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    FT 12 Dénombrement Pseudo

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    Ce document décrit la technique de dénombrement des Pseudomonas sur gélose au cétrimide. Il présente la composition du milieu sélectif cétrimide, son principe de sélectivité, ainsi que les étapes de la technique comprenant la préparation de dilutions, l'ensemencement, l'incubation et le dénombrement des colonies.

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    Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

    FICHE TECHNIQUE N°11 : Dénombrement des Pseudomonas sur


    gélose au Cétrimide.

    Gélose au Cétrimide : Milieu sélectif destiné à l’isolement et au dénombrement de


    Pseudomonas aeruginosa dans les produits biologiques d’origine animale, les produits
    pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques.
    Composition : Pour litre de milieu :
    o Peptone ……………………………………………….………………… 20 g.
    o Chlorure de magnésium (agent différentiel) …………………...…. 1.4 g.
    o Sulfate dipotassique (agent différentiel) ..……………………...……. 10 g.
    o Cetrimide : cetyltrimethylammonium bromide (agent sélectif) . 0.3 g.
    o Glycérol ………………………………………………………….………. 10 g.
    o Agar ……………………………………………………………………. 13.6 g.
    pH du milieu prêt – à - l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.
    Principe : Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthyl-ammonium), composé ammonium
    quaternaire, agit comme inhibiteur d’une grande variété de germes, y compris les
    espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa.
    La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le
    chloroforme) est stimulée en présence de chlorure de magnésium et de sulfate de
    potassium.
    Le milieu favorise également la production de pigments fluorescents (pyoverdines) par
    certaines souches de Pseudomonas aeruginosa.
    La plupart des Pseudomonas aeruginosa sont identifiables à leur odeur
    d’aminoacétophénone.
    Technique :
    1) Préparation des dilutions décimales : voir fiche technique 1.
    2) Ensemencement en surface (en nappe) : voir fiche technique 5.
    3) Incubation : incuber à 30-35 ± 1°C pendant 24 ± 2h.
    4) Lecture :
    5) Pseudomonas aeruginosa présente des colonies pigmentées en jaune-vert
    fluorescentes sous rayons ultra-violets à 254 nm.
    6) Dénombrement : Compter les colonies typiques sur les boîtes contenant entre
    15 et 150 colonies. Faire la moyenne des trois boîtes pour la même dilution.
    Appliquer la loi de Kass : N = m x 1/V x 1/D (UFC/ml).
    N : le nombre d’unités formant une colonie de P. aeruginosa. m : la moyenne des boîtes. V : le volume
    ensemencé. D : la dilution correspondant aux boîtes choisies.

    1
    Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

    1 gr 1 ml 1 ml Préparation des
    dilutions décimales

    9 ml
    yaourt TSE

    Dilution Dilution Dilution


    0,1 ml 10 -1 10 -2 10 -3
    Ensemencement
    (en surface)

    Incubation
    37°C 24 h

    Confirmation : test
    de coagulase .. . . ..
    .. .. . .
    .
    .
    75 UFC 61 UFC 65 UFC …
    5 UFC 3 UFC 7 UFC
    615 UFC 596 UFC 589 UFC

    Comptage
    Des colonies

    m1 = 600 UFC m2 = 67 UFC m3 = 5 UFC

    Dénombrement

    Appliquer la loi de Kass N = m x 1/V x1/D.


    Choisir la moyenne située entre 15 et 150 colonies : 15 < m2 <150.
    La dilution qui correspond à la série de tubes de m2 est 10-2 .
    Le volume ensemencé V =0,1 ml.
    N = 67 x 0.1/1 x 1/10-2
    N = 67.103 UFC de P. aeruginosa /gr (ou ml).

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