République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université des Sciences et de la Technologie Saad Dahleb Blida

Faculte de science tecnologie

Département Génie des procédés
Filière Génie d’environnement

Tp microbiologie
environnementale .

Realise par :
 Chettouhi mehamed-amine
 Arib ghania
 Mezaine abdenacer
 Boudache islem

2021/2022
 SOMMAIRE

Tp n01 : materiel de microbiologie :

1) LA STÉRILISATION

Tp n02 : manipulations microbiologique :

RÈGLES À SUIVRE DURANT LES TRAVAUX

PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE
1) Milieu de cultur

Defiinition
Classification
Techniques de préparation des milieux de culture

2) Tecnique d’Ensemencements

Ensemencement sur un milieu solide

Ensemencement sur milieu liquide

TPN°3 :
Examens macroscopique et microscopique des
micro-organismes
 Tp n01 :
materiel de microbiologie :

LA STÉRILISATION :
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-
organismes d'un objet, et ce de manière durable. En microbiologie, le
but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-organismes
introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la
contamination du milieu extérieur et des personnes. Il existe deux
grands moyens de Stérilisation :
1. La chaleur
2. La filtration
I. La stérilisation par la chaleur :
La chaleur détruit les bactéries et les spores. On distingue les
procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
1. Chaleur sèche :
a. Flambage : Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la
surface de matériel non inflammable assure une parfaite stérilisation.
On stérilise de cette façon les fils de platine et les pipettes Pasteur .
 B. Four pasteur :
C'est un four-étuve à air chaud et sec. Il est utilisé à 180°C pendant 90
minutes. Cet appareil n'est utilisé que pour la stérilisation de la verrerie
préalablement nettoyée et séchée ou de matériels métalliques
(instruments de dissection) pouvant tolérer de très hautes
températures.
Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l’étuve jusqu’à son
refroidissement complet, puis stocké à l’abri des poussières.

2. Chaleur humide :
La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités
 la stérilisation à l’autoclave
 La Pasteurisation,
 La Tyndallisation
a. Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de
microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une
température de 120°C pendant une durée qui varie en fonction du
milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. Ce
procédé tue toutes les cellules végétatives et les endospores.
b. Pasteurisation :
la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des
pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures
de la pasteurisation se situent entre 75 à 80°C.

c. Tyndallisation :
La tyndallisation est une série de 3 chauffages bref à des températures
de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes
résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage
suivant.Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par
un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15
minutes

II. La filtration :
 La filtration est une technique qui consiste à faire passer un
liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 μm. Les
micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits
thermolabiles comme certains acides aminés aromatiques, vitamines,
hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des
antibiotiques.

III. Autres procédés de stérilisation:

Certaines matières (Plastiques, Caoutchous ...) ne tolèrent pas
l’autoclave ou se détériorent rapidement après des expositions
répétées à la chaleur.
1. Radiations :
La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la
décontamination de l’air et des paillasses situées sous la hotte de
protection. Le rayonnement n’agit que de façon directe et sa
pénétration est faible. D’autres radiations (rayons X), peuvent servir
pour la stérilisation industrielle des boites de Pétri en matière plastique
et de produit pharmaceutiques.

2. Agents chimiques :
Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles de travail
et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés.
Ce mode de stérilisation doit être systématiquement pratiqué dans le
laboratoire pour les lames et pour la verrerie qui ne passe pas en
autoclave.
 Tp n02 :
manipulations microbiologique :

RÈGLES À SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUE de

MICROBIOLOGIE :

1 .Présentation d'un poste de travail :

 Matériels (bec bunsen, pipettes, verres, béchers anse, pinces
lame,...),
 Produits (eau, alcool, colorants divers,....)

2. Les consignes de sécurité :

Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des
ongles avant et après les manipulations, et avant toute sortie
même momentanée de la salle de TP.
  Éviter les ouvertures des fenêtres pendant les manipulations
 Ouvrir avec précaution les récipients contenant des cultures
microbiennes, afin d'éviter toute projection.
 Flamber, avant et après manipulations, les anses métalliques
utilisées pour les prélèvements, en commençant par chauffer la
partie moyenne de l'instrument afin de dessécher les restes de
culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour
éviter toute projection.
 Interdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les TP
 Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation
 Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri
des souches microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter
toute contamination.

Remrque :
une série de 5 boites de Pétri de 8cm de diamètre est laissée ouverte
sur une paillasse près d’un bec Bunsen allumé.
A la fin de la manipulation, regrouper les différentes boites de Pétri et
les placer à l’étuve à 37°C / 24 heures.
Remarque :
pour éviter que l’eau de condensation dans les boîtes de Pétri perturbe
la surface du milieu gélosé, on place les boîtes en position retournée
dans l’étuve.

Définition d’un milieu de culture :

Les milieux de culture utilisés en bactériologie sont des milieux

contenant les éléments nécessaires et en quantité suffisante à la
survie et à la multiplication des bactéries, ils doivent par ailleurs
posséder les propriétés physico-chimiques convenant à une
culture optimale (pH, Isotonie, Potentiel d’oxydoréduction)

Classification des milieux de culture :

Il existe différentes classifications des milieux de culture :
Classification selon la composition :

a- Milieu complexe empirique (naturel) :

La composition de ce milieu n’est pas bien définie, c’est le milieu naturel
de la bactérie.
On retrouve des extraits de viande, des extraits de levure, les peptones.
Exemple : Milieu cœur cervelle BHIB (Brain Heart Infusion Broth) .

b- Milieu semi-synthétique :
Au milieu complexe sont rajoutées des substances chimiques bien définit,
ceci concerne les produits ayant un intérêt pour la bactérie, comme les
facteurs de croissance, Exemple : Gélose enrichie au sang de mouton.

c- Milieu synthétique :
La composition est parfaitement définie tant en quantité qu’en qualité,
Ce sont des milieux utilisés dans la mise en évidence d’une réaction
enzymatique précise, Exemple : Milieu de Ferguson.

Classification selon la consistance :

a- Milieu liquide :
Exemple : Milieu de Clark et Lubs, Bouillon d’enrichissement.

b- Milieu solide ou gélosé :

C’est un milieu liquide solidifié par addition d’Agar à une concentration de
1 à 1.7%
Agar : Substance extraite d’algues marines et qui possède la propriété de
fixer une grande quantité d’eau d’où la gélification.
Exemple : Milieu de Chapman, TSI.

c- Milieu semi-liquide, semi-solide, ou faiblement gélosé :

La concentration en Agar est plus faible que celle du milieu gélosé, elle est
comprise entre 0,05- 0,075%
Exemple : Milieu Mannitol mobilité, MEVAG.
Classification selon le mode de stérilisation
Il existe 02 types de milieux :
-Milieux autoclavables : milieu de culture dont les composants ne
sont pas détruits par la chaleur,
Exemple : milieu gélose nutritive, Mueller Hinton en flacons.
-Milieux non autoclavables : Milieux de culture qui contiennent
des produits labiles pouvant être détruit par la chaleur,
Exemple : Loweinstein-Jensen (cultiver les mycobactéries ->
Tuberculose).

II ) Présentation des milieux de culture :

1)-Les milieux déshydratés :

 C’est une poudre conditionnée en boites de 250 ou 500g.

2)-Les milieux solides :

 Gélose en flacons
 Gélose en boites de pétri
 Gélose en tube incliné, ex : Citrate de Simmons.
 Gélose en culot et pente inclinée, ex : TSI
  Gélose profonde, ex : MEVAG
 Gélose profonde en capillaire, ex : VF (viande foie) ou
milieu de conservation.
3)-Les milieux liquides :
 Milieux liquides en flacons, ex : Bouillon d’hémoculture.
 Milieux liquides en tubes, ex : BGT.
 Milieux liquides en ampoules, ex : AA (acides aminés)

III ) Techniques de préparation des milieux de culture :

La préparation d’un milieu de culture peut se faire soit à partir
d’une poudre lyophilisée, soit directement à partir d’une gélose de
base en flacons que l’on peut couler telle quelle, ou l’enrichir en
facteurs de croissance avant de la conditionner en boites de pétri
Milieu déshydraté
Peser la quantité adéquate de poudre du milieu à préparer, et la
diluer dans de l’eau distillée stérile dans une fiole jaugée.
Conditionner le mélange liquide en flacons en verre stérile
ensuite les fermer afin de les autoclaver. Après le cycle de
stérilisation, le milieu liquide est coulé en boites de pétri sur une
hauteur de 4mm et laisser solidifier sur paillasse, l’ajout de
facteurs de croissance (sang et complexe multivitaminé) au
milieu de base doit se faire après le cycle de stérilisation dans
des conditions d’asepsie rigoureuses
Milieu gélosé en flacons
Mettre le flacon de gélose, ex : gélose nutritive ou Columbia, dans
un bain-marie bouillant (100°C) jusqu’à fusion complète.
Laisser refroidir le flacon à l’air libre ou sous un robinet d’eau
froide,
Couler dans des boites de pétri de 90mm de diamètre, sur une
hauteur (épaisseur) toujours de 4mm.
Laisser solidifier la gélose
Conserver les boites à 4°C en les mettant en réfrigérateur
– Si le milieu préparé doit être enrichi en sang, on peut utiliser du
sang (de mouton ou de cheval) selon les étapes suivantes :
Faire fondre la gélose au bain-marie bouillante ex : Gélose
nutritive ou Columbia ou Muller Hinton (antibiogramme)
Laisser refroidir à 45°C à l’air libre dans un bain-marie réglable.
Additionner 12,5 ml de sang dans le flacon de 250 ml de gélos e.
Homogénéiser délicatement jusqu’à obtention d’une couleur
rouge sang pour une GSF.
Sinon il faut remettre le flacon dans le bain-marie en surveillant le
virage de la couleur rouge vers le marron chocolat (GSC) ensuite
Couler en boite de pétri comme précédemment
Laisser solidifier la gélose
Conserver à +4°C

Ensemencement et techniques d’ensemencement :

L’ensemencement doit être effectué dans des conditions

d’asepsie rigoureuses à partir d’un prélèvement d’une colonie ou
d’un bouillon bactérien avec une anse de platine ou une pipette
de pasteur, peut être réalisé sur un milieu liquide ou solide

Ensemencement sur un milieu solide

a)-Milieu en boite de pétri :

Il existe plusieurs techniques d’ensemencement sur boites :
1er Isolement ou épuisement :
-C’est la technique des 4 quadrants qui consiste à disperser le
microorganisme à la surface d’un milieu solide afin d’obtenir des
colonies séparées, ainsi permet de retrouver tous les
microorganismes d’un mélange, mais aussi de vérifier la pureté
d’une souche bactérienne.
Technique :
Sur boite de pétri préalablement séchée sur laquelle on a dessiné
des quadrants, déposer le produit à analyser sur le 1 er quadrant,
réaliser des stries très serrées ensuite passer au 2 e sans toucher
le 1er, ou stériliser la pipette ou l’anse et reprendre du 1 er quadrant,
les stries doivent être toujours serrées ensuite passer au 3 e et au
4e quadrant en desserrant légèrement les stries, la culture se
traduit par des colonies sur les stries.
-Sur ce milieu, on pourra définir l’aspect des colonies, mais aussi
la présence ou non de l’hémolyse complète ou incomplète
lorsqu’il s’agit d’une GSF.

2ème-Beurrage :
-Technique d’écouvillonnage qui consiste à réaliser un
ensemencement très riche (pour les bactéries exigeantes et
fragiles).
3ème-Antibiogramme :
-à partir d’une suspension bactérienne d’une opacité ou densité
optique bien définie, on réalise des stries serrées à l’aide d’un
écouvillon.
4ème-Dénombrement :
-Ensemencement par étalement au râteau d’un volume connu
d’une suspension bactérienne.
b)-Milieu incliné en pente :
Ensemencer toujours du bas en haut par des stries serrées,
Résultat : la culture se traduit par apparition de colonies ou virage
de la couleur de l’indicateur pH.
c)-Milieu en culot :
Ensemencement par piqure centrale, même résultat
d)-Milieu en culot + pente :
Commencer par ensemencer la pente par des stries serrées
ensuite culot par piqûre centrale, même résultat.
e)-Milieu d’ensemencement en masse :
Se réalise en tube ou en boite, consiste à déposer le produit à
analyser (eau ou nutriments) et rajouter la gélose dessus
refroidie à 45°C, laisser se solidifier et incuber.
Technique surtout utilisée en bactériologie alimentaire et
contrôle des eaux, le lendemain il y aura apparition des colonies
lenticulaires à l’intérieure de la gélo

Ensemencement sur milieu liquide

On peut ensemencer un milieu liquide :

-soit à partir d’un produit liquide, on met quelques gouttes dans le
milieu à ensemencer avec pipette de pasteur,
-soit à partir d’un produit solide, écraser la colonie prélevée à
l’aide d’une anse de platine ou pipette de pasteur sur la paroi du
tube, pour obtenir une suspension homogène
Les resultats
On place les boites et les tubes dans une étuve qui va régulier et
maintenir la temperature a la valeur favorable a leur croissance
durrant toute la période néccessaire . la témpérature optimale
pour :
les moisissures et levures et de 30 C
pour escherichia coli et plusieurs autres bqcteries est de 37 C
le temps d' incubation est variable d'un germe a ll' autre
variant de 24 h a 72h pour la majourite des bacteries et levures
une semaine pour les moisissures
et de 10 a 15 jours pour les actinomycetes
Les résultats obtenus après 24 h de l’ incubation
 TPN°3 :
Examens macroscopique et
microscopique des micro-organismes
Introduction
L’étude morphologique d’une bactérie inconnue est la première
étape d’identification de ce micro-organismes, suivie de plusieurs
autres (étude physiologique, chimio-taxonomique, moléculaire).
Toutes les données recueillies, mèneront le chercheur à identifier
le micro-organisme c’est-à-dire attribué à ce dernier le nom du
genre et celui de l’espèce.
I. Etude macroscopique
Il s’agit d’un examen à l’œil nu ou à faible grossissement les
boites de Pétri et de noter l’aspect des colonies bactérienne, ceci
requière certaines conditions :
La culture doit être pure
Les colonies doivent être isolées (pas collées entre elles)
La culture doit être jeune (aux environs de 24 heures)
Les caractéristiques d’une colonie bactérienne sont les suivantes
:
1 La taille
Colonie punctiforme si le diamètre est inférieur à 1mm, s’il est
supérieur à 1 mm on le mesure
2 La transparence
Appréciés en lumière naturelle ou artificielle
Colonies transparentes
Colonies translucides
Colonies opaques
3 La consistance
Grasses, sèches, visqueuses…
4.Aspect de la surface
C’est un aspect particulièrement important. Il sert à différencier
les colonies lisses « S » (Smooth), souvent formées par les
germes pathogènes, des colonies rugueuses « R » (Rough)
constituées généralement par des germes saprophytes. Il existe
donc des colonies, lisses, rugueuses, brillantes, sèches,
poudreuses, plissées, muqueuses…
5. La pigmentation
La production d’un pigment (la couleur) et la diffusion (soluble ou
non).
6. L’odeur
Certaines bactéri présentent une odeur caractéristique

7. Elévation des colonies

Plates, surélevées, bombées, colonies à centre ombiliqué…
8.Contours des colonies
Lisses ou irréguliers, colonies circulaires, ondulées, amiboïdes…

II Etude microscopique
L’étude microscopique consiste à étudier :
La forme de la cellule bactérienne : Cocci, bâtonnet, spiralée,
filamenteuse.
 L’arrangement cellulaire : isolées, en chaîne, en grappe…
La mobilité
La sporulation : présence ou absence, forme et position de la
spore
Le type de Gram : positif ou négatif.
L’examen morphologique des micro-organismes peut se faire
soit à l’état frais, soit après coloration :

colonie taille porteur Aspect de La La L’élévatio Productio

surface consistan transparen n n
ce ce
De
pigment

Colonn 0.9m filamenteu Des hyphes sèche opaque bombé noir

e1 m x

Colonn 0.5m circulaire phylamenpa grasse trolocides plate rose

e2 m ux
virgulerier

Colonn 0.4m Circulaire lise grasse trolocides plate rose

e3 m
régulier

NOS Résultats