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    Analyse Microbiologique de L'eau

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    FILIERE : SCIENCES DE LA VIE

    PARCOURS 2 : BIOLOGIE APPLIQUEE ET ENVIRONNEMENT

    Module : Microbiologie Appliquée

    Partie V- Méthodes de dénombrement des


    bactéries indicatrices de la pollution fécale
    (Filtration)
    PR. R MIMOUNI
    FACULTÉ DES SCIENCES AGADIR
    2012/2013
    1

    METHODES

    y Méthodes: deux principales méthodes existent :

    y la méthode du nombre le plus probable en utilisant


    des milieux liquides (NPP)

    y la méthode de filtration sur membrane en utilisant


    des milieux solides.

    2
    Méthode de filtration : concentration
    y La méthode de filtration sur membrane en utilisant des milieux solides
    y Permet l’élimination des substances qui inhibent la croissance microbienne
    y Concentre l’échantillon et permet de tester de petits comme de grand volumes

    Unité de filtration
    1 poste

    Entonnoir  Support pour 
    membrane

    Fiole à vide
    Rampe de filtration à 3 postes 

    Pompe à vide

    Méthodes (filtration)

    Entonnoir

    Bactéries 
    Membrane de filtration

    Sens de 
    passage 
    de l’eau

    Fiole à vide

    Pore de la membrane: 
    0,45 µm
    Déroulement de la manipulation
    Désinfectant 
    1- Désinfecter le poste
    de travail

    2- Stériliser la rampe de
    Filtration (entonnoir, grille et couvercle)

    Essuyer avec 
    un torchant
    propre 

    Déroulement de la manipulation

    Pince à bouts courbés et plats Quadrillage La face quadrillée en haut 

    5- Déposer
    3- Stériliser 4- Retirer une
    la membrane
    les bouts membrane
    sur une grille
    de la pince quadrillée
    stérilisée par
    stérile
    flambage
    Déroulement de la manipulation

    7- Ensemencement :
    6- Verser stérilement La membrane est 8- Incubation :
    le volume d’eau à filtrer: Posée sur la gélose Durée et température
    100 mL (ne pas dépasser Face quadrillée appropriées
    la graduation 100 mL inscrite en haut
    à l’intérieur de l’entonnoir)

    Lecture des résultats: Escherichia coli et Coliformes

    LECTURE DES RESULTATS

    Escherichia coli  Escherichia coli  Escherichia coli 

    Colonies fluorescentes  Escherichia coli et Coliformes  Escherichia coli et Coliformes 


    d’E. coli sous lampe UV d’une eau de rivière d’une eau résiduaire
    Norme Marocaine
    ISO 9308-1

    Indice de classement NM 03.7.003

    Qualité de l'eau - Recherche et


    dénombrement des Escherichia coli et des
    bactéries coliformes

    Calcul du nombre d'E. coli susceptibles d'être présents


    dans 100 mL d'échantillon.
    Compter les colonies oranges 
    entourées par un halo jaune
    Comptage des colonies présentes sur
    la membrane et pouvant produire de
    l'indole à partir du tryptophane
    présent dans le milieu de culture
    gélosé comme étant des E. coli.

    Indole +

    1. Test d’oxydase: Après incubation, à 44°C, la


    Ce test est essentiel pour orienter présence d’indole est indiquée
    l’identification des bacilles par l’apparition d’une couleur
    et des coques à Gram- . rouge dans la phase alcoolique du
    réactif de Kovacs.
    Recherche et dénombrement des Bactéries coliformes dans les eaux traitées (NM ISO 9308-1
    année 2006) Méthode par filtration sur membrane

    Echantillon 
    TEST PRESOMPTIF de 500 mL

    Filtrer
    100mL

    Tergitol - 7 - TTC Membrane 0.45µm

    36°C ± 2°C /21H ± 3H jusqu’à 44H ± 4H

    Dénombrer les colonies typiques (Jaunes avec halo jaune) et les


    colonies atypiques (différentes couleurs et morphologies)
    Isoler
    TEST CONFIRMATIF
    TSA
    36°C ± 2°C /21H ± 3H

    Verser sur papier filtre 2 à 3 gouttes du réactif à l’Oxydase

    Etaler une partie de la culture sur le papier filtre préparé

    Apparition d’une coloration bleue / violet foncée dans les 30 ‐ +


    secondes Ä réaction positive Incolore Violet

    Considérer toutes les colonies ayant une réaction négative à l’oxydase


    comme étant des bactéries coliformes

    Nombre de colonies confirmées en UFC\100mL

    Recherche et dénombrement des Escherichia coli dans les eaux traitées (NM ISO 9308-1
    année 2006). Méthode par filtration sur membrane

    TEST PRESOMPTIF  Échantillon de 


    500 mL 

    Filtrer 100mL

    Membrane 0.45µm
    Tergitol - 7 - TTC
    44°C ± 0.5°C /21H ± 3H jusqu’à 44H ± 4H

    Dénombrer les colonies typiques (jaunes avec halo jaune) et les


    colonies atypiques (différentes couleurs et morphologies)
    Isoler
    TEST CONFIRMATIF TSA
    36°C ± 2°C /21H ± 3H
    Ensemencer sur eau peptonnée exempte d’indole
    44°C ± 0.5°C /21H ± 3H
    Réaction d’indole Ajouter 0.2 à 0.3 mL du réactif de
    Kovacs dans les tubes d’eau peptonnée

    Apparition d’une coloration rouge à la surface du milieu confirme


    la production de l’indole Ä présence d’E. coli

    Nombre de colonies Confirmées en UFC/100 mL

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