Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie -

Taoufik Khaznadar, Constantine

3ème Année du cycle Ingénieur

[Cours UE-SF 2 : Enzymologie
(Module III); La cinétique de la catalyse
enzymatique (Suite).
Chargés d’enseignement:
Enseignant responsable : Dr. MAROUF A., Mohamed
Chargée de TD : Dr. MAKHLOUF
Chargée de TP : Dr. GASMI

Année universitaire 2022-2023

CONTENTS

01 Partie introductive

02 Cinétique michaelienne à un substrat et à un produit

03 Cinétique michaelienne à deux substrats

04 Mécanismes de régulation de l’activité enzymatique

05 Facteurs physicochimiques influençant la réaction

enzymatique
03 Cinétique michaelienne à
deux substrats
 L’étude cinétique des réactions enzymatique à deux substrats
permet de déterminer :

1. Les vitesses initiales à différentes concentrations des substrats;

2. L’ordre de fixation des substrats;
3. Les paramètres cinétiques pour chacun des substrats.

La fixation des substrats à l’enzyme conduit à la formation :

Réaction enzymatique avec formation d’un complexe ternaire :

Ces réaction obéissent à 2 types de mécanismes :

 Cinétique michaelienne à deux substrats
 Les réactions enzymatiques qui impliquent deux substrats et qui conduisent à la
formation deux produits représentent environ 60% des réactions enzymatiques connues.

E
A B PQ

 Presque toutes les réactions appelées à deux substrat sont catalysées:

 Soit par des transférases
 Soit des oxydoréductases
 Ligases
Transférases  enzyme qui catalyse le transfert d’un groupe fonctionnel spécifique « X »,
depuis un substrat à l’autre E
P X  B  P  B X
Oxydoréductases  enzyme qui catalyse le transfert des équivalents réducteurs d’un substrat
à l’autre.
 Les principes fondamentaux énoncés pour les enzymes à un seul substrat s’appliquent aux
enzymes à substrats multiples.
 1. Terminologie
 Nous suivrons la nomenclature introduite par W.W. Cleland en 1963
 Les substrat sont désignés par les lettres A, B, C, et D  dans l’ordre de
leur fixation à l’enzyme.
 Les produits sont désignés par P, Q, R, et S  dans l’ordre de leur
séparation de l’enzyme (ordre n’est pas toujours respecté pour les produits). W.W.Clealand
1930-2013
 Les on appelle E, F (G, H, ...)  les différentes formes de l'enzyme pour
les systèmes impliquant une isomérisation de celle-ci.

 Les réactions sont classées : Uni, Bi, Ter ou Quad  en fonction du nombre de substrats
ou de produits:
 Bi-Uni (ou Uni Bi) système impliquant 2 substrats et 1 produit (ou l'inverse).
 Bi-Bi  système impliquant 2 substrats et 2 produits.
 Bi-Ter  système impliquant 2 substrats et 3 produits
 Iso : système impliquant une isomérisation de l'enzyme (changement de conformation )
 Complexe central complexe entre l'enzyme et tous les substrats ou complexe entre
l'enzyme et tous les produits  complexe binaire ou ternaire.
 Les réactions enzymatiques sont décrites avec un diagramme dit Diagramme de Cleland:
 Enzyme est représentée par une ligne horizontale
 Les additions successives de substrats et les départs de produits  sont figurés par des
flèches verticales.
 Les formes de l’enzyme sont indiquées sous la ligne horizontales
 Les constantes de vitesses, si besoin, sont indiqués de part et d’autre des flèches.
2. Modèles de réactions Bi Bi
Les réactions « Bi Bi » peuvent être rangés en 3 catégories:

a) Les réactions séquentielles ou « simple déplacement »

 Tous les substrats (les deux substrats) doivent se combiner à l’enzyme avant qu’une
réaction puisse avoir lieu et que les produits puissent être libérées  Formation d’un
« complexe ternaire » entre l’enzyme et les deux substrats:
E  A  B  EAB  EPQ  E  P  Q
 Cette catégorie de réactions comporte deus classes:
 Système ordonné ou obligatoire
 Système non ordonné ou au hasard.
 b) Les réactions non séquentielles ou « double déplacement »
 Système où un produit est relargué entre les additions successives des substrats 

réactions « ping-pong »  formation d’un « complexe binaire » entre l’enzyme et le substrat .

c) Réactions selon le mécanisme Theorell – Chance

Système proposé par H. Theorell & B. Chance (1951) pour un mécanisme ordonné sans

complexe central  le premier produit est relargué par la fixation du dernier substrat.
2.1. Les réactions séquentielles ou « simple déplacement »
2.1.1. Système séquentiel ordonné ou obligatoire
Ordre de liaison des substrats à l’enzyme est obligatoire ou imposé  le « substrat A »

doit se fixer à l'enzyme libre « E » avant le « substrat B »  le « substrat B » ne peut se

fixer qu'au « complexe EA ».

La liaison du 1er substrat semble nécessaire pour que l’enzyme établisse le site de fixation
du 2ème substrat  un complexe ternaire EAB est toujours formé  sites non
indépendants.
 Le mécanisme réactionnel s'écrit :

k1 k2 k3 k4 k5
E  A   EA  B  EAB  EPQ  EQ  P  E  Q
k 1 k 2 k 3 k 4 k 5
 Représentation graphique selon le diagramme de Cleland

P
P

Schéma plus biologique pour illustrer le mécanisme Bi Bi ordonné à complexe ternaire

 Plusieurs déshydrogénases à « NAD » et « NADP » suivent ce genre de mécanismes et dans
lequel le coenzyme se fixe en premier .
 Ex. La lactate déshydrogénase  mécanisme Bi Bi ordonné:
 le coenzyme se fixe toujours en premier
 le lactate est toujours relargué en premier
Le nicotinamide adénine dinucléotide est une coenzyme présente dans toutes
les cellules vivantes. Il s'agit d'un dinucléotide, dans la mesure où la molécule
est constituée d'un premier nucléotide, dont la base nucléique est l'adénine,
uni à un second nucléotide, dont la base est le nicotinamide.

Structure du NAD+ (à gauche)

et du NADH (à droite)
 Nouvelle historique

George D. Birkmayer
Il a d'abord été diplômé en biologie cellulaire
à l'Université de Munich, puis à l'Université
de Graz où il est professeur de chimie
médicinale.

Le NADH ou Hydrogène biologique permet la

respiration cellulaire à un niveau inégalé. Le Professeur
Birkmayer est l'inventeur de la stabilisation de
l'hydrogène biologique.
2.1.2. Système séquentiel non ordonné ou au hasard ou aléatoire
 Deux substrats, A et B, se fixent de manière aléatoire sur l'enzyme libre E  il n'y a pas de
fixation privilégiée de l'un ou l'autre des deux substrats.

 Enzyme possède deux sites de fixation, un pour chaque substrat  la fixation d’un

substrat se fait indépendamment du second substrat.

 Le mécanisme réactionnel s'écrit :

 Représentation graphique selon le diagramme de Cleland:

Schéma plus biologique pour illustrer le mécanisme Bi Bi aléatoire à complexe ternaire
 Certaines déshydrogénases , kinases , synthase suivent ce mécanisme
 Ex. la créatine kinase  mécanisme Bi Bi au hasard.
2.2. Les réactions non séquentielles ou « double déplacement »
 Ce sont les systèmes « Ping-pong »  un ou plusieurs produits sont libérés avant que tous

les substrats n’aient été fixés.

 Les réactions ping-pong  mettent en jeu une catalyse covalente

 Le mécanisme est caractérisé par la formation obligatoire d'une forme transitoirement

modifiée de l’enzyme.

 Dans les réactions Bi Bi ping-pong  les substrats A et B ne se rencontrent pas à la

surface de l’enzyme.

 Les réactions ping-pong Bi Bi sont des réactions de double transfert:

 Un groupe fonctionnel du 1er substrat « A » est enlevé du substrat par l’enzyme « E » 

Formation du 1er premier produit « P » et une forme stable de l’enzyme « F »  ce groupement

est lié par covalence à l’enzyme (Ping);

 Le transfert du groupement de « F » vers le 2ème substrat B génère le produit « Q » et

régénère l’enzyme E (Pong).

 Représentation graphique selon le diagramme de Cleland:

 Les aminotransférases, certaines oxydo-réductases flaviniques, certaines transférases et

certaines protéases suivent un mécanisme Bi Bi Ping-pong.
 Ex. ASAT « aspartate aminotransférase » appelé également SGOT  mécanisme Bi Bi
Ping Pong.
2.3. Réactions selon le mécanisme Bi Bi Theorell – Chance (ordonné)

 Système proposé par H. Theorell & B. Chance (1951)

 Pas de complexe central ou isomérisation de l'enzyme.

 Le complexe central ne s'accumule pas  les substrats s'associent

faiblement avec l'enzyme  la concentration à l'état stationnaire du

complexe central est négligeable du point de vue cinétique.

 L’enzyme lie le substrat A et pas le substrat B  On observe un complexe binaire EA.

 Le substrat B s’approche et sans même se fixer sur l’enzyme, la réaction se produit avec
libération des deux produits P et Q.
 Le mécanisme Théorell Chance  un cas limite du mécanisme ordonné dans lequel la
seconde réaction est tellement rapide que l’on ne peut jamais observer de complexe entre
l’enzyme et le second substrat (mécanisme ordonné sans complexe central).
 Représentation graphique selon le diagramme de Cleland:

Exemple: Alcool déshydrogénase (ADH)

L’ADH catalyse l’oxydation d’un alcool en aldéhyde
en transportant les hydrogènes sur le coenzyme
NAD+
 3. La démarche expérimentale pour déterminer les vitesses initiales
3.1. Variation de la concentration du substrat A
 On réalise des cinétiques pour lesquelles [B] est toujours à une même valeur [B]i dans le
milieu réactionnel alors qu'on se permet de varier les concentrations en A et on observe un
produit P.
 On dit alors qu'on travaille à A variable et B paramétrique.
 On test différentes valeurs pour [B]i.
3.2. Variation de la concentration du substrat B
 Il n'est pas nécessaire d'effectuer une seconde série de mesures de vitesse initiale pour
différentes concentrations de B à [A] fixe  les mesures sont déjà obtenues.
4. Equations de vitesse des cinétiques à deux substrats
4.1. Bi Bi ordonné
 Application de la théorie de l’état stationnaire aux systèmes ordonnées conduit à
l’équation suivante: v  Vmax
0
K mA K mB K SA K mB
1  
A B AB

1 1 K mA K mB K sA K mB
   
v0 Vmax Vmax A Vmax B Vmax AB
Equation en doubles inverses = droite

a) Graphes primaires
Cette équation permet de tracer deux graphes dits « Graphes Primaires »:
 Graphe primaire pour le substrat « A »  [A] variables et [B] constantes ( 1/v = f(1/[A])
 Graphe primaire pour le substrat « B »  [B] variables et [A] constantes ( 1/v = f(1/[B])
 Aspect des graphes primaires permet de déterminer le type de mécanisme réactionnel.
 Détermination de vitesse maximale apparente ou « Vmax app »
 Représentation graphique primaire des mécanismes Bi Bi ordonnés: 2 aspects

Aspect 1 (Mécanisme ordonnée): les deux graphes primaires  A se fixe avant B ou B se fixe avant A???

 Pour [A] variables et [B] constantes (paramétrique)

1  A K sA K mB  1 1  K mB 
Pente   K m   Intercepté   1
Vmax  B  Vmax app Vmax  B 
 Pour [B] variables et [A] constantes (paramétrique)
1  B K sA K mB  1 1  K mA 
Pente   K m   Intercepté   1
Vmax  A  Vmax app 
Vmax  A 
Indépendance de Vmax à la
concentration de substrat A
 A se fixe le premier à
l’enzyme.

Aspect 2 (Mécanisme ordonnée): les deux graphes primaires A se fixe avant B

 Pour [A] variables et [B] constantes (paramétrique)

1  A K K A B
 1 1  K mB 
Intercepté   1
Pente   K m    B 
s m
Vmax  B 
Vmax app Vmax 

 Pour [B] variables et [A] constantes (paramétrique)

1 1
Pente 
1  B K sA K mB 
 K m   Intercepté  
Vmax  A  Vmax app Vmax
b) Graphes secondaires

 A partir des deux graphes primaires, on peut tracer deux graphes dits secondaires
A B
 Ils permettent de déterminer les constantes cinétiques  Vmax , K , K
m m

 Graphe secondaire pour le substrat A:

1/ Vmax app= f(1/[A])

1 1 K mA 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ A]

 Graphe secondaire pour le substrat B:

1/Vmax app= f(1/[B])

1 1 K mB 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ B]
4.2. Bi Bi aléatoire
 Application de la théorie de l’état quasi-équilibre aux systèmes non ordonnées conduit à
l’équation suivante:
Vmax
v0 
K mA K mB K K  K sA xK mB  K sB xK mA
1  
A B AB

1 1 K mA K mB K
Equation en doubles inverses = droite    
v0 Vmax Vmax A Vmax B Vmax AB

 2 cas peuvent être observés:

4.2.1. Mécanisme aléatoire avec interaction entre les sites (sites dépendants)
 La fixation d'un substrat sur son site enzymatique modifie la fixation ultérieure de l'autre
substrat sur son site.
 Graphe primaire se représente sous forme d’un faisceau de droites concourantes en un
point:
 Point d’intersection est sise au-dessus de l’axe des abscisses  fixation du second
substrat est facilitée.
 Point d’intersection est situé au-dessous de l’axe des abscisses  fixation du second
substrat est gênée.
a) Graphes primaires

Mécanisme Bi Bi Aléatoire avec interactions entre les sites : graphes primaires (fixation du second
substrat est facilitée)
 Pour [A] variables et [B] constantes (paramétrique)

1  A K  1 1  K mB 
Pente   Km   Intercepté   1
Vmax  B  Vmax app Vmax  B 
 Pour [B] variables et [A] constantes (paramétrique)
1  B K  1 1  K mA 
Pente   K m   Intercepté   1
Vmax  A  Vmax app Vmax  A 
 Mécanisme Bi Bi Aléatoire avec interactions entre les sites : graphes primaires (fixation du
second substrat est gênée)

 Pour [A] variables et [B] constantes (paramétrique)

1  A K  1 1  K mB 
Pente   Km   Intercepté   1
Vmax  B  Vmax app Vmax  B 
 Pour [B] variables et [A] constantes (paramétrique)
1  B K  1 1  K mA 
Pente   K m   Intercepté   1
Vmax  A  Vmax app Vmax  A 
b) Graphes secondaires

 A partir des deux graphes primaires, on peut tracer deux graphes dits secondaires

 Ils permettent de déterminer les constantes cinétiques  A B

Vmax , K , K
m m

 Graphe secondaire pour le substrat A:

1/Vmax app= f(1/[A])

1 1 K mA 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ A]

 Graphe secondaire pour le substrat B:

1/Vmax app= f(1/[B])

1 1 K mB 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ B]
4.2.1. Mécanisme aléatoire sans interaction entre les sites (sites indépendants)

 La fixation d'un substrat sur son site enzymatique ne modifie pas la fixation ultérieure de

l'autre substrat sur son site. Les sites sont indépendants.

 Le point d’intersection des droites se situe sur l’axe des abscisses

a) Graphes primaires:

Mécanisme Bi Bi Aléatoire sans interactions entre les sites: graphes primaires

 Pour [A] variables et [B] constantes (paramétrique)

1  A K  1 1  K mB 
Pente   K m   Intercepté   1
Vmax  B  Vmax app Vmax  B 

 Pour [B] variables et [A] constantes (paramétrique)

1  B K  1 1  K mA 
Pente   Km   Intercepté   1
Vmax  A  Vmax app Vmax  A 

NB:
 Sites dépendants  K  K sA xK mB  K sB xK mA K sA  K mA ; K sB  K mB

 Sites indépendants  K  K sA xK mB  K sB xK mA K sA  K mA ; K sB  K mB
b) Graphes secondaires

 A partir des deux graphes primaires, on peut tracer deux graphes dits secondaires

Ils permettent de déterminer les constantes cinétiques 

A B
 Vmax , K , K
m m

 Graphe secondaire pour le substrat A:

1/Vmax app= f(1/[A])

1 1 K mA 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ A]

 Graphe secondaire pour le substrat B:

1/Vmax app= f(1/[B])

1 1 K mB 1
  *
Vmax app Vmax Vmax [ B]
4.3. Bi Bi Ping-Pong

Vmax
v0 
K mA K mB
1 
A B

1 1 K mA K mB
  
v0 Vmax Vmax A Vmax B
Equation en doubles inverses = droite

 Pour [A] variables et [B] constantes

K mA 1 1 K mB
Pente  Intercepté   
Vmax Vmax app Vmax Vmax B
 Pour [B] variables et [A] constantes

K mB 1 1 K mA
Pente  Intercepté   
Vmax Vmax app Vmax Vmax A
a) Graphes primaires

Mécanisme Bi Bi Ping-Pong: graphes primaires

 Les représentations linéarisées en double inverse du mécanisme Bi Bi Ping-pong  sont

remarquables par l'effet de parallélisme obtenu.
 Les pentes des droites sont indépendantes des concentrations du substrat B et du
substrat A  obtention d’une famille de droite parallèles.
Ces droites parallèles caractérisent un mécanisme Ping-pong de façon discriminante..
b) Graphes secondaires

 A partir des deux graphes primaires, on peut tracer deux graphes dits secondaires

 Ils permettent de déterminer les constantes cinétiques  Vmax , K mA , K mB

 Graphe secondaire pour le substrat A:

1/Vmax app= f(1/[A])

1 1 K mA 1
'
  *
Vmax Vmax Vmax [ A]

 Graphe secondaire pour le substrat B:

1/Vmax app= f(1/[B])

1 1 K mB 1
'
  *
V max Vmax Vmax [ B]
 5. Signification des paramètres cinétiques des réactions à deux substrats

 Les paramètres cinétiques des équations qui décrivent les réactions à deux substrats 

ont les mêmes significations que ceux des réactions à un substrat.

 Vmax  Vitesse maximale de la réaction enzymatique lorsque les deux substrats sont en

concentrations saturantes.

 K mA et K mB  Les constantes de Michaelis des substrats A et B  concentrations

nécessaires pour obtenir « Vmax/2 » en présence de concentration saturante de l’autre substrat.

 K sA et K sB  Les constantes de dissociations respectives de A et B des complexes EA et

EB.
 6. Distinction entre mécanismes séquentiels aléatoire et ordonné
 Pour savoir si un mécanisme est Bi Bi ordonné  faire des études d'inhibition par le
produit.
 Addition d’un seul produit, P ou Q, au mélange réactionnel  le produit en se liera à
l’enzyme  inhibera la réaction dans le sens de la formation des produits.

6.1. BiBi Ordonné

 Un inhibiteur compétitif est un inhibiteur enzymatique qui agit en se liant à un
site actif libre d'une enzyme à la place d'un substrat, ce qui bloque la réaction
normalement catalysée par l'enzyme.

Un inhibiteur non compétitif est un inhibiteur enzymatique qui agit en se liant,

avec une affinité égale, aussi bien à l'enzyme dont le site actif est libre qu'au
complexe formé par l'enzyme et son substrat contrairement à un inhibiteur
compétitif qui ne se lie qu'à une enzyme dont le site actif est libre).
6.2. Bi Bi aléatoire  Les deux produits et les deux substrats peuvent se combiner
directement avec E  P et Q sont tous les deux des inhibiteurs compétitifs de A quand [B] est
constante, et de B quand [A] est constante.

6.3. Bi Bi Ping-Pong
 Cas d’étude
Fabrication du Camembert
Fromage à pâte molle

Penicillium camemberti est une espèce de champignons

ascomycètes. Utilisé pour la fabrication du camembert.
Produit la croûte du fromage faite de filaments blancs.
Les étapes de fabrication du Camembert
LAIT

Préparation du lait

Maturation
Coagulation
Emprésurage

Tranchage

Brassage

Moulage

Pressage

Retournement
Egouttage
Démoulage

Séchage

Salage

Affinage
Affinage

FROMAGE
Préparation du lait
• Donner au lait des caractéristiques microbiologiques et
chimiques pour le préparer à la transformation.

Maturation • Développement la flore lactique : acidifie le milieu par

fermentation lactique et jouera un rôle dans le processus
Emprésurage
d ’affinage;
• Acidification du lait : initie la coagulation.
Tranchage • Amélioration de l’égouttage du caillé.
• Donner forme au caillé
Brassage
• Permettre la poursuite de l’égouttage
Moulage
• Améliorer l’égouttage du caillé
Pressage
• Homogénéité du caillé
Retournement

• Poursuite de l’égouttage par évaporation

Séchage
• Développement de la flore de surface

• Goût
Salage
• Amélioration de l’égouttage par effet osmotique

• Maîtriser les activités microbiennes qui vont permettre l’obtention des

Affinage caractéristiques organoleptiques particulières du fromage (flore de
surface et modifications de la pâte)
 Le processus de coagulation est provoqué par l’action d’un coagulant, le
coagulant traditionnel, la présure qui est extraite de l’estomac du jeune veau
nourri au lait.

Du fait de l’augmentation de la production mondiale de fromage et la

réduction de l’abattage de veaux non sevrés, la quantité de présure de veau
disponible est devenue insuffisante.

Cette situation a poussé de nombreux chercheurs à s’intéresser aux

nouvelles sources potentielles d’enzymes de remplacement notamment les
enzymes d’origine animale, végétale ou microbienne.
 Le problème avec les enzymes d’origine végétale réside dans leur activité
protéolytique élevée et non spécifique. En revanche les enzymes d’origine
bactérienne présentent une certaine toxicité ce qui exige une purification et
par conséquent leur prix de revient reste élevé.

Cependant les enzymes d’origine animale se révèlent les plus intéressantes et

sont pour la plupart des cas des sous produits de l’abattage : tyrosine,
chymotrypsine, pepsine avicole ou porcine.

Cette étude consiste à montrer la possibilité d’utiliser le pro-ventricule de la

dinde comme source de coagulase de substitution à la présure en technologie
fromagère.
L’étude porte sur le pro-ventricule ou ventricule succenturié de la dinde, c’est
l’estomac sécrétoire.

Pro-ventricule de la dinde
Obtention de l’extrait enzymatique brut

Obtention de
l’extrait
enzymatique brut Morsli (1997)
 Détermination de l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut

Selon la méthode SOXHLET.

Dosage des protéines de l’extrait enzymatique brut

La méthode adoptée pour le dosage des protéines est celle de Lowry (1951).

Purification de l’enzyme

La purification d’une enzyme à partir d’un extrait enzymatique brut consiste à

éliminer toutes les protéines étrangères, tout en perdant le moins d’enzymes
possible en cours de route.

Mesure de l’activité protéolytique

La mesure de l’activité protéolytique est déterminée selon la méthode de
Green et Stackpool (1975).
 Caractérisation de l’extrait enzymatique brut
Les conditions optimales d’activité de l’extrait enzymatique ont été déterminées en
faisant varier les valeurs des paramètres étudiés à savoir : la température, pH,
concentration en CaCl2, concentration en enzyme.

Influence de la température
Déterminée en faisant varier la température du lait de 30°C à 80°C avec un intervalle de 5°C.

Influence du pH
Le pH optimum de coagulation a été déterminé en variant le pH du lait de 5,2 à 7,2 avec
un intervalle de 0,2.

Influence de la concentration en CaCl2

Afin de déterminer la concentration optimale de CaCl2 on la fait varier de 0,01M à 0,1M
avec un intervalle de 0,01M.

Influence de la concentration en enzyme

Évaluée en mesurant l’activité coagulante à chaque variation de la concentration en
enzyme allant de 0,069 à 6,9mg/ml.
 CONTENTS

01 Partie introductive

02 Cinétique michaelienne à un substrat et à un produit

03 Cinétique michaelienne à deux substrats

04 Mécanismes de régulation de l’activité enzymatique

05 Facteurs physicochimiques influençant la réaction

enzymatique
 THANK
YOU
Avez –vous des questions ou des doutes ?