SP2017-1218

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

FILIERE LICENCE EN SCIENCE DE LA VIE

MODULE PT

Mémoire de projet tutoré

Intitulé :

Application des techniques moléculaires à l’étude de

la biodiversité, la taxonomie et la phylogénie
microbienne : cas des rhizobiums
Présenté par
MOUHSSINE AYA
EL KHDRI SOUKAINA
Juillet 2017

Devant le jury composé de :

Mr J. AURAG, Professeur à la Faculté des Science de RABAT............................. Modérateur

Mr El. BERRAHO, Professeur à la Faculté des Science de RABAT .....................Examinateur

Mme H. ABDELMOUMEN, Professeur à la Faculté des Science de RABAT..... Examinatrice

Mme J. MAATALLAH, Professeur à la Faculté des Science de RABAT............... Encadrante

 Remerciements
Nous tenons à exprimer notre gratitude à madame MAATALLAH
jamila, Qu’elle trouve ici l’expression de notre profond respect, aussi
pour l’encadrement, sa sympathie et son encouragement.

Nous tenons également à remercier les membres du jury, qui ont

accepté d’évaluer notre travail de fin d’étude J. AURAG,
J.MAATALLAH, B.BERRAHOU, H.ABDELMOUMEN.

Nous remercions également Mr A. El Aboudi responsable du module

Projet Tutoré pour sa disponibilité.

Un gros merci à nos familles pour leurs soutiens aussi bien moral que
financier et pour leurs sacrifices

Finalement, nous remercions tous ceux qui ont contribué de près ou

de loin à la réalisation de ce travail

II
 Dédicaces
Je dédie ce modeste travail

A ceux qui ont apporté la torche du sacrifice pour

éclaircir mon chemin et auxquels je dois ce que je suis.
A mes très chers parents, que Dieu vous protège et vous
garde on bonne santé.

A mes sœurs, votre présence auprès de moi

était un énorme soutien.

A ma chère binôme et amie MOUHSSINE AYA

je te remercie pour ton aide et ta patience.

Merci également à tous ceux qui ont, un jour ou l’autre,

m’ont offert leurs amitiés et des moments
inoubliables : Khadija, Fatima, Karim, Saâd, Ayoub.

SOUKAINA

III
 Dédicaces
Je dédie ce mémoire à :

Mes chers parents, que nulle dédicace ne puisse

exprimer mes sincères sentiments, Pour
leur patience illimitée, leur encouragement continu,
leur aide, en témoignage de mon profond amour
et respect pour leurs grands sacrifices.

À mon marie je te remercie pour ton aide et ta patience.

Mes chers frères pour leur grand amour et leur soutien.

À ma chère binôme et amie je te remercie

pour ton soutien et ta patience.

Et à toute ma famille et à tous ceux que j’aime.

Aya

IV
RÉSUMÉ

Les microorganismes sont des êtres vivants nécessaires à toute fonction dans la vie, or l’étude
de la biodiversité, la taxonomie et la phylogénie microbienne s'avère indispensable.

La prise en compte de développement des techniques moléculaires a poussé l’étude des

microorganismes de l’approche phénétique à l’approche moléculaire. Ce développement a
bouleversé la classification microbienne. Ceci est valable aussi pour les rhizobiums. Ces
microorganismes, vivent en symbiose avec les plantes légumineuses capable de fixer l’azote
atmosphérique et le rend assimilable pour son hôte.

Grâce à la découverte des marqueurs moléculaires et leur développement, les

microbiologistes ont réussi de faire une classification plus avancée et plus fiable de ces
microorganismes.

Mot clés :

Microorganisme, rhizobiums, Biodiversité, Taxonomie, Phylogénie, Techniques moléculaires

V
 Sommaire
Sommaire.…………...………………..………………………………………………………..1
Introduction ................................................................................................................................ 3
Chapitre I : Aperçu générale sur les microorganismes, la biodiversité, la taxonomie et la
phylogénie microbienne ............................................................................................................. 4
A- Généralité sur les micro-organismes ................................................................................... 4
1. Définition des micro-organismes………………………………………………………4
2. À la découverte des micro-organismes………………………………………………...4
3. Classification des micro-organismes.............................................................................. 5

4. Les intérêts des microorganismes……………………………………………………...7

B- La biodiversité microbienne............................................................................................... 7
1. Définition de la biodiversité……………………………………………………………7
2. Evolution et origine de la biodiversité microbienne…………………………………...8
3.Les types de diversité des micro-organismes…….………………………….……………...8
3.1. La diversité spécifique des micro-organismes…………………………….9
3.2. La diversité infra-spécifique………………………………………………9
3.3. La diversité des habitats et environnements………………………………9
3.4. La diversité de la physiologie des micro-organismes……………………..9
4.La classification des micro-organismes……………………………………………………...9
4.1.Archéobactéries " Archaea" ou "Archaeobacteria"………………………..9
4.2.Eubactéries "Bacteria" ou "Eubacteria"………………………………….10
4.3.Les Eucarya……………………………………………………………….10
C- La taxonomie microbienne..................................................................................................11
1. Définition de la taxonomie microbienne………………………...…………………11
2. Les rangs taxonomiques ……………………...……………….…………………...12
3. Evolution de la taxonomie microbienne.………………..….………………………12
3.1. La taxonomie phénotypique ..................................................................... 12
3.2. Taxonomie numérique .............................................................................. 12
3.3. Limites de la taxonomie phénotypique et numérique ............................... 13
3.4. Taxonomie moléculaire............................................................................. 14
3.5. Taxonomie polyphasique .......................................................................... 14

1
D- La phylogénie .................................................................................................................... 14
1. Définition de la phylogénie……….……….……..………….…………………….14
2. L’arbre phylogénétique ……………………..……………….…………….………15
2.1. Arbre raciné et arbre non-raciné................................................................ 15
2.2. Les autres constituants de l’arbre phylogénétique .................................... 15
2.3. Les différents types des arbres phylogénétiques ...................................... 16
3. Méthodes de construction d'arbres phylogénétiques……………….……………....16
Chapitre II : Les techniques moléculaires utilisé aux l'étude des microorganismes……….…18
1. Généralités …………………...……………………………………….……………18
2. Notion de marqueur moléculaire……………………….…………………………..18
2.1. Définition de marqueur génétique............................................................. 18
2.2. Critères du choix d'un marqueur............................................................... 19
2.3. Type des marqueurs moléculaires ............................................................ 19
3. Principales techniques moléculaires utilisées dans l'étude des microorganismes.…19
3.1. Techniques basées sur la comparaison des protéines ............................... 19
3.2. Techniques basées sur l’analyse des acides nucléiques ........................... 20
3.3. Les approches utilisant l’amplification génique (PCR) ............................ 21
3.4. Autres approches (n’utilisant pas l’amplification par PCR) ..................... 25
Chapitre III : Application des techniques moléculaires a l'étude de la biodiversité, la
taxonomie et la phylogénie des rhizobiums............................................................................. 28
1. Généralités……………….………………………….……….……………………..28
1.1. Aperçu général sur le processus de la symbiose ………….……………..28
1.2. L’intérêt da la symbiose rhizobium-légumineuse .................................... 29
1.3. Les partenaires de la symbiose ................................................................. 29
2. Etude da la biodiversité, la taxonomie et la phylogénie des rhizobiums................. 29
2.1Biodiversité des rhizobiums ...................................................................... 29
2.2La taxonomie des rhizobiums…………………………………..…………32
2.3 La Phylogénie des rhizobiums ………………………............................... 34
Conclusion............................................................................................................................... 37
Références bibliographiques ................................................................................................... 38

2
INTRODUCTION

Les micro-organismes ont été les seuls êtres vivants sur notre planète pendant près de deux
milliards d’années. Ils occupent une grande partie dans le monde vivant, dont seul les
bactéries représentent, aujourd’hui, une biomasse totale de 1030 bactéries. Ils sont présents
dans les trois "règnes" actuellement reconnus: les Archaeabactéries, les Bactéries, et les
Eucaryotes. Ils y assurent des fonctions importantes dans les cycles biogéochimiques, et lors
d’interactions avec les organismes supérieurs animaux et végétaux, ce qui les rend
indispensables à la survie des populations humaines. Les microorganismes sont aussi la clé
pour répondre à des questions aussi fondamentales que la nature et l’origine des premières
cellules, le rôle de l’ADN, support de base de l’hérédité et du transfert de l’information du
gène à la protéine (Dauga et al, 2005).

Parmi les fonctions importantes des micro-organismes ; la fixation biologique d’azote

moléculaire. En effet un groupe de bactéries appelées fixatrices d’azote, fixent l’azote
atmosphérique et le transforment en une forme assimilable par les plantes. La symbiose
fixatrice d'azote la plus répandue et la mieux étudié est celle qui associe les rhizobiums et les
plantes de la famille des légumineuses (Young et al. 1989).

Cependant, ce n’est qu’après le développement des techniques moléculaires que on a réussi à

bien estimer la biodiversité des microorganismes en général et des rhizobiums en particulier,
et avancer et améliorer leurs études taxonomiques et phylogéniques.

C'est donc l'objectif de ce travail bibliographique à travers lequel nous allons essayer
d'éclaircir le rôle du développement des techniques moléculaires dans les études de la
biodiversité, la taxonomie et la phylogénie d'un groupe important de microorganismes: les
rhizobiums.

3
CHAPITRE I : Aperçu général sur les microorganismes, la biodiversité, la
taxonomie et la phylogénie microbienne
A- Généralités sur les microorganismes

1. Définition des microorganismes

Les microorganismes aussi appelés microbes et protistes, forment un ensemble d’organismes vivants
microscopiques, invisibles à l’œil nu. Cette dernière propriété est leur seul point commun, car ils
diffèrent et varient par leur morphologie, leur physiologie, leur mode de reproduction et leur écologie.

Les protistes se composent: des bactéries, des protozoaires, des champignons (Mycètes)
microscopique et des algues. Les virus sont considérés comme des microorganismes non vivants,
acellulaires qui dépendent entièrement des cellules hôtes infectées.

2. À la découverte des microorganismes

Bien que les microorganismes soient répandus sur toute la terre où ils constituent les organismes
vivants les plus abondants en nombre, ce n’est qu’au milieu du 17 ème
siècle, grâce à l'invention du
microscope, qu'ils furent observés. Robert Hooke (1635-1703), un philosophe anglais, fut le premier à
observer à l’aide d'un microscope et à décrire, en 1655, les formes de certains « champignons
microscopiques » (moisissures) et « protozoaires ». Cependant, il n'a apparemment pas observé de
bactéries, étant donné la faible qualité des lentilles qu’il utilisait.

Peu après, un savant français, Louis Joblot (1645-1723) mit au point différents types de microscopes
avec lesquels il observa de nombreuses morphologies de micro-organismes. Il consacra la plus grande
partie de ses études à développer des microscopes avec lesquels il décrivit de nombreux
« animalcules » et autres « serpents, poissons et anguilles » microscopiques qu’il observait dans des
préparations infusées de diverses plantes ou de vinaigre, et dont la plus grande partie est invisible à la
portée ordinaire de nos yeux.

Au cours de la même période, Antoni Van Leeuwenhoek (1632-1723), un marchand drapier

et scientifique créa un type très simple de microscope doté d'un plus fort grossissement (figure
1). En observant différents échantillons (eau d’un étang, macérations de végétaux, liquides
biologiques, etc.), il fut surpris de découvrir avec son petit microscope de minuscules
organismes aux formes particulières, il observa ainsi de nombreux types unicellulaires et
même des bactéries. Dans plusieurs lettres adressées à la Royal Society à Londres, il décrivit

4
et dessina différentes formes bactérienne (coque, bâtonnets, spirilles), en précisant leur
mouvement et leur comportement quand elles étaient placées dans différentes conditions
physico-chimiques (Bertrand et al, 2011).
Au cours de la dernière partie du XIX° siècle Louis
Pasteur (1822-1895) était capable d’infirmer la théorie
de la génération spontanée. Le concept de cette
génération qui existe depuis l’époque biblique,
considère que les micro-organismes résultaient de la
putréfaction des matières organiques. Louis Pasteur
montre que les microorganismes présents dans l’air ont
de fortes ressemblances avec ceux retrouvés dans la
matière putréfiée. Il a avancé dans ces recherches et
réussit à infirmer cette théorie par la méthode de flacon
(Madigan et martinko, 2007). Louis Pasteur confirma
aussi le rôle des micro-organismes dans les
phénomènes de fermentation par la méthode de flacon à col de cygne (figure 2).

Figure 1: Microscope d’Anthony Van Leeuwenhoek

(Bertrand et al, Ecologie microbienne 2011)

Figure 2 : Expérience de Pasteur qui acheva la théorie de la génération spontanée (Brock, 2007).

3. Classification des micro-organismes

Selon Haeckel en (1866), ce chercheur divise le monde vivant en trois règnes, le règne animal, le
règne végétal et le règne des protistes qui rassemble les algues, les protozoaires, les champignons et
les bactéries.

Selon Edward Chatton en (1937) et grâce à l’invention du microscope électronique, ce chercheur mis
en opposition deux types de cellules, la cellule eucaryote (noyau est entouré d'une membrane et qui

5
renferme des organites cellulaires) et la cellule procaryote (noyau sans membrane et dont
l'organisation est très simple).

Selon Murray en (1968), dans la continuité du travail d’E. Chatton, ce chercheur divise le monde
vivant en deux règnes, celui des "Eucaryotae" et celui des "Procaryotae" (ou "Monera"). Au sein du
règne des Procaryotae, Murray distinguait 4 divisions retrouvées dans le manuel de Bergey:

 La division des "Gracilicutes". Regroupe les bactéries à Gram négatif.

 La division des "Firmicutes". Regroupe les bactéries à Gram positif.
 La division des "Tenericutes". Bactéries dépourvues de paroi.
 La division des "Mendosicutes" ce sont les Archaebactéries

Selon, CR, Woese (1978) : le développement des techniques de biologie moléculaire a permis de
caractériser les gènes qui codent pour les ARN ribosomaux (ARNr). En comparant une multitude de
séquences d’ARNr 16S, appartenant à divers organismes vivants, il est arrivé à diviser les organismes
vivants en trois domaines. Le domaine des Bacteria ou Eubacteria, le domaine des Archaea et le
domaine des Eucarya (animaux, plantes, les mycètes et les protistes) (figure 3) (Yahiaoui, 2014).

Figure 3 : Arbre phylogénétique universel (Bertrand et al, Ecologie microbienne 2011)

4. Intérêts et rôles des microorganismes

Les microorganismes ont plusieurs rôles dans différents domaines, nous pouvons citer quelques
exemples dans le but de montrer leur importance :

6
  fixation biologique d’azote moléculaire : un groupe des bactéries appelées fixatrices
d’azote, fixent l’azote atmosphérique et le transforment en une forme assimilable par les
plantes;
 les microorganismes assurent le recyclage des éléments qui composent la matière
organique des êtres vivants après leur mort;
 aussi dans le domaine de l’environnement, les microorganismes assurent le traitement
de l’eau, de l’air, et des sols pollués;
 ils interviennent aussi dans la disparition des composés qui jouent un rôle dans l’effet
de serre : méthane, oxyde d’azote;
 les microorganismes sont utilisés au sein de l’industrie agroalimentaire, par la
production d’aliments et boissons comme la bière, le vin, le pain et les produits laitiers, la
production d’additifs alimentaires comme les alcools, les acides aminés, les polysaccharides
et les vitamines;
 dans l’agriculture, ils assurent la production des plantes transgéniques;
 dans le domaine médical ils sont utilisés dans la production des antibiotiques,
stéroïdes, vaccins, peptides, hormones…
 plusieurs microorganismes colonisent le tube digestif de tous les êtres vivants pour
assurer plusieurs fonctions (100 milliards par gamme de contenu intestinal, chez l’Homme);
 les micro-organismes jouent des rôles importants dans divers domaines de l’industrie,
pour la production de papier, de bio cosmétique, biomatériaux (Balandreau, 2000).

B- La biodiversité microbienne

1. Définition de la biodiversité

Le mot « biodiversité » est en général une contraction de « diversité biologique ». La biodiversité

signifie la diversité et la richesse de tous les organismes vivants : les animaux, les plantes, les
champignons les virus et les microorganismes.

La biodiversité s'apprécie aussi en considérant la diversité des gènes, des espèces et

des écosystèmes dans l'espace et dans le temps et les interactions entre ces niveaux d'organisation
(Dajoz, 2008).

2. Origine et évolution de la biodiversité microbienne

Ce terme –biodiversité- a été proposé la première fois par NORSE et Mc MANUS en 1980, après elle
a été utilisé par Thomas LOVEJOY la même année, puis en 1986 par NORSE, dans un livre sous la
forme contractée « biodiversity » (Norse, 1986).
7
Du point de vue historique, la terre est âgée de 4,5 milliards d’années et les premières traces de vie
connues datent au précambrien, il y a 3,5 milliards d’années donc la biodiversité que nous connaissons
est le résultat d’une longue évolution, dès le précambrien jusqu’au notre ère.

Au précambrien, la température de la terre a atteint au moins 70°C. C’est à cette époque que la vie est
apparue mais sous ces conditions les êtres vivants ne pouvaient pas se développer et se différencier.
Ces conditions expliquent le fait que la terre ne contenait que des organismes unicellulaires, des
groupes de procaryotes analogues aux bactéries actuelles ainsi que des organismes chlorophylliens uni
ou pluricellulaires, alors que l’apparition des Eucaryotes s’est faite plus tard entre 2,5 et 2,7 milliards
d’années. Puis au début du cambrien, il y a 550 millions d’années, la température de la terre a
diminuée jusqu'à 20°C ce qu’a donné le phénomène connu sous le nom « explosion cambrienne ». Par
conséquent, le cambrien correspond à l’époque qui a connu la plus grande diversité en ce qui
concerne le nombre de phylums car les caractéristiques physico-chimiques du milieu sont devenues
plus favorables. Depuis le cambrien, l’évolution des espèces a été marquée par un ensemble de cinq
grandes extinctions dues à des catastrophes importantes : glaciations, éruptions volcaniques, chute de
météorites. Les deux plus importantes extinctions se situent à la fin de l’ère secondaire (limite de
crétacé et du tertiaire), il y a 65 millions d’années. Des groupes systématiques entiers ont été éliminés
lors de ces extinctions, mais la vie s’est vite reconstituée et la biodiversité a constamment augmenté
jusqu'à nos jours. Cependant plusieurs groupes systématiques de niveau élevé comme les phylums ont
disparu et n’ont pas été remplacés (Dajoz, 2008).
3. Les différents types de diversité des microorganismes

L’évolution des microorganismes est basée sur différents critères pour adapter au changement
physique-chimique de leur milieu de vie, ce qui explique que la diversité microbienne montre
plusieurs aspects et angles pour l’étudier.

3.1. La diversité spécifique des microorganismes

La diversité des espèces microbiennes est l’élément le plus visible de la biodiversité. La
diversité spécifique désigne le nombre d’espèces présente soit dans une zone donnée, soit
dans l’ensemble des diverses catégories d’êtres vivants. Son étude a commencé surtout avec
Linne en (1758). Elle ne peut être correctement appréciée que par les méthodes modernes de
la systématique phylogénétique qui établit les relations véritables entre les divers groupes
systématiques (Dajoz, 2008).
3.2. La diversité infra-spécifique

La diversité microbienne, c'est aussi la diversité des propriétés des souches, à l'intérieur d'une espèce,
c'est à dire la diversité infra-spécifique (Balandreau, 2000).

8
 3.3. La diversité des habitats et environnements

Les microorganismes existent partout, ils sont donc ubiquistes. En effet, on trouve des
microorganismes dans l’air, les océans, les forêts, les montagnes, le sol, l’eau, les animaux et les
plantes, et aussi ils peuvent vivre dans des conditions extrêmes, soit à une température très élevée à
une température extrêmement froide. En plus, les micro-organismes vivent soit dans un milieu acide,
alcalin ou neutre. C’est l’écologie microbienne qui assure l’étude des micro-organismes dans leur
habitat (Dajoz, 2008).

3.4. La diversité de la physiologie des micro-organismes

Du point de vue physiologique et selon les besoins des microorganismes on distingue plusieurs
diversifications en fonction des besoins nutritifs.
4. La classification des microorganismes (Jin-Yi.w, 2013)

Les microorganismes se divisent on deux groupes, d’une part les procaryotes et d’autre part les
eucaryotes. Dans le groupe des procaryotes on distingue deux domaines, les Bacteria et les Archaea.

4.1. Archéobactéries " Archaea" ou "Archaeobacteria"

Les archéobactéries : caractérisés par des cellules sans noyau et se distinguant des eubactéries par
certains caractères chimiques dont la constitution de la membrane cellulaire. Les archéobactéries
constituent un groupe très hétérogène, regroupant peu d’espèces connues.
Les archéobactéries se développent dans des niches extrêmes où les conditions de vie sont très
difficiles voire impossibles pour la plupart des autres organismes. Par exemple, Pyrobaculum provient
de réservoirs profonds de pétrole chaud. Sur la base de critères uniquement métaboliques, les archées
ont été divisées en trois grands groupes :

1- Les archéobactéries méthanogènes

2- Les archéobactéries halophiles

3- Les archéobactéries thermophiles.

4.2. Eubactéries "Bacteria" ou "Eubacteria"

Les eubactéries comprennent la plupart des bactéries, excepté les archéobactéries. Elles occupent la
plupart des milieux, elles représentent la plus grande partie du vivant. Elles remplissent des fonctions
fondamentales dans l’écosystème terrestre, comme par exemple dans le cycle de l’azote ou du soufre.
Elles jouent aussi un rôle prépondérant dans le recyclage des déchets organiques. Les eubactéries
peuvent être phototrophes, chimiotrophes ou bien hétérotrophes. On en trouve des aérobies ou des
anaérobies stricts.

Les eubactéries se subdivisent en trois groupes :

9
  Les "Gracilicutes" regroupant les bactéries dont la paroi est à Gram négatif.
 Les "Firmicutes" regroupant les bactéries dont la paroi est à Gram positif.
 Les "Tenericutes" rassemblant les bactéries dépourvues de paroi.

4.3. Les Eucarya

Tout comme les procaryotes, il existe une très grande diversité d’eucaryote. Ces microorganismes sont
communément appelés protistes. Et on trouve trois groupes principaux:

4.3.1 Les algues microscopiques

Ce sont des microorganismes photosynthétiques les plus nombreux à la surface de la terre. On les
retrouve partout où il y a de l’eau, de la lumière et des éléments nutritifs. Les algues contiennent des
pigments photosynthétiques qui leur permettent de capter l’énergie solaire. Elles jouent un rôle dans
des secteurs divers de l’économie humaine.

4.3.2. Protozoaires
Ils forment un groupe très hétérogène de micro-organismes eucaryotes. Ils sont dépourvus de pouvoir
photosynthétique et de cellulose. Ils sont unicellulaires et mobiles. Ils sont classés d’après la nature de
leur appareil locomoteur et les caractéristiques de leurs cycles vitaux.

4.3.3 Mycètes
Ce sont des organismes eucaryotes non photosynthétiques, ce qui les distingue des algues. Ils n’ont
pas d’organes de locomotion ni de paroi cellulaire imprégnée de cellulose ou de chitine. Ceci les
distingue des protozoaires. Ils vivent dans le sol humide, dégradent les matières organiques issues de
cadavres animaux et résidus végétaux. Ils ont donc un rôle important dans le recyclage des matières
organiques.

C- La taxonomie microbienne

1. Définition de la taxonomie

La taxonomie microbienne a pour but d’établir des groupes de microorganismes

présentant des caractères communs, les taxons, auxquels elle va attribuer un nom. Son
application principale est l'identification qui consiste à étudier les caractères d'un organisme à
fin de pouvoir le placer dans un taxon préalablement décrit ou dans un nouveau taxon.

Il n’existe pas de classification officielle, d’une part parce que la taxonomie poursuit des buts
pratiques et, selon l’application voulue, plusieurs classifications peuvent coexister. La
taxinomie microbienne est en perpétuelle évolution. Chaque année, de nouvelles espèces sont
découvertes. A l’heure actuelle, on connaît à peine 10 à 15% des microorganismes existant.
10
Le reste est à découvrir. Ce constat est du à notre incapacité de les isoler et de les cultiver.
L’obtention d’une culture pure est nécessaire pour toute étude taxinomique au sens large.

La taxonomie recouvre trois domaines différents: la classification, la nomenclature, et l’identification.

- La classification établit des taxons selon des critères phénotypiques et moléculaires.

- La nomenclature affecte un nom à ces taxons selon un système binomial procédant des lois de Linné
dans lequel un nom latin de genre précède le nom d'espèce.

- L'identification assigne les souches inconnues à l'un des taxons décrits

2. Les rangs taxonomiques

La "pyramide de la classification" s’élève, réunissant les espèces en genres, les genres en
familles, les familles en ordres, les ordres en classes, les classes en embranchements et les
embranchements en règnes.

Espèce est l’unité de classification ou taxon de base en taxonomie des êtres vivants.

Un genre est un ensemble d’espèces qui ont de nombreux traits en commun.

On appelle famille un ensemble de genres.

L'ordre est un ensemble de familles.

La classe est une catégorie de la classification du monde vivant plus large que l'ordre.

L’embranchement plus large que la classe.

Le règne est le plus large groupe de la classification (http://www.chambon.ac-
versailles.fr/science/faune/zool/classif.html).

3. Evolution de la taxonomie microbienne

3.1. Taxonomie phénotypique

Depuis la classification proposée par Cohn en 1872 et jusqu'au début des années soixante, toute la
taxonomie bactérienne reposait sur une classification phénétique.

L’identification de l’espèce repose sur la comparaison de divers caractères phénotypiques de

la souche à étudier vis à vis de ceux d’une souche de référence. La classification phénétique
ou phénotypique utilise un faible nombre de caractères considérés comme importants tels que
la morphologie, la mise en évidence d’un caractère biochimique, l’habitat...

Cependant, la classification phénétique ne reflète qu’un nombre réduit d’information, les

caractères considérés comme importants sont subjectifs et dépendent des conditions

11
environnementales. Aussi, il faut garder à l’esprit que ces caractères peuvent être absents
notamment chez les germes mutants (http://alphaveto.blogspot.com/).

3.2. Taxonomie numérique

En 1763, le botaniste français Adanson suggérait une méthode de classification qui prit
compte de l'ensemble des caractères d'un organisme, chaque caractère à la même « valeur ».

En 1957, Sneath fait une méthode similaire aux bactéries et développe une taxonomie
qualifiée de numérique ou d'adansonienne.

De manière schématique, la méthode consiste à étudier, pour chaque souche, plus d'une
centaine de caractères morphologiques, biochimiques, culturaux, structuraux... et à attribuer le
même poids à chacun des caractères qui sont codés 1 (présence du caractère) ou 0 (absence du
caractère). Le but recherché est de rassembler dans une classe de similitude les individus les
plus semblables.

L’analyse mathématique de quantités importantes de données concernant les caractères

phénotypiques et moléculaires permet le calcul des distances existant entre différents groupes
taxonomiques. Les résultats obtenus peuvent être représentés graphiquement sous forme de
dendrogramme (figure 4).

(www.microcsb.net/IMG/pdf/Methode_identification_criteres_choix.pdf)

Figure 4: dendrogramme, de quelques espèces du genre Bacillus et de genres apparentés

(microbia.free.fr/CoursABM/ABM6.%20Taxonomie%20bacterienne.pdf).

12
 3.3. Limites de la taxonomie phénotypique et numérique

Les techniques phénotypiques ne sont pas adaptées au diagnostic des bactéries dont la culture est lente
ou difficile (Chlamydiae, Rickettsiae...) ou aux germes non cultivables puisque la condition initiale est
de disposer d’une culture pure de l’espèce à identifier.

D’autres limites proviennent des tests en eux-mêmes et leur nombre limité, même si
l’identification numérique en a considérablement amélioré les performances. Elles ne
représentent qu’une faible partie du phénotype des bactéries. Même en multipliant le nombre
de caractères étudiés (jusqu’à 300 parfois), la taxonomie numérique n’évalue que 5 à 20% du
potentiel génétique d’une bactérie. De plus, le développement de ces tests s’est fait par
analogie avec des faits réels
(www.microcsb.net/IMG/pdf/Methode_identification_criteres_choix.pdf).

3.4. Taxonomie moléculaire

Ces méthodes sont basées sur l’analyse des molécules d’ADN ou d’ARN, soit au niveau de
l’ensemble du génome, soit en ciblant certains fragments du chromosome. En effet l’hybridation
ADN-ADN, le pourcentage de G+C ou la cartographie chromosomique apportent des informations
sur le génome microbien dans sa globalité. On pourra également s’intéresser plus particulièrement à
certains gène qui reflèteront l’évolution microbienne dans une approche phylogénétique et pourront
être ultérieurement utilisés en tant qu’outils d’identification (voir plus loin chapitre 2).

3.5. Taxonomie polyphasique

La taxonomie polyphasique ou taxonomie mixte et consensuelle se base sur l’analyse d’un ensemble
de caractères à différents niveaux d’expression et à pouvoir discriminant variable. Elle consiste à
intégrer toutes les informations phénotypiques, génétiques et phylogénétiques sous une forme
adéquate aboutissant à une estimation quantitative de la similarité entre différents organismes
(utilisation d’une large gamme d’informations phénotypiques et génétiques allant des propriétés
moléculaires aux caractères écologiques). L’avènement de la taxonomie polyphasique et de ses
multiples et différentes approches a provoqué de grand remaniement en ce qui concerne la
systématique bactérienne. Grâce à cette taxonomie, les approches classiques gardent leur valeur et
seront également évoquées (Maatallah, 2003).

D - La phylogénie
1. Définition de la phylogénie

La Phylogénie (phylogenèse) est une reconstruction de l’histoire évolutive des êtres vivants. Le terme
phylogenèse a été introduit par Haeckel (1866). La phylogénie est une classification particulière qui a

13
pour but d’établir les liens de parenté qui décrivent l’histoire évolutive entre les différentes classes,
unités évolutives ou taxons. Le support de cette histoire évolutive est l’arbre phylogénétique (Darwin,
1872).

2. L’arbre phylogénétique

Un arbre phylogénétique est donc une représentation graphique des relations de parenté entre des
groupes d’êtres vivants. Chaque groupe représente un taxon, ou une unité taxonomique Généralement,
on utilise les espèces biologiques comme taxons de base, mais il est tout à fait possible de construire
un arbre phylogénétique de plusieurs sous-populations d’une espèce par exemple. Au départ, on
possède des informations sur les feuilles de l’arbre (on connait par exemple tout ou partie du code
génétique des espèces concernées), et on veut reconstituer les branches et les nœuds internes à partir
de ces informations (Felsenstein, 2004).

2.1. Arbre raciné et arbre non-raciné (figure5)

Lorsqu’un arbre est raciné, sa racine représente l’ancêtre commun le plus récent de tous les taxons
considérés. Un arbre raciné est donc dirigé, et représente ce qu’on peut appeler un « chemin évolutif »,
de l’ancêtre commun aux taxons actuels. Tandis qu’un arbre non raciné ne donne pas d’indication de
direction, mais seulement les relations entre les taxons (Felsenstein, 2004).

Figure5 : Arbre raciné ou non-raciné (Felsenstein, 2004).

2.2. Autres constituants de l’arbre phylogénétique

Un arbre est un graphe non cyclique constitué de plusieurs nœuds qui sont les unités
taxonomiques évolutives (OTUs : Operational Taxonomic Unit) c’est-à-dire les individus à
partir desquels nous avons récolté les données sous forme phénotypiques tels que les
caractères biochimiques bactériens ou génotypiques comme les séquences d’un gène
particulier. Ces nœuds sont reliés entre eux par des branches dont la signification est relative
aux types de données utilisées pour tracer la phylogénie (Figure6). Les nœuds internes sont
des unités inexistantes en fait, mais des ancêtres hypothétiques permettent l’interprétation de
l’arbre (Felsenstein, 2004).

14
 Figure6 : les constituants de l’arbre phylogénétique (Felsenstein, 2004)

2.3. Les différents types des arbres phylogénétiques

- Cladogramme: indique simplement les relations d’ancêtre entre les espèces;

- Arbres additifs: la taille des branches indique, par exemple, le nombre de substitutions entre les deux
séquences;

- Arbres ultra métriques: Arbres additifs où les feuilles sont équidistantes de la racine.

3. Méthodes de construction d'arbres phylogénétiques

La construction d’arbres se base sur deux méthodes différentes. Ces différences sont, en fait, dues à la
nature des données dont on dispose et à la manière de les utiliser. Ainsi on peut distinguer les
méthodes suivantes:

*Les méthodes phénétiques : Cette technique est basée sur l’agglomération successive des taxons des
plus proches aux plus éloignés. Il s’agit bien d’une technique de classification et non de phylogénie.

*Les méthodes cladistiques : Ils se basent sur l’analyse des caractères en identifiant leurs états
plésiomorphe et apomorphe, c’est-à-dire les caractères primitifs de ceux dérivés.

*Les méthodes du maximum de parcimonie : Le principe fondamental des méthodes de parcimonie

consiste à diminuer au maximum le nombre d’évènements génétiques (mutations, substitutions) pour
comparer deux séquences ou deux individus ( rédéric et al, 2016).

*Phylogénie moléculaire

L’élément de base de toute classification ou phylogénie est le caractère. Plus le nombre de caractères
comparés est important, plus l’analyse phylogénétique est fiable (sous les conditions du modèle
phylogénétique). De ce point de vue, les séquences nucléiques et protéiques offrent un potentiel
d’analyse incomparable, tant par le nombre de caractères que par le nombre séquences homologues
disponibles. Depuis quelques décennies, la multiplication des données moléculaires ainsi que
l’avènement de l’informatique ont permis le développement de la phylogénie moléculaire au travers
des statistiques et de la modélisation. C’est la combinaison de l’histoire évolutive caractérisée par
l’ordre des branchements des lignées (la phylogénie ou pattern) et des caractéristiques quantitatives et

15
qualitatives du processus de l’évolution dans ces lignées qui conduit à l’état des caractères observés.
Refuser de prendre en compte les processus d’évolution lorsqu’on recherche la phylogénie est
pénalisant. La modélisation est alors toute légitime et nécessaire ( rédéric et al, 2016).

Méthodes basées sur la distance

Ces méthodes sont basées sur les distances évolutives entre les différentes séquences de l’arbre. Ces
distances (nombre de substitutions par site) ajustées deux-à-deux d’après le modèle utilisé estiment le
nombre de substitutions produites au cours de l’évolution entre toutes les paires de séquences de
l’arbre. Plusieurs matrices de taux de substitutions peuvent être utilisées ( rédéric et al, 2016).

La méthode du maximum de vraisemblance

La méthode du maximum de vraisemblance en phylogénie moléculaire fut initialement appliquée par

Cavalli-Sforza et Edwards (1967) puis développée par Felsenstein (1981). Cette méthode statistique
consiste à ajuster les valeurs des paramètres numériques du modèle (matrice de substitutions,
longueurs des branches…) aux données (l’alignement de séquences), pour chaque topologie candidate.
Cette méthode à l’énorme avantage d’utiliser toute l’information contenue dans les séquences pour
déduire une topologie d’arbre contrairement aux modèles basés sur les distances évolutives qui
réduisent l’information contenue dans les séquences à des estimations de distances évolutives. Cet
avantage est contre balancé par le nombre très important d’estimations nécessaires et donc par des
temps de calcul plus lourds ( rédéric et al, 2016).

16
CHAPITRE II: Les techniques moléculaires utilisées dans l'étude des micro-organismes

1. Généralités

Les techniques de biologie moléculaire, au sens large, sont les techniques permettant d’isoler, de
manipuler ou de caractériser les composants moléculaires d’une cellule. Basées sur l’analyse directe
de l’ADN (ou ARN) mais peuvent également inclure les protéines de structure (ex, constituant
cellulaire) ou de fonction (ex, enzyme) et les acides gras (constituant de la membrane des cellules).
Ces techniques offrent un intérêt tout particulier pour les microorganismes.

On observe en effet que près de 99% des microorganismes présents dans un échantillon
environnemental (ex, sol) ne sont généralement pas cultivables et sont donc complètement ignorés lors
d’étude utilisant des méthodes de microbiologie classiques fondus sur la culture de ces
microorganismes (Monier et Cécillon, 2015).
Initialement, les techniques de biologie moléculaire, sont utilisées afin d'identifier et de caractériser
les micro-organismes. Actuellement, de plus en plus de ces techniques sont développées dans le but de
quantifier des populations microbiennes spécifiques. Or, 1'identification et la détermination du nombre
de microorganismes, dans un échantillon, relève du véritable défi, certainement parce que les
populations microbiennes sont complexes et très diverses. Les méthodes mises en place doivent par
conséquent cibler une caractéristique spécifique. Ceci a conduit à l'établissement de nombreuses
techniques offrant aux microbiologistes un large éventail de possibilités (Lamriri, 2000).

La comparaison des protéines et des acides nucléiques fournit une information considérable sur les
parentés véritables. Ces approches moléculaires plus récentes ont pris de plus en plus d’importance
aussi bien dans la taxonomie et dans la biodiversité que dans la microbiologie médicale et industrielle.

2. Notion de marqueur moléculaire

2.1. Définition de marqueur génétique

Les marqueurs moléculaires regroupent un ensemble de techniques qui révèlent des différences
séquence d’ADN entre individus. Ils permettent de détecter ce polymorphisme (différence) dans des
régions spécifiques de l’ADN.
Les marqueurs moléculaires c’est un moyen d’étude de la diversité génétique, ils établissent
l'empreinte génétique d'un individu ce qui permet de décrire et de définir des individus et des variétés
en vue de leur inscription et de leur classification.
www.peyrehorade.fr/content/download/3591/22612/file/A6_1_Labo%20posters_100PI_9pages.pdf

2.2. Critères du choix d'un marqueur

Un marqueur moléculaire est considéré comme idéal s’il présente différents caractères parmi eux :

 neutre : ses différents allèles n'ont pas d'effet sur le phénotype de l'individu

17
  polymorphe : possédant de nombreux allèles caractérisant les différents individus
 insensible au milieu
 en grand nombre et bien répartis dans le génome
 non épistatique: absence d’interactions inter locus.

2.3. Type des marqueurs moléculaires

Les marqueurs les plus utilisés sont classés en deux catégories:

basés sur l’amplification génique in vitro par PCR: REP, RAPD et AFLP …
basés sur l’hybridation moléculaire: RFLP…

3. Principales techniques moléculaires utilisées dans l'étude des micro-organismes

L’apparition des techniques moléculaires devant la scène a bouleversé la taxonomie et la phylogénie,

ce qui nous a permis de bien comprendre la biodiversité, non seulement des microorganismes, mais
aussi de tout les êtres vivant.

3.1. Techniques basées sur la comparaison des protéines

3.1.1. Comparaison des séquences en acides aminés

Les séquences en acides aminés des protéines reflètent directement les séquences des ARNm et sont
donc étroitement reliées à la structure des gènes qui les encodent. L’approche la plus directe est de
déterminer la séquence en acides aminés des protéines ayant la même fonction. Les séquences des
protéines différentes se modifient souvent à des rythmes différents, certaines séquences changent
rapidement, tandis que d’autres sont très stables. Cependant, si des séquences de protéines de même
fonction sont similaires, il est probable que les organismes qui les possèdent sont étroitement
apparentés. Comme il est long et coûteux de déterminer la séquence d’une protéine, des méthodes
indirectes de comparaison ont été fréquemment employées.

3.1.2. Méthodes d’analyse des protéines cellulaires totales (SDS-PAGE)

Dans cette analyse, l’isolement et la purification des protéines cellulaires est une étape critique.
Après cet isolement, l’ensemble des protéines est analysé par électrophorèse sur un gel d’acrylamide
en condition dénaturante par la présence de SDS. Les profils de protéines cellulaires obtenus après
migration peuvent être analysés par un programme informatisé ce qui rend la comparaison plus facile.
Cette méthode permet l’étude de la diversité qui existe entre les micro-organismes testés avec un
pouvoir de résolution allant du niveau souches à espèces. Cependant, elle doit être standardisée afin
d’obtenir des résultats reproductibles.

18
 3.1.3. Le polymorphisme enzymatique

Le principe de cette technique est le suivant : un iso enzyme ou allo enzyme est codé par un gène qui
peut être sous la forme de différents allèles, chacun codant pour une forme électrophorétique de cette
enzyme. Ces différentes formes iso enzymatiques sont séparées par électrophorèse sur gel et leur
identification se fait par rapport à un substrat donné. La lecture des gels permet alors de classer les
individus testés en fonction de leur type électrophorètique.

Chez les bactéries du sol, en particulier cette approche a permis d’obtenir une bonne estimation de la
diversité génétique existante au niveau des espèces.

3.2. Techniques basées sur l’analyse des acides nucléiques

3.2.1. Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

La technique RFLP est basée sur la digestion de l'ADN par des coupures spécifiques de séquences
nucléiques par des endonucleases. Ces enzymes, dont plusieurs centaines ont été découvertes, coupent
l'ADN au niveau de sites présentant une séquence spécifique, après la séparation par taille des
fragments d'ADN se fait sur gel d'électrophorèse et une visualisation de séquences spécifiques d'ADN
en utilisant des sondes marquées par radioactivité ou par des molécules fluorescentes (Ould ahmed,
2009).

La méthode des RFLP a connu un grand succès vers les années 80. La technique est une meilleure
approche pour estimer la diversité intra spécifique (polymorphisme existant entre individus d’une
même espèce) et la diversité inter spécifique (les relations entre les différentes espèces). La RFLP
permet de construire la carte génétique et elle est utile pour cibler un grand nombre des souches et
déterminer leur classification phylogénétique, par contre, il fallait attendre l'association de cette
technique avec la PCR pour que cette méthode prenne la place qu'elle occupe aujourd'hui dans l'étude
du polymorphisme.

3.2.2. L’électrophorèse en champs pulsé (PFGE)

La PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) est un cas particulier de la RFLP. Dans cette technique
l’ADN total est digéré par des enzymes de restriction à faible fréquence de restriction. Par conséquent
les fragments obtenus sont plus faibles en nombre et plus grands en longueurs ce qui rend leur
séparation difficile voir impossible en électrophorèse ordinaire. Pour cette raison une électrophorèse
spéciale appelée électrophorèse sur gel en champs pulsé ou (PFGE) est utilisée, la particularité la plus
importante de cette électrophorèse c’est que le champ électrique est alterné et multidirectionnel (camp
pulsé, à l’origine du nom de la méthode). Alors au cours de la PFGE les molécules d’ADN sont
forcées à changer leur direction de migration en modifiant le courant et leur vitesse de réorientation
qui varie en fonction de leur poids moléculaire. La PFGE peut être utilisée chez les procaryotes pour
19
différencier entre les espèces du biovar et de la souche. Elle est utilisée également dans les études de
réarrangement du génome et pour l’estimation de sa taille.

Toutefois, aussi bien la RFLP que la PFGE sont actuellement de moins en moins utilisées dans les
études de l’identification et de la caractérisation génétiques des micro-organismes. En effet ces deux
techniques sont lourdes à mettre en œuvre. De ce faite, les méthodes basées sur l’amplification
génétique, de plus en plus adoptées, restent les plus faciles et les plus avantageuses.

3.3. Les approches utilisant l’amplification génique (PCR)

Après l’intervention de la PCR, cette technique d'amplification génique. Elle utilise la propriété de
l’enzyme ADN polymérase de synthétiser le brin complémentaire d'un ADN simple brin servant de
matrice en assemblant des nucléotides (comme dans le mécanisme naturel de réplication de l'ADN).
La réaction débute par l'hybridation d'une courte séquence d'ADN (quelques dizaines de bases)
spécifique de l'ADN à amplifier (amorce d'amplification) sur chacun des deux brins de l'ADN
dénaturé par chauffage. L'adjonction d'une ADN polymérase thermorésistante permet d'aboutir en
quelques minutes à deux copies de l'ADN original. Apres n cycles consécutifs, le nombre de copies
d'ADN amplifie atteindra au plus 2n en quelques heures, offrant ainsi une sensibilité de détection
extraordinairement élevée par comparaison avec les méthodes de culture les plus performantes.
Concrètement, la PCR a l'avantage d'être à la fois rapide et peu couteuse (Lamriri, 2000). La
taxonomie et la phylogénie microbienne à bien évolué grâce a cette technique d’amplification qui
entre en évidence avec différent marqueurs moléculaires.

3.3.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

La DGGE est un procédé d’électrophorèse sur gradient de dénaturants chimiques qui permet
d’observer les différences de mobilité de fragments d’ADN de même taille, mais de séquence
différente. Sous l’effet d’un champ électrique, les produits de PCR migrent dans le gel et rencontrent
des concentrations en dénaturants de plus en plus importantes, entraînant la dénaturation progressive
de leurs brins d’ADN selon leur composition en bases GC et AT. L’abondance des bandes sur le profil
électrophorétique obtenu reflète la biodiversité de la communauté pour les micro-organismes
considérés, chaque bande correspondant au moins à une espèce cible. En découpant les bandes sur le
gel et en réamplifiant par PCR l’ADN qu’elles contiennent, il est également possible de connaître
l’identité du microorganisme correspondant après séquençage. La DGGE reste lourde à mettre en
œuvre car elle nécessite au moins deux jours de manipulations, depuis l’extraction d’ADN jusqu’à la
révélation des fragments d’ADN du gel sous illumination UV. (Juzan and al, 2012).

20
 3.3.2. AFLP (Amplified fragment- length polymorphism)

La technique AFLP ou polymorphisme de taille des fragments d’ADN amplifies, dotée du pouvoir
discriminant et révélateur de la diversité génétique, a été développée par (Vos et al, 1995). Elle est
fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de site de restriction et d’hybridation
d’amorces arbitraires.

La technique AFLP est considérée comme une technique fine dans la taxonomie microbienne, son
pouvoir résolutif est plus élevé que la technique ARDRA et va jusqu’au niveau infraspécifique.
(Konate, 2007).

3.3.3. DNAr 16S

Les travaux de Carl Woese en 1987, ont véritablement révolutionné la taxonomie microbienne. Ils ont
démontré que les séquences d’ADN ribosomaux (ADNr) sont des marqueurs évolutifs robustes
permettant de déchiffrer la phylogénie et l’évolution des populations microbiennes au cours du temps.
Toutes les cellules contiennent des ARNr. (Alauzet, 2009) Ce sont des composants essentiels à leur
fonctionnement. Les cellules eucaryotes possèdent des ARNr 28S, 18S, 5,8S et 5S tandis que les
cellules procaryotes possèdent des ARNr 23S, 16S et 5S. Leurs gènes s’organisent en opérons pouvant
être présents en mono- ou multi-copies dans les génomes (1 à 15 copies par génome bactérien)
(Rainey et al, 1996). Les ARNr sont des molécules ayant évolué plus lentement que le reste du
génome et constituent de ce fait une horloge moléculaire lente (Woese 1987).

Aujourd’hui, la majorité des études de diversité microbienne s’effectue seulement sur la base des
séquences d’ARNr 16S. On considère ainsi que les microorganismes qui présentent plus de 97% de
similarité dans leurs séquences d’ADNr 16S appartiennent à la même espèce. (Fierer, 2007).
L’utilisation de ce gène comme biomarqueur en taxonomie a permis de révéler la biodiversité
d’eucaryotes et de procaryotes dans de nombreux environnements et de pallier les limites de
l’approche culturale (NCBI).

L’existence de banques spécialisées dans les séquences de gène codant les ARNr comme la base de
données SILVA, disponible sur le site http://www.arb-silva.de/ permet d’avoir accès aux séquences
des gènes d’ARNr 16S et 23S de Bacteria et d’Archaea mais également des gènes ribosomaux
eucaryotes. Le nombre de séquences disponible dans la base de données RDPII (Ribosomal Data
Project) puis SILVA (Figure 7) illustre clairement l’intérêt et l’engouement des microbiologistes pour
l’utilisation de ce marqueur phylogénétique.

21
 Figure 7: Evolution du nombre de séquences d’ARNr depuis 1992 dans la base de données
(http://www.arb-silva.de/ )

3.3.4. PCR et séquençage du gène ARN 16S

Le gène code la sous-unité 16S de l’ARN ribosomal (ARNr) et est essentiellement utilisé en raison de
sa structure, très conservée dans toutes les bactéries. En effet, il est constitué d’une succession de
domaines conservés, sites de complémentarité pour les amorces universelles utilisées pour le
séquençage de ce gène, et d’autres portions de séquences propres à un groupe de bactéries, nommées
séquences signatures (espèce, genre, famille). Le choix de l’ARN 16S plutôt que 23S ou 5S est d’ordre
technique (taille du gène, nombre d’informations) et, surtout, les banques de données de séquences du
gène 16S sont aujourd’hui très développées. Enfin, l’identification est fiable : les résultats obtenus par
séquençage du gène 16S sont similaires à ceux obtenus avec le génome entier. La technique PCR-
séquençage basée sur le choix d’une amorce universelle, courte chaîne nucléotidique de 15 à 25
nucléotides, complémentaire de la séquence d’ADN connue à amplifier et située juste en amont de la
zone à séquencer. Cette amorce est nécessaire à l’accrochage de l’ADN polymérase. Le séquençage de
l’ADN consiste à déterminer la succession de nucléotides composant l’ADN. La première phase est la
synthèse d’ADN complémentaire au brin matrice par l’ADN polymérase (à partir de l’amorce), par
l’ajout de désoxyribonucléotides : dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Ce qui est particulier, pour le
séquençage, est l’utilisation de nucléotides légèrement différents, les didésoxyribonucléotides ddNTP
(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Dans le milieu de réaction, les dNTP sont en grande quantité et les
ddNTP en faible nombre. Lorsque l’ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu d’un dNTP, la
synthèse du brin s’arrête. L’incorporation aléatoire de ddNTP permet d’obtenir des fragments d’ADN
de taille variable. Les ddNTP sont incorporés, marqués par 4 fluorochromes différents. Les fragments

22
d’ADN obtenus sont de longueurs différentes ; le séquenceur sépare les fragments d’ADN selon leur
taille par chromatographie. Les systèmes actuels détectent la florescence des 4 nucléotides à partir de
la même colonne. Le résultat est présenté sous forme d’électrophorégramme. Ensuite, est effectué
l’alignement, soit graphiquement, soit par texte, c'est- à-dire que les séquences écrites en ligne sont
envoyées sur Internet et comparées à des séquences déposées dans des banques de données. On peut
ainsi obtenir des BLAST, c’est- à-dire des comparaisons avec les séquences les plus proches et
l’identification qui correspond, rendue avec un pourcentage d’homologie (Carole, 2015).

3.3.5. REP-PCR (repetitive extragenic palindromic ou repetitive element PCR)

La méthode de REP–PCR a été introduite par Versalovic et al en 1991. Le but de cette méthode est de
caractériser des souches bactériennes par des profils électrophorétiques obtenus en amplifiant des
séquences répétitives appelées séquences REP (Versalovic et al ,1991) . Ce sont des séquences
répétitives de 38 Pb de longueur, ayant 6 positions dégénérées et une boucle de 5 Pb variable se
trouvant entre les deux séquences palindromiques conservées. Versalovic et al, (1991) ont pu définir
des amorces pour explorer la présence de séquences qui ressemblent aux séquences REP et ils ont
trouvé que ces séquences peuvent se trouver chez plusieurs genres de bactéries dont les entérobactéries
(Gilson et al. 1984)

Cette méthode a été appliquée sur les genres Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium,
Azorhizobium et Agrobacterium (de Bruijn 1992). L’étude a montré que des séquences REP sont
présentes chez ces bactéries. La REP–PCR a aussi été employée dans beaucoup d’études sur la
diversité des microorganismes. Les avantages de cette méthode sont sa fiabilité, sa simplicité et sa
rapidité. Un simple gel d’agarose peut permettre de séparer les fragments d’ADN obtenus. De plus,
ces réactions de PCR peuvent donner de bons profils analysables, si elles sont réalisées à partir d’un
petit nombre de cellules mises en suspension dans le mix de PCR (de Bruijn 1992). Elle continuera
sans doute d’être très utilisée à l’avenir.

3.4. Autres approches (n’utilisant pas l’amplification par PCR)

3.4.1. Détermination du pourcentage G+C

Le premier élément des acides nucléiques ayant été utilisé en taxonomie est le pourcentage (G+C%).
En 1949 Chargaff et al montrent que le contenu en bases puriques (guanine, adénine) et en bases
pyrimidiques (cytosine, thymine) est variable chez les espèces. C’est à dire le nombre de couples
"guanine + cytosine" pour 100 couples de bases dans la molécule d’ADN (Zakhia, de Lajudie. 2006).
Sa détermination est considérée comme l’une des méthodes génotypiques les plus classiques et fait
partie intégrante de la description standard d’un taxon bactérien. Ce pourcentage peut être déterminé

23
de différentes manières, en mesurant la température de fusion de l’ADN ou par chromatographie
liquide haute performance (CLHP). (Alauzet, 2009)

Règles d’interprétations du GC% :

 2 espèces microbiennes ayants des GC% différents n’ont aucune communauté
génétique.
 2 espèces microbiennes ayants les mêmes séquences nucléotidiques ont
nécessairement le même GC%.
 2 espèces microbiennes ayants le même GC% peuvent être génétiquement éloignées.
 Les bactéries appartenant à la même espèce ont le même GC%.

3.4.2. Hybridation ADN/ADN

Cette technique permettant de mettre en évidence au sein d'une cellule ou d'un tissu, une séquence
d'acide nucléique, par exemple de localiser un locus sur un chromosome. . Leurs réalisations n’ont été
possibles qu’après la découverte par Marmur dans les années 60 du phénomène de la renaturation de
l’ADN. Elle est basée sur le principe de complémentarité des bases nucléiques, plus particulièrement
entre Le brin d’ADN et le brin d'ADN de séquence complémentaire.

La valeur d’hybridation entre les ADN totaux de deux souches est un indicateur de la similarité des
séquences entre génomes entiers (Madigan and Martinko, 2007). Les techniques utilisées pour
réaliser ces expérimentations d’hybridation ADN-ADN sont basées sur le phénomène de renaturation
de l'ADN dû à la propriété des brins complémentaires de deux molécules dénaturées d’ADN de se
réassocier s’ils présentent une analogie dans leurs séquences. La stabilité thermique des hybrides
obtenus, reflet de la proportion de mésappariements, doit ensuite être déterminée par élévation de la
température et comparaison de la stabilité thermique des duplex homologues à celle des duplex
hétérologues (ΔTm) en conditions standardisées. Il a été montré que la stabilité thermique diminuait de
1 à 2.2% pour chaque 1% de mésappariement (Vandamme, et al, 1996). Des valeurs d’hybridation au
moins égales à 70% sont recommandées pour considérer que deux isolats appartiennent à la même
espèce et des valeurs supérieures à 25% d’hybridation sont nécessaires pour affirmer que ces isolats
peuvent être placés dans le même genre (Madigan, et Martinko. 2007).
3.4.3. Puce à ADN

La technologie des puces à ADN (DNA microarray ou microchip) constitue un outil puissant pour
étudier l’expression des gènes et leur régulation à l’échelle d’un génome, et pour détecter des
polymorphismes génétiques. Cette technologie a été introduite seulement récemment en écologie
microbienne. Si la mise en œuvre de la technique est assez compliquée, son principe est relativement
simple. Des oligonucléotides ou des fragments d’ADN amplifiés par PCR (dénaturés juste avant
24
l’hybridation pour être sous forme simple brin) sont déposés sur une lame recouverte de polylysine qui
permet leur fixation grâce à des interactions électrostatiques (une fois les acides nucléiques fixés, la
polylysine est saturée). Différents types de sondes peuvent être utilisées pour lesquelles il existe 2
types de fluorochromes si l’on désire tester 2 échantillons à la fois. Si l’on s’intéresse au niveau
d’expression de gènes, on effectuera une extraction des ARN messagers d’une culture pure ou d’un
échantillon environnemental puis une transcription inverse (RT-PCR), et l’on hybridera avec des ADN
complémentaires. Les sondes peuvent également être constituées d’ARN ribosomaux ou d’ADN, si
l’on cherche à détecter leur présence dans un échantillon. Après l’hybridation sonde-cible, chaque spot
est excité par un laser et la fluorescence émise est récupérée par un photomultiplicateur (PMT) couplé
à un microscope confocal. Des logiciels permettent d’analyser les données et de déterminer l’intensité
d’hybridation sur chaque spot (si 2 échantillons sont testés en même temps, on peut définir leurs
différences d’expression en fonction des intensités respectives émises par chaque fluorochrome). Le
principe de la technique est schématisé sur le schéma (figure 8) (Alain, 2003).

Figure 8 : Schématisation du principe des puces à ADN (stéphane Le crome FIG 2003)

25
CHAPITRE III : Application des techniques moléculaires à l'étude da la
biodiversité, la taxonomie et la phylogénie des rhizobiums
1. Généralité

1.1. Aperçu général sur le processus de la symbiose

La symbiose fixatrice d'azote la plus répandue et la mieux étudie est celle qui associe les
rhizobia et les plantes de la famille des légumineuses (Young et al. 1989). L'association
symbiotique permet la formation de véritables organes spécialisés dans la fixation d'azote,
appelés nodules ou nodosités, qui sont généralement localisés au niveau des racines des
plantes hôtes (Dreyfus et al. 1984). La mise en évidence d'un nodule fixateur d'azote est le
résultat de plusieurs étapes mettant en jeu les deux partenaires (voir schéma figure 9)

Figure 9 : Développement des nodules sur les racines dans un cas de symbiose entre
Rhizobium et une plante légumineuse (Perry et al, 2004).

26
 1.2. L’intérêt da la symbiose rhizobium-légumineuse

Grace à l’association symbiotique entre ces deux partenaires, les légumineuses participent à la
revégétalisation des écosystèmes pauvres en azote. Elles constituent aussi la source
d’alimentation extrêmement importante aussi bien chez l’homme (soja, pois…) que pour
l’animal (trèfle, luzerne…). Elles ont été utilisées depuis l’antiquité pour améliorer la fertilité
des sols.
1.3. Les partenaires de la symbiose

1.3.1. Les légumineuses

Les légumineuses présentent la troisième super famille par ordre d'importance chez les
Angiospermes, avec près de 19 000 espèces végétales réparties dans 750 genres Elles
comprennent trois sous-famille, Les Mimosoïdées, les Papilionoïdées (également appelées
Fabacées) et les Caesalpinoïdées. On estime cependant, que 80 % d'entre elles forment des
symbioses racinaires. La nodulation par les rhizobia est plus fréquente dans les sous-familles
des Mimosoïdées (90 %), et des Papilionoïdées (97 %), que dans la sous-famille des
Caesalpinoïdées (23%) (Polhill et Raven, 1981).

1.3.2. Les rhizobiums

Les bactéries fixatrices d'azote associées aux légumineuses et communément appelées

rhizobia appartiennent à la famille des Rhizobiaceae (Jordan, 1984). Cette famille est membre
de la sous-classe alpha Protéobactéries (Stackebrandt et al. 1988). Les rhizobiums sont des
bactéries Gram négatifs, non sporulant et existent sous deux formes. La forme végétative, les
rhizobiums sont mobiles par un seul flagelle polaire ou par deux à six flagelles péritriches et
apparaissent sous forme de bâtonnets réguliers. La forme bactéroïde, à l’intérieur des cellules
du cortex racinaire, les rhizobiums se transforment en bactéroides de forme branchée,
sphérique ou en massue.

2. Etude da la biodiversité, la taxonomie et la phylogénie des rhizobiums

2.1. Biodiversité des rhizobiums

Les rhizobiums sont connus comme des bactéries fixatrices d’azote capable d’établir des
relations symbiotiques avec plusieurs espèces de la famille des fabacées. Toutefois, une large
population de rhizobiums non symbiotiques peut exister dans le sol ou dans la rhizosphère des
plantes légumineuses (Segovia et al, 1993). Ils peuvent également exister comme des cellules
viables dans l’eau où ils sont capables d’infecter et de noduler des légumineuses aquatiques

27
telles que Aechynomene spp, et Sesbania spp (Chaintreuil et al, 2000). Récemment, les
rhizobiums ont été également identifiés comme endophytes de plusieurs non légumineuses
telles que le mais, le riz et le blé (Ueda et al, 1995)

Rappelons que la biodiversité des rhizobiums ou de tout autre organisme peut être définie
comme suit " La diversité biologique, ou biodiversité, est la variété et la variabilité de tous les
organismes vivants. Ceci inclut la variabilité génétique à l'intérieur des espèces et de leurs
populations, la variabilité des espèces et de leurs formes de vie, la diversité des complexes
d'espèces associées et de leurs interactions, et celle des processus écologiques (El-Hilali,
2006).

2.1.1 Méthodes d’étude de la diversité des rhizobiums

Plusieurs techniques ont été utilisées par les microbiologistes pour évaluer la diversité des
rhizobiums. Ces techniques ont permis l’analyse de différents traits phénotypiques et
génétiques qui sont devenus par la suite une base de définition du concept de l’espèce.

1-Les marqueurs phénotypiques :

La caractérisation phénotypique utilisée dans l'étude de la diversité phénotypique des

rhizobia se base sur des critères morphologiques, symbiotiques, biochimiques, et
physiologiques (Graham et al, 1991).

Chez les rhizobiums, les critères symbiotiques sont considérés comme les plus utilisés parmi
les caractéristiques phénotypiques car ils reflètent la diversité fonctionnelle de ces bactéries.
En effet, bien que les nouvelles approches permettent de bien décrire leur diversité
microbienne, cela reste d’un intérêt limité si cette diversité génétique ne possède aucune
signification au niveau fonctionnel et écologique. Ces critères indiquent l’infectivité des
rhizobia, qui exprime le pouvoir de la bactérie à noduler une ou plusieurs légumineuses hôtes
et l’efficience qui exprime la capacité de fixer l’azote atmosphérique. Ces critères
symbiotiques indiquent aussi la compétitivité qui représente la résistance de la souche
bactérienne considérée aux microorganismes antagonistes et la concurrence avec les souches
indigènes pour la nodulation (Graham et al, 1991).

Parmi les critères physiologiques aussi les plus utilisés dans l'étude de la diversité des
rhizobiums nous pouvons citer le taux de croissance de la bactérie sur le milieu YEM
(Vincent, 1970) et la capacité d’utiliser différents carbohydrates comme source de carbone et
différentes sources d’acides aminés comme seule source de nitrogène. En effet, la première

28
classification des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote en deux genres Rhizobium et
Bradyrhizobium était basée sur le premier critère (le taux de croissance). Ainsi, les rhizobiums
ont une croissance rapide alors que les bradyrhizobiums ont une croissance lente (Jordan,
1982).

Concernant la capacité d’utiliser différents carbohydrates et différentes sources d’acides

aminés, vu sa grande variabilité, est la plus utilisée chez les rhizobia dans les études de la
taxonomie et la biodiversité. En effet, les bactéries du genre Rhizobium montrent une grande
aptitude à assimiler les mono et disaccharides et d’une manière restreinte les trisaccharides,
contrairement aux bactéries du genre Bradyrhizobium qui ont une assimilation variable pour
les mono, moindre pour les di et rare pour les tris saccharides.
2- Les marqueurs moléculaires

Ces marqueurs regroupent différentes techniques utilisant les protéines et les acides
nucléiques ADN ou ARN pour étudier la localisation ou la variabilité en séquence des gènes
ou de fragments de gènes.

Les techniques les plus utilisées dans l'étude de la diversité génétiques chez les rhizobiums
sont les suivantes :

*Analyse des protéines cellulaires totales par SDS-PAGE. La SDS-PAGE (sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) des protéines totales a été utilisée dans l’étude de
la diversité qui existe entre les souches des rhizobiums avec un pouvoir de résolution allant
du niveau souche à espèce (Vandamme et al, 1996).

*Méthode d’électrophorèse d’iso enzymes: Cette méthode permet une classification en

fonction de type électrophorétique ce qu'on appel le polymorphisme enzymatique. Chez les
rhizobiums cette méthode permet d'obtenir une bonne estimation de la diversité génétique
existant au niveau des espèces et elle peut être utilisée comme marqueur de souches
(Vandamme et al, 1996).

*Le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (RFLP): Cette technique est
largement utilisée pour l’étude de la diversité génétique ainsi que la classification des rhizobia
(El-Hilali, 2006). C'est une technique qui a connu un grand succès vers les années 80 car elle
donnait accès à un nombre très élevé de Marqueurs génétiques distribués le long du génome.
Cette technique permet:

29
  la mise en évidence de polymorphisme existant entre individus d’une même espèce
(diversité intra spécifique);
 d'étudier les relations entre différentes espèces (diversité inter espèces);
 de caractériser l’empreinte génétique d’un individu.

*L’électrophorèse en champ pulsé (PFGE)

La PFGE a été utilisée pour la différentiation entre les souches d’une même population de
Rhizobium leguminosarum bv.viciae et entre les souches nodulant différents arbres
légumineux originaires du Sudan (El-Hilali, 2006)

*Les séquences répétitives (REP, ERIC et BOX): L’amplification sélective des régions
existant entre ces séquences conservées a été utilisée comme une méthode stable et rapide
pour l’identification des bactéries (Versalovic et al, 1998). En effet, cette approche est
largement utilisée dans les études de la biodiversité des bactéries du sol. Elle permet l’étude
da la variabilité intraspécifique et elle est utilisée avec succès pour le typage d’isolats de
grandes collections (Maatallah, 2003).

2.2. La taxonomie des rhizobiums

2.2.1. Historique de la taxonomie des rhizobiums

En (1879) Frank a rapporté que ces microorganismes « les rhizobiums » étaient des
champignons en leur affectant le nom de Schinzia leguminosarum. En 1888, Hellriegel et
Willfarth ont fourni une explication scientifique pour la fixation biologique de l’azote. Dans
la même année, Beyerinck (1888) a pu isoler une bactérie d’une plante légumineuse et l’a
nommée Bacillus radicicola. Par la suite, le bacille a été renommé Rhizobium leguminosarum
(Young, 2001). Baldwin et Fred (1929) ont rapporté que la classification des différents
rhizobiums devrait être basée sur la spécificité de l’espèce bactérienne par rapport à la plante
hôte. Ainsi, Fred et al. (1932) ont pu identifier six groupes de nodulation croisée, Rhizobium
leguminosarum pour Lathyrus, Pisum, Vicia et Lens ; R. trifolii pour Trifolium ; R. phaseoli
pour Phaseolus ; R. meliloti pour Glycine max et R. lupini pour Lupinus. Cette première
classification a connu par la suite plusieurs critiques;
Lohnis et Hansen (1921) ont montré que les rhizobiums présentent une croissance soit lente
soit rapide dans le milieu synthétique. Le concept du taux de croissance a été repris par Norris
(1965) qui a défini en plus le critère de l’affinité symbiotique. Selon l’auteur, les bactéries à
croissance lente n’acidifient pas le milieu de culture et nodulent les légumineuses des régions
tropicales, alors que les bactéries à croissance rapide acidifient le milieu de culture et nodulent

30
les légumineuses des régions tempérées. Cependant, plusieurs contre-exemples ont été
rapportés. Ainsi, Lupinus et Corallina qui sont des légumineuses des régions tempérées, sont
nodulées par des bactéries à croissance lente. Sesbania et leucaena qui sont des légumineuses
des régions tropicales, sont nodulées par des bactéries à croissance rapide. Les observations
discordantes entre la croissance de la bactérie et la gamme d’hôte ont jeté le doute sur la
validité de cette classification. Toutefois, sur la base du taux de croissance, Jordan (1982) a pu
classer les rhizobia en deux genres, le genre Rhizobium pour les souches à croissance rapide et
le genre Bradyrhizobium pour les souches à croissance lente. Plusieurs méthodes
comparatives comme la sérologie, SDS-PAGE des isoenzymes ou des protéines totales,
FAME, le coefficient de Chargaff, l’hybridation ARN / ADN ou ADN / ADN, et l’analyse
des plasmides ont été adoptées pour la classification des rhizobiums. Mais ce n’est qu’après
l’identification en 1987 par Woese que les ADNr 16S des bactéries sont spécifiques à ces
bactéries que la taxonomie des rhizobiums s’est considérablement modifiée. La première
séquence partielle de l’ADNr 16S a été publiée par Young et al. (1991) pour la souche
Rhizobium BTAi1 (El-Hilali, 2006). Actuellement, les bactéries nodulantes aux légumineuses
appartiennent à trois types différents classes bactériennes; α-Proteobacteria, β-Proteobacteria et
γ-Proteobacteria. La plus grande classe, les alphaproteobactéries, est composée de six
familles, y a compris Rhizobiaceae, Phylobactericiae, Bradyrhizobiaceae,
Hephomicrobiaceae, Methylobacteriiaceae et Brucellaceae. La deuxième classe composé de
betaproteobacteria, contient actuellement un Famille des Burkholderiales, et contient deux
genres. La classification des bactéries symbiotiques, nodulantes aux légumineuses est en
grand état de flux, plus que jamais. Zakhia Et de Lajudie (2001) ont ensuite résumé la
classification de ces bactéries dans six genres Rhizobium avec 28 espèces reconnues. En 2003
cependant, Sawada et al. (2003) A signalé que 44 espèces bactériennes réparties dans 12
genres peuvent forme une symbiose de fixation de l'azote avec des légumineuses. Par la suite,
Willems (2006) a déclaré que les rhizobia sont composés de 53 bactéries espèces qui sont
réparties respectivement comme suit: 16, 11, 11, 7, 5, 2 et 1 espèce appartenant aux genres
Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Agrobacterium, Azorhizobium
et Allorhizobium. Les autres subdivisions de rhizobia continuent et Berrada et Fikri-
Benbrahim (2014) ont signalé qu’il existe 98 espèces de bactéries nodulantes aux
légumineuses à 14 genres. Récemment Shamseldin et al (2016) a décrit environ 238 espèces
réparties en 18 genres (Shamseldin et al, 2016).

31
 2.2.2. Méthodes d’étude de la taxonomie

*Analyse des acides gras: Les acides gras sont les constituants majeurs de plusieurs variétés
de lipides et de lipopolysaccharides. Ils ont été largement utilisés dans l’étude de la taxonomie
bactérienne (Vandamme et al, 1996). L’analyse des acides gras cellulaires ou FAME (fatty
acid methyl esters) chez des souches de Bradyrhizobium japonicum a montré des résultats en
concordance avec ceux de l’homologie ADN / ADN (Kuykendall et al, 1988).

*Le pourcentage en nucléotides G+C : C’est une méthode qui peut être utilisée comme un
premier moyen taxonomique des rhizobia. L’évaluation du pourcentage en molarité des bases
G+C contenus dans l’ADN (coefficient de Chargaff) est essentielle pour la description des
bactéries (Vandamme et al, 1996). Selon Graham et al. (1991), le pourcentage G+C varie
d’une souche a l’autre, les souches de Rhizobium ont une valeur du pourcentage G+C qui
varie de 59 à 64 %, les souches de Bradyrhizobium ont des valeurs comprises entre 61 et 65 %
alors que les souches d’Azorhizobium présentent des valeurs élevées de 66 à 68 %. (El-Hilali,
2006).

* Hybridation d’acides nucléiques: de ces hybridations l'hybridation ADN/ADN est la plus

utilisée dans les études de la taxonomie. Elle est utilisée pour la définition d’une espèce
microbienne car actuellement, cette définition repose essentiellement sur le pourcentage
d’hybridation entre l’ADN total des souches bactériennes. Les souches ayant moins de 60%
d’homologie et une valeur de ΔTm (voir chapitre II) supérieure à 7°C n’appartiennent pas à
la même espèce génomique (Maatallah, 2003).
2.3 La Phylogénie des rhizobiums

La comparaison des données obtenues pour les souches ou les espèces par différentes
approches moléculaires permet l’identification de groupes ou de taxons. Les différents taxons
obtenus peuvent alors être comparés et utilisés pour le traçage de lignées de filiation
reconnues communément sous le nom d’arbre phylogénétique (figure 10) (Olsen et al, 1994).

32
Figure 10. Arbre phylogénétique des rhizobiums et d’espèces apparentées construite par la méthode du
Neighbors joining à partir de la séquence complète de l’ADNr 16S (Shamseldin et al, 2016).

33
La séquence de l’ADNr 16S est une base fiable pour la classification des espèces à des
niveaux plus élevés. En effet, les gènes codant pour les ARN ribosomaux (ADNr)
représentent un outil phylogénétique et une référence de la taxonomie moléculaire répondant
aux critères nécessaires à une étude évolutive. Le plus important de ces critères est le fait que
l’ADNr présente une structure particulière avec une succession de domaines dont les vitesses
d’évolution sont très variables (de relativement élevées à presque nulles). Chaque domaine a
son importance pour l’identification moléculaire des microorganismes.

Cependant, cette approche est peu informative aux niveaux souches et individus (Willems et
al, 2001). A ces niveaux, l’hybridation de l’ADN génomique s’avère nécessaire. Il a été
rapporté que la phylogénie établie actuellement pour les Rhizobiaceae ne peut pas refléter la
vraie phylogénie de la famille parce qu’un seul gène (ADNr 16S) ne constitue pas une base
suffisante pour représenter le génome entier (van Berkum et al, 2003). Petes et Hill (1988) ont
rapporté que l’établissement des cartes génétiques ainsi que la reconnaissance des fréquences
de recombinaisons génétiques entre les différentes genres ou espèces de rhizobia pourrait
approfondir la base pour une systématique plus fiable. De nos jours, l’usage de la séquence de
l’ADNr 16S reste l’outil principal dans l’étude de la phylogénie microbienne. Cependant, de
nouvelles techniques moléculaires sont récemment adoptées. Les plus utilisées sont : la
technique FT-IR (Fourier-transfom infrared spectroscopy) qui permet d’étudier la diversité
des bactéries au niveau intraspécifique (Oberreuter et al, 2002), la technique du typage par
PCR ciblé (target PCR fingerprinting) (Perret et Broughton, 1998) et surtout la technique des
puces à ADN communément appelée DNA microarrays. Dans cette dernière technique, la
conception des puces permet de détecter simultanément des milliers de séquences voire même
recouvrir l’intégralité du génome d’un organisme (Shalon et al, 1996). Ainsi le gène de
ménages tel que, le atpD, RecA, gln par la technique MLST qui a permis l'analyse
phylogénétique (Silver, 2006). Récemment, deux nouvelles méthodes ont été utilisées pour
l'étude de la taxonomie des rhizobiums: génomique comparative (Ormeno-Orrillo et al 2015).
Et l'identité nucléotidique moyenne (ANI pour average nucleotide identity) des comparaisons
du génome (Rashid et al 2015). L’ensemble de ces techniques peuvent révéler plus
d’information sur la diversité des rhizobia et peuvent donc fournir plus de données qui seront
disponibles pour l’étude de la phylogénie.

34
CONCLUSION

L’apparition des techniques moléculaires devant la scène a développé les études de

biodiversité, taxonomie et phylogénie microbienne. Ce développement a bien été reflété sur
la classification récente des rhizobiums.

Le développement considérable de ces techniques moléculaires au cours des 20 dernières

années a facilité l'identification de nouvelles espèces de rhizobiums et entraîné des
changements considérables dans la proposition de classification. Actuellement on a environ
238 espèces de rhizobiums réparties en 18 genres.

Les techniques de biologie moléculaire sont actuellement les meilleurs moyens pour
quantifier ces microorganismes. L’ensemble de ces techniques peuvent révéler plus
d’informations sur la diversité des rhizobia et peuvent donc enrichir leur classification et
éclaircir leur évolution.

35
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