90-60-0005-A

ADN branché ou bDNA

I. Vassias

La technique de l’acide désoxyribonucléique (ADN) branché, ou branched DNA (bDNA) permet la détec-
tion d’acides nucléiques sans étape d’amplification. Elle est basée sur l’amplification d’une ou plusieurs
sondes hybridées à un acide nucléique cible. Elle a été développée pour détecter et quantifier des ADN
ou des ARN. Elle utilise une cascade de sondes spécifiques de la cible qui sont ensuite immobilisées
sur un support solide. Ces sondes s’hybrident à d’autres sondes, aboutissant à l’amplification d’un
signal quantifiable. Cette technique est aujourd’hui appliquée au diagnostic des infections virales et
plus particulièrement du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et des virus des hépatites.
© 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : bDNA ; Amplification de sonde ; ADN ; ARN

Plan Processus d’amplification

■ Principe de la technique 1
Hybridation des sondes cibles
■ Étapes 1 Deux sondes cibles sont utilisées : elles possèdent une région
Préparation de l’échantillon 1 complémentaire de l’ARN cible et une région complémentaire
Processus d’amplification 1 d’une autre sonde (Fig. 1).
Détection des sondes amplifiées 1
■ Avantages et inconvénients 3 Capture des complexes sonde-ARN
■ Applications possibles 3 Une des deux sondes cibles possède une séquence complémen-
■ Conclusion 3 taire d’une sonde (appelée sonde capture) fixée à un support solide
(microplaque). Le complexe sonde cible-ARN-sonde capture est
donc immobilisé.

 Principe de la technique Amplification des sondes

Les deux sondes cibles possèdent une séquence complémen-
La technique dite de l’« ADN branché », ou branched DNA taire d’une sonde appelée préamplificateur. Ce préamplificateur
(bDNA) est une technique basée sur l’amplification du signal de comporte plusieurs séquences complémentaires d’un amplifica-
détection et non sur l’amplification de l’acide nucléique, comme teur. Celui-ci est une structure branchée ayant l’aspect d’un
la polymerase chain reaction (PCR). L’acide nucléique, après avoir arbre de Noël, comportant de multiples séquences identiques,
été libéré des particules virales, est hybridé à des sondes spéci- complémentaires d’une sonde marquée à la phosphatase alcaline
fiques de la cible qui sont ensuite immobilisées sur un support. (sonde de marquage). Chaque structure branchée peut fixer 45
Ces sondes s’hybrident à d’autres sondes, aboutissant à l’émission sondes de marquage. Le substrat dérivé du dioxétane est ajouté et
d’un signal quantifiable. Cette technique a été développée pour une émission de photons est alors générée (Fig. 1).
détecter et quantifier des ADN ou des acides ribonucléiques
(ARN).
Détection des sondes amplifiées
La production de chimiluminescence peut être mesurée dans
 Étapes un luminomètre. Chaque échantillon est testé en double et
comparé à des standards de quantification. Ils permettent
Préparation de l’échantillon d’établir une courbe d’étalonnage, nécessaire à la détermina-
tion de la quantité d’acide nucléique présent dans l’échantillon.
Les acides nucléiques sont libérés par un traitement des échan- En effet, l’intensité du signal chimiluminescent, est directe-
tillons (le plus souvent du plasma) par la protéinase K et un ment proportionnelle à la quantité de cibles présentes au
détergent [1] . départ.

EMC - Biologie médicale 1

Volume 90-60-0005-A 2012
doi:10.1016/S2211-9698(12)56772-5
90-60-0005-A  ADN branché ou bDNA

Figure 1. Technique du branched DNA (bDNA). Les sondes cibles et la sonde capture s’hybrident à l’acide ribonucléique (ARN) cible et l’ensemble est
immobilisé sur un support solide. Un préamplificateur s’hybride alors aux deux sondes cibles simultanément. Plusieurs sondes « amplificateur » ayant la
structure d’acide désoxyribonucléique (ADN) branché en arbre de Noël s’hybrident au préamplificateur. Chaque structure branchée peut alors fixer 45
sondes de marquage. Une fois le substrat dérivé des dioxétanes ajouté, une émission de photons est générée, lisible par un luminomètre.

2 EMC - Biologie médicale

 ADN branché ou bDNA  90-60-0005-A

 Avantages et inconvénients aujourd’hui moins sensible que ses concurrentes. Dans la mesure
où le suivi des cinétiques virales est crucial pendant toutes les
Cette technique présente l’avantage, contrairement à la PCR, phases de la maladie, des essais virologiques spécifiques et sen-
de ne pas être sensible aux contaminations puisque la cible sibles sont désormais nécessaires [7-9] .
n’est pas amplifiée. De plus, il n’est pas nécessaire d’installer des
pièces spécifiques comme c’est le cas des techniques de détection Cet article a fait l’objet d’une prépublication en ligne : l’année du copyright peut
par amplification génique. Elle est relativement courte : 5 heures donc être antérieure à celle de la mise à jour à laquelle il est intégré.
réparties sur 2 jours, extraction des acides nucléiques comprise.
Enfin, elle peut s’effectuer à partir d’un échantillon simplement
lysé puisque peu de molécules inhibent les hybridations. En  Références
revanche, elle ne peut être utilisée que dans le cadre de trousses
commercialisées. [1] Vassias I. Principe de l’amplification en chaîne par polymérase. EMC
Dotée d’une bonne reproductibilité, elle est adaptée à l’analyse Biologie médicale 2012;7(1):1–5 [Article 90-60-0015-A].
de grandes séries dans le cadre de l’utilisation d’automate. [2] Scott JD, Gretch DR. Molecular diagnostics of hepatitis C virus infec-
tion: a systematic review. JAMA 2007;297:724–32.
[3] Elbeik T, Surtihadi J, Destree M, Gorlin J, Holodniy M, Jortani SA,
 Applications possibles et al. Multicenter evaluation of the performance characteristics of the
bayer VERSANT HCV RNA 3.0 assay (bDNA). J Clin Microbiol
2004;42:563–9.
Cette technique a été développée pour le diagnostic du VIH [4] Holguin A, Lopez M, Molinero M, Soriano V. Performance of
dans les années 1990. Deux autres trousses sont commercialisées three commercial viral load assays, Versant human immunodeficiency
depuis, pour le diagnostic du virus de l’hépatite C (VHC) et celui virus type 1 (HIV-1) RNA bDNA v3.0. Cobas AmpliPrep/Cobas
de hépatite B (VHB). Ce sont les trousses de troisième génération TaqMan HIV-1, and NucliSens HIV-1 EasyQ v1. 2, testing HIV-1
qui sont actuellement commercialisées (Versant® ). La sensibilité non-B subtypes and recombinant variants. J Clin Microbiol 2008;46:
de ces trousses reste néanmoins inférieure à celle utilisant la tech- 2918–23.
nique de PCR quantitative (real-time reverse transcriptase [RT]-PCR). [5] Church D, Gregson D, Lloyd T, Klein M, Beckthold B, Laupland
En effet, avec la technologie du bDNA, le seuil de détection du K, et al. Comparison of the RealTime HIV-1, COBAS TaqMan
VHC est de 615 UI/ml versus 50 UI/ml pour les trousses utili- 48 v1.0. Easy Q v1. 2, and Versant v3. 0 assays for determi-
sant la RT-PCR et 5 UI/ml pour celles employant la technologie nation of HIV-1 viral loads in a cohort of Canadian patients
transcription-mediated amplification (TMA) [2] . Néanmoins, elle est with diverse HIV subtype infections. J Clin Microbiol 2011;49:
très reproductible et sa spécificité oscille entre 96 % et 98,8 % [3] . 118–24.
Concernant le diagnostic du VIH, les techniques de PCR en [6] Ronsin C, Pillet A, Bali C, Denoyel GA. Evaluation of the COBAS
temps réel ont largement supplanté celle du bDNA en termes de AmpliPrep-total nucleic acid isolation-COBAS TaqMan hepatitis B
sensibilité [4] et aussi de spécificité vis à vis certains sous-types [5] . virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV
DNA 3.0 assay. J Clin Microbiol 2006;44:1390–9.
Enfin, la trousse Versant® pour le diagnostic des infections à
[7] Bourlet T, Signori-Schmuck A, Roche L, Icard V, Saoudin H, Tra-
HBV est aussi largement remplacée par les trousses utilisant les
baud MA, et al. HIV-1 VIRAL LOAD COMPARISON BETWEEN
techniques de PCR en temps réel, ces dernières étant plus sen- FOUR COMMERCIAL REAL-TIME ASSAYS. J Clin Microbiol
sibles [6] . 2011;49:292–7.
[8] Chevaliez S, Pawlotsky JM. Virological techniques for the diag-
nosis and monitoring of hepatitis B and C. Ann Hepatol 2009;8:
 Conclusion 7–12.
[9] Pawlotsky JM, Dusheiko G, Hatzakis A, Lau D, Lau G, Liang TJ, et al.
L’arrivée des techniques de PCR en temps réel depuis mainte- Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and
nant 10 ans a révolutionné les méthodes de détection des génomes practice: recommendations for a standardized approach. Gastroente-
viraux. Si la technique de l’ADN branché est séduisante, elle est rology 2008;134:405–15.

I. Vassias ([email protected]).
UMR 218 Institut Curie/CNRS, Centre de recherche, 26, rue d’Ulm, 75005 Paris, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Vassias I. ADN branché ou bDNA. EMC Biologie médicale 2012;7(1):1-3 [Article 90-60-0005-A].

Disponibles sur www.em-consulte.com

Arbres Iconographies Vidéos/ Documents Information Informations Auto- Cas
décisionnels supplémentaires Animations légaux au patient supplémentaires évaluations clinique

EMC - Biologie médicale 3