification and

 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to chemometrics for identification and

 ŖNew sensor for direct detection of pesticides in water by Raman spectroscopy

 ŖSensitive unmodified Gold Nanoparticle-based dynamic light scattering assay for

 ŖEnhanced Raman spectroscopy coupled to acetylcholinesterase activity for

-Communications à des colloques/congrès

 Journées de lřécole doctorale, 18 et 19 juin 2015 à Université du Maine: « New sensor

 SETAC Europe, 3-7 May 2015 en Centre Convencions Internacional de Barcelona

 Journées de lřécole doctorale, 1θ et 17 juin β014 à Université de Nantes, le titre du

7.3. Carbamates ................................................................................................................ 35

3.1.1 Biorécepteurs catalytiques pour les pesticides .................................................. 44

3.1.2 Biorécepteurs basés sur l'inhibition par des pesticides....................................... 45

3.2 Les types de transducteurs ..................................................................................... 46

3.2.1 Capteurs électrochimiques........................................................................... 46

3.2.2 Capteurs thermométriques et calorimétriques ....................................... 46

3.2.3 Capteurs à effet piézoélectrique (ou mécaniques) .................................. 47

4.2. Nature du plasmon de surface .................................................................................. 59

4.3. Plasmon de surface localisé dans les nanoparticules métalliques ................................ 60

5. La diffusion Raman Exaltée de surface ..................................................................... 62

5.2. L’effet chimique ........................................................................................................ 65

5.3. Types de substrat SERS actifs :............................................................................... 67

6. Techniques de fabrication de Substrats SERS : nanoparticules d’or .............. 68

1.2. Mode opératoire ....................................................................................................... 76

1.3. Caractérisation des nanoparticules d'or synthétisées ..................................... 77

1.4. Elaboration de substrats pour la spectrométrie Raman SERS ........................ 78

2. Préparation des solutions: ............................................................................................ 79

2.2. Préparation/stockage de la solution de l’AC(E ................................................ 80

2.4. Préparation des solutions de pesticides .............................................................. 80

2.4.1. Paraoxon .......................................................................................................... 80

2.4.2. Carbaryl ............................................................................................................ 81

3. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E par la spectroscopie Raman

3.1.1. Activité de l’AC(E en absence de pesticides ............................................. 81

3.1.2. Activité de l’AC(E en présence de pesticides ........................................... 82

3.1.3. Activité de l’AC(E en présence de plastiques avec additifs ................... 83

3.2. L’AC(E )mmobilisée sur la surface d’or ............................................................... 84

3.2.1. Modification de la surface d’or .................................................................... 86

3.2.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E ............................................. 88

4. Mesure de l’activité de l’AC(E par la diffusion de lumière DDL ...................... 88

4.2. Microscopie électronique en transmission (MET) ............................................ 95

2.2 Détection du Paraoxon .......................................................................................... 102

3. Détection des inhibiteurs de l’AC(E par mesure de son activité

3.2. Mesure de l’activité enzymatique de l’AC(E en absence de pesticides ....... 106

3.3. Optimisation de paramètres d’élaboration du biocapteur. ........................... 108