Table des matières

Listes figures..........................................................................................................................................3

INTRODUCTION..................................................................................................................................4

I. Généralités.....................................................................................................................................5

1. Définitions..................................................................................................................................5

2. Les enzymes alimentaires...........................................................................................................6

II. Extraction des enzymes.................................................................................................................8

1. Choix de la technique d’extraction :...................................................................................8

2. Techniques d’extraction :...........................................................................................................8

III. Techniques DE PURIFICATION DES ENZYMES.................................................................11

1. Filtration...................................................................................................................................12

 Les filtres membranes (écrans ou de surface)...................................................................14

2. La centrifugation...............................................................................................................14

 La centrifugation différentielle.........................................................................................17

 La centrifugation en gradient de densité...........................................................................18

3. L’électrophorèse.......................................................................................................................19

 Nature de la molécule.......................................................................................................19

 Composition ionique du tampon d’électrophorèse............................................................20

 Support.............................................................................................................................20

 Champ électrique..............................................................................................................20

4. la chromatographie...................................................................................................................22

IV. Cas pratique : extraction de la papAine....................................................................................25

1. Définition.................................................................................................................................25

2. Extraction.........................................................................................................................26

 Méthode de récolte du latex :....................................................................................................26

3. Purification...............................................................................................................................27

Conclusion............................................................................................................................................28

Références bibliographiques.................................................................................................................29

1
 Listes figures
Figure 1 : homogénéisateur de type Potter-Elvehjem.................................................................8
Figure 2 : Appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre .................................................9
Figure 3 : sonicateur....................................................................................................................9
Figure 4 : La membrane millipore............................................................................................13
Figure 5 : L’entonnoir ordinaire...............................................................................................13
Figure 6 : Centrifugeuse............................................................................................................15
Figure 7: Isolement des organites cellulaires...........................................................................17
Figure 8 : Structure chimique du SDS......................................................................................20
Figure 9 : Le Principe de la chromatographie (cours chimie analytique Dr UTZMAN; 1967)
...................................................................................................................................................22
Figure 10:. La colonne chromatographique..............................................................................24
Figure 11 : récolte du latex......................................................................................................25
Figure 12 : latex desséché.........................................................................................................26

2
 INTRODUCTION

Depuis plusieurs millénaires, l'homme utilise des micro-organismes générés

naturellement - bactéries, levures et moisissures -, ainsi que les enzymes qu'ils produisent,
pour confectionner des aliments comme le pain, le fromage, la bière et le vin. De nos jours,
les enzymes ont de plus en plus d'applications - boulangerie-pâtisserie, fabrication de
fromage, transformation de l'amidon et fabrication de jus de fruits et autres boissons - où elles
améliorent la consistance, l'aspect et la valeur nutritive et peuvent produire les goûts et
arômes souhaités.

Les enzymes alimentaires utilisées actuellement proviennent parfois d'animaux et de

plantes ; elle n'est donc pas une enzyme pure, mais bien un extrait plus ou moins purifié, celui
obtenu lors de la fabrication. Quels sont donc les techniques d'extraction et de purification des
enzymes ? Répondre à ces questions reviendra à présenter d'abord les généralités sur les
enzymes ; ensuite, de discuter sur les techniques d’extraction des enzymes et enfin de donner
l'intérêt et les indices de purification d'une enzyme, les techniques utilisées.

3
 1. Généralités

2. Définitions
Les enzymes sont des protéines (Matériaux-protéines) qui assurent la catalyse biologique.
Elles accélèrent les réactions chimiques sans être elle-même modifiée.

Une enzyme est une protéine qui transforme des substrats en des produits (acte de catalyse)
dans un temps déterminé. On dit qu'elle catalyse une réaction chimique. Elle peut être le
catalyseur d'une réaction anabolique, au cours de laquelle une substance est construite, d'une
réaction catabolique lorsque le substrat est détruit, ou d'une réaction métabolique au cours de
laquelle le substrat est modifié.

 Quels sont les différents types d'enzyme ?

Il existe deux catégories d'enzymes : les enzymes digestives qui permettent de déstructurer
l'alimentation en nutriments assimilables par les cellules et les enzymes métaboliques
indispensables au fonctionnement de chacune des 10 000 milliards de cellules connectées
composant notre organisme

 Comment est-elle synthétisée ?

Les enzymes sont des bio molécules, c'est-à-dire des molécules synthétisées par les êtres
vivants. Les enzymes digestives sont synthétisées par le foie et le pancréas mais elles sont
aussi apportées par l'alimentation. Les autres enzymes sont produites par chacune des cellules
de l'organisme suivant leurs besoins.

 Fonctions des enzymes

Les enzymes sont des molécules de protéines présentes dans tout ce qui est vivant. Elles ont
pour mission d'accélérer et orienter les réactions chimiques, augmentant dans de nombreux
cas la vitesse de réaction de plusieurs millions de fois. Il existe un grand nombre d'enzymes
spécifiques qui jouent un rôle important dans les processus physiologiques (digestion,
conduction nerveuse, synthèse d'hormones, etc.). Elles favorisent par exemple la digestion,
métabolisent et éliminent les déchets chez l’homme et l’animal et jouent un rôle fondamental
dans la contraction musculaire.

On peut toutefois classer les enzymes en six catégories suivant la réaction biochimique
qu'elles réalisent :
4
  Les oxydoréductases, qui catalysent des réactions d'oxydoréduction (comme la
peroxydase) ;
 Les transférases, qui transfèrent un groupement fonctionnel d'une molécule à l'autre
(comme les méthyltransférases qui transfèrent un groupement méthyle) ;
 Les hydrolases, qui hydrolysent des liaisons chimiques (comme les nucléases qui
coupent l'ADN ou l'ARN) ;
 Les lyases, qui rompent des liaisons mais en produisent de nouvelles simultanément
(comme l'adénylate cyclase qui produit l'AMP cyclique à partir d'ATP) ;
 Les isomérases, qui réarrangent les groupements fonctionnels d'une molécule pour
former des isomères (comme les topoisomérases qui enroulent l'ADN) ;
 Les ligases ou synthétases, qui permettent la jonction de deux molécules (comme les
ADN ligases).

Seuls les substrats et les produits varient d'une enzyme à l'autre.

3. Les enzymes alimentaires

Une enzyme alimentaire est un produit obtenu à partir de plantes, d'animaux ou de micro-
organismes, qui contient une ou plusieurs enzymes capables de catalyser une réaction
biochimique spécifique, et qui est ajouté à des denrées alimentaires à des fins technologiques
à toute étape de leur fabrication, transformation, préparation, traitement, conditionnement,
transport ou entreposage.

a) Sources d'enzymes alimentaires

 Plantes : Certaines enzymes sont extraites de plantes, par exemple la papaïne extraite
de l'écorce de la papaye encore verte.
 Animaux : Certaines enzymes sont d'origine animale : la présure, par exemple, qui
sert à la fabrication du fromage, peut être extraite de l'estomac des veaux.
 Source microbienne : Certaines enzymes alimentaires peuvent être produites dans un
fermenteur (cuve) où sont cultivées des bactéries, des levures ou des moisissures
productrices d'enzymes, après quoi un processus de filtration permet de séparer les
enzymes alimentaires des micro-organismes.
 GMM : À l'heure actuelle, de nombreuses enzymes sont produites dans un fermenteur
à l'aide de micro-organismes génétiquement modifiés (GMM en anglais). On peut

5
 ainsi améliorer la production et/ou la qualité des enzymes alimentaires. Les micro-
organismes génétiquement modifiés et leur ADN sont enlevés de l'extrait.

L'enzyme alimentaire contient, outre l'enzyme ou les enzymes, encore d'autres substances
produites par la source, ainsi que des résidus de substances qui ont été utilisées lors de la
fabrication, par exemple des restes d'antimoussants.

L'enzyme alimentaire n'est donc pas une enzyme pure, mais bien un extrait plus ou moins
purifié, celui obtenu lors de la fabrication.

b) Avantages des enzymes alimentaires

Dans la fabrication des produits alimentaires, les enzymes présentent un certain nombre
d'avantages

 Dans de nombreux procédés de fabrication, elles remplacent avantageusement les

produits chimiques de synthèse, permettant ainsi de faire de réels progrès dans la
réduction des déchets émanant de ces procédés, grâce à la biodégradabilité et à une
moindre consommation d’énergie ;
 Étant donné qu'elles ont une action plus spécifique que les produits chimiques de
synthèse, les procédés qui les utilisent ont moins de réactions secondaires et de sous-
produits résiduaires, et donnent des produits de meilleure qualité tout en diminuant la
probabilité de pollution ;
 Elles permettent d'exécuter certains procédés qui, sans elles, seraient impossibles.
Ainsi, c'est une enzyme, la pectinase, qui permet de fabriquer du concentré de jus de
pomme parfaitement limpide.

4. Extraction des enzymes

L’extraction désigne l’action de séparer une enzyme d’un composé dont elle fait partie.
Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de la
membrane cellulaire (BRISSET, 2005).
L’extraction est spécifique aux enzymes intracellulaires, Lorsque l’enzyme est extracellulaire,
elle est libérée dans le milieu extérieur, donc on n’aura pas besoin de passer par l’étape
d’extraction (BRISSET, 2005).

6
 1. Choix de la technique d’extraction :
Plusieurs choix s’offrent pour l’extraction des enzymes. Ce choix se fait en fonction de :

 Type de cellule utilisée ;

 La localisation de l’enzyme ;
 Les conditions de purification de notre enzyme ;
 L’équipement disponible ;

2. Techniques d’extraction :
On distingue les techniques d’extraction :
 Physique,
 Mécanique,
 Chimique,
 Enzymatique


a) Techniques d’extraction physiques :

 Choc osmotique :
Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum dommage,
les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre
osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane
plasmique (LEBLANC, 2013).
L’éclatement des organites est l’inconvénient de cette technique.

La lyse des noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation
de la viscosité de la solution : c'est la chromatine libérée. (LEBLANC, 2013).

b) Techniques d’extraction mécanique :

 Congélation- décongélation
Suite à un refroidissement brusque et à la concentration du soluté intra et
extracellulaire, la formation de cristaux intra et extracellulaire entraine des cassures dans la
cellule. (LAURENT, 1982).

7
  Broyage ou agitation avec des abrasifs
L’agitation violent en présence de microbilles de verre désintègre les microorganismes
avec rupture de la paroi (LAURENT, 1982).

 Bombe à disruption
Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de
l’azote à haut pression. La pression force l’azote à se mobiliser dans le liquide. On libère alors
la pression tout d’un coup ; l’azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulls à
l’intérieur des cellules et les faits éclater (LEBLANC, 2013).

 Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem

Elle est considérée comme une technique douce et est généralement employée pour
l’homogénéisation des tissus mous tels que les tissus animaux.
L’homogénéisateur de type Potter-Elvehjem est un équipement simple ayant un pilon sous
forme de tige de verre avec des dents sur son bout. La manipulation du pilon se fait
manuellement ou par dispositif mécanique (KUMAR et GARG, 2006).

Figure 1 : homogénéisateur de type Potter-Elvehjem

 Les billes de verre

L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blinder, à ceci près qu’il est
beaucoup plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petits
bills en verre sur lesquels on verse la suspension de cellules. La suspension se réparti entre les
billes. Il est important de remplir complétement le contenant et de ne pas y laisser d’air pour
éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on lance la
machine, qui fait furieusement tourbillonner les billes de verre dont l’action abrasive fait
dégrader les cellules (LEBLANC, 2013).

8
 Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que
l’agitation cesse. On doit prendre soin de garder le tout au frais ; le contenant est souvent
muni d’une chambre ou on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet
beaucoup de chaleur (LEBLANC, 2013).

Figure 2 : Appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre (LEBLANC, 2013).

 Sonication
Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Une tige de métal du "sonicateur"
à l’extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules.

Figure 3 : sonicateur

c) Techniques d’extraction chimique :

Cette technique est l’un des plus utilisées en industrie, consiste à mélanger le produit
en solution aqueuse avec un petit volume de solvant organique dans lequel il est très soluble.
On agite ensuite vigoureusement le mélange pour permettre au produit de se déplacer de la
phase aqueuse vers la phase organique, puis on récupère celle-ci. Le choix du solvant est
déterminant dans l’efficacité de l’extraction. Il repose sur plusieurs critères (TESSIER,
2007) :

 La solubilité du produit dans la phase organique par rapport à la phase aqueuse ;

9
  La stabilité du produit dans la phase organique ;
 La sélectivité du solvant.

Après l’extraction, les phases sont séparées sont séparées dans le cas des protéines qui ne
sont pas solubles ou sont déstabilisées dans des solvants organiques, on peut les extraire
en créant deux ou plusieurs phases aqueuses séparables à l’aide de polymères hydrophiles
comme le polyéthylèneglyçol (PEG) et le dextrane (TESSIER, 2007).

d) Techniques d’extraction enzymatique :

Enzymes lytiques : avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la
paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique. Pour ceci les enzymes lytiques comme
les cellulases, pectinases… peuvent être employées pour rompre les parois de ces cellules
(KUMAR et GARG, 2006).

5. Techniques DE PURIFICATION DES ENZYMES

Pour étudier une protéine (enzyme) en détail, il faut la séparer des autres protéines
cellulaires. Les cellules contiennent des milliers de protéines différentes, la préparation à
l'état pure d'une protéine est essentielle avant que ses propriétés, sa composition en acides
aminés et sa séquence puissent être déterminées. La question qui se pose ici est celle de
savoir comment une protéine (enzyme) peut-elle être purifiée ?

En chime, la purification est la séparation de substances critiques dans le but de container des
substances. Il existe plusieurs moyens de purification:

 La filtration.
 La centrifugation.
 La chromatographie.
 L’électrophorèse...

1. Filtration
La filtration est une méthode mécanique utilisée pour séparer un solide d’un liquide ou
d’un gaz en faisant passer le mélange par une membrane ou un chiffon fin, par l’aide d’un
entonnoir.

10
La filtration est un procédé de séparation permettant de séparer les constituants d’un mélange
qui possède une phase liquide et une phase solide au travers d’un milieu poreux. C’est une
technique très utilisée que ce soit dans le domaine de l’agro-alimentaire ou de la pharmacie ou
par de nombreuses espèces animales, principalement aquatique. L’utilisation d’un filtre
permet de retenir les particules du mélange hétérogène qui sont plus grosses que les trous du
filtre (porosité). Le liquide ayant subi la filtration se nomme filtrat, et ce que le filtre retient se
nomme un résidu (aussi communément appelé "gâteau" ou rétentat).

La microfiltration est une séparation de particules de l’ordre de micromètre.

La filtration stérilisante est un cas particulier, les particules étant des

microorganismes.

Les applications de la filtration courante résultent de la séparation d’un solide dispersé dans
un liquide pour obtenir:

 Un liquide clarifié, débarrassé des particules solides.

 Un solide essoré de l’excès de liquide.

a) Principe de la filtration
La filtration est une séparation selon le diamètre des particules solides de différentes
tailles, qui sont dispersées dans un liquide. La différence de pression force le liquide à passer
à travers le filtre alors que les particules solides restent à la surface.
Deux phénomènes accompagnent souvent la filtration:

 Le colmatage: La pénétration des particules dans les interstices [petits espaces vides
entre les parties du filtre] de la matière filtrante provoque le phénomène du colmatage.
Ceci modifie la porosité et ralentie la filtration.
 L’adsorption: Il résulte de la charge électrique qui possède la matière filtrante. Ceci
induit la rétention de certains produits par le filtre malgré que leurs dimensions
permettent leur passage à travers les pores du filtre.

b) Matériel de filtration
Le matériel de filtration regroupe les filtres et les entonnoirs.

11
 (1) Les filtres
Il existe deux types de filtre, les filtres d’épaisseur et les filtres membranes.
L’utilisation de l’un de ces deux types dépend du but de l’expérience, de la qualité et la
quantité du matériel à filtrer. Ils peuvent être utilisés séparément ou ensemble, selon les
besoins. Les filtres doivent être inerte chimiquement et physiquement vis-à-vis du liquide à
filtrer; insolubles et ne subissent aucun changement d’état physique (gonflement,
rétrécissement, distorsion).
 Les filtres d’épaisseur (épais ou en profondeur)
Ils retiennent les particules dans un réseau de fibres (papier, amiante, cellulose,
coton, fibre de verre, etc.) ou de canalicules (verre fritté, sable, charbon, etc.). L’efficacité
d’un filtre en profondeur augmente avec son épaisseur par contre elle diminue lorsque la
pression appliquée sur le filtre augmente. Les matériaux utilisés dans les filtres d’épaisseur
sont:
 Les papiers filtres classiques, qui diffèrent par leur formes (en feuilles
rectangulaires, circulaires, plissées, etc.), leur texture (lâche, fine), leur
porosité, leur pureté (brut, purifié, sans cendre, etc.). Il existe des papiers filtre
sans cendres, déminéralisés par lavage aux acides, d’une très grande pureté et
qui, après combustion, n’ajoutent aucun élément étranger au précipité. Il
existe un code de couleur ou de numérotation définissant la porosité du
papier.
 Les textiles: gaze, coton, laine.
 Les fibres: laine de verre, amiante.
 Les terres d’infusoires, argiles et porcelaine.
 Le matériel fritté: le verre fritté est obtenu par compression à température
contrôlée de microbilles de verre. Des porosités différentes sont obtenues
selon le diamètre de ces grains et la température de frittage. Les porosités sont
codées de 0 (larges pores) à 4 (pores étroits).

 Les filtres membranes (écrans ou de surface)

Les plus utilisés sont les membranes millipores (Fig. 1). Ils sont constitués d’une fine
lame plastique percée de pores calibrés. Les membranes filtrantes sont constituées de
cellulose, d’acétate de cellulose, de nitrate de cellulose ou de téflon. Le diamètre des pores
est faible, et varie de 5 à 35 nm pour l’ultra-filtration et de 0.1 à 8 µm pour la
microfiltration.

12
 Les membranes de la microfiltration permettent une filtration rapide, malgré le faible
diamètre des pores, cela est dû à leur faible épaisseur et à la forte densité des pores (10 10
pores/cm2). Ces membranes ne sont constituées que par 15 à 35% de leur volume par de la
matière, le reste étant occupé par des pores.

Figure 4 : La membrane millipore.

(2) Les entonnoirs

Ce sont des instruments en forme de cône, terminés par un tube et destinés à recevoir
un matériel filtrant. Deux types d’entonnoirs sont distingués:
 Les entonnoirs ordinaires: peuvent être en verre, en porcelaine ou en
polycarbonate (Fig. 5).

Figure 5 : L’entonnoir ordinaire.

2. La centrifugation
La sédimentation est une technique d’analyse permettant de séparer une dispersion
d’un solide au sein d’un liquide ou une dispersion d’un liquide au sein d’un autre liquide
non miscible et de densité différente. Cette séparation peut se faire d’elle-même sous
l’action de la pesanteur lorsque la dispersion est formée d’une substance plus dense que le
liquide (décantation). La centrifugation permet de remplacer l’accélération de la pesanteur
(g) par une accélération centrifuge développée par un rotor tournant à grande vitesse (6 à
10000 tours par minute).
La centrifugation est une technique qui permet la séparation des composés d’un
mélange en fonction de leur densité sous l’action d’une force centrifuge. Elle permet de

13
récupérer un précipité (culot) et un surnageant. Le mélange à séparer peut être constitué de
deux phases liquides ou de particules solides en suspension dans un liquide.
L’ultracentrifugation utilise des vitesses de rotation encore plus grandes (allant jusqu’à
75000 tours par minute) et permet la sédimentation de particules ultramicroscopiques.

a) Principe de la centrifugation
La centrifugation permet de séparer des constituants de taille et de masse très
différentes contenus dans un liquide. Les constituants contenus dans un échantillon sont
soumis à deux forces:
 La gravité: C’est la force qui s’exerce du haut vers le bas.

 La poussée d’Archimède: C’est la force qui s’exerce du bas vers le haut.

Pour une vitesse de rotation donnée, chaque rotor a une force relative de centrifugation en
x.g (force de gravité relative ou accélération) qui peut être exprimée en vitesse de rotation
en rotations par minute selon la formule mathématique de conversion. Celle-ci est:
g = 1.119 • 10-5 • r • N2

où g est la force relative de centrifugation, r est le rayon de rotation du rotor (en cm) et N
(rotations par minute: rpm) exprime la vitesse de rotation.

b) Matériel de centrifugation
La centrifugeuse est l’appareil utilisé pour la centrifugation. La centrifugeuse est
constituée d’un axe de rotation enfermé dans une chambre de centrifugation. A l’exception
des centrifugeuses de paillasse dont la vitesse de rotation et le temps d’utilisation sont
relativement limités, il est nécessaire d’empêcher l’échauffement des échantillons. Pour
cela, la chambre de la centrifugeuse doit être réfrigérée (Fig. 6).
Les échantillons à centrifuger doivent être équilibrés deux à deux. Chaque couple doit être
placé symétriquement par rapport à l’axe de rotation.

14
Figure 6 : Centrifugeuse.

c) Type de centrifugeuses
La force du moteur qui le fait tourner constitue la principale limite qui détermine la
vitesse de rotation du rotor. Plus, le rotor est lourd et volumineux, plus l’effort que doit
fournir le moteur est grand. Selon les besoins expérimentaux (accélérations, volume du
matériel à centrifuger, la température de travail), plusieurs types de centrifugeuse ont été
développés.
 Centrifugeuses de table (ou cliniques): Constituent les modèles les plus simples et
sont caractérisées par de faibles accélérations (1000 à 3000 g). Elles peuvent être
réfrigérées.
 Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes et caractérisés par
des accélérations de l’ordre de 20000 g. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger
des volumes relativement gros. Certains rotors peuvent même contenir quatre ou six
bouteilles de 250 ml. Tous les modèles sont réfrigérés.
 Ultracentrifugeuses: Comme leur nom indique, ce sont des appareils qui permettent
d’atteindre des accélérations très élevées (jusqu’à 300000 g). Tous les modèles sont
réfrigérés. Les rotors ne peuvent contenir qu’une dizaine de tubes de 40 ml.
 Micro-centrifugeuses: Ce sont des centrifugeuses spécialement conçues pour les
microvolumes. Elles peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l’ordre de
12 à 15000 g.
 Ultracentrifugeuses analytiques: Elles servent surtout à analyser la taille et la masse
des particules et des protéines. Elles sont moins utilisées.

Selon l’axe de rotation, il existe trois catégories de machines à centrifuger:

 Les centrifugeuses horizontales: Sont ainsi nommées car les pots sont horizontaux en
rotation. Des tubes à centrifuger à fond conique sont utilisés pour clarifier un liquide
(pour récupérer le liquide surnageant et rejeter le culot). Alors que les tubes à fond rond

15
 sont utilisés pour récupérer le culot. Ce type de centrifugeuse présente quelques
inconvénients: mauvais aérodynamisme du rotor et, de plus, les particules qui
sédimentent doivent traverser une grande épaisseur de liquide
 Les centrifugeuses verticales: Sont des centrifugeuses avec un bol à assiettes ou à
chambre qui tourne sur un axe vertical.
 Les centrifugeuses obliques: Dans ce type de centrifugeuses, les tubes sont logés dans
un rotor circulaire appelé couronne dans lequel ils sont inclinés à 45°. A l’inverse de
centrifugeuses horizontales, ce type de centrifugeuses présente un bon aérodynamisme
permettant d’atteindre des vitesses élevées. De plus, les particules n’effectuent qu’un
court parcours au sein d’un liquide, elles migrent horizontalement, atteignent la paroi et
glissent le long de celle-ci. Ceci favorise la sédimentation.

d) Types de centrifugation
Il existe deux principaux types de centrifugation.

 La centrifugation différentielle
Elle se base sur les différences de vitesse de sédimentation entre particules qui
diffèrent par densité et dimensions. Le principe de ce type de centrifugation est de séparer
les différents constituants à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération
croissante. Dans une centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont
sédimenter et former un culot au fond du tube. Les éléments dont l’accélération est trop
faible pour contrebalancer les effets de l’agitation moléculaire, ou le temps de centrifugation
est trop court vont rester dans le surnageant. Cette méthode est utilisée, par exemple, pour
récupérer les éléments (les cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très
faibles.
Exemple: Isolement des organites cellulaires. Tout d’abord au cours d’une première
centrifugation, les constituants les plus lourds sont isolés. Puis, en augmentant la vitesse de
sédimentation les constituants de densité croissante seront séparés

16
Figure 7: Isolement des organites cellulaires.

 La centrifugation en gradient de densité

Dans cette méthode, les particules sédimentent au sein d’un gradient de densité. A
l’équilibre, elles se stabilisent dans la zone du gradient où la densité est gale à

la siennes. La différence entre la densité de la particule et celle du solvant constitue l’un des
facteurs qui influence la vitesse de sédimentation. Cette dernière peut être modulée en
faisant varier cette différence de densité par la création d’un gradient de densité.
 Si la densité de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sédimentera.
Plus la différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide.
 S’il n’y a aucune différence de densité, il n’y aura aucune sédimentation, quelle
que soit l’accélération.
 Si la particule est moins dense que le milieu, celle-ci s’élèvera dans le tube
jusqu’à atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou, le cas échéant, jusqu’à
flotter à la surface.
Pour obtenir des solutions de densités différentes, deux gradients peuvent être utilisés, un
gradient de saccharose formé préalablement à la centrifugation, et un gradient de chlorure
de césium (CsCl).
Il existe deux types de gradients: le gradiant continu et le gradiant discontinu

17
 6. L’électrophorèse
C’est une des nombreuses techniques de séparation et d’analyse de particules
chargées par migration différentielles sous l’action d’un champ électrique.
Des particules chargées sont donc placées dans un champ électrique créé par une tension
continue et se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge à une vitesse
proportionnelle à cette charge. Si on dépose une espèce anionique (chargée négativement),
elle migrera vers l’anode (+) et une espèce cationique (chargée positivement) du côté de la
cathode (-).

A) Principe
L’électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant
perdu leur neutralité électrique) sous l’effet d’un champ électrique. Ceux-ci migrent vers
leur électrode respective: Les anions migrent vers l’anode et les cations migrent vers la
cathode. Pour les molécules non chargées, il n’existe pas de migration. Du fait de leurs
caractéristiques propres et des conditions de l’électrophorèse, la vitesse de migration et la
distance parcourue dans la matrice par ces ions diffèrent, ce qui permet leur séparation.

B) Facteurs influençant la mobilité électrophorétique

Plusieurs facteurs peuvent influencer la mobilité électrophorétique.

 Nature de la molécule

La taille et la charge de la molécule influencent le processus électrophorétique. En effet, les

petites molécules migrent facilement mais leur mobilité dépend des autres substances
dissoutes susceptibles de les solvater et de diminuer leur vitesse. De même, la charge des
molécules influence directement leur mobilité. La charge est fonction du pH pour les
molécules ionisables, de la force ionique et de la formation éventuelle de complexes. Le
signe de la charge détermine le sens de migration et sa vitesse.

 Composition ionique du tampon d’électrophorèse

La présence d’ions étant nécessaire au passage du courant, un compromis est obtenu

avec une force ionique comprise entre 0.05 et 1 mol/l. Le pH influe sur l’ionisation des acides
faibles et bases faibles, pour lesquels il s’avère nécessaire de

18
travailler dans un milieu tamponné. A pH et force ionique identiques, deux tampons de
nature différente ne produisent pas toujours des mobilités électrophorétiques identiques.
Certaines substances ajoutées au tampon de migration modifient aussi les comportements
électrophorétiques. Ainsi:
 La présence d’EDTA ou d’acide citrique favorise par complexation la séparation de
certains ions minéraux.
 Les ions boratés forment avec les sucres des complexes chargés rendant ainsi possible
leur séparation.
 L’addition d’urée modifie le comportement électrophorétique des macromolécules par
rupture de liaisons hydrogène.

 Support

Certains supports possèdent des propriétés adsorbantes et peuvent fixer les molécules de
solvants ou de solutés. Il en résulte un ralentissement de la migration entrainant un
élargissement des zones sur l’électrophorégramme. Ces propriétés adsorbantes sont liées à
la présence de certains groupements fonctionnels comme les hydroxyles.

 Champ électrique

Il représente la chute de potentiel par unité de longueur entre deux électrodes séparées par
une distance. Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le
support de ce champ est constitué par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant
d’un pôle à un autre. Ce support peut être liquide: on parle alors d’électrophorèse en veine
liquide. Dans une large majorité des cas, on utilise un support poreux stabilisant la phase
liquide: on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones. Le
mélange à séparer est déposé sur un support poreux imprégné de tampon. Ce support peut
être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose, du polyacrylamide, etc. Le
support doit être homogène et inerte. Les particules à séparer peuvent être de nature et de
taille très différentes: des composés organiques ou minéraux, de la taille d’une cellule ou de
celle d’un ion. Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des acides nucléiques, des
petits peptides ou des protéines.

C) Types d’électrophorèse
L’électrophorèse peut être en des conditions non dénaturantes ou en des conditions
dénaturantes (SDS-PAGE).

19
 (1) Electrophorèse en des conditions non dénaturantes
Les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif.
La vitesse de migration dépend de la charge native de la molécule et de sa structure
tridimensionnelle.
(2) Electrophorèse en des conditions dénaturantes
Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant avant la séparation
électrophorétique, détruisant la structure tridimensionnelle native. La séparation est donc en
fonction de la masse moléculaire. Les agents de dénaturation sont le SDS (Sodium Dodécyl
Sulfate) et le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des protéines. Le SDS (Fig.
8) est un dénaturant doux et un surfactant, il agit sur les protéines de plusieurs façons: - Si la
protéine est oligomérique, ses sous unités sont séparées les unes des autres.
- Il se fixe sur les protéines, les tapissant de charge négative . Les protéines transformées
en manopolyanions, possèdent toutes la même mobilité électrophorétique. La charge
négative globale permet la migration vers l’anode, mais les molécules sont séparées
uniquement en fonction de leur masse moléculaire.

Figure 8 : Structure chimique du SDS.

(3) Electrophorèse en veine liquide (électrophorèse libre)

Il s’agit de la première méthode élecrophorétique décrite. La solution échantillon est
placée dans un tube en U et recouverte d’une solution tampon de densité plus faible que
celle de l’échantillon pour éviter les courants de convection. Les électrodes sont placées
dans le tube où l’on applique le champ électrique. La migration dans ce cas s’effectue au
sein d’un liquide constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenable
dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce type de d’électrophorèse
présente de multiples inconvénients

20
(Appareillage couteux, mise en œuvre longue et délicate, séparation incomplète des
particules).

D) Les avantages et inconvenients de l'electrophoreses

Si l'electrophorèse dite "libre" en veine liquide, permet une bonne determination des
mobilités electrophoretiques, elle presente par contre certains inconvénients: non seulement
elle nécéssite un appareillage couteux, une mise en oeuvre longue et deéicate, mais encore
elle ne permet pas de distinguer, d'isoler ni de caracteriser les fractions proteiques autrement
que par leur mobilité. C'est pourquoi a partir de 1950, on a proposé différents supports qui
permettent d'effectuer une électrophorèse de zone sur un support dite "stabilisateur" le papier-
filtre, le gel d'agar ou encore l'acetate de cellulose.

7. la chromatographie
La chromatographie est une méthode destinée à séparer les constituants d’un mélange
(ou soluté) en les distribuant entre deux phases: une phase stationnaire et une phase mobile
non miscibles. Le système chromatographique est l'ensemble (PS, PM, solutés)
La chromatographie est une méthode d'analyse physico-chimique, destinée à séparer les
constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile
liquide ou gazeuse (PM) le long d'une phase stationnaire solide ou liquide fixé(PS), grâce à
la (ré)partition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à
une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la
phase mobile.

A) Principe général
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux
phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile (gaz ou liquide) qui se déplace.
La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange. Ces
derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps proportionnels à leurs propriétés
intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...).

21
Figure 9 : Le Principe de la chromatographie (cours chimie analytique Dr UTZMAN; 1967)

B) Terminologie générale de la chromatographie

Soluté: toute substance, constituant d’un mélange, séparée par chromatographie.
Phase mobile PM: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté.
Phase stationnaire PS: le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va permettre leur
séparation quand la phase mobile les déplace.
Support: Un substrat inerte qui porte la phase stationnaire.

Colonne chromatographique: tube de diamètre et longueur variable, en verre, métal

ou autre substance, à l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.
* Valeurs de rétention: toutes données qui permettent de chiffrer l’action spécifique
de la PS sur le soluté, au cours de l’analyse (temps de rétention, volume de rétention…).
Chromatogramme: l’ensemble des réponses successives du détecteur, au cours de
l’élution des solutés hors de la colonne.

C) Types de chromatographie
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase
stationnaire en:

(1) Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice)

C’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange par migration dans
un dispositif constitué de deux phases:
 La phase stationnaire: support solide.

22
  La phase mobile: le solvant.

La vitesse de déplacement des composés dans la colonne dépend de:

 L’affinité à la phase stationnaire: plus, l’affinité à la phase stationnaire est grande, plus
le déplacement des composés dans la colonne est très lent.
 La solubilité dans la phase mobile (plus le composé est très soluble dans la phase
mobile, plus son déplacement dans la colonne est très vite).
Le choix du type de chromatographie et du support dépend de la nature des composés à
séparer

(2) Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,

chromatographie sur papier).
Elles peuvent être classées aussi selon la nature de la phase mobile en:
 Chromatographie en phase gazeuse (CPG).
 Chromatographie en phase liquide (CPL):
a. Chromatographie sur couche mince (CCM).

b. Chromatographie de partage centrifuge (CPC).

c. Chromatographie liquide haute pression (ou performance) (HPLC).

Suivant le type de chromatographie, elle peut servir à identifier (CCM, HPLC, CPG), à
séparer ou à purifier les composés d’une réaction (chromatographie sur colonne, HPLC).
Cette technique peut également, grâce à un témoin, permettre de quantifier un produit (CPG,
HPLC).
Le choix de l’une ou l’autre de ces techniques dépend de la nature des composés à séparer et
en fonction de celle-ci, le choix de l’adsorbant utilisé

Figure 10:. La colonne chromatographique.

23
 D) les inconvenients de la chromatographie
la chromatographie couche mince (CCM) nécéssite plus de temps que les autres techniques de
purification, les analyses doivent etres realysées forcement par un chimiste, un pharmatien ou
un laborantin;
 Elle ne donne pas des renseignements sur la concentration des produits psychotropes
detectés, elle a une faible sensibilité por certains composés et certains ne peuvent
meme pas etre détectées car ils sont adsorbés de manière irreversible.
 Bien qu'il soit facile d'utiliser les méthodes HPLC existantes, il peut etre complexe de
resoudre les problemes ou de développer des nouvelles methodes. Ceci est dù en
grande partie a la diversité des modules, des colonnes et des phases mobiles;
 En révanche, la HPLC est polyvalente et extremement precise lorsqu'il sagit
d'identifier et de qualifier les composants chimiques

8. Cas pratique : extraction de la papAine

1. Définition
Enzyme extraite du latex de papayer (Du suc de papayer) utilisée notamment dans
l'industrie alimentaire, comme attendrisseur chimique de la viande et dans la préparation des
céréales précuites (d'apr. Clém. Alim. 1978) ; employé également en médecine, pour le
traitement des hématomes et des inflammations localisées, et pour fluidifier les sécrétions des
voies respiratoires`` (Méd. Biol. t.3 1972). 1.1

Description du fruit : La papaye est une baie [1] ovoïde ou arrondie, de 21 à 31 cm

de long, dont la pulpe est comestible. Elle pèse environ 1 kg (et parfois jusqu'à 5 kg). Elle
renferme de nombreuses graines noires entourées d'un mucilage. À maturité, les papayes sont
vert jaunâtre, et leur chair juteuse est jaune orangé et peut être d'une autre couleur.

2. Extraction
L'extraction serait possible aussi bien à partir des feuilles, tronc, pétioles que des fruits
Cependant seul les fruits sont utilisés car la purification du latex est beaucoup plus facile et le
produit obtenu est meilleur. La récolte se fait par scarification des fruits.

24
 Méthode de récolte du latex :
Pour réaliser les saignées, on utilise le plus souvent une laine de rasoir enfoncée dans un
bouchon de façon que le tranchant dépasse seulement de 1,5 mm ce qui donne une certitude
quant à la profondeur de l 'incision. On peut aussi utiliser des instruments en os, en
aluminium, en acier inoxydable, en ivoire, en verre ou en bambou. Ils doivent être adaptables
à un long manche pour éviter l 'utilisation d’échelles.
Les canaux laticifères étant coupés, le latex s'écoule et peut être recueilli à la base du
fruit dans des récipients appelés « parasols » composés de deux lattes de bois faisant un angle
d'ouverture variable. Lorsque le latex ne coule plus, il râcle le produit coagulé sur la toile et le
met dans une boite. Le latex solidifié sur le fruit ne sera récolté qu’ensuite à part, car il est de
qualité inférieure.

Figure 11 : récolte du latex

 SECHAGE DU LATEX : La dessication du latex doit être faite le plus rapidement

possible après la récolte car le contact prolongé avec l'air entraîne une perte importante de
l 'activité protéolytique du produit.
Avant tout traitement, il est nécessaire de tamiser le coagulant afin d'éliminer les impuretés
inévitables. Un tamis à mailles de 3-4 nun est le mieux (il ne doit pas être en fer).

Les modalités de séchage ont une influence considérable sur l ' activité du produit fini. Pour
bien se conserver le latex doit être desséché (perte des 4/5 de son poids : Figure 12).

 Au soleil,
 Par four à air chaud,
 Sous vide.

Figure 12 : latex desséché

25
3. Purification.
Des techniques diverses (une trentaine d ' après KILMER) ont été utilisées pour
éliminer les composants non protéolytiques du latex séché. L'enzyme constituerait, d’après
BALLS et col., la moitié des protéines totales du latex. Pour purifier le principe actif, le latex
sec est dilué dans l'eau (à saturation) puis précipité par l’alcool (2 volumes, alcool à 95 °à
froid. Au bout de 24 11, le précipité blanc est filtré et séché sous vide. La précipitation peut
être provoquée aussi par l'adjonction de divers produits : sels minéraux, acétate. KILMER a
amélioré la méthode en traitant le latex sec successivement par l'éther, le chloroforme, le
benzène et l’alcool. Le produit est une poudre fine, blanchâtre, amorphe, presque
complètement soluble dans l 'eau et plus active que celle obtenue par les méthodes anciennes.

26
 Conclusion

Parvenus au terme de notre travail ou il était question de présenter les techniques

d'extraction et de purification des enzymes, il en ressort que les enzymes sont des molécules
de protéines présentes dans tout ce qui est vivant. Les enzymes sont considérées non toxiques
et ne représentant pas de problème en matière de sécurité pour les consommateurs car elles
sont naturellement présentes dans des ingrédients utilisés pour produire des aliments.
Cependant, le développement de nouvelles méthodes de production plus performantes et
l’utilisation de nouvelles sources d’enzymes on conduit à des enzymes dites complexe
remettrai en cause les risques associés au enzymes alimentaire.

9.

27
 Références bibliographiques
1. BRISSET J_ (2005). Chimie analytique en solution principes et applications.
Lavoisier Paris. (
2. KUMAR A et GARG N. (2006. Enzymology : enzyme purification School of
biotechnology Devi Ahilya University. (P).
3. LAURENT J. (1982). Les enzymes production et utilisation industrielles. Gauthier
Vilars. France. (P).
4. LeBlanc B. (2013). Cours de biochimie des protéines. Université de Sherbrooke.
5. TESSIER L. (2007). Technologies des bioprocédés industriels. CCDMD. Québec.

28