Adressage des protéines au

peroxysome et à la mitochondrie
Par Alexandre Ottaviani, MCU UCA, IRCAN

Sujet préparé à l’aide de l’ouvrage Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

TD L1SV OMM Ecue1 2021-2022

 Adressage des protéines cellulaires
Protéines sécrétées
et de la membrane

Lysosomes
Adressage
Rétention Importation des protéines
lysosomial
golgienne du nucléoplasme par les
Mitochondries (Mannose6P)
pores (NLS)
(préséquences)
Péroxysomes
(PTS1 et PTS2)

Biogénèse
Rétention dans Protéines de
le RE (KDEL,…) l’enveloppe
Autres nucléaire Transcription
séquences
d’adressage

Insertion post-
traductionnelle rare Si séquence signal
avec chaperonnes

Traduction

Protéines Polysomes 2
cytosoliques
Figure 1 : Annexe

Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 1 : Quelle séquence semble nécessaire et suffisante pour localiser la protéine

dans le peroxysome ? Dans quel contexte particulier ?
La séquence de 3 aa S-K-L est nécessaire à l’adressage car si 1 seul manque la protéine n’est plus
adressée au péroxysome (même si on ne peut vraiment conclure pour le K qui n’a jamais été testé seul).
Il est aussi nécessaire que S-K-L soient bien les derniers acides aminés de la chaîne polypeptidique
considérée et dans cet ordre, car si on ajoute d’autres aa C-terminaux ou que l’ordre est altéré
l’adressage est compromis.
Tout ceci semble aussi suffisant dans le contexte puisqu’on peut enlever tous les autres aa en C-terminal
et on conserve l’adressage spécifique mais on ne peut en être sûr puisque les résidus R-E-I (et tous ceux
qui précèdent) n’ont pas été modifiés/remplacés au cours de cette expérience. On pourrait le démontrer
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si SKL à la fin d’une autre protéine (cytosolique) l’adresse au peroxysome.
Figure 2 :

D’après Hwang,S.T. et Schatz,G. (1989) PNAS dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

*
ATP externe
*
Préséquence-DHFR
P P P
marquée
+ ou - : Paramètres
+ + + ΔΨ manipulés
- - - expérimentalement

ATP matriciel
P P P

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 SDS-PAGE + autoradiographie
Extraits protéiques
+SDS+chaleur+βMe

SDS = Sodium Dodécyl Sulphate

PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
 SDS-PAGE + autoradiographie
- -
Extraits protéiques -
+SDS+chaleur+βMe
- -

chaleur

Migration sur gel

selon le poids
moléculaire
βMe

SDS = Sodium Dodécyl Sulphate

PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
 SDS-PAGE + autoradiographie

Révélation par
autoradiographie = Détection
sur film photosensible

SDS = Sodium Dodécyl Sulphate

PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Figure 2 :

D’après Hwang,S.T. et Schatz,G. (1989) PNAS dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 2 : A quoi correspondent les bandes du haut et du bas sur la figure 2 ? Quels
conditions sont nécessaires à l’importation dans les mitochondries de la protéine chimère ?

Rq : on abréviera « sous-unité IV de la cytochrome oxydase » en COX4

La bande du haut est présente dans les puits 2, 3, 5 et en très faible quantité dans le 4. Elle correspond à la
protéine marquée de plus grande taille, donc à la protéine de fusion (préséquence COX4-DHFR) entière.
La bande du bas est présente dans les puits 1, 4 et 5. Elle est de plus petite taille mais elle aussi marquée
donc c’est une version plus courte de la protéine de fusion, à priori suite à la protéolyse de la préséquence
d’après les informations dont on dispose.
Ici cette protéolyse est donc le résultat de l’importation de la protéine de fusion dans les mitochondries et
c’est bien l’information que veulent obtenir les chercheurs : si la protéine est plus courte c’est donc qu’elle
a été importée dans la mitochondrie, et si elle a toujours la forme plus longue c’est donc qu’elle n’a pas été
importée.
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Figure 2 :

D’après Hwang,S.T. et Schatz,G. (1989) PNAS dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 2 : A quoi correspondent les bandes du haut et du bas sur la figure 2 ? Quels
conditions sont nécessaires à l’importation dans les mitochondries de la protéine chimère ?

Lorsque ΔΨ, ATP externe et ATP interne sont tous les 3 présents (puits 1), on voit que la taille est réduite
donc que la protéine a été importée.
Si on enlève que le ΔΨ (puits 2), la petite forme disparait donc la protéine n’a pas été importée et ΔΨ est
nécessaire à l’importation.
Mais il n’est pas suffisant puisque lorsqu’il est seul la protéine n’est pas protéolysée/importée (puits 3).
Si on enlève que l’ATP externe, la petite forme est toujours présente en très grande quantité, donc l’ATP
externe n’est que peu nécessaire à l’importation (puits 4).
Si on enlève que l’ATP matriciel, la petite forme n’est présente qu’en faible quantité par rapport à la
grande, donc l’ATP matriciel est nécessaire à une importation efficace (puits 5).
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 Annexe
Figure 3 :

Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Hélices alpha

Résidus vers l’extérieur

Vue dans ce sens 10

 hydrophobe Annexe
Figure 3 : +
hydrophobe

hydrophobe
+ +
Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 3 : Comment se répartissent les propriétés des acides aminés autour des
hélices ? Sachant que le ΔΨ donne une charge relative négative à la matrice
mitochondriale, quelle(s) hypothèse(s) sur le mécanisme pouvez vous formulez
On observe que les hélices alpha formées par ces séquences présentes toutes un côté composé de
nombreux résidus chargés positivement et un côté composé de nombreux résidus apolaires. Ces hélices
alpha sont donc polarisées et amphiphiles.
On peut supposer que les charges positives des hélices vont être attirées par la charge négative de la
matrice mitochondrial et que la partie apolaire de l’hélice peut favoriser sa pénétration dans les
membranes.

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Figure 4 :

D’après Maduke, M. et Roise, D. (1993) Science dans

Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 4 : Quelle propriété des préséquences met-on en évidence ? De quoi est-elle

dépendante ?
Les préséquences ne peuvent être protéolysées que si elles pénètrent dans les liposomes. La protéolyse
met donc en évidence ici la capacité des préséquences à traverser la bicouche lipidique des liposomes.
On voit en figure 4B que la protéolyse n’est réellement efficace que lorsqu’il existe un ΔΨ (négatif à
l’intérieur du liposome) et donc que cette capacité de pénétration des membranes des préséquences est
dépendante de ce ΔΨ.

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Figure 5 :

D’après Eilers, M., Hwang, S. et

D’après Murakami, H., Pain, D. et Blobel, G. (1988) J.Cell Biol.
Schatz, G. (1988) EMBO J.
Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 5 : Que peut-on dire des effets de la dénaturation ou du SPR sur l’importation
mitochondriale ? Qu’indique le résultat du traitement à la trypsine réalisé en figure 5B ?
Que peut-on conclure sur les rôles de la chaperonne hsp70 et du SPR d’après la figure 5C ?

A:
* *
Préséquence-DHFR * Native *
marquée + mitochondries Mesure de
Δt
purifiées l’importation

*
* Dénaturée 13
Figure 5 :

D’après Eilers, M., Hwang, S. et

D’après Murakami, H., Pain, D. et Blobel, G. (1988) J.Cell Biol.
Schatz, G. (1988) EMBO J.
Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 5 : Que peut-on dire des effets de la dénaturation ou du SPR sur l’importation
mitochondriale ? Qu’indique le résultat du traitement à la trypsine réalisé en figure 5B ?
Que peut-on conclure sur les rôles de la chaperonne hsp70 et du SPR d’après la figure 5C ?

B: + SPR +/- prétraité Mesure de

à la trypsine l’importation

*
marquée
*
Protéine matricielle C:
+ hsp70 Mesure de
+/- SPR l’importation
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Figure 5 :

D’après Eilers, M., Hwang, S. et

D’après Murakami, H., Pain, D. et Blobel, G. (1988) J.Cell Biol.
Schatz, G. (1988) EMBO J.
Dans Biochimie et biophysique des membranes de E. Shechter

Question 5 : Que peut-on dire des effets de la dénaturation ou du SPR sur l’importation
mitochondriale ? Qu’indique le résultat du traitement à la trypsine réalisé en figure 5B ?
Que peut-on conclure sur les rôles de la chaperonne hsp70 et du SPR d’après la figure 5C ?
La figure 5A montre que la dénaturation améliore l’importation et que cet effet s’atténue rapidement
avec le temps, certainement car la protéine reprend une forme repliée.
La figure 5B montre que le SPR accroît fortement l’importation.
Le traitement à la trypsine en 5B montre que c’est une protéine qui est à l’origine de l’effet du SPR
puisqu’il disparait sous l’action d’une protéase.
La figure 5C montre que hsp70 a peu d’effet en absence de SPR et qu’il accélère de façon importante
l’importation en présence du SPR. Hsp70 n’est donc pas le facteur protéique responsable de l’effet du SPR
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mais il potentialise son effet.
 Préséquence
+ + +
+
+ - - - - + + - - - ++- - +
+ - - - + ΔΨ + - - + ΔΨ
+ - - + - -
- -

+SPF et
chaperonnes

Préséquence
+ + + Importation et
protéolyse
+ - - - - - + + - - - - +
+ - - + ΔΨ + - - - + ΔΨ
+ - - + - + + + -
- -

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Mossmann et al., (2012)

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