NNT : 2017SACLS062

THESE DE DOCTORAT
DE
L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY
PREPAREE A
L’UNIVERSITE PARIS-SUD

ECOLE DOCTORALE N° 568 BIOSIGNE

Signalisations et réseaux intégratifs en biologie

Spécialité : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Par

Mme Mary Zakaria

Caractérisation des rôles du co-récepteur de Sonic Hedgehog, Boc, dans le

développement et la réparation de la myéline du système nerveux central

Thèse présentée et soutenue au Kremlin Bicêtre, le 22 mars 2017:

Composition du Jury :

Mr Daniel Hervé PU – Neuro PSI, Orsay Président

Mme Durbec Pascale DR – IBDM, Marseille Rapporteur

Mme Fombonne Joanna MCU- HDR – CRCL, Lyon Rapporteur

Mr Nait-Oumesmar Brahim DR – ICM, Paris Examinateur

Mme Traiffort Elisabeth DR – Inserm, Univ. Paris Saclay, Kremlin-Bicêtre Directeur de thèse
Tout obstacle renforce la détermination.
Celui qui s’est fixé un but n’en change pas.

Léonard de Vinci
 Remerciements
Par ces quelques lignes, je tiens à remercier toutes les personnes qui ont participé de près
ou de loin au bon déroulement de cette thèse…

Je tiens à remercier en premier lieu les membres du Jury d’avoir accepté de juger ce
travail. M. Hervé Daniel, je vous remercie d’avoir accepté de présider le jury de ma thèse.
M. Brahim Nait Oumesmar, votre parcours et votre travail reflètent d’excellentes avancées
dans le domaine de la réparation de la myéline, je suis ravie que vous soyez dans mon jury de
thèse et j’espère que cette soutenance nous donnera l’opportunité d’échanges fructueux. Je
remercie en particulier Mme Joanna Fombonne, d’avoir accepté d’évaluer ce travail. Vous
m’avez accompagnée au cours de ce travail de thèse, notamment au moment de l’évaluation de
mi-parcours par visioconférence, la soutenance sera alors l’occasion d’un échange face à face
vif et amical. Mme Pascale Durbec, je vous remercie vivement pour le temps que vous avez
accordé à ce projet que ce soit durant notre rencontre à Carry le Rouet ou pendant la
correction de la thèse. J’ai toujours admiré vos présentations et votre travail.

Je tiens à remercier spécialement ma directrice de thèse Elisabeth Traiffort. Je te

remercie d'avoir cru en mes capacités et pour le temps que tu as accordé à la réussite de
cette thèse. Merci pour ta gentillesse, ta patience et tes conseils scientifiques. Démarrer
avec toi une nouvelle équipe m’a permis d’apprendre beaucoup de taches de gestion et
d’autonomie, la patience, et surtout la persévérance pour continuer de creuser
scientifiquement.

Je remercie également Michael Schumacher, directeur de l’unité U1195. Merci de m’avoir

accueillie dans ton unité. Merci pour ta présence sécurisante (et aussi parfois effrayante!
humour belge) les weekends au labo.

Je tiens à remercier ensuite l’ensemble des personnes qui m’ont aidée à la réalisation de ce
travail. NaTTy, merci pour ton soutien non seulement au niveau des manips mais aussi moral.
Je te remercie pour toute l’aide que tu m’as apportée surtout pendant les derniers mois de
thèse. Tu m’as appris qu’il y a des jours avec et des jours sans…et les jours sans, il faut faire
avec boire de l’alcool… Merci pour ton mode fofolle ! Ghislaine, je ne pourrais jamais oublier
tous tes conseils et ton savoir scientifique qui m’ont permis de réussir mes manips. Merci
pour tes protocoles super bien détaillés et pour tout le matériel que tu nous as cédé. Olivier
et Philippe, je vous remercie pour l’aide et les conseils que vous m’avez transmis pour la
réalisation et le traitement des images au microscope. Marion, je me rappelle toujours de la
première fois quand tu m’as montré les coupes au cryostat, depuis je coupais comme dans du
beurre ! Abdel, je te remercie de m’avoir appris à faire les cultures organotypiques, merci
également pour nos petites discussions d’humour. Cindy, je te remercie également de m’avoir
aidée dans mes histoires de PCR. Merci pour l'aide que tu m'as apportée dans mes sujets
divers. Avec toi tout semble plus facile !

Pour les personnes qui ont participé moins directement à cette thèse, je tiens à vous
remercier.
Hiroko, Ce fut une période difficile et ton aide fut plus qu’appréciable. Tu m’as montré que
les vrais amis sont ceux qui te soutiennent et t’encouragent quand tu passes des moments
difficiles. Merci pour toutes ces années, je n’oublierai jamais toutes nos sorties sympa. Yous,
merci pour ton riche fond intellectuel. Après tous nos beaux souvenirs ensemble j’ai réalisé
que mieux vaut être giflée par la vérité qu’embrassée par un mensonge. Martine, que dois-je
dire ? Pendant ces 3 années, tu étais pour moi, une mère, une sœur, une amie et un médecin…
je t'écris un « Merci » qui vient vraiment du fond du cœur. Kaja, my lovely sweet friend,
thank you for all the good memories we shared in Paris, hanging out with you was a pleasure!
See you in Lebanon! Aya, merci pour ta bonne humeur au quotidien et ta sincérité, je te
remercie de m’avoir remonté le moral avec ton beau sourire, et tes encouragements à chaque
fois que tu me voyais down ! Je suis très ravie de ton amitié ya banadoura… Marcel, je te
remercie pour ton soutien et pour toutes tes réflexions solides et fructueuses. Merci
également pour nos petites plaisanteries diverses. Jenny, le génie du Word ! Grand merci
pour ton aide !! Geri, grazie mille mia bella !! Enfin, Laurent, être là, présent et
m'écouter...une petite chose pour toi mais crois-moi tu m'as énormément aidé et j'apprécie
de tout mon cœur ton soutien. Merci !!

Pour tous ceux que j’ai oubliés dans ces quelques lignes, merci d’avoir d’une façon ou d’une
autre contribué à ces trois années de thèse.

Enfin, j’ai une pensée très affectueuse pour l’ensemble des personnes de mon entourage.

Cynthia, colloc’ et chère amie… merci pour tous les moments qu’on a partagés ensemble à
l’école, à la fac, au foyer, à Jussieu, au Cantagrel, tu as rendu mes jours à Paris beaucoup plus
agréables. Mes parents m’ont donné une sœur, mais la vie m’en a donné une autre qui est aussi
chère à mon cœur. Mais juste une question : shou 3m na3mol hon ? Love you ciciiii. A mes amis
libano-parisiens, Mohsen, Steph, Sacha et Racha, vous êtes adorables, merci pour tous ces
moments agréables qu’on a partagés ensemble, je vous aime  Marsida, mon amie depuis 4
ans déjà, je n’oublierai jamais nos sorties et nos discussions, merci à toi, je suis vraiment
contente de t’avoir rencontrée. Dandouna, sache que tes passages à Paris m’ont vraiment
donné un nouveau souffle à chaque fois, merci ma cousine préférée 

Walid mon bibi, sans que je te le demande, tu as su m'aider au moment où j'en avais le plus
besoin. Ta présence, ton soutien et ton écoute m'ont permis de remonter la pente. Sans toi,
je ne serais peut-être pas là aujourd'hui. Je te remercie de tout mon cœur et je te serai
toujours reconnaissante. Je te soutiendrai jusqu’à la fin… comme tu as fait pour moi. Je
t’aime.
Enfin, une dernière pensée à ma famille au Liban qui est derrière la personne que je suis
devenue. Cette thèse vous est dédiée. Maman, Papa, merci de m’avoir toujours soutenue sans
compter par vos pensées et vos prières et malgré la distance et les moments en famille qui
sont devenus de plus en plus rares au fil des années. J’espère que vous êtes fiers de moi. Je
vous serais à jamais reconnaissante. Ma sœur Fabie, mes deux frères Bacho et Moni,
merci...c'est un mot trop simple. Ce que je souhaiterai exprimer est au-dessus de cela. Je
suis à la fois touchée et reconnaissante pour l'aide que vous m'avez apportée...et je ne pourrai
jamais vous remercier assez. Je vous aime infiniment. A Joseph, Cynthia et Ghaina, je vous
remercie également, je vous aime tous. A mes neveux, Sam et Christ, à mes nièces, Laura et
Maria, je vous remercie pour la joie que vous avez apportée à ma vie. Désolée pour le temps
que j’ai passé loin de vous mais sachez que vous étiez toujours dans mon cœur et mes pensées.
Table des matières

INTRODUCTION ...................................................................................................................................................... 1
CHAPITRE 1. LES OLIGODENDROCYTES ET LE PROCESSUS DE MYELINISATION DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL ... 2
1. Les oligodendrocytes ................................................................................................................................... 3
2. L’oligodendrogenèse et la myélinisation du SNC. ....................................................................................... 6
2.1. Génération des OLs durant le développement prénatal .................................................................................... 6
2.2. Génération périnatale et postnatale précoce des OLs ....................................................................................... 9
2.3. Génération des OLs chez l’adulte ..................................................................................................................... 10
2.4. La myélinisation du système nerveux central ...................................................................................................12
2.4.1. La myéline : composition et architecture ....................................................................................................12
2.4.2. Processus de myélinisation ......................................................................................................................... 15
A. Communication axone – OL......................................................................................................................... 16
B. Facteurs contrôlant la myélinisation ........................................................................................................... 17

CHAPITRE 2. DEMYELINISATION ET REPARATION DE LA MYELINE ........................................................................ 20

1. La sclérose en plaques ............................................................................................................................... 20
1.1. Signes cliniques et diagnostic ........................................................................................................................... 20
1.2. Epidémiologie et etiologie ................................................................................................................................ 21
1.3. Les formes évolutives de la SEP ........................................................................................................................ 23
1.4. Les approches thérapeutiques de la SEP .......................................................................................................... 24
2. Modèles expérimentaux de démyélinisation ............................................................................................. 25
2.1. Démyélinisation induite par les toxines. ........................................................................................................... 25
2.2. Encéphalomyélite auto-immune expérimentale .............................................................................................. 27
3. La remyélinisation : ................................................................................................................................... 27
3.1. Caractéristiques de la myéline régénérée ........................................................................................................ 28
3.2. Les populations de cellules mobilisées : les progéniteurs ................................................................................ 29
3.3. Rôle de la microgliose et de l’astrogliose réactives .......................................................................................... 30
3.3.1. Implication de la microglie activée .............................................................................................................. 30
3.3.2. Implication des astrocytes réactifs .............................................................................................................. 31
3.4. Les différents régulateurs positifs et négatifs ...................................................................................................34

CHAPITRE 3. LA VOIE SONIC HEDGEHOG ET SON IMPLICATION DANS LA REGULATION DU SYSTEME NERVEUX
CENTRAL .............................................................................................................................................................. 37
1. Les protéines Hedgehog : identification, biogenèse, sécrétion et transport. ............................................ 37
1.1. Synthèse et maturation ....................................................................................................................................38
1.2. Sécrétion et transport ....................................................................................................................................... 39
2. Transduction du signal Sonic Hedgehog ................................................................................................... 42
2.1. La voie canonique ............................................................................................................................................. 42
2.1.1. Les mécanismes d’interaction proposés entre Ptc et Smo .......................................................................... 43
2.1.2. De l’activation de Smo vers l’induction des Glis : quel est le rôle du cil primaire ? ...................................45
2.2. Les voies non-canoniques indépendantes de Gli .............................................................................................. 46
3. Shh et le lignage oligodendrocytaire ................................................................................................... 48
3.1. Au cours du développement embryonnaire .....................................................................................................48
3.1.1. Dans la moelle épinière ............................................................................................................................... 48
3.1.2. Dans le cerveau postérieur et le mésencéphale .......................................................................................... 50
3.1.3. Dans le cerveau antérieur ........................................................................................................................... 51
3.2. Au cours du développement post-natal précoce .............................................................................................. 53
3.3. A l’âge adulte : Shh en physiologie et en pathologie ........................................................................................ 54
3.3.1. L’expression des composantes de la voie Shh dans le cerveau mature ...................................................... 54
 3.3.2. Rôles de Shh dans le lignage oligodendrocytaire chez l’adulte ...................................................................56
3.3.3. Pathologies associées à une dysrégulation de la voie Shh et son rôle dans les maladies démyélinisantes 58

CHAPITRE 4. BOC, UNE PROTEINE TRANSMEMBRANAIRE, IMPLIQUEE DANS LA TRANSMISSION DE LA

SIGNALISATION HEDGEHOG ................................................................................................................................. 61
1. Identification, structure et interactions ................................................................................................. 61
2. Expression, activation et renouvellement ........................................................................................... 66
3. Fonctions Biologiques de Boc .............................................................................................................. 71
3.1. Boc s'associe à Cdo pour réguler positivement la différenciation myogénique ............................................... 72
3.2. Boc est impliqué dans la régulation du poids et de la masse adipeuse ............................................................ 72
3.3. Boc modifie le spectre de l’holoprosencéphalie chez des souris mutantes Gas1 et Cdo .................................73
3.4. Boc est impliqué dans la prolifération des progéniteurs des neurones granulaires du cervelet induite par Shh
………………………………………………………………………………………………………………………................................................74
3.5. Boc favorise la progression des médulloblastomes vers des formes de tumeurs avancées ............................. 76
3.6. Boc est le récepteur de Shh dans le guidage des axones commissuraux. ......................................................... 77
3.7. Boc est indispensable à la ségrégation des axones ipsilatéraux des cellules ganglionnaires de la rétine ........ 78
3.8. Shh via son récepteur Boc participe à la formation des microcircuits corticaux durant le développement
postnatal précoce ............................................................................................................................................................. 80

OBJECTIFS ............................................................................................................................................................ 82
RESULTATS ........................................................................................................................................................... 84

Article (p1-41)

Revue (p1-20)

DISCUSSION ET PERSPECTIVES.............................................................................................................................. 87
1. Boc et la complexité de la signalisation Sonic Hedgehog ................................................................ 89
2. L’influence de Boc sur la distribution des différentes populations oligodendrocytaires. .............. 93
3. Le rôle unique de Boc dans le contrôle de la myélinisation des petits axones du SNC .............. 95
4. Boc et la théorie de la « récapitulation » du processus développemental au cours de la
réparation de la myéline .................................................................................................................................. 98
CONCLUSION .......................................................................................................................................................100
BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................................................................101
Table des illustrations
FIGURE 1: STADES DE DIFFERENCIATION ET DE MATURATION DES CELLULES DU LIGNAGE OLIGODENDROCYTAIRE CHEZ LA SOURIS ............... 4
FIGURE 2: L'OLIGODENDROGENESE DANS LA MOELLE EPINIERE ET LE CERVEAU EN DEVELOPPEMENT..................................................... 8
FIGURE 3: PROLIFERATION ET DIFFERENCIATION DES NSCS DANS LE CERVEAU EMBRYONNAIRE. .......................................................... 9
FIGURE 4: STRUCTURE ET COMPOSITION DE LA MYELINE CENTRALE. ............................................................................................ 14
FIGURE 5: REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES DIFFERENTES ETAPES CONDUISANT A LA COMPACTION DE LA MYELINE.......................... 16
FIGURE 6: COUPE DU CERVEAU ANTERIEUR D'UN PATIENT DECEDE DE SCLEROSE EN PLAQUES. .......................................................... 21
FIGURE 7: PREVALENCE DE LA SEP DANS LE MONDE ET EN PARTICULIER EN FRANCE. ...................................................................... 23
FIGURE 8: ARCHITECTURE DE LA MYELINE APRES DEMYELINISATION. ............................................................................................ 28
FIGURE 9: LES DIFFERENTES MORPHOLOGIES DE LA MICROGLIE. .................................................................................................. 31
FIGURE 10: LES DIFFERENTES MORPHOLOGIES DES ASTROCYTES MARQUES PAR LA GFAP. ............................................................... 32
FIGURE 11: LES ETAPES ET LES POPULATIONS CELLULAIRES DE LA REMYELINISATION. ....................................................................... 33
FIGURE 12: LA FAMILLE HEDGEHOG. .................................................................................................................................... 38
FIGURE 13: BIOGENESE ET SECRETION DE LA PROTEINE HEDGEHOG............................................................................................. 41
FIGURE 14: LA VOIE CANONIQUE DE SHH. .............................................................................................................................. 43
FIGURE 15: LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES NON CANONIQUES DE SHH. ...................................................................................... 47
FIGURE 16: LA GENERATION DES OLIGODENDROCYTES DEPEND DE SHH DANS LA MOELLE EPINIERE ET LE CERVEAU EN DEVELOPPEMENT.... 52
FIGURE 17: EXPRESSION DES COMPOSANTS DE LA VOIE SHH DANS LE CERVEAU ET LE CERVELET ADULTE DU RONGEUR. .......................... 56
FIGURE 18: REPRESENTATION DE LA STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE ET DES INTERACTIONS DE LA PROTEINE BOC. .............................. 63
FIGURE 19: SCHEMA RESUMANT LES DOMAINES DE CDO ET BOC REQUIS OU NON POUR LA TRANSDUCTION DU SIGNAL HH. ................... 65
FIGURE 20: PROFILS D'EXPRESSION DE CDO ET BOC. ................................................................................................................ 67
FIGURE 21: EXPRESSION DE BOC DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL EMBRYONNAIRE. ................................................................. 70
FIGURE 22: LE PHENOTYPE DES SOURIS BOC KO DANS LE CERVELET EN DEVELOPPEMENT. ............................................................... 75
FIGURE 23: LE RECEPTEUR DE SHH BOC EST IMPLIQUE DANS LE GUIDAGE AXONAL DANS LE TUBE NEURAL ET LE CHIASMA OPTIQUE. ......... 79
FIGURE 24: SHH ET SON RECEPTEUR BOC REGULENT LA FORMATION SPECIFIQUE DES SYNAPSES PENDANT LE DEVELOPPEMENT CORTICAL. . 81

TABLEAU 1: PRINCIPAUX FACTEURS IMPLIQUES DANS LE PROCESSUS DE REMYELINISATION. .............................................................. 35

Liste des abréviations
AEP Anterior Entopeduncular area
AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
AMPc Adénosine Mono-Phophate cyclique
APC Adenomatous Polyposis Coli
ATP Adenosine triphosphate
BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
BHE Barrière Hémato-Encéphalique
bHLH basic Helix-Loop-Helix
BOC Brother of CDO
Boi Brother of ihog
Brg1 Brahma-related gene 1
CAII Carbonic Anhydrase II
CD4/8 Cluster of differentiation 4/8
CDO Cell adhesion molecule-related, down-regulated by oncogenes
CGNPs Cerebellum Granular Neuron Progenitors
CNP Cyclique nucléotide phosphodiestérase
CNTF Ciliary Neurotrophic Factor
CRD Cysteine Rich Domain
Cxcr4 Chemokine receptor 4
DCC Deleted in Colorectal Cancer
Dhh Desert Hedgehog
Disp Dispatched
DRG Dorsal Root Ganglion
DTI Diffusion Tensor Imaging
EAE Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
EBV Epstein-Barr Virus
EEG Electroencéphalographie
EGL External Granule Layer
ERK1/2 Extracellular Related Kinases1/2
FGF Fibroblast Growth Factor
Fn Fibronectin
Gal3 Galectine-3
GalC Galactosylceramidase
Gas6 Growth arrest specific 6
GPCR G Protein-Coupled Receptor
GPI Glycosylphosphatidylinositol
GRKs G Protein-Coupled Receptor Kinases
HDAC Histones deacetylases
Hip Hedgehog interacting protein
HSPG Heparin Sulfate proteoglycans
IGF-1 Insulin like-growth factor 1
IGL Internal Granule Layer
Ihh Indien Hedgehog
Ihog Interference hedgehog
IL Interleukin
iNOS Inducible nitric oxide synthase
IRM Imagerie par résonnance magnétique
KO KnockOut
LGE Lateral Ganglionic Eminence
LIF Leukemia Inhibitory Factor
LINGO1 Leucine-rich repeat and Immunoglobulin Domain-Containing-1
LPC Lysophosphatidilcholine
MAPK Mitogen Activated Protein Kinase
MBP Myelin Basic Protein
MGE Medial Ganglionic Eminence
MOG Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
mTor mammalian Target of rapamycin
Myrf Myelin Regulatory Factor
NG2 Neural Glial Antigen 2
NRG-1 Neureguline-1
NSCs Neural Stem Cells
NT-3 Neurotrophine 3
O4 Oligodendrocyte Marker
OL Oligodendrocyte
OPC Oligodendrocyte Progenitor Cell
PCR Polymerase Chain Reaction
PDGF-A Platelet-Derived Growth Factor A
PDGFRα Platelet-Derived Growth Factor Receptor alpha
PI3K Phosphoinositide 3-kinase
PIP4 Phosphatidyl-Inositol-4 Phosphate
PLP Proteolipid Protein
PSA-NCAM Polysialylated Neuronal Cell Adhesion Molecule
Ptc Patched
PTX Pertussis Toxin
RND Resistance Nodulation Division
Robo Roundabout
ROS Reactive oxygene species
SEP Sclérose En Plaques
Shh Sonic Hedgehog
Smo Smoothened
SN Système Nerveux
SNC Système Nerveux Central
SNP Système Nerveux Périphérique
Sox10 SRY (sex determining region Y)-box 10
Sufu Suppressor of fused
Sulf Sulfatase
TAPs Transitory-Amplifying Progenitors
Tcf4 Transcription factor 4
TEP Tomographie par Emission de Positron
TNFα Tumor Necrotic Factor alpha
VEGF-A Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A
V-SVZ Ventriculare- Subventriculare Zone
YY1 Ying Yang 1
Introduction

1
 Introduction

Chapitre 1. Les oligodendrocytes et le processus de

myélinisation du système nerveux central

Avant-propos : Généralités concernant le système nerveux chez les vertébrés

Le système nerveux (SN) est le système biologique de l’organisme responsable de la réception,

du transport et de l’intégration des informations venant de l’environnement extérieur ou des
différentes parties du corps. En permettant une réponse précise et rapide, il confère à l’organisme
une grande capacité d’adaptation et participe au maintien de l'homéostasie des différents tissus.

Le système nerveux des vertébrés se compose du système nerveux central (SNC), constitué
de l’encéphale (cerveau, tronc cérébral, cervelet), et de la moelle épinière, et du système nerveux
périphérique (SNP) qui comporte les nerfs et ganglions à l’extérieur du cerveau et de la moelle
épinière.

Cette distinction repose sur des considérations d'ordre embryologique. Le SNC et le SNP
dérivent l’un et l’autre du tube neural, mais le SNP n’est issu que de la partie la plus dorsale du
tube neural appelée ‘crêtes neurales’. Alors que le SNC constitue le centre de régulation et
d'intégration des informations, le SNP a un rôle essentiel dans la transmission de l'information
soit du SNC vers les différents organes ou tissus (voies motrices ou efférentes) soit des différents
organes ou tissus vers le SNC (voies sensitives ou afférentes).

Cette thèse étant focalisée sur les processus conduisant à la production de la myéline en
conditions physiologiques ou pathologiques, ce premier chapitre sera consacré à la description
des oligodendrocytes (OLs), les cellules produisant la myéline dans le SNC, à leur genèse et à la
génération de la myéline proprement dite.

2
 Introduction

1. Les oligodendrocytes

Les cellules gliales auxquelles appartiennent les OLs, représentent environ 90% des
cellules du SNC. A l’heure actuelle, elles se voient attribuer des rôles beaucoup plus étendus que
celui de « glue » qui leur avait été initialement attribué (Virshow, 1846) puisqu’elles participent
notamment au développement et à la plasticité du système nerveux (Herculano-Houzel, 2014;
Zuchero and Barres, 2015). Leur découverte par Rio Hortega et Ramon y Cajal (Raymond Y
Cajal, 1913; Rio Hortega, 1921) a rapidement conduit à distinguer deux catégories : les cellules
microgliales ou (microglie) représentant 5 à 10% des cellules gliales, d’origine mésodermique et
appartenant au lignage monocyte/macrophage, et les cellules macrogliales dérivées du
neuroectoderme et regroupant les astrocytes et les OLs (pour revue, (Rowitch and Kriegstein,
2010).

Présent de manière uniforme chez tous les vertébrés, l’OL permet la formation de la gaine
myéline et des nœuds de Ranvier assurant par conséquent la conduction optimale de l'influx
nerveux (Bradl and Lassmann, 2010). La myélinisation des axones assurée par les OLs constitue
une avancée au cours de l’évolution des espèces (Hartline and Colman, 2007). Chaque OL émet
plusieurs prolongements qui s'enroulent autour de différents axones adjacents. En effet,
contrairement à la cellule de Schwann qui ne myélinise qu’un seul axone dans le SNP, l’OL est
capable de myéliniser plusieurs axones. Il enroule sa membrane plasmique en couches
successives qui forment une spirale sur un segment d'axone ou internoeud. Les segments de
myéline adjacents sur un axone peuvent donc provenir de différents OLs (Baumann and Pham-
Dinh, 2001). L’OL présente un noyau dense, un corps cellulaire irrégulier et de petite taille, et de
nombreux prolongements qui contrairement à ceux des astrocytes, ne sont pas riches en
filaments intermédiaires mais en microtubules (Lunn et al., 1997).

De nombreux outils génétiques et biochimiques ont fait évoluer nos connaissances sur le
développement des OLs ou oligodendrogenèse. En particulier, l’identification de marqueurs
cellulaires spécifiques et l’utilisation des séquences promotrices des gènes codant pour ces
marqueurs (Figure 1D) ont permis une caractérisation détaillée des progéniteurs d’OL (OPCs) et
plus généralement des cellules de l’ensemble du lignage oligodendrocytaire (Emery, 2010; Hartline
and Colman, 2007; Kessaris et al., 2006; Richardson et al., 2006). Ces outils ont par la suite permis
d’analyser le renouvellement physiologique (turn-over) des OLs et leur régénération consécutive à
une destruction pathologique dans le cerveau adulte (Fancy et al., 2011a; Franklin and Ffrench-
Constant, 2008; McTigue and Tripathi, 2008; Miller and Mi, 2007).

3
 Introduction

Figure 1: Stades de différenciation et de maturation des cellules du lignage

oligodendrocytaire chez la souris
A-C, Immunomarquage fluorescent des OPCs NG2+ de la moelle épinière (A) (Kucharova and
Stallcup, 2015), des OLs matures exprimant APC/CC1 et des gaines de myéline exprimant la MBP
dans le nerf optique (B) (Emery, 2010), des chaînettes de cellules oligodendrocytaires exprimant
le facteur de transcription Olig2 dans le corps calleux où les noyaux sont marqués par le Dapi (C)
(Ming et al., 2013). (D) Représentation schématique des principaux stades de développement du
lignage oligodendrocytaire ainsi que des différents marqueurs permettant de les identifier. Le
marqueur Olig2 est exprimé tout du long du lignage. Les deux marqueurs NG2 et PDGFRα, sont
exprimés par les OPCs. Lorsque les OPCs se différencient en OLs pré-myélinisants, ils perdent
l'expression de ces deux marqueurs Les OLs myélinisants acquièrent l’expression des protéines
de myéline. Adaptée de (Ghoumari et al., 2005; Podbielska et al., 2013).

Parmi les marqueurs les plus précoces, on trouve les facteurs de transcription de la famille
Olig. En absence d’Olig2, aucun OPC ne se développe (Lu et al., 2002; Zhou and Anderson, 2002).
Olig1 quant à lui a été récemment montré jouer un rôle dans la différenciation des OPCs du cerveau
mais pas de la moelle épinière (Dai et al., 2015). Localisé au niveau nucléaire, Olig2 est exprimé

4
 Introduction

par l’ensemble des cellules du lignage oligodendrocytaire (Figure 1C). La distribution subcellulaire
d’Olig1 est intéressante puisqu’elle est nucléaire dans les OPCs et cytoplasmique dans les OLs
matures (Arnett et al., 2004). Un autre marqueur précoce du lignage est le récepteur de surface
« Platelet-Derived Growth Factor Receptor alpha » (PDGFR-), Lorsqu’elle est co-exprimée avec
Olig2 et la forme polysialylée de la molécule d’adhésion cellulaire neurale (PSA-NCAM) détermine
un stade de précurseur du lignage oligodendrocytaire dont dérivent les OPCs. Ces derniers se
caractérisent comme des cellules hautement prolifératives, mobiles et bipolaires exprimant Olig1/2,
PDGFR, l’épitope glycosylé A2B5, le chondroitine sulfate protéoglycane « neural-glial antigen 2 »
(NG2) (Figure 1A) et l’isoforme dm20 de la protéine protéolipidique (PLP) (Noble et al., 1988;
Richardson et al., 2011).

Le stade de maturation suivant est celui des pré-OLs qui présentent une morphologie plus
ramifiée et sont moins mobiles que les OPCs (Fok-Seang and Miller, 1994; Noble et al., 1988;
Pfeiffer et al., 1993). A ce stade, deux anticorps supplémentaires sont utilisables. Le premier
reconnaît le dérivé sulfaté O4 du galactocérébroside (GalC) et le second l’anhydrase carbonique
II (CAII), la seule enzyme de cette famille présente dans le système nerveux et qui marque les
multiples stades de transition entre les OLs immatures et les OLs matures (Baumann and Pham-
Dinh, 2001). Contrairement aux OPCs, les pré-OPCs ne répondent plus au PDGF, mais au facteur
de croissance des fibroblastes (FGF) qui favorise leur prolifération et maintient un état d’immaturité
(Fok-Seang and Miller, 1994). Les OLs prémyélinisants qui leur succèdent perdent l’expression de
PDGFR, NG2, A2B5, mais expriment Adenomatous polyposis coli (APC) (Figure 1B). Au cours
du développement chez la souris, APC localisé dans les corps cellulaires des OLs matures, est
l’un des premiers marqueurs spécifiques indiquant le début de la différenciation d’un OPC (Fancy
et al., 2014). La dernière étape de maturation aboutit à l’OL mature myélinisant. Ces cellules
sortent du cycle cellulaire, deviennent post-mitotiques et sont capables d’établir des contacts avec
les axones environnants et de synthétiser la gaine de myéline (Pfeiffer et al., 1993). Les marqueurs
de myéline exprimés sont la protéine protéolipidique (PLP), la protéine basique de la myéline
(MBP) ou la glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline (MOG) (Baumann and Pham-Dinh,
2001; Solly et al., 1996).

5
 Introduction

2. L’oligodendrogenèse et la myélinisation du SNC

2.1. Génération des OLs durant le développement prénatal

Durant le développement embryonnaire, les OPCs sont spécifiés à partir de pools de

progéniteurs neuraux situés dans la zone ventriculaire du tube neural et du cerveau en
développement. L’identité phénotypique des progéniteurs dépend de l’expression de combinaisons
spécifiques de facteurs de transcription qui sont activés ou réprimés en fonction de leur position le
long de l’axe dorso-ventral par des concentrations précises de morphogènes. Shh en position
ventrale (notochorde et plaque du plancher) et BMP/Wnt en position dorsale (plaque du toît) sont
les morphogènes présents le long de l’axe dorso-ventral sous forme de gradients de
concentrations. Ces gradients subdivisent le tube neural en 5 domaines distincts dont le domaine
pMN d’où émerge une première vague d’OPCs dépendant de la signalisation Shh à E12.5. Elle
sera décrite en détail dans le chapitre 3. Une seconde vague plus dorsale émerge ensuite à E15.5
(Figure 2A). Exprimant le marqueur Pax7, elle se trouve suffisamment éloignée de la source de
Shh pour suggérer qu’elle ne dépend pas de ce morphogène (Cai et al., 2005; Fogarty et al., 2005;
Vallstedt et al., 2005). Dans la moelle épinière adulte, 80% des OLs dérivent de la première vague
ventrale (Tripathi et al., 2011).

Dans le cerveau antérieur en développement, plusieurs vagues de production et de

migration d’OPCs sont également à l’origine de l’ensemble de la population oligodendrocytaire.
Chez la souris à E12.5, une première vague ventrale d’OPCs est produite dans l’éminence
ganglionnaire médiane (MGE) à partir de précurseurs exprimant Nkx2.1 (Spassky et al., 2001;
Tekki-Kessaris et al., 2001). Une deuxième puis une troisième vagues d’OPCs émanent ensuite
respectivement des éminences ganglionnaires latérales et caudales à E15.5, et du cortex cérébral
au cours de la période périnatale. Ces deux dernières vagues dérivent respectivement de
précurseurs exprimant respectivement Gsh2 et Emx1 (Figure 2B, C). De façon remarquable, la
majorité des OLs générés au cours de la première vague se trouve progressivement remplacée
par les OLs issus des deux dernières vagues (Kessaris et al., 2006). La dépendance à la
signalisation Shh des vagues 1 et 3 sera décrite en détail dans le chapitre 3. De façon intéressante,
lorsque l’une de ces populations est détruite, les populations voisines réagissent rapidement afin
de combler le manque et assurer un nombre d’OLs normal dans le cerveau mature (Kessaris et
al., 2006). Ainsi, au cours du développement, les OPCs des différentes vagues semblent être en
compétition, mais fonctionnellement équivalents. A l’issue de ces trois vagues, seuls 20% des OLs
localisés dans le corps calleux sont issus de la première vague alors que le reste dérive de la

6
 Introduction

vague néo-natale. De façon intéressante, les propriétés électriques des OPCs/OLs d’origine
ventrale et dorsale sont identiques (Tripathi et al., 2011).

Au cours du développement embryonnaire, les OPCs subissent une importante phase de

prolifération et de migration afin de coloniser l'ensemble des régions du SNC. Ces cellules
répondent aux effets prolifératifs du PDGF et FGF (Fok-Seang and Miller, 1994). Ces mêmes
facteurs ainsi que le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) sont impliqués dans le contrôle
de la migration des OPCs (Armstrong et al., 1990; Milner et al., 1997; Yan and Rivkees, 2002). La
sémaphorine 3A et la Nétrine-1 sont respectivement chémo-attractifs et –répulsifs sur les OPCs
du nerf optique chez le rongeur (Spassky et al., 2001). Par ailleurs, l’expression du protéoglycane
NG2 favorise la migration des OPCs (Niehaus et al., 1999). NG2 contrôlerait la polarité et la
migration directionnelle de ces précurseurs en modulant les signalisations RhoA et Rac via des
complexes de polarité (Biname et al., 2013). Une découverte récente indique que la migration des
OPCs repose sur des interactions physiques entre les OPCs et les cellules de l’endothelium
vasculaire. La signalisation Wnt et le récepteur Cxcr4 (chemokine receptor 4) réguleraient ces
interactions qui permettent aux OPCs de se mouvoir le long des vaisseaux dans le cerveau
antérieur en développement (Tsai et al., 2016).

7
 Introduction

Figure 2: L'oligodendrogenèse dans la moelle épinière et le cerveau en développement

(A) Dans le tube neural, les OPCs proviennent d’abord du domaine pMN ventral sous le contrôle
de Shh, puis d’un domaine plus dorsal indépendamment de ce morphogène. A la naissance, les
OPCs de la région ventrale se distribuent dans l’ensemble de la moelle épinière, alors que ceux
issus de la région dorsale se confinent en position dorsale. Adapté de (Fancy et al., 2011a). (B)
Schéma représentatif de la distribution des morphogènes et facteurs de croissance influençant
l’oligodendrogénèse dans le cerveau antérieur embryonnaire d’une souris à E14.5. LGE,
éminence ganglionnaire latérale ; MGE, éminence ganglionnaire médiane. (C) Modèle de
l’oligodendrogénèse dans le cerveau antérieur montrant les trois vagues successives de
production des OPCs qui dérivent des précurseurs neuraux Nkx2.1+ au niveau de la MGE à
E12.5, Gsh2+ au niveau des éminences ganglionnaires latérale (LGE) et caudale (CGE) à E15.5,
et Emx1+ dans la zone ventriculaire corticale à la naissance. Adapté de (Naruse et al., 2017).

8
 Introduction

2.2. Génération périnatale et postnatale précoce des OLs

A la période embryonnaire tardive et péri-natale, la zone ventriculaire / sous ventriculaire

(V-SVZ) est une zone germinative importante qui longe les parois des ventricules latéraux, inclut
des composantes dérivées de la MGE, de la LGE, du septum et du cortex et contient des cellules
souches neurales (NSCs for Neural Stem Cells) (Alvarez-Buylla et al., 2008; Merkle et al., 2007).
La V-SVZ représente la source majeure des OPCs nouvellement générés à ce stade du
développement. Afin d’établir la période à laquelle les cellules du lignage oligodendrocytaires se
séparent du pool de NSCs caractérisées par leur capacité à s’auto-renouveler, Naruse et
collaborateurs utilisèrent le système Cre-Lox inductible afin de suivre les cellules appartenant
respectivement au lignage des cellules souches (Nestin+) et à celui des cellules
oligodendrocytaires (Olig2+). En accord avec les résultats précédents (Kessaris et al., 2006), ces
expériences révèlent que la ségrégation entre les OPCs corticaux et les NSCs débute juste avant
E16.5 et jusqu’à P10. La limite dorso-ventrale de la V-SVZ semble être la source des OPCs
corticaux (Naruse et al., 2016). Les conclusions de Tong et collaborateurs vont dans le même sens
montrant qu’une région dorsale de la V-SVZ dépendant de la signalisation Shh produit un grand
nombre de cellules oligodendrocytaires dans le cerveau post-natal (Tong et al., 2015). Cette
dépendance à Shh sera décrite dans le chapitre 3.

Figure 3: Prolifération et différenciation des NSCs dans le cerveau embryonnaire

Les cellules souches neurales aussi connues comme les cellules gliales radiales (jaune),
produisent des neurones (vert) au milieu du stade embryonnaire, puis des oligodendrocytes
(bleue) et des astrocytes (violet) durant le stade embryonnaire tardif (Naruse et al., 2017).

9
 Introduction

2.3. Génération des OLs chez l’adulte

Chez l’adulte, la SVZ continue à générer des progéniteurs neuraux qui donnent naissance
en majorité à des neuroblastes migrant vers les bulbes olfactifs où ils se différencient en
interneurones. Ces progéniteurs sont aussi la source d’une quantité plus restreinte d’OPCs qui
migrent vers le corps calleux et le cortex (Doetsch and Alvarez-Buylla, 1996; Luskin et al., 1993;
Menn et al., 2006). La SVZ se compose de divers types cellulaires identifiables par leurs
caractéristiques morphologiques et les marqueurs qu’ils expriment. Les NSC adultes (NSCa) sont
des cellules de type astrocytaire exprimant le marqueur GFAP (Mirzadeh et al., 2008).
Multipotentes et capables de s’auto-renouveler lorsqu’elles passent de l’état quiescent à l’état
activé, elles donnent naissance par un processus de division asymétrique notamment régulé par
la signalisation Shh (Ferent et al., 2014) aux progéniteurs à amplification transitoire appelés TAPs.
Les TAPs hautement prolifératifs expriment les marqueurs Mash1 et EGFR et forment de petits
amas cellulaires. Ils sont à l’origine des neuroblastes migrants qui expriment les marqueurs PSA-
NCAM et doublecortine et se dirigent vers les bulbes olfactifs, et à une petite proportion d’OPCs
qui expriment Olig2 et se dirigent vers le corps calleux et le cortex (Aguirre and Gallo, 2004;
Doetsch et al., 1997; Menn et al., 2006). Une analyse récente utilisant des techniques d'imagerie
in vivo qui permet de suivre les cellules dérivées de la SVZ indique qu'une NSCa donnée génère
exclusivement soit des OLs soit des neurones (Ortega et al., 2013).

La fraction des TAPs qui donne naissance à des OLs exprime le facteur de transcription
Olig2 (Menn et al., 2006). Seulement 2% des cellules générées dans la SVZ adulte sont des OPCs.
Ces OPCs expriment PDGFR, prolifèrent et migrent dans les régions sous-corticales et corticales
adjacentes où ils peuvent rester des progéniteurs ou se différencier en OLs myélinisants (Hack et
al., 2005; Menn et al., 2006). La partie dorsale de la SVZ (bordant le corps calleux) produit une
quantité plus importante d’OPCs que la partie ventrale (longeant le striatum). Par ailleurs, la SVZ
rostrale produit moins d’OLs que de neurones contrairement à la SVZ caudale (Menn et al., 2006).
La régionalisation de la SVZ est en particulier régulée par les signalisations Shh (Tong et al., 2015),
BMP (Colak et al., 2008) et Wnt (Ortega et al., 2013).

En dehors de ces signaux contribuant à la régionalisation de la production des OPCs,

d’autres facteurs interviennent pour réguler l’oligodendrogenèse à ce niveau. Ainsi, l’engagement
des TAPs vers le lignage oligodendrocytaire est favorisé par l’expression des facteurs de
transcription Olig2 (Maire et al., 2010), Sox10 (Pozniak et al., 2010), et Ascl1 (Nakatani et al.,
2013). La surexpression du facteur de croissance épidermique (EGF) dans le ventricule latéral

10
 Introduction

induit une énorme production de cellules oligodendrocytaires capables d’envahir les aires
cérébrales adjacentes (Gonzalez-Perez et al., 2009).

Comme nous l’avons précédemment mentionné, une partie des OPCs générés à la période
péri- et post-natale ne se différencient pas après avoir migré dans le parenchyme où ils constituent
la population des OPCs adultes représentant environ 5% de la population cellulaire totale du SNC
(Dawson et al., 2003; Nishiyama et al., 2009). Ces cellules partagent un certain nombre de
marqueurs avec les OPCs apparus durant le développement embryonnaire tels que NG2,
PDGFR, Olig1/2, Nkx2.1 (Dawson et al., 2003; Fancy et al., 2004; Nishiyama et al., 1996). Ils ont
une morphologie très ramifiée (Berry et al., 2002), se divisent lentement, ont des capacités
migratoires réduites et répondent différemment aux facteurs de croissance en comparaison de
leurs homologues générés pendant le développement (Engel and Wolswijk, 1996). Une
hétérogénéité caractérise cette population de cellules chez l’adulte. Leur capacité à proliférer et à
se différencier est variable selon la région considérée, en particulier supérieure dans la substance
blanche comparé à la substance grise (Dimou et al., 2008; Rivers et al., 2008). L’hétérogénéité
porte aussi sur les réponses électrophysiologiques des OPCs. Dans le cervelet, seule la sous-
population des OPCs exprimant des canaux sodiques et potassiques et capable de recevoir des
afférences synaptiques peut déclencher des potentiels d’action (Karadottir et al., 2008).

Des études de traçage génétique inductible de ces cellules ont conduit à montrer que 20%
des OPCs et 30% des OLs matures présents dans le corps calleux adulte sont générés après 7
semaines post-natales chez la souris, mais aussi que des évènements de myélinisation existe
dans le cerveau adulte et ne sont pas limités à la période de myélinisation post-natale précoce
(Dawson et al., 2003; Dimou et al., 2008; Psachoulia et al., 2009; Rivers et al., 2008). Malgré un
renouvellement continuel associé à la différenciation des OPCs et à la mort cellulaire, ces
progéniteurs demeurent uniformément distribués à travers le SNC adulte. Plusieurs mécanismes
moléculaires contribuent à cette homéostasie. Ainsi, ces cellules très dynamiques surveillent leur
environnement avec leurs filopodes très motiles, maintiennent un territoire autour d’elles par auto-
évitement et déclenchent la prolifération et la migration des cellules voisines afin de restaurer leur
densité en cas de diminution de celle-ci (Hughes and Appel, 2016). Une étude récente a mis en
évidence la signalisation de la nétrine-1 dans la prolifération précoce et la restauration de la densité
des OPCs qui disparaissent de la substance grise (Birey et al., 2015). Par ailleurs, des souris
apprenant à courir sur une roue complexe génèrent de nouveaux OLs. Si leur production est
bloquée, les animaux ne réussissent pas à surmonter la complexité de la roue, ce qui signifie que

11
 Introduction

la formation de nouveaux OLs et de nouvelles gaines de myéline facilitent l’apprentissage d’une

nouvelle tâche motrice (McKenzie et al., 2014).

2.4. La myélinisation du système nerveux central

Durant l’évolution des espèces animales, la conduction rapide de l'influx nerveux a

constitué un grand avantage adaptatif et a amélioré les chances de survie pour les prédateurs et
les proies. La conduction de l'influx nerveux est classiquement modélisée sous la forme d'un flux
d'ions à travers un cylindre creux. Dans ce modèle, deux paramètres physiques essentiels du
cylindre affectent la vitesse du flux d'ions: la résistance et la capacitance. Par des modifications de
l'un ou l'autre de ces paramètres, différentes stratégies d'évolution ont atteint le même objectif :
augmenter la vitesse de conduction des signaux neuronaux. Chez certaines espèces, le diamètre
des axones a été augmenté de façon à diminuer la résistance axonale interne, une adaptation qui
a abouti aux «axones géants» chez de nombreux invertébrés. A l'inverse, chez les vertébrés, le
développement de la gaine de myéline permet une conduction rapide dans les fibres de faible
diamètre, la fidélité de transport du signal sur de longues distances et l’économie d’espace puisque
le calibre des axones ne nécessite pas d’être augmenté (Castelfranco and Hartline, 2015). En
augmentant la vitesse de conduction de l'influx, la myéline a sans doute contribué à l'expansion du
cerveau des vertébrés et à l'émergence de comportements complexes. A l’inverse, la myélinisation
n’est vraisemblablement pas apparue dans le but de réduire les besoins énergétiques de
l’organisme puisque la synthèse de la myéline et le maintien des OLs nécessitent des quantités
d’ATP supérieures à celles économisées par l’existence des axones myélinisés (Harris and Attwell,
2012). En effet, au cours du développement post-natal, la myéline synthétisée par un OL peut
atteindre 5000 µm2 par jour (Pfeiffer et al., 1993).

2.4.1. La myéline : composition et architecture

La myéline est une substance qui entoure et protège les axones en même temps qu'elle
les isole électriquement. Elle est constituée d’une spirale à tours jointifs de membranes
lipoprotéiques dérivées des extensions membranaires des OLs (pour revue, (Hughes and Appel,
2016; Nave and Werner, 2014; Tomassy et al., 2016). Elle accroît considérablement la vitesse de
conduction de l'influx nerveux qui peut passer de moins de 1 m/s dans l'axone non myélinisé à 50-
100 m/s pour un axone myélinisé d’un diamètre de 1 à 40 µm. La rapidité de conduction du signal
est due à sa périodicité expliquée par l’accolement consécutif de segments membranaires ou
internoeuds, d’une longueur pouvant aller jusqu’à 1.7 mm dans le SNC. Chaque segment est
séparé du suivant par un nœud de Ranvier, zone dépourvue de myéline et riche en canaux

12
 Introduction

sodiques voltage-dépendant (Waxman, 2006). Cette disposition particulière des segments est à
l’origine de la transmission de l’influx nerveux dit « saltatoire » où le potentiel d’action saute d’un
segment de myéline à l’autre plutôt que de progresser lentement le long de l’axone comme c’est
le cas pour les axones non myélinisés (Roots, 2008; Zalc and Colman, 2000).

La structure et la composition moléculaire de la myéline sont uniques. Comme la plupart

des membranes, la myéline est riche en lipides qui constituent 70 à 75% de son poids total sec.
Cependant, elle diffère des autres membranes cellulaires par une composition lipidique rare avec
un rapport molaire proche de 2: 2: 1: 1 respectivement pour le cholestérol, les phospholipides, les
glycosphingolipides et les plasmalogènes (Norton and Poduslo, 1973). Tous ces lipides présentent
une grande mobilité latérale et la teneur en cholestérol limite la fluidité de la membrane (Maxfield
and van Meer, 2010; Rosetti et al., 2008; Yurlova et al., 2011). La myéline comporte environ 2 fois
plus de cholestérol que les membranes plasmiques classiques. Le cholestérol est un composant
limitant au cours du processus de myélinisation comme l’indique le phénotype des souris dont les
OLs sont dépourvus de squalène synthase, une enzyme essentielle à la biosynthèse du cholestérol
(Saher et al., 2011; Saher et al., 2009; Saher et al., 2005).

En dehors des lipides, la myéline du SNC contient certaines protéines spécifiques

exprimées majoritairement par les OLs comme la Protéine ProtéoLipidique (PLP) et la Protéine
Basique de la Myéline (MBP). L’abondance relative de ces protéines avait été initialement évaluée
après séparation sur des gels de polyacrylamide et colorations classiques au bleu de Coomassie.
Par cette approche, seul un nombre restreint de protéines étaient détectées ce qui a conduit à
conclure que la PLP et la MBP constituaient à elles seules jusqu’à 80% des protéines totales de la
myéline (pour revue (Bauman and Kasper, 2004)). Plus récemment, l’analyse de la composition
en protéines de la myéline a été réalisée à l’aide de techniques plus sophistiquées faisant appel à
la protéomique. Les données obtenues indiquent que la MBP, la PLP et la 2’,3’- nucléotide cyclique
3’-phosphodiestérase (CNP) représentent respectivement 17, 8 et 4% de l’ensemble des protéines
associées à la myéline soit un total de 35% alors que les 65% restants correspondent à des
protéines nouvellement identifiées (Jahn et al., 2009).

13
 Introduction

Figure 4: Structure et composition de la myéline centrale

Myéline du nerf optique visualisée en microscopie électronique. (A) Fibres axonales entourées
de myéline compactée. La myéline adaxonale correspond à la zone de croissance de la myéline.
(B) Les composantes radiales correspondent à des jonctions serrées qui stabilisent l’apposition
des membranes dans l’internoeud. (C) Dans la myéline compactée, le cytoplasme des OLs
disparaît. Les feuillets internes s’accolent et forment les lignes denses majeures (MDL : Major
Dense Lines). Les feuillets externes s’accolent aussi tout en laissant persister un espace
extracellulaire constituant les lignes intrapériodiques claires (IPL : Intra Period Lines) Adaptée de
(Nave and Werner, 2014). (D) Absence de myéline compacte et présence de boucles
paranodales au niveau des nœuds de Ranvier. D’après (Aggarwal et al., 2011).

La PLP, une protéine transmembranaire associée au cholestérol, existe sous deux formes
résultant d'un épissage alternatif. La forme la plus longue appelée PLP possède une masse molaire
de 25 kDa. La forme courte appelée DM20 a une masse de 20kDa et représente 10-20% de la
PLP chez l’adulte (Nave et al., 1986). Le gène codant pour la PLP localisé sur le chromosome X,
possède 7 exons tandis que la partie 5’ de l’exon 3 est épissée dans le cas de la DM20 ce qui
conduit à une délétion de 35 acides aminés (Bizzozero et al., 1987). Tôt au cours du
développement du SNC, l’ARN et la protéine DM20 précèdent ceux de la PLP qui devient l’isoforme
prédominante lors de la myélinisation. Cependant d’autres données rapportent l’expression de la
PLP avant celle de la DM20 ou même en l’absence de l’isoforme courte (pour revue, (Wight and
Dobretsova, 2004)). La PLP est une protéine particulièrement conservée chez les mammifères. La
PLP humaine et la PLP murine possèdent 100% d’homologie de séquence. La PLP est formée de

14
 Introduction

4 hélices α hydrophobes formant les domaines transmembranaires, de 2 domaines extracellulaires

et de 3 domaines cytoplasmiques. Des délétions ou des mutations dans la séquence codante du
gène de la PLP provoquent des anomalies de la myéline comme le syndrome de Pelizaeus-
Merzbacher (Garbern, 2007).

Le gène codant pour la MBP correspond à une famille de protéines en raison de l’existence
de plusieurs isoformes issues de différents épissages alternatifs. La masse moléculaire des
principales isoformes est 14, 17, 18.5 et 21.5 kDa chez la souris. Le gène est localisé sur le
chromosome 18 et fait partie d’une unité de transcription plus vaste, le Golli-MBP contenant 10
exons dont 7 constituent le gène de la MBP (Golli est pour ‘Gene expressed in the OL lineage’).
Les isoformes de 17 et 21.5 kDa qui contiennent l’exon 2, apparaissent très tôt au cours du
développement chez la souris. L’isoforme 18.5 KDa prédomine dans le SNC adulte (Harauz and
Boggs, 2013). Ces isoformes subissent différentes modifications post-traductionnelles incluant une
acétylation N-terminale et une méthylation qui pourraient être importantes pour la compaction des
membranes lors de la maturation de la myéline (Mendz et al., 1995). La MBP est la seule protéine
structurale essentielle à la formation de la myéline. La souris possédant la mutation Shiverer, une
mutation naturelle où une partie importante du gène de la MBP est délétée, ne possède
pratiquement pas de myéline compactée dans le SNC (Readhead and Hood, 1990).

La myéline est une structure remarquablement stable et qui semble toujours très proche de
son équilibre thermodynamique. De façon intéressante, lorsque les OLs sont détruits par
l’expression de la toxine diphtérique via le système de recombinaison inductible Cre/LoxP, la
myéline n’est pas immédiatement détruite, mais reste stable pendant plusieurs semaines (Pohl et
al., 2011; Traka et al., 2010). Dans le SNC normal, la demi-vie de la myéline est de l’ordre de
quelques semaines à quelques mois. De plus, la demi-vie du cholestérol que l’on retrouve dans la
myéline a été évaluée à plus de huit mois (Saher and Simons, 2010).

2.4.2. Processus de myélinisation

Le mécanisme de production de la gaine de myéline a lieu de façon extrêmement

stéréotypée au cours du développement. Elle progresse de façon caudo-rostrale dans le cerveau
antérieur et rostro-caudale dans la moelle épinière. Chez la souris, ce processus débute à la
naissance et est achevé dans la majorité des régions entre 45 et 60 jours de vie post-natale. Chez
l’Homme, la myélinisation atteint un pic au cours de la première année post-natale et continue

15
 Introduction

jusqu’à l’âge de 20 ans dans quelques fibres corticales, notamment dans les aires associatives
(pour revue, (Baumann and Pham-Dinh, 2001)).

Figure 5: Représentation schématique des différentes étapes conduisant

à la compaction de la myéline.
D’après (Nave and Werner, 2014)

A. Communication axone – OL

Dans des conditions normales, le processus de myélinisation est initié par un dialogue entre
un OL et un ou plusieurs axones. Durant l’initiation de la myélinisation, les axones stimulés
électriquement sécrètent du glutamate au niveau de leurs sites de contact avec les OPCs qui
peuvent répondre via les récepteurs AMPA qu’ils n’expriment qu’au début de leur maturation
(Kukley et al., 2007). Dès son premier contact avec une membrane axonale, l’extrémité du
prolongement émis par l’OPC s’étend et se rétracte alternativement jusqu’à se stabiliser sur l’axone
tant au cours du développement (Kirby et al, 2006) que chez l’adulte (Biname et al., 2013; Hughes
et al., 2013; Young et al., 2013). L’identité des protéines d'adhésion permettant cette stabilisation
reste à être déterminée. Le diamètre seuil des axones à myéliniser a été déterminé comme étant
de 0.2 m dans le SNC et 1 µm dans le SNP (Voyvodic, 1989; Waxman, 1972). Le contact OPC-
axone entraîne des modifications importantes dans les OPCs. Localement, la membrane de l’OPC
s’enrichit en phosphinositides (Goebbels et al., 2012; Snaidero et al., 2014). La tyrosine kinase
Fyn s’associe aux microdomaines membranaires riches en lipides (Czopka et al., 2013) et la cellule

16
 Introduction

se polarise en direction de l’axone à myéliniser (Baron and Hoekstra, 2010) par exemple via le
transport de l’ARN de la MBP jusqu’au site où la protéine est requise (Muller et al., 2013). De plus,
des protéines participant à la formation de lamellipodes telles que la protéine WAVE1 localisée au
niveau du prolongement émis par la cellule, en particulier au niveau du site de polymérisation de
l’actine, se révèlent nécessaires à la formation de la gaine de myéline dans le corps calleux et le
nerf optique (Kim et al., 2006). Plus globalement, l’assemblage puis le désassemblage des
filaments d’actine participent vraisemblablement à la croissance de la gaine de myéline. Celle-ci
s’étend non pas en adhérant fortement à l’axone, mais en engainant l’axone à la façon d’un liquide
suite au désassemblage des filaments d’actine (Nawaz et al., 2015). Le mécanisme moléculaire
de ce désassemblage des filaments d’actine repose sur l’activité de la MBP qui favorise
l’enroulement de l’axone en libérant des protéines appartenant à la famille de la cofiline et de la
gelsoline connues pour induire le désassemblage des filaments d’actine. En effet, la MBP entre en
compétition avec ces protéines sur les phosphoinositides membranaires (Zuchero et al., 2015).

B. Facteurs contrôlant la myélinisation

A côté des travaux permettant l’identification des facteurs contrôlant la spécification, la

prolifération et la migration des OPCs, de multiples études ont été consacrées aux signaux
exogènes affectant la dernière étape à savoir la différenciation des OPCs et la myélinisation.
L’activité électrique est capable d’instruire sélectivement la myélinisation d’un circuit neural
notamment dans les couches profondes du cortex pré-moteur et dans la matière blanche sous-
corticale (Gibson et al., 2014). Par ailleurs, la densité spatiale des OPCs induit des contraintes
biophysiques dans une niche axonale donnée qui influence la différenciation des OPCs
(Rosenberg et al., 2008).

Parmi les signaux locaux qui induisent la myélinisation, on citera les facteurs de
transcription Olig1 et Olig2. En dehors de son rôle majeur dans la spécification des cellules du
lignage oligodendrocytaire, Olig2 contrôle également la différenciation des OPCs en recrutant le
remodeleur de la chromatine Brg1 (Brahma-related gene 1) vers les éléments régulateurs des
protéines associées à la myéline comme la MBP, et vers les gènes promoteurs de différenciation
comme Sox10 [SRY (sex determining region Y)-box 10] et le facteur régulateur de la myéline
(Myrf). La protéine Myrf est associée à la membrane exprimée par les OLs post-mitotiques. Son
invalidation ne bloque pas la génération des OLs, mais leur capacité à produire les protéines
constituant la myéline (Emery et al., 2009). Une étude récente montre que le facteur de
transcription Olig1 est aussi nécessaire pour la production et la différenciation des OPCs dans le

17
 Introduction

cerveau mais pas dans la moelle épinière (Dai et al., 2015). Le facteur de transcription Zfp191 est
requis pour induire les gènes liés à la myéline (Howng et al., 2010). Chez la souris, l’invalidation
de Ying Yang 1 (YY1) se traduit par une hypomyélinisation consécutive à l’altération de la
différenciation terminale des OLs. Le facteur YY1 recrute les histones déacétylases (HDAC), des
enzymes responsables de la suppression de groupes acétyl sur les histones structurant l’ADN
génomique. L’activité de ces enzymes détectée dans le corps calleux est importante pour la
différenciation des OLs et la myélinisation (He et al., 2007). Le recrutement des HDAC1/2 aboutirait
à la répression d’inhibiteurs de la maturation terminale des OLs tels que le complexe β-catenine /
Tcf7l2. En se fixant sur le répresseur transcriptionnel Tcf7l2, les HDACs favorisent la différenciation
des OLs (Ye et al., 2009).

D’autres voies ont aussi été impliquées dans la régulation de la myélinisation. On peut citer
notamment les mécanismes dépendant de l’activité de la β- et de la γ-secrétase, qui constituent
respectivement des régulateurs positifs et négatifs de la myélinisation (Hu et al., 2006; Watkins et
al., 2008) ou encore la voie PI-3 Kinase/Akt/mTOR (Flores et al., 2008; Narayanan et al., 2009) et
la voie des kinases régulées par des signaux extracellulaires (ERK1/2) (Jeffries et al., 2016) qui
l’une et l’autre sont promyélinisantes.

Enfin, des études récentes ont mis en évidence le rôle des modifications post-
transcriptionnelles régulées par des microARN, au cours du développement des OLs (Svaren,
2014). En particulier, trois microARNs (miR-219, miR-138 et miR-338) favorisent la différenciation
des OLs en réprimant des facteurs positifs pour la prolifération tels que PDGFR-α et Sox6. Chez
l’Homme, miR-219 et miR-338, sont enrichis dans la substance blanche et fortement exprimés
dans les OLs (de Faria et al., 2012; Dugas et al., 2010).

En dehors de l’activité de la -secrétase et de la signalisation Wnt en tant que régulateurs

négatifs de la myélinisation, d’autres facteurs inhibiteurs ont été décrits bien que la plupart soient
plutôt rapportés dans le cadre de la réparation de la myéline ((Harlow and Macklin, 2014) et
chapitre 2). La molécule d’adhésion cellulaire PSA-NCAM présente sur les fibres nerveuses en
développement doit absolument voir son expression diminuée pour que la gaine de myéline se
développe (Charles et al., 2000). L’inhibition de la protéine LINGO1 (leucine-rich repeat and Ig-
domain- containing 1) sur les neurones comme sur les OLs induit la différenciation des OPCs et la
myélinisation quel que soit le diamètre des axones (Lee et al., 2007). Le facteur neurotrophique
NGF est un puissant régulateur négatif des signaux axonaux contrôlant la myélinisation du SNC
(Chan et al., 2004). Enfin, le récepteur couplé aux protéines G, GPR17, s’oppose à l’activité

18
 Introduction

positive d’Olig1 sur la maturation des OLs (Chen et al., 2009). Certains de ces facteurs
interviennent également en cas de démyélinisation du SNC.

19
 Introduction

Chapitre 2. Démyélinisation et Réparation de la myéline

Les OLs et la gaine de myéline que ces cellules synthétisent jouent un rôle essentiel au
fonctionnement correct des axones. En cas de démyélinisation, un processus endogène de
réparation de la myéline ou remyélinisation se met en place. Cependant cette capacité de
réparation a des limites et justifie la recherche de stratégies thérapeutiques destinées à favoriser
la production ou la mobilisation de nouveaux OPCs et leur maturation en OLs myélinisants. Dans
une première partie, je présenterai brièvement la Sclérose en plaques (SEP), la plus fréquente
des pathologies inflammatoires démyélinisantes, puis les modèles animaux de démyélinisation
couramment utilisés et enfin les principaux mécanismes moléculaires et cellulaires sur lesquels
repose le processus de remyélinisation.

1. La sclérose en plaques

Plus de 140 ans après la description de la SEP par les neurologues français Jean-Martin
Charcot et Alfred Vulpian en 1868, de nombreuses interrogations persistent. Le ou les processus
responsable(s) du déclenchement et du développement de la maladie restent mystérieux.
Cependant, la recherche actuelle est remarquablement dynamique dans de nombreux domaines
et ouvre de réelles perspectives dans la compréhension de la maladie et le développement de
nouveaux traitements.

1.1. Signes cliniques et diagnostic

La SEP tient son nom des plaques de démyélinisation observées en histologie dans le
cerveau des patients (Figure 6). Les plaques peuvent s’étendre sur quelques millimètres ou
quelques centimètres. Elles apparaissent par poussées. Les plaques nouvellement formées sont
dites ‘actives’. Les plaques où la démyélinisation est terminée sont dites chroniques ou non
actives et les ‘plaques fantômes’ sont les plaques où une remyélinisation s‘est produite. La SEP
est une maladie neurologique auto-immune chronique du SNC qui se manifeste généralement
entre 25 et 35 ans. Cependant, des formes juvéniles rares chez des patients de moins de 18 ans
ainsi que des formes d’apparition plus tardive chez des patients de plus de 40 ans existent
également. Le diagnostic est souvent long à établir car il nécessite la concordance de plusieurs

20
 Introduction

éléments : une destruction de la gaine de myéline dans différentes aires du SNC (voies optiques,
moelle épinière, tronc cérébral, cervelet) et à différentes périodes de temps, des signes cliniques
évalués à l’aide d’échelles précises (notamment celle des critères de McDonald, datant de 2010),
des images caractéristiques obtenues par Résonance Magnétique (IRM) et l’existence de
marqueurs biologiques (biomarqueurs) bien définis dans le liquide céphalo-rachidien, tels qu’un
index IgG élevé et/ou la présence de 2 bandes oligoclonales non détectées dans le sérum
(Brownlee et al., 2016; Derfuss, 2012; Miller et al., 2008).

Figure 6: Coupe du cerveau antérieur d'un patient décédé de sclérose en plaques.

La coloration au bleu de Luxol (Luxol fast blue) est utilisée pour révéler les zones myélinisées
dans la substance blanche. Les flèches vertes indiquent des plaques de démyélinisation. Les
flèches rouges indiquent des plaques fantômes ou « shadow plaques », dans lesquelles les
axones ont été remyélinisés. D’après (Franklin, 2002).

Selon la zone cérébrale touchée, le patient peut développer une multitude de symptômes
très variés comportant des troubles neurologiques répétés en particulier des troubles sensitifs
(fourmillements, sensations de brûlures), des troubles moteurs (fatigabilité à la marche, faiblesse
des membres) ou des troubles de la vision (une perte partielle ou complète de la vision avec des
douleurs oculaires).

1.2. Epidémiologie et étiologie

La SEP est la pathologie neurologique chronique la plus répandue chez les jeunes
adultes. Comme pour la plupart des maladies auto-immunes, elle affecte plus souvent les

21
 Introduction

femmes que les hommes (Irizar et al., 2014). Parmi 100 000 sujets atteints en France, 75% sont
des femmes qui développent la maladie classiquement 5 ans avant les hommes (Orton et al.,
2006). L’espérance de vie des hommes atteints est par ailleurs réduite de 6 à 7 ans en moyenne
(Leray et al., 2007). Les dernières estimations de la fondation ARSEP indiquent que 400 000
personnes sont atteintes en Europe et 2,3 millions dans le monde. L’incidence et la prévalence
varient géographiquement. La prévalence est plus élevée en Europe et plus particulièrement en
Europe du nord, au Canada, dans le nord des USA, la Nouvelle-Zélande et l’Australie. L’origine
de ces variations pourrait être des différences ethniques. La répartition est aussi hétérogène en
France où plus de cas sont répertoriés dans le Nord-est que dans le Sud-Ouest du pays. Enfin,
la pathologie prédomine dans les pays les plus industrialisés (Compston and Coles, 2008).

La SEP est considérée comme une maladie multifactorielle dans laquelle des facteurs de
risque génétiques et des facteurs environnementaux comme le tabac, une exposition au soleil
insuffisante, l’obésité ou des facteurs infectieux interviennent (pour revue, (Ascherio and Munger,
2008)) . En faveur d’une origine génétique de la SEP, une association a été identifiée dans les
années 1970 avec certains allèles du complexe majeur d’histocompatibilité HLA (Compston et
al., 1976; Terasaki et al., 1977; Visscher et al., 1979). L’antigène HLA-DRB1*15 est porté par
60% des patients caucasiens atteints de SEP mais par seulement 25-30% des individus sains de
la même origine ethnique (Greer, 2015). De plus, les études d’association pangénomiques ont
montré l’implication d’une douzaine de gènes non-HLA parmi lesquels des gènes codant pour
des récepteurs aux interleukines (Oksenberg and Baranzini, 2010).

Concernant les facteurs environnementaux, l’exposition au virus d’Epstein-Barr (EBV) est

retrouvée chez une majorité des patients développant une SEP (Goodin, 2009). Par ailleurs, la
carence en vitamine D également fréquente chez ces patients est cohérente avec la corrélation
négative existant entre l’augmentation de la prévalence de la SEP et l’intensité des rayons UV
(Fernandes de Abreu et al., 2009a; Fernandes de Abreu et al., 2009b; Handel et al., 2009)

22
 Introduction

Figure 7: Prévalence de la SEP dans le monde et en particulier en France

Le nombre de sujets atteints augmente en s’éloignant de l’équateur : les populations de l’Europe
du Nord sont plus atteintes que les populations asiatiques ou indiennes. En France, la SEP est
plus représentée dans le Nord-Est que dans le Sud-Ouest (d’après les estimations actuelles de
l’ARSEP).

1.3. Les formes évolutives de la SEP

Maladie inflammatoire et auto-immune, la SEP conduit à la destruction des OLs et de la

gaine de myéline susceptible de détériorer la conduction nerveuse. La pathologie est complexe
et évolutive atteignant la substance grise et la substance blanche (Calabrese et al., 2015a;
Calabrese et al., 2015b; Haider et al., 2014; Prins et al., 2015; Vercellino et al., 2009a; Vercellino
et al., 2009b). En général, 80% des patients diagnostiqués comme porteurs d’un «syndrome
clinique isolé» avec des lésions détectables à l’IRM évoluent vers une sclérose en plaques (Brex
et al., 2002). Cette maladie est caractérisée par deux phénomènes cliniques majeurs : les
poussées ou réapparition de symptômes neurologiques aigus qui se terminent par une rémission
partielle ou complète, et la progression qui correspond à une aggravation irréversible des
symptômes d’une durée supérieure à 6 mois.

23
 Introduction

La forme dite « récurrente-rémittente » qui se développe chez environ 85% des patients
se caractérise par des poussées qui durent de quelques jours à quelques mois suivies de
rémissions avec disparition progressive des symptômes. Au bout de plusieurs années, les
patients développent une forme dite «progressive secondaire», où les symptômes neurologiques
progressent sur 3 à 6 mois sans retour à un état antérieur. La progression des handicaps est
directement associée à une perte axonale précoce, diffuse, chronique et progressive. Cependant
15% des patients développent une forme «progressive primaire» qui se caractérise par une
évolution lente et progressive de la maladie. Les poussées ont une amplitude modérée
contrairement à la forme rémittente, bien que la maladie puisse s’aggraver par moments
(Confavreux and Vukusic, 2006).

1.4. Les approches thérapeutiques de la SEP

Dans les années 1990, les immunomodulateurs tels que l’interféron-β (Avonex®,
Bétaféron®, Rebif®) et l’acétate de glatiramer (Copaxone®) ont été introduits avec des résultats
spectaculaires réduisant de 30% la fréquence des poussées dans les formes rémittentes de SEP.
Cependant ces molécules ne montrent pas d’efficacité dans les formes progressives de la
maladie. Les deux molécules atténuent l’activation des lymphocytes T, inhibent et stimulent
respectivement la production des cytokines pro- et anti-inflammatoires et inhibent le passage des
lymphocytes auto-réactifs du sang vers le SNC en modulant la réactivité de la barrière hémato-
encéphalique.

D’autres molécules sont utilisées en seconde intention notamment un immunosuppresseur,

la mitoxantrone (Elsep®) et un anticorps monoclonal, le Natalizumab (Tysabri®) dirigé contre
l’intégrine 4 exprimée à la surface des lymphocytes activés et des monocytes. Les 2 molécules
sont proposées dans les formes très actives et agressives. Leurs effets secondaires, leucémie et
insuffisance cardiaque pour la première, leucoencéphalite multifocale progressive pour la
seconde justifient leur utilisation en seconde intention.

Plus récemment, le fingolimod (Gylenia®) s’est révélé constituer une alternative

thérapeutique en seconde intention. Cet immunosuppresseur actif par voie orale se lie aux
récepteurs sphingosine 1-phosphate notamment présents sur les lymphocytes T et induit la
séquestration de ces cellules dans les organes lymphoïdes (Kappos et al., 2010; Louapre et al.,
2013).

24
 Introduction

Plusieurs anticorps monoclonaux permettant de réduire la prolifération des lymphocytes T et

d’induire une déplétion des lymphocytes B sont aussi en cours d’études cliniques (pour revue,
(Delbue et al., 2016; Dolati et al., 2016; Louapre et al., 2013)).

Tous ces traitements permettent de retarder l’évolution de la maladie, mais aucun traitement
curatif n’existe pour favoriser la régénération de la myéline détruite (ou remyélinisation), un
processus spontané qui pour des raisons encore mal comprises peut échouer (voir le paragraphe
dédié à la remyélinisation). Seul un anticorps monoclonal dirigé contre le régulateur négatif de la
myélinisation Lingo-1, développé par la société Biogen Idec (Pepinsky et al., 2011a; Pepinsky et
al., 2011b) est en phase d’essai clinique. Cependant, l’amplification de la remyélinisation
endogène et la greffe de cellules myélinisantes font l’objet de nombreuses recherches (pour
revue, (Delbue et al., 2016; Dolati et al., 2016; Louapre et al., 2013)).

2. Modèles expérimentaux de démyélinisation

Plusieurs modèles animaux de démyélinisation sont actuellement utilisés afin d’explorer

les mécanismes impliqués dans l’initiation et la progression de la maladie ainsi que pour valider
de potentiels traitements favorisant la remyélinisation.

2.1. Démyélinisation induite par les toxines

Les modèles utilisant les toxines ont comme objectif de permettre de disséquer étape par
étape dans le temps les différents processus impliqués dans la démyélinisation et la
remyélinisation (Blakemore and Franklin, 2008). Les trois toxines principalement utilisées sont la
lysolécithine (lysophophatidylcholine ou LPC), le bromure d’éthidium et la cuprizone.

La LPC est un détergent qui induit d’une manière spécifique et rapide la phagocytose de
la gaine de myéline et la formation de pores dans les OLs myélinisants. Le produit est
classiquement injecté sous forme d’une solution saline à 1% dans la matière blanche de la moelle
épinière ou dans le corps calleux après repérage stéréotaxique (Denic et al., 2011; Jeffery and
Blakemore, 1995). Bien que le processus n’implique pas directement le système immunitaire, les
sites de lésion sont souvent infiltrés par les lymphocytes T, les lymphocytes B et les
macrophages, entre 6 et 12 heures après l’injection de la toxine. Cette infiltration pourrait avoir
un rôle dans la forte activation de macrophages/microglie, observée au bout de 48 heures et donc
sur le processus de démyélinisation (Ghasemlou et al., 2007). Toutefois, l’inflammation chronique
dans ce modèle de lésions reste minime et les lésions sont complètement réparées après environ
4 semaines.

25
 Introduction

Le traitement par la LPC est donc un modèle de démyélinisation rapidement réversible

impliquant une réparation spontanée et mettant en jeu le système immunitaire. Plus l’animal est
jeune, plus la remyélinisation sera efficace et rapide (Denic et al., 2011) d’où l’avantage de ce
modèle dans la caractérisation des différentes phases de la remyélinisation. Ainsi, les tissus lésés
peuvent être prélevés à différents temps après l’injection et analysés afin d’étudier différents
aspects des mécanismes de réparation de la myéline. La prolifération et la migration des
progéniteurs atteignent un maximum 5 jours suivant l’injection. Le processus se poursuit avec la
différenciation et la maturation des OLs qui débute vers le jour 10 après l’injection. Enfin, la
remyélinisation des axones est initiée vers le jour 15 (Blakemore and Franklin, 2008). Par ailleurs,
la lysolécithine a également l’avantage d’être utilisable ex-vivo pour induire une démyélinisation
dans des cultures organotypiques, notamment pour détruire les gaines de myéline entourant les
axones des cellules de Purkinje du cervelet (Birgbauer et al., 2004; Hussain et al., 2011; Miron
et al., 2010). Ce modèle in vitro peut servir à des études pharmacologiques plus rapides tout en
réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Le bromure d’éthidium (BET) est injecté à des concentrations de 0.01 à 0.1% par
stéréotaxie dans le funicule dorsal de la moelle épinière ou dans les pédoncules cérébelleux
postérieurs. Le BET est un agent intercalant de l’ADN. Il détruit les astrocytes et les OLs dans la
région ciblée. Le processus de démyélinisation est plus lent (jusqu’à deux semaines) que celui
observé pour la lysolécithine (Merrill, 2009). Bien que la lésion obtenue dans la moelle épinière
soit souvent beaucoup plus étendue que celle induite par la LPC, la remyélinisation est aussi
rapide dans les deux modèles (Blakemore and Franklin, 2008).

La cuprizone est un chélateur du cuivre administré par voie orale mélangé à raison de
0.2% à la nourriture des souris. Cette molécule cible les OLs matures qui ne parviennent plus à
répondre à la demande métabolique importante pour fabriquer la myéline et meurent
progressivement par apoptose (Franklin and Ffrench-Constant, 2008). Suite à ce traitement chez
la souris, plusieurs structures cérébrales de la substance blanche (notamment le corps calleux et
les pédoncules cérébelleux) et de la substance grise (le cortex et l’hippocampe), sont atteintes.
Si la cuprizone est retirée de l’alimentation au bout de 4 à 6 semaines, une remyélinisation
spontanée survient progressivement dans le corps calleux et le cortex. Si l’administration de
cuprizone est maintenue pendant 12 semaines, la phase de remyélinisation à l’arrêt de
l’administration est allongée (Gudi et al., 2009; Matsushima and Morell, 2001; Skripuletz et al.,
2008).

26
 Introduction

2.2. Encéphalomyélite auto-immune expérimentale

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle expérimental le plus

proche de la pathologie humaine. La démyélinisation est induite par une réaction immunitaire
générée par l’injection sous-cutanée d’une émulsion contenant un adjuvant et des peptides de
synthèse dérivés des composantes de la myéline de type MOG, MBP ou PLP (Franklin and
Ffrench-Constant, 2008). L’immunisation entraîne l’activation des lymphocytes T périphériques
qui en pénétrant le SNC, rencontrent les antigènes spécifiques de la myéline, et déclenchent la
maladie. Ce modèle reflète à la fois l’aspect immunitaire et démyélinisant de la SEP. Il est utilisé
dans plusieurs espèces allant du rongeur au primate non-humain (Baxter, 2007; Mix et al., 2008).

Ce modèle a contribué au développement de certains traitements utilisés en clinique comme

la mitoxantrone, le natalizumab et l’acétate de glatiramer. Cependant, comme tout modèle
animal, l’EAE possède également ses limites. Les cellules immunitaires de type CD4+, sont
identifiées dans l’EAE, alors que les plus fréquemment observées dans la SEP sont de type
CD8+. Par ailleurs, l’EAE ne permet pas de mimer la forme progressive primaire de la maladie
(Gold et al., 2006). Un inconvénient majeur de ce modèle est la difficulté de suivre l’apparition
chronologique des lésions dans le temps puisque les processus de démyélinisation et
remyélinisation peuvent être concomitants à travers l’ensemble du SNC. Des variantes sont
actuellement développées notamment une EAE focale qui consiste à provoquer des lésions
précisément localisées en injectant par stéréotaxie un cocktail pro-inflammatoire chez un animal
pré-immunisé (Chaudhary et al., 2015). Ce modèle permet de contrôler les lésions dans le temps
et dans l’espace.

3. La remyélinisation

Le processus de remyélinisation spontanée consiste à régénérer de nouvelles gaines de

myéline autour des axones suite à un évènement démyélinisant. Ce processus de réparation
permet ainsi le rétablissement de la conduction saltatoire et de l’intégrité axonale nécessaires à
la récupération fonctionnelle (Duncan et al., 2009; Liebetanz and Merkler, 2006). Ce processus
régénératif peut se produire spontanément dans les modèles murins de démyélinisation (Franklin
and Ffrench-Constant, 2008) comme chez les patients atteints de SEP (Blakemore, 1981; Bunge
et al., 1961; Hirano, 1989; Patrikios et al., 2006; Prineas and Connell, 1979). Néanmoins, chez
certains patients, l’efficacité de la remyélinisation peut être très réduite pour des raisons mal

27
 Introduction

connues, ce qui conduit à une dégénérescence axonale et à la mort des neurones. Cette
variabilité de la réparation n’est pas corrélée à l’âge ou au sexe des patients (Patrikios et al.,
2006). Elle pourrait dépendre de certaines prédispositions génétiques, de la sévérité et de la
répétition des poussées, de la localisation et de l’étendue des lésions dans le tissu nerveux. Les
raisons précises restent à être déterminées. Par conséquent, comprendre les mécanismes de la
remyélinisation et identifier les cellules et signaux moléculaires impliqués est nécessaire pour
envisager des approches thérapeutiques permettant d’amplifier la remyélinisation spontanée.

3.1. Caractéristiques de la myéline régénérée

L’observation initiale des gaines de myéline régénérées après une lésion a d’abord
indiqué des caractéristiques différentes de celles de la myéline produite au cours du
développement post-natal (Ludwin and Maitland, 1984). En effet, dans la myéline régénérée, il
semble n’y avoir aucune corrélation entre le diamètre de l’axone et l’épaisseur de la gaine de
myéline contrairement à ce que l’on observe dans la myéline produite au cours du développement
(Fancy et al., 2011a). La gaine de myéline régénérée est plus fine et elle est dotée de segments
internodaux plus courts pour un diamètre d'axone donné (Blakemore, 1974) (Figure 8).

Figure 8: Architecture de la myéline après démyélinisation

Coupes transversales de la substance blanche cérébelleuse de rats adultes, montrant des
axones normaux myélinisés de divers diamètres (à gauche), des axones démyélinisés après
injection de bromure d'éthidium (au centre) et quatre semaines plus tard, des axones remyélinisés
avec des gaines de myéline moins épaisses (à droite). D’après (Franklin and Ffrench-Constant,
2008).

Ainsi, le g-ratio des axones remyélinisés (c’est-à-dire le rapport entre le diamètre axonal et le
diamètre total de la fibre incluant la myéline) semblait permettre de distinguer les axones sains
des axones remyélinisés tout au moins dans le cas des axones de grand diamètre puisque sur

28
 Introduction

les axones de faible diamètre (par exemple ceux du corps calleux), la différence est beaucoup
plus difficile à évaluer (Stidworthy et al., 2003). Cependant, cette hypothèse a été récemment
remise en question. D’une part, des données récentes montrent que les OLs générés à l’âge
adulte conduisent à des segments internodaux plus courts donc comparables à ceux que l’on
observe dans la myéline régénérée (Young et al, 2013). D’autre part, plusieurs mois après une
lésion, les segments de myéline régénérés ne se révèlent ni plus fins, ni plus courts que ceux de
la myéline néonatale (Powers et al., 2013).

3.2. Les populations de cellules mobilisées : les progéniteurs

La remyélinisation est assurée par deux types de cellules: les OPCs du parenchyme et
les OPCs dérivés des NSCs présentes dans la SVZ. Lors d’une démyélinisation, les OPCs
présents dans le parenchyme à proximité de la lésion migrent rapidement vers celle-ci puis se
différencient en OLs matures. Cette conclusion repose à la fois sur des expériences de
transplantations cellulaires (Groves et al., 1993), sur l’observation de cellules oligodendrocytaires
exprimant transitoirement des marqueurs d’OPCs et/ou d’OLs matures (Franklin and Blakemore,
1997; Levine and Reynolds, 1999) et plus récemment sur le traçage génétique des OPCs en
utilisant la lignée de souris transgéniques Pdgfr-CreERT2 (Zawadzka et al., 2010). Une
observation intéressante montre qu’en réponse à une lésion focale de la moelle épinière ou du
corps calleux, les OPCs dorsaux s’activent, migrent vers la lésion et se différencient d’une
manière beaucoup plus importante que les OPCs ventraux, et par conséquent contribuent
d’avantage à la remyélinisation. Par ailleurs, les OLs matures présents autour de la lésion ne
semblent pas contribuer au processus de remyélinisation (Crawford et al., 2016).

Les OPCs dérivés de la SVZ dont nous avons précédemment mentionné l’existence en
conditions physiologiques (Menn et al., 2006), ont été décrits dans le contexte de la
remyélinisation à partir de la fin des années 1990 (Calza et al., 1998; Magalon et al., 2007; Nait-
Oumesmar et al., 1999). La réactivité de la SVZ qui se traduit par une augmentation de la
prolifération cellulaire locale est décrite chez le rongeur comme chez l’Homme (Nait-Oumesmar
et al., 2008; Nait-Oumesmar et al., 2007). Elle induit une densité accrue de progéniteurs
neuronaux PSA-NCAM+ co-exprimant des marqueurs du lignage oligodendrocytaire (Olig2,
Sox10) dans la SVZ comme à proximité de la lésion. Une étude de traçage génétique plus récente
confirme qu’après démyélinisation du corps calleux, les neuroblastes génèrent des cellules
myélinisantes et participent à la réparation de la gaine (Jablonska et al., 2010). La capacité des

29
 Introduction

cellules de la SVZ à produire des OPCs est multipliée par quatre en contexte démyélinisant
comparé aux conditions physiologiques (Menn et al., 2006).

Enfin, la remyélinisation du SNC peut également faire intervenir des cellules de Schwann,
les cellules formant la myéline du système nerveux périphérique comme décrit dans plusieurs
modèles animaux expérimentaux de démyélinisation ainsi que dans les maladies
démyélinisantes humaines (Dusart et al., 1992; Felts et al., 2005; Snyder et al., 1975). Ces
cellules de Schwann présentes dans les lésions du SNC dérivent comme les OLs matures des
précurseurs NG2+ PDGFRα+ et synthétisent de la myéline périphérique notamment constituée
des protéines P0 et PMP22 (Zawadzka et al., 2010). Cette voie de différenciation des OPCs en
cellules de Schwann est proposée être sous l’influence des astrocytes (Bielecki et al., 2016;
Monteiro de Castro et al., 2015). De façon intéressante, une allogreffe de cellules de Schwann
chez des rongeurs après induction d’une EAE augmente la survie des animaux (Zujovic et al.,
2012).

3.3. Rôle de la microgliose et de l’astrogliose réactives

3.3.1. Implication de la microglie activée

La microglie constituée des cellules immunitaires résidentes du SNC et les macrophages

d’origine périphérique jouent un rôle essentiel dans les troubles neuro-inflammatoires. Faisant
partie du système immunitaire inné, cette population de cellules inflammatoires participe à la
physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la SEP (Jack et al., 2005). Les cellules
microgliales et les macrophages étant difficiles à distinguer, nous les engloberons ici sous le
terme de microglie. Dans des conditions pathologiques, la microglie peut être polarisée pour
acquérir des phénotypes et des fonctions distinctes (Colton, 2009). On distingue la microglie
activée pro-inflammatoire (de type M1) et la microglie activée anti-inflammatoire/
immunorégulatrice (de type M2) (Miron et al., 2013; Psachoulia et al., 2016).

Les cellules microgliales M1 sont les premières à être mises en jeu suite à une lésion.
Elles sécrètent des cytokines pro-inflammatoires dont les interleukines (IL)-1, IL-6 et le TNFα
(Tumor necrosis factor alpha) (Jack et al., 2005), des dérivés réactifs à l’oxygène (ROS) ainsi
que des radicaux libres favorisant la destruction des OLs et la démyélinisation (Liu et al., 2015).
De plus, les cellules M1 sont des cellules présentatrices d'antigène conduisant au recrutement et

30
 Introduction

à l’activation des lymphocytes T (Jack et al., 2005). Dans le contexte de la SEP, cela conduit à
une démyélinisation primaire généralisée.

Inversement, les cellules microgliales de type M2 suppriment l'inflammation en favorisant

l'élimination des débris, l'angiogenèse, le remodelage des tissus et la réparation des lésions
(Lassmann, 2014; Mantovani et al., 2013). Par conséquent, la microglie activée peut favoriser la
remyélinisation par la phagocytose des débris de myéline qui sont connus pour inhiber la
différenciation des OLs (Kotter et al., 2005; Robinson and Miller, 1999) et par la sécrétion de
cytokines et de facteurs de croissance favorables à la remyélinisation (Arnett et al., 2004;
Franklin, 2002; Franklin and Hinks, 1999). En accord avec ces observations, la déplétion de la
microglie de type M2 conduit à un retard dans la différenciation des OLs au sein de la lésion
(Miron et al., 2013) alors que l'augmentation de leur densité atténue les symptômes chez les
souris EAE (Denney et al., 2012; Mikita et al., 2011).

A B

Brain
injury

Microglia
activation

Figure 9: Les différentes morphologies de la microglie

(A) Image confocale de néocortex de souris transgénique (CX3CR1 GFP/+ :Thy1-YFP) montrant
la microglie quiescente exprimant la GFP (en vert) qui s’intercale entre les dentrites des neurones
pyramidaux exprimant la YFP (en jaune) (D’après (Eyo and Dailey, 2013). (B) Après une lésion
cérébrale dans le cortex de rat, la morphologie de la microglie ramifiée change rapidement. Les
cellules perdent leurs extensions et deviennent amoéboïdes (Adapté de (Ziebell et al., 2015).

3.3.2. Implication des astrocytes réactifs

En dehors de leur rôle dans le maintien de l’homéostasie du SNC, les astrocytes

interviennent également dans les traumatismes du SNC en particulier dans les processus
démyélinisants. En cas de lésion, ces cellules répondent rapidement. Ce phénomène de
« astrogliose réactive » se caractérise par une induction de l’expression de la GFAP, un
remodelage de la morphologie astrocytaire notamment une hypertrophie des prolongements

31
 Introduction

(Pekny et al., 2016) et une sécrétion abondante de cytokines pro-inflammatoires (IL6, iNOS,
TNFα) et de facteurs de croissance (LIF, IGF1, PDGFα, CNTF) (Sofroniew and Vinters, 2010).

Plusieurs études soulignent les rôles directs et indirects des astrocytes réactifs dans le
processus de remyélinisation. Par exemple, la forte expression de l’endothéline-1 sur les
astrocytes réactifs présents dans les aires démyélinisées est un inhibiteur puissant de la
remyélinisation parce qu’elle induit l’expression du ligand Jagged 1 dans les astrocytes réactifs
qui à son tour active son récepteur Notch dans les OPCs (Hammond et al., 2014; Stidworthy et
al., 2004; Zhang et al., 2009). A l’inverse, le fait que les OPCs endogènes maturent en OLs
myélinisants uniquement en présence d’astrocytes (Bielecki et al., 2016; Talbott et al., 2005)
suggère soit l’absence de facteurs pro-myélinisants d’origine astrocytaire, soit la présence de
signaux inhibiteurs prédominants dans les aires dépourvues d’astrocytes. Dans leur ensemble,
ces données reflètent l’existence vraisemblable de différentes sous-populations d’astrocytes pour
lesquelles des marqueurs bien spécifiques doivent maintenant être identifiés (Nash et al., 2011).

Figure 10: Les différentes morphologies des astrocytes marqués par la GFAP
(A) Astrocyte protoplasmique (à gauche) possédant une morphologie en étoile dans la substance
grise et astrocyte fibreux (au centre) dans le corps calleux chez la souris. Adapté de (Sun and
Jakobs, 2012). A droite, l’astrocyte GFAP+ chez l’Homme possède une morphologie plus
complexe Adapté de (Oberheim et al., 2012). (B) Suite à une lésion dans le SNC, les astrocytes
‘’activés’’ deviennent plus denses et hypertophiés. D’après (Pekny et al., 2016).

32
 Introduction

Par ailleurs, les astrocytes activés peuvent agir indirectement dans la régulation de la
différenciation des OPCs en affectant d’autres cellules présentes dans la lésion. Ainsi, chez les
souris dépourvues du NF-kB astrocytaire (un facteur de transcription qui altère la production de
cytokines pro-inflammatoires), une réduction de l'infiltration de cellules inflammatoires et de la
sécrétion de cytokines par les cellules T est observée dans la moelle épinière après induction de
l’EAE (Brambilla et al., 2014). Cependant, les astrocytes réactifs contribuent aussi à
l'augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par la sécrétion de la
thymidine phosphorylase (TYMP) et du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire A
(VEGF-A) (Argaw et al., 2012; Chapouly et al., 2015).

Figure 11: Les étapes et les populations cellulaires de la remyélinisation

(a) Substance blanche adulte normale. (b) Perte des OLs et destruction de la myéline suite à un
évènement démyélinisant suivie de l’activation des OPCs, des astrocytes et de la microglie. (c)
Phase de prolifération et migration des OPCs qui répondent aux mitogènes et aux facteurs pro-
migratoires secrétés par les astrocytes réactifs et la microglie. Les débris de myéline sont
phagocytés par les macrophages. (d) Phase de différenciation des OPCs et de régénération de
la myéline. D’après (Franklin and ffrench-constant, 2008).

33
 Introduction

3.4. Les différents régulateurs positifs et négatifs

Pour que la remyélinisation ait lieu, plusieurs étapes clés consécutives doivent être franchies
(Figure 11). La première étape est la prolifération des OPCs et leur migration vers les régions
démyélinisées. Cette étape peut être contrôlée par plusieurs facteurs parmi lesquels les facteurs
de croissance PDGF et FGF, capables d’induire une prolifération rapide des OPCs (Carroll and
Jennings, 1994) et les sémaphorines 3A et 3F nécessaires au recrutement des OPCs au cœur
de la lésion (Piaton et al., 2011; Williams et al., 2007).

L’étape suivante consiste en la différenciation des OPCs en OLs remyélinisants. Cette étape
comporte elle-même trois phases : i) l’établissement du contact avec l’axone destiné à être
remyélinisé, ii) l’expression des gènes spécifiques de la myéline et la synthèse de la myéline, iii)
l’enroulement et la compaction de la myéline pour former une gaine (pour revue, ((Fancy et al.,
2011a; Franklin and Ffrench-Constant, 2008)). Par exemple, le facteur de transcription Olig1 qui
possède un rôle primordial dans le développement précoce des OPCs, s’est avéré nécessaire à
la maturation des OLs dans le cadre de la remyélinisation. En effet, les animaux Olig1 KO
présentent une absence quasi totale de régénération de la myéline, malgré un nombre suffisant
d’OPCs recrutés dans les lésions causées par l’intoxication à la cuprizone ou la LPC (Arnett et
al., 2004).

C’est l’étape de différenciation des OPCs et de régénération de la myéline qui semble être
la plus sensible dans ce processus et faire défaut dans les pathologies de la myéline (Kuhlmann
et al., 2008), d’où la nécessité d’identifier les multiples facteurs qui contrôlent ces étapes afin de
pourvoir à terme intervenir pour corriger une défaillance dans ce processus. Le tableau 1
présente une vue d’ensemble des principaux régulateurs extrinsèques et intrinsèques mis en jeu
dans le processus de réparation en dehors des facteurs liés à l’âge ou à l’environnement puisque
la jeunesse et des conditions environnementales propices à l’exercice physique et à
l’enrichissement intellectuel constituent des facteurs positifs pour la remyélinisation (Magalon et
al., 2007; Sim et al., 2002).

34
 Introduction

Tableau 1: Principaux facteurs impliqués dans le processus de remyélinisation.

Facteurs Effets sur les oligodendrocytes et la Voie / mode d'administration chez Références
régénération l'animal

Facteurs de croissance- neurotrophiques

Favorise la prolifération des OPCs et (Fruttiger et al., 1999; Mason
PDGF augmente la remyélinisation et al., 2003; Murtie et al.,
2005; Woodruff et al., 2004)
Induit le recrutement des OPCs vers la (Armstrong et al., 2000;
FGF2 lésion / inhibe la différenciation Messersmith et al., 2000;
Zhou et al., 2012)
Induit la migration et la prolifération des Infusion dans le ventricule latéral ou (Aguirre and Gallo, 2007;
EGF OPCs et augmente la remyelinisation administration intranasale du HB- Cantarella et al., 2008;
EGF induisent le recrutement des Gonzalez-Perez et al., 2009)
OPCs de la SVZ vers les lésions
démyélinisées.
Régule le nombre d'OPCs et induit leur (VonDran et al., 2011)
BDNF différenciation; stimule l'expression des
protéines de la myéline
Induit la prolifération des OPCs et Injection directe dans le corps calleux (Cohen et al., 1996; Jean et
NT-3 augmente la survie des OLs matures induit l'oligodendrogenèse et la al., 2003)
remyélinisation dans un modèle LPC
Favorise la prolifération des OPCs et Transfert adénoviral d'IGF-1 échoue (Mason et al., 2000; Mason et
IGF-1 augmente la remyélinisation à induire la remyélinisation al., 2003; Yao et al., 1995)
Cytokines
Régule négativement le nombre et la (Arnett et al., 2001; Cammer
TNFα différenciation des OPCs and Zhang, 1999)
Induit la prolifération, la migration et la (Patel et al., 2010)
CXCL12 maturation des OLs
Accélère la différenciation des OLs (Mason et al., 2001a)
IL-1β

Favorise la prolifération, la maturation des Dans un modèle LPC, le ciblage des (Deverman and Patterson,
LIF OPCs et augmente la réparation de la progéniteurs NG2+ par des 2012; Marriott et al., 2008;
myéline nanoparticules délivrant le LIF Rittchen et al., 2015)
augmente le nombre d'axones
myélinisés et l'épaisseur de la
myéline.
Diminue l'inflammation et augmente le (Psachoulia et al., 2016)
IL-4I-I nombre des OLs matures
Augmente la remyélinisation en favorisant (Yuen et al., 2013)
Endothéline 2 la formation de la gaine de myéline

Favorise la prolifération et la migration des (Tanaka et al., 2013;

CNTF OPCs de la SVZ et induit leur maturation Vernerey et al., 2013)
Hormones
Favorise la maturation des OPCs et induit Dans le modèle cuprizone, l'injection (Bogazzi et al., 1994;
T3 (triiodothyronine) l'expression de la MBP et de la PLP dans systémique de T3 chez les rats Dell'Acqua et al., 2012;
les OLs matures augmente le ratio OLs Franco et al., 2008; Harsan et
matures/OPCs; Dans le modèle EAE, al., 2008)
le traitement par la T3 favorise la
formation de la gaine de myéline, la
protection axonale et augmente la
conduction nerveuse
Favorise la prolifération et la migration des Le traitement par la progestérone ou (El-Etr et al., 2015; Hussain
Progestérone/PR OPCs la néstorone augmente la et al., 2011; Schumacher et
remyélinisation des axones dans des al., 2012)
tranches de cervelet démyélinisées
par la LPC et dans des lésions
chroniques du corps calleux et du
cortex cérébral
Favorise le recruitement des astrocytes Le traitement à la testostérone (Bielecki et al., 2016; Hussain
Téstostérone/AR favorable à la prolifération et la stimule la régénération de la myéline et al., 2013)
différenciation des OLs dans un modèle de démyélinisation
chronique sévère chez la souris

35
 Introduction

Facteurs Effets sur les oligodendrocytes et la "Voie / mode d'administration Références

régénération chez l'animal"

Facteurs de transcription
Crucial pour la différenciation des OLs et la (Arnett et al., 2004)
Olig1 réparation de la myéline

Module la prolifération des OPCs et régule (Nielsen et al., 2004; Vana et

Myt1 leur différenciation al., 2007)

Induit la différencitation des OPCs et la (Ming et al., 2013)

Sox17 survie des OLs

Augmente la différencitation des OPCs et la La surexpression inductible d'Olig2 (Wegener et al., 2015)
Olig2 remyélinisation chez les souris TetOlig2:Sox10
(rtTA/+) favorise la réparation des
lésions induite par la LPC

Favorise la maturation des OLs L’administration de l’acide rétinoïque (Huang et al., 2011; Yang et
RXR-γ 9-cis, sur des tranches de cervelet al., 2016)
démyélinisées permet d’accélérer la
remyélinisation axonale; Le
traitement EA peut activer la
signalisation RXR favorisant la
différenciation des OPC en OL dans
des lésions de la moelle épinière.
Autres voies de signalisation
Retarde la maturation des OPCs et la (Hammond et al., 2014; Zhang
Notch remyélinisation et al., 2009)
Inhibe la différenciation des OPCs et la La petite molécule XAV-939 qui (Fancy et al., 2011a; Fancy et
Wnt /β-caténine remyélinisation stabilise le niveau de l'Axine 2 al., 2009; Fancy et al., 2011b)
inhibitrice de la β-caténine, favorise
la différenciation des OLs et accélère
la remyélinisation
Induit la prolifération et la différenciation des La surexpression adénovirale de Shh (Ferent et al., 2013)
Shh OLs; diminue l'astrogliose et la microgliose diminue la taille de la lésion et
réactives augmente le nombre
d'oligodendrocytes
Inhibe la remyélinisation et empêche la L'infusion de l'antagoniste des BMP (Ara et al., 2008; Bae et al.,
BMP récupération Noggin dans les lésions augmente la 2009; Fuller et al., 2007;
densité des OLs matures dans le Jablonska et al., 2010; Sabo et
corps calleux. Son antagoniste al., 2011)
Chordine induit l'oligodendrogenèse
dérivée de la SVZ.
Autres régulateurs
Stimule la migration des OPCs de la SVZ et (Cayre et al., 2013; Spassky et
Nétrine-1 du nerf optique al., 2002)S
Stimule la génération des OLs et augmente (Goudarzi et al., 2016)
Gas6 la production de la myéline

Inhibe la différenciation des OPCs et la Anti-LINGO1 accélère la (Mi et al., 2008; Mi et al., 2007;
LINGO-1 remyélinisation remyélinisation et la conduction Mi et al., 2009; Pepinsky et al.,
axonale 2011a)
Nécessaire pour l'enrobage de la myéline et (Hoyos et al., 2016)
Gal-3 (Galectine-3) le maintien des axones
Inhibe l'activation des gènes de la myéline (Shen et al., 2008)
HDAC et la remyélinisation

Facteurs positifs à la remyélinisation / facteurs négatifs à la remyélinisation

36
 Introduction

Chapitre 3. La voie Sonic Hedgehog et son implication

dans la régulation du système nerveux central

Parmi les nombreuses voies de signalisation fondamentales identifiées depuis la

drosophile jusqu’à l’humain, la voie Hedgehog (Hh) est connue pour réguler la prolifération, la
croissance et la mise en place de la plupart des tissus, y compris le système nerveux. Une
activation aberrante ou une insuffisance d’activité de cette voie sont respectivement à l’origine de
cancers et d‘anomalies du développement. Ce chapitre récapitule les connaissances actuelles
sur la signalisation Hh dans le système nerveux central (SNC), en particulier celles concernant
les mécanismes d'action canoniques et non canoniques associés à cette voie, le contrôle Hh-
dépendant de la genèse et du maintien du lignage oligodendrocytaire et son implication dans les
pathologies du SNC, notamment les pathologies démyélinisantes.

1. Les protéines Hedgehog : identification, biogenèse,

sécrétion et transport

Les protéines de la voie Hedgehog (Hh) sont des protéines sécrétées appartenant à la
famille des morphogènes. Ces molécules contrôlent le développement et l'homéostasie tissulaire
et participent à la spécification de différents types cellulaires en fonction de leur concentration
dans l’environnement. Le gène Hh a été identifié pour la première fois en 1980, dans un criblage
génétique réalisé chez la drosophile par Christian Nüsslein-Volhard et Eric Wieschaus (Nusslein-
Volhard and Wieschaus, 1980). Ils reçurent le Prix Nobel de Médecine en 1995 pour leur
découverte des gènes de polarité segmentaire de l’embryon de drosophile parmi lesquels le gène
Hh. La perte de fonction de la protéine Hh conduit à l’apparition de denticules recouvrant la
majorité du corps de l’animal et lui donnant l’aspect d’un hérisson, d’où l’origine du nom
‘Hedgehog’.

Des gènes orthologues de la famille Hh ont ensuite été identifiés dans plusieurs espèces
telles que, le poisson zèbre (Krauss et al., 1993; Roelink et al., 1994), le poulet (Riddle et al.,
1993), la souris (Echelard et al., 1993), le xénope (Ekker et al., 1995) et l’Homme (Marigo et al.,
1995) (Figure 12). Chez les vertébrés, Sonic hedgehog (Shh), Indien hedgehog (Ihh) et Desert
hedgehog (Dhh) forment une famille de protéines sécrétées jouant un rôle clé dans la mise en

37
 Introduction

place des tissus embryonnaires. Shh est en particulier impliqué dans le développement du SNC.
Dhh et Ihh sont notamment reconnus pour leur activité respective au cours du développement du
tissu nerveux périphérique et du tissu osseux. Bien qu’il s’agisse de trois gènes différents, les
protéines correspondantes partagent des mécanismes de synthèse, de sécrétion et de transport
similaires (Gallet, 2011).

Figure 12: La famille Hedgehog

(A) Illustration du mutant Hedgehog (à droite) comparé à une larve de drosophile normale (à
gauche). Chez le mutant, on observe une taille globalement réduite et le rapprochement des
différents segments constituant le corps de la mouche. D’après (Nusslein-Volhard and
Wieschaus, 1980). (B) Phylogramme illustrant l'évolution des protéines Hh. Les différentes
protéines ont été alignées en utilisant le logiciel PRANKSTER. Les sous-familles Hh sont
indiquées par un code couleur : Dhh (bleu), Shh (vert) et Ihh (rouge) D’après (Varjosalo and
Taipale, 2008).

1.1. Synthèse et maturation

Les protéines Hh sont d’abord synthétisées sous la forme d’une protéine-précurseur de

45 kDa qui subit de multiples modifications post-traductionnelles dans le réticulum
endoplasmique avant d’être sécrétée hors de la cellule, via des mécanismes conservés au cours
de l’évolution des espèces (pour revue, (Varjosalo and Taipale, 2008)) (Figure 13). Ces
modifications impliquent un premier clivage de l’extrémité N-terminale du précurseur

38
 Introduction

correspondant à la séquence signal, et un deuxième clivage auto-protéolytique de la partie C-

terminale qui possède des caractéristiques d’intéines. Ces clivages génèrent un peptide C-
terminal (Hh-C ou Shh-C) et un peptide N-terminal biologiquement actif (Hh-N ou Shh-N)
respectivement de 25 et 20 kDa. L’autoprotéolyse du précurseur s’accompagne de l’addition
covalente d’un groupement cholestérol sur l’exptrémité N-terminale du peptide amino-terminal
(Porter et al., 1996). Enfin, sur la cystéine du peptide amino-terminal (exposée après clivage du
peptide signal, un acide palmitique est ajouté par l’acyltransférase, Skn (Chen et al., 2004) ou
Hhat (Buglino and Resh, 2008) chez les vertébrés, et Ski chez la drosophile (Chamoun et al.,
2001).

Ces deux modifications lipidiques sont essentielles à l'activité de la signalisation Hh.

L'addition du cholestérol est considérée comme une modification post-traductionnelle rare. Elle
augmente la lipophilie des protéines Hh, favorise leur ancrage dans la membrane plasmique et
limite par conséquent un relargage inapproprié de la protéine (Chen et al., 2004). Mais de façon
inattendue, cette modification semble également avoir un rôle important dans le transport à
longue distance des protéines Hh actives en participant notamment à la constitution du gradient
de concentrations caractéristique des morphogènes. En accord avec cette hypothèse, la mutation
du site de liaison du cholestérol accroît l’étendue du gradient tout en réduisant l’activité de la
protéine (pour revue, (Briscoe and Therond, 2013)).

Cependant des données plus récentes rapportent qu’une forme non modifiée par le
cholestérol peut aussi être libérée par de nombreuses cellules chez les mammifères comme chez
la drosophile. Les deux formes semblent avoir des rôles complémentaires sur l’activité de la
signalisation Hh, ce qui laisse penser que la quantité absolue de protéines Hh, mais aussi les
proportions relatives des différentes formes participent de manière complexe à l’activité de la voie
grâce à la création de gradients plus complexes que ce que l’on imaginait initialement (Palm et
al., 2013).

L’addition de l’acide palmitique confère quant à elle aux protéines Hh une activité 40 à
160 fois plus élevée que celle de la forme non palmitoylée (Buglino and Resh, 2008). L’inhibition
de Hhat par l'inhibiteur RU-SKI 43, conduit à l’inhibition de la signalisation Hh indiquant le rôle
critique de l’enzyme et de la palmitoylation qu’elle induit (Rimkus et al., 2016).

1.2. Sécrétion et transport

La libération des différentes formes des protéines Hh par les cellules qui les synthétisent
a fait l’objet de multiples études (pour revue, (Eaton, 2008)). La forte hydrophobicité des protéines

39
 Introduction

Hh modifiées par les lipides (Hh-Np) a conduit à émettre plusieurs hypothèses pour expliquer leur
relargage dans le milieu extracellulaire notamment leur interaction avec différentes protéines
telles que la protéine à 12 segments transmembranaires Dispatched (Disp) ou des composantes
de la matrice extracellulaire comme les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPGs) (pour revue,
(Briscoe and Therond, 2013)) (Figure 13).

Disp s’apparente à la famille des transporteurs de type RND (Résistance Nodulation

Division) et possède un domaine sensible aux stérols. Disp et la protéine sécrétée Scub2
interagissent avec différentes régions de la molécule de cholestérol pour libérer Hh-Np et
permettre son activité à longue distance (Tukachinsky et al., 2012). Plus récemment, D’angelo et
collaborateurs ont montré que Disp permet en plus l’internalisation de Hh-Np puis son recyclage
par un mécanisme dépendant des protéines Rab, un processus nécessaire pour promouvoir
l’activité à longue distance des protéines Hh (D'Angelo et al., 2015).

Les HSPGs sont quant à eux attachés à la membrane plasmique des cellules par une
ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ils supportent la formation de multimères / oligomères
de Hh-Np (pour revue, Varjosalo and Taipale, 2008 ; Briscoe and Therond, 2013). Les complexes
HSPGs / Hh-Np peuvent recruter la lipoprotéine lipophorine permettant l’assemblage des
multimères en particules lipoprotéiques qui sont ensuite libérées de la membrane plasmique par
Notum, une enzyme proche des phospholipases C. Par ailleurs, les multimères assemblés à la
surface de la cellule productrice peuvent être internalisés, puis conditionnés dans des vésicules
intraluminales qui après fusion avec la membrane plasmique sont libérées sous forme
d’exovésicules ou exosomes. Alternativement si des sheddases, des enzymes de la famille
ADAM qui conduisent à l’élimination des groupements cholestérol et palmitate sur les protéines
Hh-Np, sont présentes à la surface de la cellule productrice, les protéines Hh sont libérées sous
forme de multimères non associés à des lipides (Jakobs et al., 2016; Jakobs et al., 2014;
Parchure et al., 2015).

Enfin, un autre mécanisme de communication a été également rapporté entre les cellules
produisant et les cellules répondant au ligand Hh au niveau des bourgeons des membres chez
le poulet. Ce mécanisme repose sur l’émission d’extensions (ou filopodes) contenant soit le ligand
Hh dans le cas des cellules émettant le signal soit ses récepteurs (en particulier Cdo et Boc) dans
le cas des cellules recevant le signal (Sanders et al., 2013). De nombreuses questions demeurent
notamment sur l’existence d’un tel mécanisme dans d’autres types cellulaires et la nature du
moteur moléculaire permettant le transport des protéines Hh le long de ces filopodes.

40
 Introduction

Figure 13: Biogenèse et sécrétion de la protéine Hedgehog

Les protéines Hedgehog sont synthétisées sous forme d’un précurseur de 45 kDa. Elles
subissent plusieurs modifications post-traductionnelles dans le réticulum endoplasmique (ER).
Ces modifications sont montrées plus en détail dans l’encart situé en bas de la figure. La
séquence signal est clivée (1), le domaine autocatalytique (HH-C) induit la protéolyse du
précurseur libèrant le segment N-terminal HH-N (2) et participe à l’addition d’une molécule de
cholestérol à son extrémité C-terminale avant d’être dégradé par le protéasome (3).
L’acyltransférase Skinny (SKI) hedgehog ajoute un acide palmitique en N-terminal de HH-N (4)
conduisant à la forme finale (HH-Np). Adaptée de (Varjosalo and Taipale, 2008). Une fois à la
surface externe de la cellule, HH-Np est associé à la bicouche lipidique de la membrane
plasmique. Sa libération peut se faire par l’un des mécanismes suivants: (1) sécrétion du
monomère sous l’action coopérative de DISP et SCUBE2, (2) association de plusieurs
monomères en multimères qui se libèrent de la membrane en présence de sheddases. (3)
recrutement d’apolipoprotéines via les chaines héparane sulfates des glypicans permettant aux
multimères de s’assembler en particules lipoprotéiques. (4) libération à la surface d‘exovésicules.
Adaptée de (Briscoe and Thérond, 2013).

41
 Introduction

2. Transduction du signal Sonic Hedgehog

2.1. La voie canonique

Le modèle classique de transduction du signal Hh est décrit chez les vertébrés au niveau
du cil primaire, une organelle présente à la surface de la plupart des cellules de vertébrés et
constituant le site de rassemblement des différentes composantes de certaines voies de
signalisation (Szymanska and Johnson, 2012). Ce modèle implique un complexe de récepteurs
comprenant d’une part le principal récepteur des protéines Hh, Patched (Ptc), une protéine à 12
domaines transmembranaires possédant comme précédemment décrit pour Disp, un domaine
sensible aux stérols, et d’autre part l'un des co-récepteurs du ligand, à savoir les protéines de
surface cellulaire de la famille des immunoglobulines / fibronectines comme Cdon/Ihog et Boc/Boi
(chez vertébrés/drosophile), ou la glycoprotéine à ancre GPI, Gas-1 (chez les vertébrés) (Izzi et
al., 2011). La glycoprotéine Hip (Hedgehog interacting protein) quant à elle est un récepteur des
protéines Hh, mais a été caractérisée comme un antagoniste physiologique de ces protéines
chez les vertébrés (Chuang et al., 2003).

En absence de Shh, Ptc exerce une activité répressive sur Smoothened (Smo), protéine
à 7 domaines transmembranaires qui appartient à la superfamille des récepteurs couplés aux
protéines G, en particulier à la sous-famille des récepteurs Frizzled (Schulte, 2010). La liaison de
Shh sur ses récepteurs, lève l’inhibition exercée par Ptc sur Smo, ce qui déclenche une cascade
de signalisation intracellulaire complexe aboutissant à l’activation des facteurs de transcription
de la famille Gli chez les vertébrés, permettant ainsi la transcription des gènes cibles de la voie
entre autres Ptc et Gli1 (pour revue, (Briscoe and Therond, 2013; Robbins et al., 2012)).

La transcription de Gli1 reflète le niveau d'activation de la voie Hh tandis que les autres
membres de la famille, Gli2 et Gli3, fonctionnent respectivement comme activateur (GliA) et
répresseur (GliR) transcriptionnels (Sasaki et al., 1999).En l’absence de ligand Hh, Gli1 existe
sous forme de complexe avec la protéine Supressor of fused (Sufu) qui l’empêche d’entrer dans
le noyau. Quant à Gli2 et Gli3, elles sont phosphorylées et adressées au protéasome où elles
sont alternativement dégradées (Gli2) ou clivées pour générer un fragment N-terminal doté d’une
activité répressive (Gli3). En présence de Hh, Gli2 et Gli3 ne sont pas clivées. La forme longue
de Gli2 est un activateur transcriptionnel, tandis que celle de Gli3 théoriquement activatrice, est
rapidement dégradée (pour revue, (Robbins et al., 2012)) (Figure14).

42
 Introduction

Figure 14: La voie canonique de Shh

En absence de Shh, Ptch1 inhibe Smo. La séquence complète de Gli2 est dégradée par le
protéasome et celle de Gli3 est clivée pour générer le répresseur Gli3 (Gli3R) bloquant la
transcription. Shh active la signalisation en se liant à ses récepteurs Ptch1, Boc, Cdon ou Gas1
levant l’inhibition sur Smo. L’activation de Smo stimule le clivage protéolytique de Gli2 puis sa
translocation dans le noyau induisant la transcription des gènes cible de la voie. Adaptée de (Yam
and Charron, 2013).

2.1.1. Les mécanismes d’interaction proposés entre Ptc et Smo

Comme précédemment mentionné, Ptc représente le récepteur majeur des protéines Hh.
L’affinité du peptide Hh-N pour Ptc est de l’ordre du nanomolaire (Marigo et al., 1996) (pour revue,
(Briscoe and Therond, 2013; Varjosalo and Taipale, 2008)). La fixation du ligand sur son
récepteur est suivie de l’internalisation rapide du complexe formé et par conséquent de la
diminution du nombre de récepteurs Ptc disponibles à la surface de la cellule. La transcription de
Ptc étant elle-même induite par l’activation de la voie Hh, une boucle de rétrocontrôle s’établit
puisque le récepteur Ptc nouvellement généré permet de limiter l’activation de la voie et/ou de
réduire la quantité de ligand libre qui pourrait diffuser dans le tissu de façon inappropriée
(Dessaud et al., 2007). De façon intéressante, Ptc participe à la formation du gradient de

43
 Introduction

concentrations des protéines Hh. Ce gradient serait fonction du rapport existant entre les
récepteurs Ptc liés au ligand et les récepteurs Ptc libres, mais aussi de la quantité totale de
récepteurs Ptc exprimés à la surface cellulaire (Casali, 2010).

Le ou les mécanismes précis permettant l’inhibition de Smo par Ptc continuent à susciter
la curiosité des scientifiques. L’hypothèse d’une interaction directe a été proposée suite à des
expériences de co-immunoprécitpitation, mais elle fut rapidement démentie par des études
ultérieures. Plusieurs observations vont à l’encontre de cette hypothèse. Les profils d’expression
de Ptc et Smo ne sont pas toujours superposables comme montré dans le cerveau post-natal
chez les mammifères (Traiffort et al., 1998). De même, les deux protéines ne sont pas
systématiquement co-localisées à l’échelle subcellulaire chez la drosophile (Denef et al., 2000;
Incardona et al., 2002). Par ailleurs, une seule molécule de Ptc est capable d’inhiber de
nombreuses molécules de Smo, ce qui caractérise un mode d’action catalytique et non
stœchiométrique (Ingham et al., 2000).

La structure de Ptc, similaire à celle des pompes à petites molécules de type RND,
suggère que ce récepteur pourrait agir en transportant une molécule qui serait directement
responsable de la régulation de l’activité de Smo (Taipale et al., 2002). En accord avec cette
hypothèse, des études in vitro et in vivo chez le poisson zèbre proposent la vitamine D3 comme
un régulateur négatif de l’activité de Smo (Bijlsma et al., 2006). Les oxystérols (des intermédiaires
de synthèse dans la voie de biosynthèse du cholestérol) ont été caractérisés comme des
activateurs de Smo probablement requis pour la signalisation endogène (Nedelcu et al., 2013).

L’implication de Ptc dans l’efflux du cholestérol des cellules a été montrée. Elle pourrait
permettre la stabilisation de Smo à la surface de la membrane plasmique (Bidet et al., 2011). De
plus, Ptc pourrait empêcher l’accumulation de phospholipides membranaires notamment les
phosphatidyl-inositol-4 phosphate (PIP4), qui participent à la localisation membranaire et à
l’activité de Smo (Yavari et al., 2010). Enfin, les endocannabinoïdes viennent d’être identifiés
comme une classe de lipides capables de bloquer la signalisation Hh vraisemblablement au
niveau de Smo (Khaliullina et al., 2015). Il est intéressant de noter qu’à l’inverse, Smo régule Ptc
puisque la dégradation de Ptc par les ubiquitines ligases de la famille des Smurfs dépend de Smo
(Huang et al., 2013).

44
 Introduction

2.1.2. De l’activation de Smo vers l’induction des Glis : quel est le rôle du cil
primaire ?

Smo appartient à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) et plus
spécifiquement à la classe des récepteurs Frizzled. Ces récepteurs comportent 7 domaines
transmembranaires et un domaine riche en cystéines (CRD pour ‘Cystein Rich Domain’). La
cristallisation des domaines transmembranaires, puis celle du domaine CRD et enfin de
l’ensemble du récepteur ont été réalisées (Byrne et al., 2016; Nachtergaele et al., 2013; Wang et
al., 2013). Le domaine CRD s’avère être un site de liaison des oxystérols et de plus être
absolument indispensable à la signalisation des ligands Hh natifs (Nachtergaele et al., 2013). La
superposition dans l’espace du domaine CRD et des domaines transmembranaires semble
contribuer à stabiliser Smo dans un état inactif. Plus surprenant encore, une molécule de
cholestérol a été détectée dans le site de liaison du domaine CRD. Elle permet à Smo de
transmettre les signaux Hh natifs (Byrne et al., 2016).

Au niveau de ses domaines intracellulaires, Smo est activé par la phosphorylation de

plusieurs sites situés dans son extrémité C-terminale (Jia et al., 2004). Ces phosphorylations sont
censées contrebalancer les interactions électrostatiques qui maintiennent Smo dans sa
conformation inactive (Zhao et al., 2007). Plusieurs kinases sont impliquées, mais la grande
conservation des sites GRKs suggère que la régulation de Smo par ces enzymes est essentielle
au déclenchement de la signalisation intracellulaire en aval du récepteur (Maier et al., 2014).

Le changement conformationnel faisant passer Smo de l’état inactif à l’état actif

s’accompagne de sa dimérisation et de sa translocation à la surface de la cellule. Le niveau
d’activation de Smo est fonction du degré de phosphorylation du récepteur. Ainsi, la caséine
kinase 1γ permettrait d’atteindre le niveau d’activation maximal du récepteur (Li et al., 2016).

Le cil primaire, caractéristique de la signalisation Hh chez les vertébrés (Goetz and

Anderson, 2010), est une organelle composée d’un corps basal formé par les centrioles mère et
fille, d’un faisceau de microtubules centraux connu sous le nom d’axonème, des complexes
protéiques constituant la ‘zone de transition’ et de la membrane ciliaire. Le transport dans et en
dehors du cil est un processus très finement régulé et, des mutations des protéines structurelles
du cil primaire conduisent à des pathologies appelées ciliopathies (Srymanska K et al, Cilia,
2012).

Localisé dans la membrane ciliaire lorsque son ligand est absent, Ptc sort du cil lors de la
fixation de la protéine Hh. Ce mouvement de Ptc s’accompagne de la translocation de Smo

45
 Introduction

phosphorylé dans le cil, un processus médié par la -arrestine et KIF3A, un membre de la famille
des protéines de transport intra-flagellaires (IFT) (Corbit et al., 2005; Kovacs et al., 2008; Rohatgi
et al., 2007).

La translocation de Smo est concommitante avec la sortie de GPCR161, un régulateur négatif

de la signalisation Hh qui en accroissant les niveaux d’AMPc favorise la protéolyse des facteurs
Gli en leur forme répressive (Mukhopadhyay et al., 2013). La présence de Smo dans le cil
s’accompagne d’une augmentation des protéines Gli à l’extrémité distale du cil. Le complexe
Sufu/Gli se dissocie pour permettre aux facteurs Gli d’être transloqués dans le noyau (pour revue,
Briscoe and Therond, 2013). La localisation appropriée des facteurs de transcription Gli dans le
cil est médiée par la kinésine Kif7 (He et al., 2014).

2.2. Les voies non-canoniques indépendantes de Gli

A côté de la voie canonique aboutissant à l’activation de la transcription de gènes cibles

et qui est principalement impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire, des voies
non-canoniques indépendantes des facteurs de transcription Gli ont aussi été décrites (pour
revue, (Brennan et al., 2012; Ferent and Traiffort, 2015; Robbins et al., 2012)). Les voies non-
canoniques identifiées chez les vertébrés sont les mieux caractérisées et seront les seules à être
décrites dans ce manuscrit. Ces voies non-canoniques se répartissent en mécanismes de type 
impliquant Ptc (mais pas Smo) et de type  impliquant Smo de manière dépendante (IIa) ou
indépendante (IIb) du cil primaire (Figure 15).

Les voies non-canoniques de type I décrites jusqu’à maintenant contrôlent la prolifération

et la survie cellulaire. La première de ces voies repose sur l’interaction de la troisième boucle
intracellulaire de Ptc (en l’absence de son ligand) avec la cycline B1. La rétention de cette cycline
hors du noyau ralentit la progression du cycle cellulaire. A l’inverse, la présence du ligand Hh
modifiant vraisemblablement la conformation du récepteur Ptc réduit son affinité pour la cycline
B1 tout en augmentant celle pour la kinase GRK2 induisant ainsi la mitose (Barnes et al., 2001;
Jiang et al., 2009). La seconde voie non-canonique de type I repose sur la caractérisation de Ptc
comme un récepteur à dépendance. En effet, en l’absence de son ligand, Ptc induit une apoptose
cellulaire indépendante de la voie de signalisation canonique. Pour induire cette apoptose, Ptc
doit être clivé par des caspases afin d’exposer son domaine pro-apoptotique qui lui permet de
recruter un complexe constitué de la caspase 9, de DRAL et de TUCAN-1 (Mille et al., 2009;
Thibert et al., 2003).

46
 Introduction

Les mécanismes de signalisation Hh non-canoniques de type II sont définis comme des

cascades de signalisation Smo-dépendantes et Gli-indépendantes destinées au réarrangement
du cytosquelette, à la modulation des signaux calciques intracellulaires ou au contrôle du
métabolisme cellulaire. En tant que GPCR fonctionnel, Smo possède une sélectivité pour les
protéines hétérotrimériques Gi notamment caractérisées par leur sensibilité à la toxine
pertussique (PTX). La capacité de Smo à agir comme un GPCR classique a été associée à
certaines réponses canoniques de la voie telles que la prolifération des progéniteurs des cellules
granulaires du cervelet induite par Shh (Barzi et al., 2011). Cependant elle est surtout considérée
comme un mécanisme de signalisation Hh non-canonique dans différents contextes tels que la
migration des fibroblastes, la tubulogenèse des cellules endothéliales (Chinchilla et al., 2010;
Polizio et al., 2011), le switch métabolique induit par l’activation d’un axe Smo-Ca2+-Ampk dans
les adipocytes et le muscle squelettique (Teperino et al., 2012) ou, le déclenchement de pics
d’activités calciques dans le cil primaire des neurones post-mitotiques de la moelle épinière
(Belgacem and Borodinsky, 2011). Enfin, la stimulation de l’activité de la famille des Src kinases
par Shh via Boc et de façon Smo-dépendante est un autre exemple de signalisation non-
canonique qui contrôle le guidage des axones commissuraux (Yam et al., 2009) (voir Chapitre 4)

Figure 15: Les différents types de voies non canoniques de Shh

D’après (Teperino et al., 2014)

47
 Introduction

3. Shh et le lignage oligodendrocytaire

Le morphogène Shh a été initialement caractérisé comme un signal essentiel à la

ventralisation du tube neural. Depuis cette découverte, la signalisation Hh a été impliquée dans
des activités très diversifiées allant du guidage axonal au cours du développement au contrôle
de l’activité électrique des neurones matures dans le SNC adulte (pour revue, (Ferent and
Traiffort, 2015; Traiffort et al., 2010)). Dans ce paragraphe seront décrits les différents rôles
physiologiques de Shh dans le développement du lignage oligodendrocytaire chez l’embryon et
en période post-natale (pour revue, (Traiffort et al., 2016) ainsi que l’implication de la voie dans
le processus de remyélinisation. Nous terminerons en citant brièvement les autres rôles de la
signalisation Hh dans le SNC.

3.1. Au cours du développement embryonnaire

3.1.1. Dans la moelle épinière

Shh est produit à la fois par la notochorde (le mésoderme qui sous-tend la moelle épinière
ventrale) et la plaque de plancher (le type cellulaire le plus ventral de la moelle épinière) au niveau
de la ligne médiane ventrale du tube neural. Le morphogène forme un gradient de concentrations
ventro-dorsal qui est interprété par les progéniteurs afin d’établir des profils d'expression de
plusieurs facteurs de transcription à homéodomaines ou de type hélice-boucle-hélice (bHLH).
L’expression combinée de ces gènes (dits de classe I s’ils sont réprimés par Shh ou de classe II
s’ils sont activés par Shh) divise ainsi la partie ventrale du tube neural en 5 domaines qui vont
générer des sous-types spécifiques de motoneurones et d’interneurones au moment où la
différenciation neuronale est initiée. De la partie dorsale vers la partie ventrale, ces domaines
sont nommés, p0, p1, p2, pMN et p3 et génèrent respectivement les neurones V0, V1, V2, les
motoneurones MN et les neurones V3. Les régions les plus ventrales, p3 et pMN sont
respectivement définies par l’expression des facteurs de transcription Nkx2.2 et Olig2 (Briscoe
et al., 2000; Briscoe et al., 1999; Dessaud et al., 2010; Ericson et al., 1997) (Figure 16A).

Dans les années 1990, la démonstration par plusieurs groupes que la génération des OLs
est restreinte au domaine pMN et dépend de la présence de la notochorde et/ou de la plaque du
plancher (Poncet et al., 1996; Pringle et al., 1996) a conduit à suggérer que Shh produit par ces
deux structures pouvait être le facteur impliqué dans la spécification des OPCs. En accord avec

48
 Introduction

cette hypothèse, l’expression ectopique de Shh dans la ligne médiane dorsale induit la production
de nombreuses cellules oligodendrocytaires dans la région adjacente à cette source ectopique
de Shh (Rowitch et al., 1999). De plus, l’expression de Shh est complètement compatible avec
l’apparition des OPCs dans la moelle épinière ventrale du poulet (Orentas et al., 1999; Soula et
al., 2001).

Les facteurs de transcription de type bHLH, Olig1 et Olig2, critiques pour la spécification
des OPCs, sont les cibles de la signalisation Shh dans ce processus. Le morphogène est
apparemment nécessaire et suffisant pour l'expression de ces facteurs. De plus, dans les souris
Shh knockout, une absence complète de transcrits Olig est observée dans les zones exprimant
normalement Shh (Lu et al., 2000).

Les premiers OPCs étant générés à E12.5 dans le domaine pMN qui quelques jours
auparavant (E10.5) génère des motoneurones, de nombreuses études ont été menées afin de
comprendre le mécanisme de cette transition motoneurones/OPCs. Ces travaux démontrent que
le domaine générant les OPCs est situé dans la partie la plus ventrale du domaine Nkx2.2+ du
neuroepithelium chez le poulet et non pas dans le domaine adjacent Pax6+ à partir duquel
émergent les motoneurones (Soula et al., 2001). De façon intéressante, Shh participe à la
transition motoneurones/OPCs et donc à la mise en place du domaine d’où dérivent les OPCs,
notamment en maintenant l’expression d’Olig2 dans le domaine pMN, en favorisant l’extension
dorsale du domaine Nkx2.2 et en induisant la régression du domaine Pax6 qui a lieu entre E5 et
E6 chez le poulet (Agius et al., 2004). Le mécanisme moléculaire à l’origine de cette activité de
Shh implique l’accumulation de la protéine Shh à la surface des progéniteurs sous l’influence de
la sulfatase 1, un régulateur des HSPGs. (Al Oustah et al., 2014; Danesin et al., 2006; Touahri et
al., 2012).

Des travaux plus récents de Ravanelli et collaborateurs utilisant des protéines

photoconvertibles exprimées par un transgène Olig2 et l’imagerie à intervalles de temps réguliers,
indiquent par ailleurs que la majorité des motoneurones et des OPCs dérivent de lignages de
progéniteurs distincts. La ségrégation de ces deux populations de cellules résulte du recrutement,
via les protéines Hh, de progéniteurs de cellules gliales qui à partir d’un domaine en position
dorsale par rapport au pMN se déplace ventralement et progressivement vers le domaine pMN
après la période de neurogenèse, mais avant de commencer à exprimer Olig2 et à générer des
OPCs (Ravanelli and Appel, 2015).

Comme nous l’avons déjà mentionné dans le Chapitre 1, Shh ne participe pas à la
seconde vague de production des OPCs qui débute vers E15.5 dans le tube neural dorsal (Figure

49
 Introduction

16B). Comme 80% des cellules du lignage oligodendrocytaire sont d’origine ventrale dans la
moelle épinière de l’adulte, les populations d’OLs chez l’adulte sont donc majoritairement celles
générées de façon Shh-dépendante (Tripathi et al., 2011).

3.1.2. Dans le cerveau postérieur et le mésencéphale

Comme dans la moelle épinière en développement, les premiers OPCs de la partie la plus
caudale du cerveau sont générés à partir de progéniteurs ventraux chez la souris, le poulet et le
poisson zèbre (Alberta et al., 2001; Davies and Miller, 2001; Lu et al., 2000; Park et al., 2002).
Chez le poulet, la zone ventriculaire ventrale est le site où les premiers OPCs sont détectés dans
le métencéphale (la région à l’origine du pons et du cervelet) chez le poulet au stade 26. Entre
les stades 26 et 34, les OPCs envahissent les parties latérales et dorsales du métencéphale
d’une manière rostro-caudale. D’autres domaines ventriculaires en position plus latérale et plus
dorsale génèrent aussi une population restreinte d’OPCs d’apparition un peu plus tardive et
correspondant à environ 20% de l’ensemble des OPCS produits (Alberta et al., 2001). Tous les
domaines générant des OPCs sont corrélés avec l’expression transitoire de Shh dans le tissu
adjacent. L’injection de l’anticorps Shh mAb5E1 au stade 19 conduit à une diminution dramatique
du nombre d’OPCs générés (Davies and Miller, 2001). Chez la souris (Alberta et al., 2001) et le
poisson zèbre (Park et al., 2002), ce processus dépend aussi de la signalisation Shh et des
facteurs de transcription Olig1/2. Le mutant Smo homozygote chez le poisson zèbre présente
une absence totale de cellules Plp/dm20 dans le cerveau caudal où la signalisation Hh contrôle
non seulement l’expression d’Olig2 mais aussi de Nkx2.2a.

Dans le mésencéphale, Shh est détecté à proximité des cellules Olig2+ qui émergent de
la zone ventriculaire ventrale et dorsale (Fu et al., 2003). Par ailleurs, la bande parabasale, une
petite région du neuroépithélium mésencéphalique a récemment été proposée comme étant la
source de la majorité des OPCs présents dans le cervelet (Mecklenburg et al., 2011). L'implication
de Shh dans la spécification de cette population d’OPCs reste à être étudiée. Cependant, des
données récentes indiquent que dans le cervelet périnatal, Shh stimule la prolifération des OPCs
Olig2+ et diminue leur différenciation en inhibant les effets des facteurs de pro-différenciation. En
accord avec cette hypothèse, à la fin de la première semaine post-natale, les cellules de Purkinje
diminuent la synthèse de Shh et produisent la vitronectine qui induit la maturation des OPCs
(Bouslama-Oueghlani et al., 2012).

50
 Introduction

3.1.3. Dans le cerveau antérieur

Comme dans la moelle épinière et le cerveau caudal, Shh est impliqué dans la première
vague de spécification des OPCs dans la partie ventrale du cerveau antérieur à partir de l’aire
entopédonculaire (AEP) et de la MGE (Nery et al., 2001) (Figure16 B,C). Cependant les
différentes études consacrées à l’implication de Shh dans la spécification des OPCs du
télencéphale semblent révéler un niveau de complexité plus important que dans les autres
régions (Alberta et al., 2001; Nery et al., 2001; Qi et al., 2002; Tekki-Kessaris et al., 2001) . Le
premier argument en faveur de l’implication de Shh est que le domaine d’expression des cellules
Pdgfr+ est situé dans le neuroépithelium de l’hypothalamus antérieur qui co-exprime Shh et son
récepteur Ptc entre E13.5 et E17 chez le rat. Par ailleurs, les souris mutantes Nkx2.1 qui
n’expriment pas Shh dans le télencéphale (Nery et al., 2001) ou le poisson zèbre mutant Syu,
dépourvu de Shh (Park et al., 2002) sont respectivement dépourvues d’OPCs Pdgfr+ dans la
zone ventriculaire du cerveau antérieur ou dotés d’une expression très réduite d’Olig2. De façon
cohérente, l’expression ectopique de Shh dans le neuroepithelium télencéphalique d’embryons
de souris à E9.5 conduit à la production d’une majorité d’OPCs aux dépens des neurones (Nery
et al., 2001). En revanche, ces résultats ne sont pas confirmés in vitro dans des cultures de
télencéphale ventral issu de souris Nkx2-/- puisque ces cultures génèrent des OPCs (Nery et al.,
2001; Tekki-Kessaris et al., 2001). Cette discordance reste à être éclaircie même si l’une des
hypothèses avancées soit la présence de protéines Hh dans les milieux de culture.

Contrairement à ce qui a été observé dans la moelle épinière, le développement des

OPCs n’est pas affecté dans le télencéphale du mutant Gli2 (Qi et al., 2003). A E12.5, chez ce
mutant comme chez les animaux sauvages, Shh est exprimé dans la zone du manteau de la
MGE, de l’AEP et de l’hypothalamus et les cellules Pdgfr+ et Olig2+ sont présentes dans la
zone ventriculaire de la MGE et à un niveau moindre dans la LGE. De même, à E14.5, de
nombreux OPCs Olig2+ et Pdgfrα+ se retrouvent dans les régions striatale et septale, et
atteignent dorsalement le néocortex dans les deux phénotypes (Qi et al., 2003).

Une autre source d’OPCs régulée par Shh dans le cerveau antérieur ventral est le
plancher du troisième ventricule situé juste au-dessus du chiasma optique (Figure 16D). Les
OPCs générés à ce niveau envahissent le nerf optique par un mécanisme qui est resté mal
compris jusqu’à ce que Gao et collaborateurs démontrent que Shh synthétisé dans les cellules
ganglionnaires de la rétine et transporté jusqu’au chiasma otique via les axones rétiniens induit
l’apparition des OPCs dans cette aire cérébrale (Gao and Miller, 2006). La colonisation du nerf
optique par les OPCs dépend également de Shh via un mécanisme probablement Gli-dépendant

51
 Introduction

(Merchan et al., 2007). La Mégaline, un membre de la famille des récepteurs aux lipoprotéines
de basse densité, pourrait participer à ces effets. Exprimée par les astrocytes, la mégaline fixerait
Shh puis le libèrerait progressivement pour induire la prolifération et la migration des cellules
Olig2+ qui expriment Ptc et Gli1 (Ortega et al., 2012).

Figure 16: La génération des oligodendrocytes dépend de Shh dans la moelle épinière et
le cerveau en développement.
(A) Vue en coupe transversale du tube neural indiquant la production des protéines Shh (rouge)
sécrétées par la notochorde (NC) et la plaque du plancher (FP pour Floorplate). La plaque du toît
(RF pour Roofplate) sécrète les protéines BMP et Wnt. Les OPCs sont produits sous forme de
deux vagues successives à E12.5 et E15.5 chez la souris. La première vague dépend de Shh et
provient du domaine pMN. La seconde dérive de progéniteurs exprimant Pax7 / Gsh1/2 / Mash1
ou Dbx1/2 et est indépendante de Shh. Les domaines du neuroépithélium ventral (p0-p3, pMN)
et dorsal (dp1-6) sont indiqués sur le côté droit du tube neural alors que les profils d'expression
génique de chaque domaine ventral sont indiqués sur le côté gauche. (B) Vue en coupe
transversale du télencéphale de souris indiquant les régions de la zone ventriculaire où les
différentes vagues d’OPCs sont générées. La première vague (E12.5, rouge) provient des
précurseurs exprimant Nkx2.1, qui apparaissent dans l‘AEP et la MGE, puis migrent dans
l’ensemble du télencéphale. La deuxième vague dérive de précurseurs Gsh2+ situés dans
l'éminence ganglionnaire latérale (LGE, vert) à E15.5. La dernière vague émerge des précurseurs
corticaux exprimant Emx1 (bleu) autour de la naissance. (C) Schéma visualisant les centres
organisateurs du cerveau antérieur en position ventrale (rouge) et dorsale (bleu), qui sécrètent
respectivement les protéines Hedgehog et BMP / Wnt; (D) Vue sagittale du cerveau indiquant la
position de l’hypothalamus qui génère les OPCs destinés à envahir le nerf optique. D’après
(Traiffort et al., 2016).

52
 Introduction

3.2. Au cours du développement post-natal précoce

La découverte de l’existence de trois vagues successives d’OPCs dans le cerveau

antérieur a contribué à améliorer notre compréhension des mécanismes apparemment
complexes qui régulent l’oligodendrogenèse dans cette région (voir Chapitre 1). A partir de cette
observation, l’hypothèse selon laquelle dans la moelle épinière, les OPCs d’origine ventrale
dépendent de la signalisation Shh alors que ceux d’origine dorsale n’en dépendent pas, fut remise
en question dans le cerveau antérieur.

En effet, l’invalidation du récepteur Smo dans les progéniteurs neuroépithéliaux Nestine+

au stade E12.5 chez la souris conduit à un déficit en OLs dans le télencéphale post-natal précoce
(Machold et al., 2003) et suggère que Smo est impliqué dans la dernière vague de production
des OPCs (Kessaris et al., 2006). De plus, des cultures purifiées d’OPCs issues du cortex
néonatal de rat répondent à Shh qui induit une augmentation dose-dépendante de la prolifération
de ces progéniteurs (Lelievre et al., 2006). En accord avec ces observations, les travaux de Tong
et collaborateurs indiquent que la signalisation Shh via Smo contrôle la génération des OPCs à
partir de la partie dorsale de la V-SVZ à la période péri-natale (Tong et al., 2015). L’expression
de Gli1 dans cette aire cérébrale et le résultat des manipulations génétiques de Smo dans les
cellules de la glie radiale dorsale in vivo sont en faveur d’un rôle positif de Smo via Gli1 dans la
production des OPCs dans le corps calleux (Tong et al., 2015). Cependant ces résultats entrent
en contradiction apparente avec des travaux menés en parallèle en utilisant les souris Gli1
knockout qui indiquent une myélinisation plus précoce du corps calleux lorsque Gli1 est invalidé
(Samanta et al., 2015).

Chez l'Homme, les OPCs proviennent à la fois du télencéphale ventral et de la SVZ

corticale (Jakovcevski et al., 2009; Rakic and Zecevic, 2003). La production des OLs générés in
vitro à partir des cellules de la glie radiale fœtale humaine isolées de la SVZ corticale est
augmentée en présence de Shh, mais n’est pas bloquée par un antagoniste de Smo, la
cyclopamine suggérant l'existence d'un mécanisme Shh / Smo indépendant supplémentaire au
moins in vitro (Mo and Zecevic, 2009; Ortega et al., 2013).

53
 Introduction

3.3. A l’âge adulte : Shh en physiologie et en pathologie

3.3.1. L’expression des composantes de la voie Shh dans le cerveau mature

En 1998, Elisabeth Traiffort et ses collaborateurs ont décrit pour la première fois
l’expression persistante des différents gènes de la voie Shh dans le cerveau adulte (Traiffort et
al., 1998; Traiffort et al., 1999). Une cartographie étendue des cellules exprimant Shh, Ptc, Smo
et Hip a été établie en utilisant des sondes non radiomarquées (Coulombe et al., 2004; Traiffort
et al., 1999), puis confortées quelques années plus tard par l’utilisation de sondes radiomarquées
(Banerjee et al., 2005) et de souris transgéniques exprimant un gène rapporteur sous le
promoteur des gènes spécifiques de la voie notamment Shh, Ptc, Gli1, Gli2, Gli3 (Garcia et al.,
2010; Harwell et al., 2012; Machold et al., 2003) (Figure 17).

Chez le rongeur adulte, l’expression de Shh est majoritairement détectable dans la partie
ventrale du cerveau antérieur (globus pallidus, septum, hypothalamus, amygdale), dans le cortex
(couches IV et V), les cellules de Purkinje du cervelet et les motoneurones du tronc cérébral et
de la moelle épinière. Sa localisation est essentiellement neuronale (Traiffort et al., 1998; Traiffort
et al., 2001; Traiffort et al., 1999). Dans certaines régions, Shh et son complexe récepteur Ptc-
Smo sont co-exprimés. C’est le cas du cortex cérébelleux ou de la paroi de la partie ventrale du
troisième ventricule. Dans le cas particulier du cervelet, une analyse détaillée de l’expression de
Shh, Ptc et Smo à l’échelle cellulaire indique leur co-expression dans les cellules de Purkinje
(Petralia et al., 2012; Traiffort et al., 1999). Ptc et Smo seuls sont exprimés dans les cellules de
la glie de Bergmann et dans les cellules granulaires avec un enrichissement du côté post-
synaptique suggérant l’implication de la signalisation Hh dans l’activité des neurones post-
mitotiques (Petralia et al., 2012; Traiffort et al., 1999). Dans d’autres régions, seuls Shh et Ptc
sont co-exprimés notamment dans le noyau facial et le septum médian.

Alternativement, Ptc peut être observé dans des aires de projection des régions exprimant
Shh. Enfin, Smo est souvent détecté dans des aires n’exprimant pas Ptc telles que les organes
circumventriculaires ou le noyau réticulaire thalamique suggérant que le complexe Shh-Ptc d’une
part, et Smo d’autre part, peuvent vraisemblablement fonctionner indépendamment l’un de l’autre
dans le cerveau adulte (Pascual et al., 2005; Traiffort et al., 1998; Traiffort et al., 1999). Les
transcrits de la protéine réceptrice Hip comme ceux de Ptc sont visualisés dans des aires de
projection des régions exprimant Shh, mais pas obligatoirement dans des régions où Ptc est
exprimé (Coulombe et al., 2004; Loulier et al., 2005) suggérant que Ptc et Hip n’ont

54
 Introduction

vraisemblablement pas dans le cerveau adulte, les activités coordonnées qui ont été décrites
durant le développement embryonnaire (Jeong and McMahon, 2005; Loulier et al., 2005).

La localisation des facteurs de transcription Gli a aussi été caractérisée dans le cerveau
de souris adultes. Les cellules exprimant Gli1, Gli2 et Gli3 sont des cellules complètement
différenciées appartenant à des sous-populations d’astrocytes matures co-exprimant le récepteur
Ptc dans le cerveau antérieur (Garcia et al., 2010). Un pourcentage très minime des cellules Gli1+
exprime le marqueur oligodendrocytaire APC dans la substance grise et Gli1 est absent des
passages de fibres du cerveau antérieur adulte (Garcia et al., 2010 ). Dans le cerveau caudal, en
particulier dans le cervelet, Gli2 et Gli3 sont fortement exprimés dans la couche des cellules de
Purkinje et dans la couche des cellules granulaires, Gli1 est présent à un plus faible niveau dans
la couche granulaire que dans la couche des cellules de Purkinje (Corrales et al., 2004).

A l’échelle subcellulaire, Shh est localisé dans des microdomaines membranaires enrichis
en sphingolipides et cholestérol, appelés ‘radeaux’ (Traiffort et al., 2001). Shh est également
transporté via les axones comme montré dans les cellules ganglionnaires de la rétine par des
expériences d’incorporation de méthionine radiomarquée (Traiffort et al., 2001) ainsi que par la
visualisation de la protéine ShhN sous forme de signaux ponctiformes colocalisés avec des
marqueurs de vésicules synaptiques dans le soma, les dendrites et l’axone de ces cellules (Beug
et al., 2011). Smo est aussi associé à des vésicules synaptiques dans les fibres moussues des
cellules granulaires de l’hippocampe (Masdeu et al., 2007). Enfin, Ptc et Smo sont
essentiellement localisés du côté post-synaptique dans le cervelet (Petralia et al., 2012). Ces
localisations suggèrent l’implication de la signalisation Hh dans l’activité des neurones post-
mitotiques.

55
 Introduction

Figure 17: Expression des composants de la voie Shh dans le cerveau et le cervelet adulte
du rongeur
Panel gauche, localisation des cellules exprimant Shh dans le cerveau de rat et distribution
comparée de ses récepteurs Ptc, Smo, Hip. Adaptée de (Traiffort et al., 2010; Traiffort et al.,
2001; Traiffort et al., 1999) et de son gène cible Gli1 (Alvarez-Buylla and Ihrie, 2014). Les
transcrits sont indiqués par des points colorés. AA, anterior amygdaloid area; B, basal nucleus of
Meynert; CPu, caudate putamen; Cx, cerebral cortex; D3V, dorsal third ventricle; fi, fimbria; GP,
globus pallidus; H, hypothalamus; IG, indusium griseum; Rt, reticular thalamic nucleus; SFO,
subfornical organ; SI, substantia innominata; SO, supraoptic nucleus. Panel droit, expression de
Shh, des facteurs Gli (Corrales et al., 2004), des récepteurs Ptc et Smo (Traiffort et al., 1999)
dans le cervelet. PL, Purkinje cell Layer; mo, molecular cell layer; gr: granular cell layer

3.3.2. Rôles de Shh dans le lignage oligodendrocytaire chez l’adulte

A ce jour, peu de données relient la signalisation Shh et la production persistante des OLs
myélinisants dans le SNC adulte. Les recherches basées sur le transfert adénoviral de ShhN
dans le ventricule latéral de souris adultes montrent une augmentation du niveau d’expression
de Ptc dans les cellules oligodendrocytaires exprimant le marqueur Olig1 dans le cortex et le
corps calleux. De plus, 26 jours après l’infection virale, une augmentation significative de 50% de
la prolifération des OPCs exprimant le protéoglycane NG2 ou les transcrits de la protéine
plp/dm20 est observée dans le cortex cérébral et le corps calleux des animaux analysés (Jiao

56
 Introduction

and Chen, 2008; Loulier et al., 2006). En accord avec ces données, les travaux récents de Tong
et collaborateurs montrent que la surexpression de la forme constitutivement active de Smo,
SmoM2, induite dans la V-SVZ dorsale de souris âgées de 30 jours conduit un mois après
l’injection à une augmentation significative du nombre de cellules exprimant Olig2, Sox10 et le
marqueur d’OLs matures APC dans le corps calleux de ces animaux suggérant que l’activation
ectopique de Smo dans la V-SVZ dorsale favorise l’oligodendrogenèse chez l’adulte (Tong et al.,
2015).

Si les données concernant directement le lignage oligodendrocytaire restent peu

nombreuses, il convient malgré tout de décrire brièvement les autres activités connues de la
signalisation Shh dans le cerveau adulte sain en particulier parce qu’elles concernent le contrôle
des NSCs, des neurones et des astrocytes qui peuvent participer directement ou indirectement
à la myélinisation physiologique. La présence des composantes de la signalisation Shh dans les
aires neurogéniques adultes, la SVZ des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ)
du gyrus denté de l’hippocampe, a rapidement orienté les recherches sur l’activité de la voie dans
ces deux régions. La première démonstration de l’activation possible de la voie a été réalisée par
l’injection intra-striatale de la protéine recombinante qui induit fortement l’expression du gène
cible Ptc dans la SVZ (Charytoniuk et al., 2002). Ces résultats furent ensuite confirmés par
l’utilisation de modulateurs pharmacologiques du récepteur Smo qui régulent la prolifération
cellulaire dans cette région (Machold et al., 2003; Palma et al., 2005), par l’invalidation de Smo
dans les cellules Nestine+ indiquant que Smo est requis pour le maintien de la neurogenèse
adulte (Balordi and Fishell, 2007) et par la surexpression de Shh dans le ventricule latéral qui
induit la rétention des neuroblastes nouvellement générés dans la SVZ (Angot et al., 2008). Shh
participe aussi à l’organisation en mosaïque de la SVZ en contrôlant la génération de populations
de neurones gabaergiques bien définies dans les bulbes olfactifs (Ihrie et al., 2011). En accord
avec la colocalisation de ShhN avec des marqueurs de vésicules synaptiques, sa sécrétion peut
être induite par dépolarisation des cellules neuronales différenciées (Beug et al., 2011). La
signalisation Shh est également un régulateur des NSCs de l’hippocampe (Han et al., 2008; Lai
et al., 2003; Machold et al., 2003).

Enfin, l’hypertrophie astrocytaire induite par l’invalidation de Smo spécifiquement dans les
astrocytes suggère que la signalisation Shh est vraisemblablement impliquée dans la
communication astrocyte-neurone (Garcia et al., 2010). De plus, le profile moléculaire et
fonctionnel des astrocytes dans le cerveau adulte sain est contrôlé par la sécrétion neuronale de
Shh (Farmer et al., 2016).

57
 Introduction

3.3.3. Pathologies associées à une dysrégulation de la voie Shh et son rôle

dans les maladies démyélinisantes

Etant donné l’implication majeure de la voie de signalisation Shh dans de multiples

processus biologiques dans le cerveau en développement ou adulte, il est évident d’une part que
tout dysfonctionnement de la voie peut être à l’origine de pathologies telles que des
malformations congénitales ou des tumeurs, et d’autre part que sa manipulation pharmacologique
peut constituer une approche thérapeutique potentielle pour diverses pathologies
neurodégénératives.

Parmi les nombreux désordres congénitaux associés au dysfonctionnement de la

signalisation Shh, nous citerons l’holoprosencéphalie (HPE) et le syndrome de Down (SD) qui
ont fait l’objet d’un nombre considérable de travaux. L’HPE est la plus fréquente des
malformations du cerveau antérieur chez l’Homme avec un spectre clinique pouvant aller d’une
incompatibilité complète avec la vie intra-utérine jusqu’à des malformations isolées de la face
(Hong and Krauss, 2012). Des mutations inactivatrices ont été détectées sur plusieurs gènes de
la voie incluant Shh, Gli2, Cdo tandis que Ptc ou Boc jouent le rôle d’allèles modificateurs
modulant la sévérité du spectre clinique de l’HPE (voir Chapitre 3). Le syndrome de Down, l’une
des causes génétiques les plus fréquentes de déficit intellectuel, est relié dans la majorité des
cas à une insuffisance d’activité de la signalisation Shh par surexpression du récepteur Ptc
vraisemblablement liée à des niveaux accrus du précurseur de la protéine amyloïde (Trazzi et
al., 2013). L’activation pharmacologique de la voie par un agoniste de Smo suffit à normaliser la
morphologie du cervelet et à restaurer la capacité d’apprentissage associée au fonctionnement
de l’hippocampe (Currier et al., 2012; Das et al., 2013).

L’activation inappropriée de la signalisation Shh est non seulement la cause majeure de

médulloblastomes, les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes de l'enfance mais aussi
de gliomes, les plus communes des tumeurs cérébrales primaires chez l’adulte (Huang and Yang,
2015; Li et al., 2009; Northcott et al., 2012). Le médulloblastome a été initialement associé au
syndrome de Gorlin, une pathologie congénitale caractérisée par des mutations inactivatrices du
récepteur Ptc. Les cellules cibles du processus oncogéniques sont les précurseurs des cellules
granulaires du cervelet (pour revue, (de Lucas et al., 2016)).

Par ailleurs, l’activation de la signalisation Shh pourrait être bénéfique dans des
pathologies telles que la maladie de Parkinson, l’axotomie du nerf facial, les déficits cérébraux

58
 Introduction

néonataux liés à l’administration de glucocorticoïdes (pour revue, Traiffort et a.l, 2010). Enfin, la
protéine induit la neurogenèse, l’angiogenèse et l’oligodendrogenèse.

Avant les travaux publiés par l’équipe, l’implication de la signalisation Shh dans le
processus de remyélinisation a été suggérée au cours de diverses études. Un déficit de clivage
de la protéine Shh a d’abord été proposé dans des expériences d’analyse de western blots
réalisées à partir du tissu cérébral post-mortem de malades atteints de sclérose en plaques.
L’étude concluait à une diminution de la protéine Shh dans la matière grise de ces patients
(Mastronardi et al., 2003). En contradiction apparente avec ces données une augmentation de
Shh est montrée dans des lésions de sclérose en plaques et des modèles d’animaux EAE (Seifert
et al., 2005; Wang et al., 2008).

Par ailleurs, l’amélioration clinique obtenue après administration d'interféron-β ou de

triiodothyronine dans différents modèles animaux de démyélinisation chez le rongeur a été
attribuée à une augmentation de l'expression de Shh (Franco et al., 2008; Harsan et al., 2008;
Mastronardi et al., 2004) corrélée à une augmentation progressive du nombre de cellules Olig2+
(Harsan et al., 2008). De plus, dans un modèle de lésion de la moelle épinière, des allogreffes
d’OPCs combinées à l’administration de la protéine recombinante Shh se sont révélées plus
efficaces que les allogreffes seules sur le plan de la conduction axonale (Bambakidis and Miller,
2004). En accord avec cette conclusion, l’administration d’un agoniste de la voie dans ce modèle
induit une augmentation de prolifération d‘une population de précurseurs neuraux endogènes
(Bambakidis et al., 2009). La signalisation Shh se révèle aussi être un facteur contrôlant
l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique et un système anti-inflammatoire endogène
d’importance probablement majeure lors des attaques immunitaires du SNC, telles qu’elles sont
observées dans la sclérose en plaques (Alvarez et al., 2011).

Récemment, le blocage de l’activité du facteur de transcription Gli1 a été récemment

rapporté comme une approche thérapeutique prometteuse dans les maladies démyélinisantes
(Samanta et al., 2015). Ces données sont apparemment discordantes avec le rôle de régulateur
positif de la remyélinisation que nos propres travaux ont permis d’attribuer à la signalisation Shh
(Ferent et al., 2013)

En effet, nos données montrent que 4 jours après injection stéréotaxique de LPC dans le
corps calleux des souris, la protéine Shh est secrétée par les cellules oligodendrocytaires Olig2+.
Cette sécrétion s’accompagne d’une forte induction de la transcription du récepteur Smo et du
facteur de transcription Gli2, mais d’une induction plus limitée des gènes cibles classiques de la
voie Gli1 et Ptc. Le transfert adénoviral de Shh augmente le nombre d’OPCs et d’OLs matures,

59
 Introduction

réduit l’étendue de la lésion ainsi que la gliose réactive au niveau de la lésion. A l’inverse, le
transfert adénoviral de l’antagoniste physiologique de Shh, Hip, bloque la prolifération et la
différenciation des OPCs et empêche la réparation du tissu (Ferent et al., 2013). Etant donné
l’existence d’un certain nombre de discordances apportées par l’ensemble de ces données, les
mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation des lésions démyélinisantes médiée par
la modulation de l’activité des composantes de la signalisation Hh méritent à présent d’être
finement disséqués.

60
 Introduction

Chapitre 4. Boc, une protéine transmembranaire,

impliquée dans la transmission de la signalisation
hedgehog

La communication cellulaire est à la base du développement harmonieux des organes et de

l'homéostasie tissulaire. Les cellules sont capables d’interagir entre elles par différents
mécanismes parmi lesquels l'adhésion cellulaire et l'activation de diverses cascades de
signalisation par des molécules extracellulaires. Cdo ou Cdon (pour Cell adhesion molecule-
related / Down-regulated by Oncogenes) et Boc (pour Brother of Cdo), ont récemment émergé
comme des acteurs importants au sein de ces deux mécanismes de communication. Je me
focaliserai dans ce chapitre plus particulièrement sur Boc sur lequel porte mon projet de thèse,
mais je ferai aussi référence à Cdo en tant que premier membre de cette nouvelle famille à avoir
été isolé.

1. Identification, structure et interactions

Le gène Cdo a été isolé à partir du criblage d’une banque d’ADNc destiné à identifier
de nouveaux gènes impliqués dans la capacité de certaines lignées de fibroblastes de rat à
résister à l’effet induit par les oncogènes sur la croissance cellulaire (Kang et al., 1997). Peu de
temps après, l’implication de Cdo dans la différenciation myogénique fut rapportée (Kang et al.,
1998). Ensuite, le criblage à faible stringence d'une banque d'ADNc de cerveau fœtal humain
avec une sonde Cdo de rat, a conduit à l'identification du gène apparenté Boc codant pour une
protéine ayant des effets semblables à ceux de Cdo sur la différenciation myogénique (Kang et
al., 1998; Kang et al., 2002). Chez la drosophile, les homologues de Boc et Cdo ayant été
identifiés lors d’un criblage visant à isoler de nouvelles composantes de la voie de signalisation
Hh, ces deux gènes furent nommés Ihog (Interference hedgehog) et Boi (Brother of ihog) (Lum
et al., 2003).

Chez l’Homme, le gène BOC est localisé sur le chromosome 3 et composé de 20 exons
codant pour une protéine de 1114 acides aminés. Chez la souris, Boc est situé sur le
chromosome 16 et code pour une protéine de 1110 acides aminés. Boc et Cdo sont très
conservés chez les vertébrés y compris chez le poisson zèbre chez lequel Boc code pour une

61
 Introduction

protéine de 1033 acides aminés et présente 75% d’identité en nucléotides avec Boc humain, de
rat, de souris ou de xénope. Les protéines codées par ces gènes sont des glycoprotéines de
surface proches des molécules d’adhésion cellulaire (CAMs) appartenant à la superfamille des
Immunoglobulines (Ig). Elles comprennent un domaine extracellulaire ou ectodomaine contenant
cinq (Cdo) ou quatre (Boc) domaines Ig-like, suivi par trois motifs fibronectine (Fn1-3) de type 3,
un unique domaine transmembranaire et une région intracellulaire de 270 (CDO) ou 238 (BOC)
acides aminés. Cette dernière région n’étant pas conservée, elle est susceptible d’expliquer
certaines différences fonctionnelles entre les deux protéines. L’homologie en acides aminés de
l’ectodomaine de Boc et Cdo varie de 38% dans le quatrième domaine Ig à 80% dans le troisième
domaine Fn (Kang et al., 2002; Mulieri et al., 2002). Chez la drosophile, Ihog et Boi se distinguent
par la présence de 4 domaines Ig et seulement 2 motifs Fn (Fn1-2) (Figure 18A). Par ailleurs,
l’arbre phylogénétique permettant de comparer Boc/Cdo et des protéines structurellement
apparentées, tels que les récepteurs impliqués dans le guidage axonal qui possèdent aussi 5
domaines Ig et 3 domaines Fn, indique que Boc et Cdo forment une sous-famille distincte de la
sous-famille contenant Roundabout (Robo), Neurogenin ou Deleted in Colorectal Cancer (DCC)
(Figure 18C).

Boc et Cdo interagissent au niveau de leurs domaines extra- et intracellulaires pour former
des homo- ou hétérodimères en cis (au niveau de la membrane d’une seule cellule). Les deux
protéines lient à haute affinité la partie N-terminale biologiquement active des membres de la
famille Hh. La liaison au ligand ShhN met en jeu le domaine Fn3 de Boc/Cdo et un site de liaison
du calcium sur ShhN (Figure 18B) (McLellan et al., 2008; Tenzen et al., 2006; Yao et al., 2006).
Ce mode de liaison n’est pas conservé chez la drosophile où la liaison au ligand implique le
domaine Fn1 de Ihog/Boi et le site de liaison de l’héparine sur HhN (McLellan et al., 2008; Yao
et al., 2006). En plus de cette liaison au ligand, Boc/Cdo (via Fn1 et Fn2 ; (Izzi et al., 2011)) et
Boi/Ihog (via Fn2 ;(Zheng et al., 2010)) forment un complexe avec le récepteur Ptc. Chez la
drosophile, ce complexe est nécessaire à la liaison à haute affinité des protéines Hh sur leur
principal récepteur Ptc. En accord avec cette observation, les embryons chez lesquels Boi/Ihog
sont génétiquement invalidés présentent un défaut d’expression des gènes cibles de la voie et
de sévères anomalies du processus de segmentation de la larve (Zheng et al., 2010).

62
 Introduction

Figure 18: Représentation de la structure tridimensionnelle et des interactions de la

protéine Boc
(A) Dans le contexte de la signalisation Hh, Boc s’associe aux protéines Shh Dhh ou Ihh et à Ptc. Des
interactions homo- (Boc/Boc) ou hétérodimériques (Boc/Cdo) existent. Les hétérodimères peuvent
aussi se lier à Gas1. Les flèches et les pointillés représentent les interactions protéiques. Les
domaines fibronectine de type III (FnIII) numérotés de 1 à 3 sont matérialisés par des triangles verts
et les domaines Ig par des ellipses bleues. (B) Représentation des résultats de l’analyse
cristallographique du complexe calcium-dépendent formé entre ShhN (jaune) et CDOFn3 (violet) ou
BOCFn3 (marron). L’ion zinc est représenté par un disque rouge et les deux ions calcium par des
disques bleus. Adapté de (Kavran et al., 2010). (C) Arbre phylogénétique comparant les séquences
complètes des protéines Cdo et Boc avec les séquences apparentées identifiées dans les bases de
données (Kang et al., 2002).

Chez les vertébrés, des expériences de gain et perte de fonction respectivement réalisées
dans l’embryon de poulet ou de souris suggèrent que les complexes Shh/Boc ou Shh/Cdo
augmentent le niveau de signalisation dans la cellule répondant à Shh en facilitant la présentation
de la forme active du ligand à Ptc ou alternativement en empêchant la séquestration et le turnover
du ligand. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de Boc ou Cdo favorise la
ventralisation du tube neural chez le poulet. Par ailleurs, l’expression de Boc et Cdo est régulée
négativement suite à l’activation de la signalisation Shh suggérant un possible mécanisme de
rétro-contrôle destiné à empêcher une activation excessive de la voie (Tenzen et al., 2006).

Une différence notable entre les vertébrés et la drosophile est l’existence chez les vertébrés
d’une autre protéine capable de lier les protéines Hh et de se substituer à la fonction de Boc ou
Cdo. Cette protéine est Gas1, une protéine à ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) dont le
domaine extracellulaire partage des homologies avec le récepteur du GDNF (Glial derived
neurotrophic factor) (Schueler-Furman et al., 2006). Si l’invalidation génétique de Boc ou Cdo n’a
qu’un effet modéré sur l’activité de la signalisation Shh, l’invalidation simultanée de ces deux

63
 Introduction

gènes ou de l’un d’entre eux associée à l’invalidation de Gas1 aboutit à une réduction notable
des réponses induites par Shh telles que la ventralisation du tube neural (Allen et al., 2011; Bae
et al., 2011). Ainsi, chez les doubles mutants Boc-/- ;Cdo-/- ou Gas1-/- ;Cdo-/- ou Gas1-/- ;Boc-/-
, la spécification des progéniteurs neuraux Nkx2.2+ et Olig2+ est sévèrement altérée au niveau
du domaine pMN dans le tube neural. L’invalidation complète des 3 gènes abolit la ventralisation
du tube neural phénocopiant la perte totale de Shh ou de Smo (Allen et al., 2011). Cependant,
l’implication de Cdo et Boc dans l’activation de la signalisation Shh dépend du tissu considéré
puisque par exemple la spécification des doigts induite par Shh chez l’embryon est tout à fait
normale dans le mutant Boc-/- ;Cdo-/- (Allen et al., 2011; Zhang et al., 2011).

Malgré des redondances fonctionnelles, Boc et Cdo utilisent des mécanismes différents pour
activer la signalisation Hh. Des approches de gain de fonction dans le tube neural du poulet en
développement, ont servi à évaluer le rôle du domaine transmembranaire et des domaines Fn de
Boc et Cdo dans la transmission du signal Hh. La première observation est que l’ancrage à la
membrane de Boc et Cdo est indispensable pour transmettre le signal Hh, puisque les formes
solubles de ces protéines sont incapables d’induire l’activation de la voie (Tenzen et al., 2006).
Cependant, lorsque le domaine transmembranaire de Boc et Cdo est remplacé par le domaine
transmembranaire de la protéine de surface CD4 ou par une ancre GPI, toutes ces constructions
sont capables de promouvoir la signalisation Hh à l’exception de la construction Boc /GPI
suggérant l’existence d’une différence dans les mécanismes par lesquels Boc et Cdo agissent.
Puisque l’arrimage de Boc à la surface de la membrane par l’ancre GPI rend la protéine non
fonctionnelle, la localisation subcellulaire de Boc semble être essentielle à son activité en tant
que co-récepteur des protéines Hh. De plus, il apparaît que les domaines Fn de Cdo sont
suffisants pour induire la signalisation Hh, alors que ceux de Boc ne le sont pas. En effet, Boc
nécessite un motif additionnel de 78 acides aminés qui relie les domaines Fn et Ig et agit de
concert avec les domaines Fn1 ou Fn2 pour activer la voie. L’activité de Boc requiert également
une séquence juxtamembranaire contenant un site de reconnaissance de la matrice
métallopeptidase 9. Ce domaine conduit à la libération du domaine extracellulaire de Boc par une
protéase non encore identifiée. Il reste à déterminé si ce clivage est requis pour que Boc induise
l’activation du signal Hh (Song et al., 2015)

64
 Introduction

Figure 19: Schéma résumant les domaines de Cdo et Boc requis ou non pour la
transduction du signal Hh
Les caractéristiques communes aux deux co-récepteurs sont répertoriées au centre alors que
celles spécifiques à l’un ou l’autre sont indiquées sous chaque protéine. Parmi les
caractéristiques partagées: le domaine cytoplasmique et les domaines Ig ne sont pas
indispensables pour induire la signalisation Hh. A l’inverse, le domaine Fn3, les domaines Fn1
et/ou Fn2 et l’ancrage à la membrane sont requis. Parmi les caractéristiques spécifiques d’un
récepteur : en l'absence des domaines Ig, Boc, à l’inverse de Cdo, nécessite une séquence de
liaison supplémentaire située en N-terminal des domaines Fn. Boc possède également un site
de clivage extracellulaire dont le rôle dans l’induction du signal Hh n’est pas encore connu. Enfin,
Boc nécessite un ancrage intégral dans la membrane plasmique, alors que Cdo reste fonctionnel
même s’il est ancré en périphérie de la membrane. D’après (Song et al., 2015).

A côté de la cascade intracellulaire classiquement associée à la voie Hh mettant en jeu les

facteurs de transcription de la famille Gli, d’autres cascades de signalisation ont été récemment
associées à l’activité des protéines Boc et Cdo. C’est d’abord l’analyse d’une activité
indépendante de la signalisation Hh, l’induction de la différenciation myogénique des cellules
C2C12, qui a contribué à une meilleure compréhension du rôle de chaque protéine et des
mécanismes d’action associés (Bae et al., 2009; Kang et al., 2002). L’activité pro-différenciative

65
 Introduction

des myoblastes associée au complexe Boc/Cdo repose sur le domaine intracellulaire de Cdo
alors que le domaine intracellulaire de Boc ne semble pas être indispensable dans ce contexte
(Kang et al., 2002). La cascade de signalisation intracellulaire comporte l’association de la
tyrosine kinase Abl sur un motif riche en résidus proline du domaine intracellulaire de Cdo. La
kinase Abl activée permet ensuite l’activation de la p38 MAP kinase requise pour la différenciation
myoblastique (Bae et al., 2009).

Un autre modèle informatif sur le plan mécanistique est celui de la différenciation neuronale
et de la formation des dendrites induite par Shh via Boc. Dans ce cas, en réponse à Shh le
domaine SH2 de la kinase Abl interagit avec le motif riche en proline (YXXP) conservé au niveau
de la région 963-1037 du domaine intracellulaire de Boc. Cette interaction entraîne l’activation de
la kinase c-Jun NH2-terminale (JNK). En accord avec cette cascade intracellulaire, l’invalidation
ou la réduction de Boc diminue le niveau de JNK activée durant la différenciation neuronale. De
plus, Abl augmente l’activation de JNK lorsqu’elle est co-exprimée avec Boc. Enfin, des anticorps
anti-phospho-tyrosine étant capables d’immunoprécipiter Boc, on peut imaginer que Boc est
vraisemblablement phosphorylé par une kinase qu’il reste à identifier (Vuong et al., 2017).
D’autres tyrosines kinases telles que les membres de la famille des Src kinases (SFKs) ont été
impliquées en aval du complexe Shh/Boc notamment dans le contexte du guidage axonal. Dans
ce cas, l’activation des SFKs dépend de Smo, mais pas de l’induction de la transcription de Gli
(Yam et al., 2009). Ainsi diverses kinases semblent être nécessaires pour réguler Boc et
transmettre le signal destiné à contrôler la dynamique du cytosquelette.

2. Expression, activation et renouvellement

Les ARNs messagers de Boc et Cdo ont été initialement identifiés dans des lignées de
cellules myoblastiques comme mentionné précédemment. Les profils d’expression des deux
gènes se superposent d’ailleurs largement dans le système musculo-squelettique au cours du
développement (Kang et al., 1998; Mulieri et al., 2002).

La distribution de Boc et Cdo a ensuite été analysée en détail chez l’embryon de souris
au cours des étapes de gastrulation (E6.5-E8.0), neurulation (E8.5-E10.5), organogenèse
(E11.5-E13.5) et vie fœtale tardive (E14.5-E17.5) (Figure 20)

66
 Introduction

Figure 20: Profils d'expression de Cdo et Boc

Adapté de (Mullieri et al., 2000 ; Mullieri et al., 2002)

Boc est exprimé dans de nombreux tissus à partir de la fin de la gastrulation jusqu’à la fin
de l’embryogenèse. Les domaines d’expression de Boc sont majoritairement des régions
contenant des cellules en prolifération ou indifférenciées. De façon remarquable, le profil
d’expression observé pour Boc (Mulieri et al., 2002) est très proche de celui décrit pour Cdo
(Mulieri et al., 2000). Cependant plusieurs divergences discrètes sont à noter. Par exemple,
l’expression la plus précoce de Cdo se situe entre E7.0 et E7.5 alors que celle de Boc n’est
détectée qu’à partir de E8.0. Plus généralement, au cours du développement de nombreux tissus,

67
 Introduction

l’expression de Cdo est plus précoce que celle de Boc, mais l’expression de Boc persiste plus
longtemps que celle de Cdo suggérant que les deux protéines peuvent fonctionner
indépendamment l’une de l’autre. Une autre observation renforçant cette hypothèse est que
durant le développement des muscles squelettiques et des reins, Boc est exprimé respectivement
dans les myoblastes et le primordium métanéphrique, mais pas dans les cellules musculaires
différenciées ou les tubules matures du tractus uro-génital où Cdo est détecté.

Des profils d’expression particuliers sont également à noter dans les organes sensoriels
notamment dans l’œil où Cdo est exprimé dans toutes les structures oculaires à l’exception de
l’épithélium pigmentaire rétinien alors que Boc n’est quasiment pas détecté sauf dans la cornée
à un niveau très faible. De plus, dans l’épithélium de l’oreille interne, Cdo est fortement exprimé
tout au long du développement alors que Boc n’est détecté que très tardivement (Mulieri et al.,
2002; Mulieri et al., 2000)

Dans le système nerveux central, la plus forte expression de Boc et Cdo est détectée
dans les régions dorsales chez la souris, le poulet et le poisson-zèbre (Aglyamova and Agarwala,
2007; Connor et al., 2005; Mulieri et al., 2002). La première cartographie a été réalisée chez la
souris où l’expression de Boc apparaît entre les jours embryonnaires E8.0 et E8.5 dans deux
régions dorsales du repli céphalique et sous forme d’un gradient antéro-postérieur le long de la
partie dorsale des plis neuraux (Figure 21). A E9.5, l’expression est uniforme dans la partie
dorsale de la totalité du tube neural. Pendant le reste du développement, l’expression de Boc est
essentiellement restreinte aux régions dorsales du télencéphale et du diencéphale, ainsi que
dans le cerveau médian, postérieur et la moelle épinière. Néanmoins, Boc est détecté à un faible
niveau dans quelques structures ventrales telles que l’éminence ganglionnaire médiane et
l’hypothalamus (Mulieri et al., 2002).

Dans le télencéphale dorsal, Boc est exprimé dans le neuroépithélium contenant les cellules
progénitrices corticales depuis le stade E9.0 jusqu’au stade E13.5. A cette période, l'expression
se limite à la zone ventriculaire. Aux stades embryonnaires plus tardifs, une forte expression de
Boc est maintenue le long des ventricules dans les neuroblastes en prolifération (Mulieri et al.,
2002). Cette expression se limite à l’éminence ganglionnaire latérale et à la zone ventriculaire
corticale, mais reste complètement absente de l’éminence ganglionnaire médiane (Tucker et al.,
2008).

Dans le diencéphale, Boc est initialement exprimé dans la région thalamique dorsale et dans
la région hypothalamique ventrale dans les deux cas suivant un gradient dorso-ventral. A E13.5,

68
 Introduction

ce gradient persiste dans la région thalamique, mais seul un faible niveau d'expression de Boc
peut être détecté dans l'hypothalamus. Aux stades plus tardifs, l’expression de Boc est encore
plus restreinte et se limite à l’extrémité dorsale du diencéphale (Mulieri et al., 2002).

Boc est également détecté dans le cerveau médian et postérieur. Comme dans le cerveau
antérieur, la plus forte expression de Boc est limitée au neuroépithélium dorsal du cerveau
médian. Cependant, un faible niveau d'expression peut être observé dans les structures
ventrales. Dans la région antérieure du cerveau postérieur qui est à l’origine du cervelet (du côté
dorsal) et du pons (du côté ventral), Boc est exprimé dans le neuroépithélium de ces deux
structures, mais seul le cervelet exprime fortement Boc. Dans la partie postérieure du cerveau
postérieur, qui est à l’origine de la médulla oblongata, une forte expression de Boc est détectée
dans la partie dorsale. Comme dans le télencéphale, au-delà du stade E13.5, les régions du
cerveau médian et postérieur exprimant Boc sont des zones contenant des neuroblastes en
prolifération (Mulieri et al., 2002).

Dans la moelle épinière en formation, l'expression de Boc est également limitée aux
structures dorsales. Entre E9.5 et E11.5, Boc est exprimé dans la zone ventriculaire selon un
large gradient dorsoventral. Alors que le développement progresse, son expression se restreint
aux régions médianes et dorsales. A E14.5, l'expression se limite à une bande étroite de cellules
le long de la moelle épinière (Mulieri et al., 2002).

A l’issue de ces premières cartographies, la localisation de Boc a été caractérisée à

l’échelle cellulaire dans le SNC, Ainsi, Boc, mais pas Cdo, se localise au niveau des neurones
commissuraux différenciés de la moelle épinière (Okada et al., 2006) et dans les cellules
ganglionnaires ipsilatérales de la rétine (Fabre et al., 2010). Durant le développement postanatal
précoce, Boc est aussi détecté dans les précurseurs neuronaux, au niveau des couches
granulaires externe et interne du cervelet (EGL et IGL) ainsi que dans les cellules de Purkinje
(Izzy et al., 2011). Enfin, l’expression de Boc augmente dans le cortex entre le jour postnatal P4
et P14, dans les cellules neuronales callosales projetant au niveau des couches 2/3 du cortex
(Harwell et al., 2012).

69
 Introduction

Figure 21: Expression de Boc dans le système nerveux central embryonnaire.

(A) Hybridation in situ in toto sur embryon de souris au stade E8.5 montrant l’expression de Boc
dans le tube neural dorsal sous forme d’un gradient antéropostérieur (flèche) et dans le repli
céphalique (pointes de flèches). Un faible niveau d'expression de Boc est également détecté
dans les somites (double flèche). Aucune expression n'est détectée dans le mésoderme
présomitique (astérisque). (B,C) Coupe frontale (B) ou parasagittale (C) de cerveau d’embryons
à E12.5 indiquant une forte expression de Boc dans la partie dorsale du télencéphale, du
diencéphale, du cerveau médian et postérieur. Un haut niveau d’expression de Boc est détecté
dans le mésenchyme olfactif (C, flèche) et dans le trajet de migration rostral (C, pointe de flèche).
(D) Coupe frontale de moelle épinière d’embryons de souris à E12.5 montrant le niveau élevé
d’expression de Boc dans la zone ventriculaire dorsale. fb, forebrain ; di, diencephalon ; hm, head
mesenchyme ; ey, eye ; dvz, dorsal ventricular zone ; nt, neural tube ; v,vertebra. Adapté de
(Mulieri et al., 2002).

La distribution majoritairement dorsale de Boc et Cdo dans le tube neural et par

conséquent leur exclusion de la plupart des domaines de signalisation Hh suggéra très
rapidement que Boc et Cdo sont des cibles transcriptionnelles négatives de la signalisation Hh.
En accord avec cette hypothèse, l’invalidation de la signalisation Hh chez les mutants murins Shh
et Smo accroît l’expression de Cdo et Boc qui s’étend alors notamment dans le tube neural
ventral. A l’inverse, le profil d’expression normal de Boc et Cdo est perdu ou notablement réduit,
lorsque la signalisation Hh est dé-réprimée dans le mutant Ptc ou activée de façon ectopique

70
 Introduction

suite à la surexpression d’un allèle constitutivement actif de Smo (Tenzen et al., 2006). De façon
inattendue, dans le mutant Gli3, l’expression de Boc s’étend de façon ectopique dans la MGE et
la région septale suggérant que Gli3 ne régule pas Boc en réprimant la signalisation Shh.
Alternativement, l’activité répressive que Shh exerce sur Boc de façon Gli3-dépendante pourrait
dépendre de la fonction activatrice de Gli3 (Tucker et al., 2008).

Cependant Boc et Cdo participent aussi à la signalisation Hh dans des domaines où la

signalisation Hh est active comme l’indique l’expression élevée des cibles transcriptionnelles Ptc
et Gli1 à la limite ventrale du domaine d’expression de Boc dans le tube neural ou à la limite
postérieure du domaine d’expression de Boc et Cdo dans le mésenchyme des membres. Ces
observations font donc de Boc et Cdo des régulateurs positifs de la signalisation Hh qui en retour
les régule négativement. La régulation négative de Boc et Cdo permet vraisemblablement de
limiter l’activation de la voie à une région strictement définie (Tenzen et al., 2006). L’étude de Boc
chez le poisson zèbre a permis de valider les mêmes conclusions et de montrer que Boc amplifie
les signaux Hh en augmentant la concentration locale de Hh ou son temps de liaison à la cellule
réceptrice (Bergeron et al., 2011; Connor et al., 2005). De façon remarquable, les autres
protéines membranaires capables de lier les protéines Hh telles que Ptc ou Hip sont considérées
comme des régulateurs négatifs de la signalisation Hh qui en retour les régule positivement. La
signalisation Hh est ainsi très finement régulée dans les tissus où elle est active (Tenzen et al.,
2006). Cependant, l’étude du mutant de poisson zèbre umleitung (uml) porteur d’une mutation
inactivatrice de Boc, révèle pour Boc un rôle inattendu de régulateur négatif de la signalisation
Hh dans la spécification et la prolifération des progéniteurs participant à la formation de la
mâchoire inférieure. Dans ce tissu, l’expression élevée de Boc conduirait à piéger Shh et à limiter
sa capacité à activer la chondrogenèse et la prolifération cellulaire (Bergeron et al., 2011).

3. Fonctions Biologiques de Boc

Après la caractérisation initiale de l’activité Hh-indépendante de Boc/Cdo dans le processus

de différenciation myogénique (Kang et al., 2002), le développement et la caractérisation des
souris mutantes Boc knockout (Okada et al., 2006) et l’identification du mutant de poisson zèbre
uml (Bergeron et al., 2011) furent le point de départ d’un nombre croissant d’études destinées à
identifier les rôles de Boc notamment dans la transmission des signaux Hh.

71
 Introduction

De façon remarquable, les souris mutantes Boc sont viables, fertiles et ne présentent pas de
phénotype apparent. Néanmoins, l’analyse précise de ce mutant permet à présent d’impliquer
Boc dans plusieurs activités induites par les protéines Hh au niveau des tissus périphériques ou
du SNC. Je souligne ci-dessous des aspects importants de ses activités en développant en partie
celles spécifiques du SN.

3.1. Boc s'associe à Cdo pour réguler positivement la

différenciation myogénique

La première activité associée à Boc fut son implication dans la différenciation des
myoblastes. Plusieurs arguments sont en faveur de cette conclusion. (i) Cdo et Boc sont co-
exprimés dans les précurseurs musculaires dans l'embryon de souris et dans la lignée
myoblastique C2C12; (ii) la surexpression rétrovirale de l’ADNc humain de CDO ou BOC dans
les lignées myoblastiques C2C12 et F3 favorise la différenciation cellulaire; (iii) l’oncogène Ras
inhibe la différenciation des myoblastes en diminuant l’expression de CDO et de BOC; (iv) CDO
et BOC forment des hétérodimères en cis dans des lysats de cellules C2C12; (v) la surexpression
de BOC ou CDO dans la lignée cellulaire de rhabdomyosarcome humain RD induit la
différenciation de ces cellules normalement déficiente chez les enfants atteints de
rhabdomyosarcome (Wegorzewska et al., 2003).

L’analyse détaillée du rôle de Boc dans la différenciation des myoblastes révéla que Boc
interagit directement avec Cdo au niveau du domaine extra- et intracellulaire. Dans ce complexe
membranaire, Boc est vraisemblablement impliqué par son domaine extracellulaire dans la
reconnaissance d’un ligand en trans ou d’autres composantes nécessaires au complexe en cis,
mais pas dans la signalisation intracellulaire conduisant à la différenciation des myoblastes qui
est-elle assurée par le domaine intracellulaire de Cdo (Kang et al., 2002) via la formation d’un
complexe intracellulaire avec la kinase AbI (Bae et al., 2009).

3.2. Boc est impliqué dans la régulation du poids et de la masse

adipeuse

Malgré leur apparence normale, les souris Boc KO à l’âge de 32 semaines présentent un
surpoids de 16% par rapport aux souris sauvages. Ce surpoids est vraisemblablement lié à une

72
 Introduction

augmentation progressive du tissu adipeux. En effet, le tissu adipeux blanc (dont l’accumulation
est la principale caractéristique de l’obésité) est significativement augmenté tant au niveau sous-
cutané que viscéral. Il en est de même du tissu adipeux brun qui présente chez les animaux
mutants des marques de blanchiment évidentes.

Les mutants Boc ne sont pas hyperphagiques, mais présentent une diminution de leur
température corporelle, de leur activité locomotrice spontanée, de leur quotient respiratoire ainsi
qu’une dépense énergétique plus faible que les souris sauvages. Ces mutants développent par
ailleurs une réponse exagérée à un régime riche en graisses avec notamment des perturbations
de l’homéostasie glucidique, des taux de triglycérides et d’acides gras non estérifiés plus élevés
que la normale, une accumulation des lipides hépatiques et une augmentation des enzymes
associées au métabolisme lipidique favorisant l’adipogenèse. L’absence de Boc se traduit par
une diminution de l’expression des gènes cibles de la signalisation Shh, Gli1 et Ptc, et une
induction de l’expression de Cdo. Néanmoins, des allèles ‘faibles’ du gène BOC chez l’Homme
sont proposés contribuer à l’accumulation du tissu adipeux blanc chez des individus possédant
des prédispositions génétiques ou liées à leur style de vie (Lee et al., 2015).

3.3. Boc modifie le spectre de l’holoprosencéphalie chez des

souris mutantes Gas1 et Cdo

Contrairement aux mutants Cdo et Gas1, les mutants Boc ne présentent pas de
phénotype d’holoprosencéphalie (HPE), un déficit du développement notamment caractérisé par
des anomalies de clivage du télencéphale. Chez l’Homme, les formes sporadiques d’HPE sont
les plus fréquentes. Elles sont reliées à des anomalies chromosomiques aboutissant à des
protéines mutées dans quatre voies de signalisation principales parmi lesquelles la signalisation
Hh (Roessler and Muenke, 2010).

Cette pathologie peut se présenter sous des formes très variables dites alobaires,
semilobaires et lobaires qui décrivent le niveau de clivage du télencéphale. L’étude récente de
Seppala et collaborateurs (Seppala et al., 2014) a ajouté un rôle essentiel de Boc dans l’étiologie
d’une forme unique d’HPE lobaire qui apparaît lorsque l’activité Gas1 est également perdue en
plus de son rôle dans l’accroissement des phénotypes chez les souris Cdo-/- (Zhang et al., 2011).
Cette découverte s’est d’abord appuyée sur l’existence de différences discrètes dans la
localisation de Boc, Cdo et Gas1 dans la région fronto-nasale de l’embryon de souris puis sur
l’analyse des doubles mutants Boc-/- Gas1-/-. Cette analyse permit la mise en évidence d’un

73
 Introduction

phénotype jusque-là non détecté dans la région pré-maxillaire des mutants Gas1 ou Cdo
comportant des incisives surnuméraires ou dupliquées, une fente labiale unilatérale, une fente
palatine particulièrement sévère, une langue fendue et une cavité nasale fenestrée. Les incisives
surnuméraires ont une architecture reflétant un arrêt apparent de développement compatible
avec l’expression de Boc dans l’épithélium et le mésenchyme des incisives maxillaires en
formation.

En plus de ces anomalies fronto-nasales, les double mutants ont un télencéphale

normalement divisé, mais leur corps calleux ne se développe pas notamment au niveau de la
ligne médiane, les ventricules sont élargis et la structure du diencéphale désorganisée. La
réduction du domaine d’expression des gènes cibles Ptc et Gli1 dans la ligne médiane de la face
et du SNC en développement suggère que l’HPE lobaire est vraisemblablement secondaire à
une diminution de la signalisation Shh et que Boc et Gas1 sont des co-récepteurs du
morphogène. En raison de sa localisation sur le chromosome 3q13.2 humain, Boc est proposé
être un locus modificateur pour l’HPE. En accord avec cette hypothèse, des délétions dans une
région encadrant ce locus ont été précédemment associées à une agénésie du corps calleux et
à des anomalies de la face (Genuardi et al., 1994; Lawson-Yuen et al., 2006), mais l’hypothèse
reste à être validée.

3.4. Boc est impliqué dans la prolifération des progéniteurs des

neurones granulaires du cervelet induite par Shh

Le rôle de la signalisation Shh dans le développement post-natal du cervelet a été décrit

il y a plus de quinze ans. Secrété par les cellules de Purkinje durant la période embryonnaire
tardive, puis tout au long de la vie post-natale (Traiffort et al., 1999), Shh induit la prolifération
des progéniteurs des neurones granulaires du cervelet (CGNPs) (Dahmane and Ruiz i Altaba,
1999; Kenney and Rowitch, 2000; Wallace, 1999; Wechsler-Reya and Scott, 1999). Ces cellules
issues de la lèvre rhombique entre les jours embryonnaires E13.5 et E14.5, migrent et forment la
couche germinale externe (EGL) du cervelet en développement (Roussel and Hatten, 2011). La
prolifération des CGNPs dans l’EGL est suivie de leur différenciation en cellules granulaires et de
leur migration au-delà de la couche des cellules de Purkinje afin de constituer la couche
granulaire interne (IGL) présente dans le cervelet mature.

A E18.5, Boc est observé dans l’EGL en prolifération et plus faiblement dans la couche
des cellules de Purkinje. Cdo se confine à l’extrémité de la lèvre rhombique. A l’âge post-natal

74
 Introduction

P6, alors que Cdo n’est détecté que dans les plexus choroïdes, Boc est fortement exprimé dans
les CGNPs en prolifération et plus faiblement dans les cellules granulaires différenciées en cours
de migration ainsi que dans les cellules de Purkinje (Figure 22A).

Figure 22: Le phénotype des souris Boc KO dans le cervelet en développement

(A) Immunofluorescence sur des coupes de cervelet de souris au jour postnatal P6 montrant la
localisation de Boc dans les cellules exprimant Lim1, un marqueur des neurones granulaires du
cervelet (CGNPs) et des cellules de Purkinje (PC). (B) La comparaison du cervelet adulte de
souris Boc-/- et Boc+/- montre qu’en l’absence totale de Boc, la taille du cervelet est réduite en
accord avec la diminution de la densité des CGNPs en prolifération, visualisée par le marquage
anti-Brdu spécifique des cellules en division (Izzi et al., 2011).

Dans le mutant Boc, la réduction de la taille du cervelet est en accord avec la capacité de
Boc à réguler de façon cellule-autonome la prolifération des CGNPs induite par Shh (Figure 22B).
Ce phénotype est comparable à celui observé dans le mutant Gas1. Alors que les simples
mutants ne conduisent pas à l’abolition complète de la réponse des GCNPs à Shh, le double

75
 Introduction

mutant Boc-/- Gas1-/- présente une absence complète de prolifération des CGNPs. Les données
de co-immunoprécipitation ne vont pas dans le sens d’un complexe tripartite Boc/Gas/Ptc, mais
plutôt de complexes Boc/Ptc ou Gas1/Ptc. Par ailleurs, l’introduction de mutations ponctuelles de
Shh au niveau de la glutamine E90 qui conduit à une forme de Shh capable de se lier à Ptc mais
pas à Boc/Cdo/Gas1 indique que la liaison de Shh à Ptc n’est pas suffisante à elle seule pour
induire la prolifération des CGNPs (Izzi et al., 2011).

3.5. Boc favorise la progression des médulloblastomes vers des

formes de tumeurs avancées

Le médulloblastome, la plus commune des tumeurs cérébrales malignes de l’enfant,

résulte dans certains cas d’une suractivation inappropriée de la voie de signalisation Shh. Dans
les médulloblastomes humains appartenant à cette sous-famille, l’expression de BOC est
fortement induite. L’analyse génomique comparative d’une cohorte de médulloblastomes
humains indique que 9% de ces tumeurs ont un gain du locus 3q13.2, la région chromosomique
contenant le gène BOC. Des patients atteints du syndrome de Li-Fraumeni qui présentent une
mutation somatique du gène codant pour la protéine tumorale p53 et développent des
médulloblastomes de la sous-famille Shh ont aussi une amplification de la région chromosomique
contenant le gène BOC.

De même, dans les modèles murins de médulloblastomes, Boc est très fortement exprimé
dans les CGNPs à la fois dans les formes pré-néoplasiques et dans les formes avancées. La
surexpression de Boc dans des cultures de CGNPs augmente la prolifération de ces cellules.
Inversement, l’inactivation de Boc réduit la taille des tumeurs et réduit leur progression vers une
forme avancée. La régulation de la taille de la tumeur associée à l’activité de Boc est médiée par
l’expression de gènes importants pour la prolifération cellulaire notamment Cyclin D1 et N-Myc.
De plus, en favorisant la signalisation Shh, Boc entraîne l’apparition d’un niveau élevé de
dommages sur l’ADN. Ainsi, l’inactivation de Boc réduit l’endommagement de l’ADN, mais aussi
l’incidence de la perte d’hétérozygotie de Ptc, un évènement critique dans le contrôle de la
progression de la tumeur vers une forme avancée (Mille et al., 2014).

76
 Introduction

3.6. Boc est le récepteur de Shh dans le guidage des axones

commissuraux.

Les premières données reliant Boc et le guidage des axones du SNC sont issues d’études
d’invalidation du gène chez le poisson zèbre en utilisant des oligonucléotides morpholino
antisens. L’inactivation de Boc induite au moment de la neurulation, lorsque son expression se
confine au cerveau dorsal, entraîne l’apparition de trajectoires aberrantes pour les axones du
télencéphale en formation qui projettent en direction du cerveau ventral via le tractus
supraoptique. Au lieu de suivre une trajectoire purement ventrale, ces axones se développent de
façon anormale à travers le cerveau dorsal suggérant que Boc pourrait agir comme un signal
chémorépulsif. Ainsi, les axones du tractus supraoptique sortent de ce tractus et cheminent le
long du domaine contenant les cellules exprimant normalement Boc. Par ailleurs, les axones du
tractus dorsoventral du diencéphale et ceux du tractus de la commissure postérieure se croisent
en l’absence de Boc alors qu’ils sont normalement séparés par des cellules neuroépithéliales
exprimant Boc chez les animaux contrôles (Connor et al., 2005).

D’autres travaux menés en parallèle chez la souris mutante Boc révélèrent peu de temps
après que Boc joue un rôle majeur en tant que récepteur de Shh dans le guidage des axones
commissuraux du tube neural. En effet, les neurones commissuraux situés dans la partie dorsale
du tube neural envoient leurs axones en direction, puis à travers la plaque du plancher au niveau
de la ligne médiane ventrale. Deux molécules attirent ces axones dans la plaque du plancher : la
nétrine-1 (Kennedy et al., 1994) et Shh (Charron et al., 2003). Boc et Cdo sont exprimés dans les
progéniteurs des neurones commissuraux à partir de l’âge embryonnaire E11.5. Alors que
l’expression de Cdo reste essentiellement dorsale, celle de Boc s’étend plus latéralement et
ventralement y compris dans la région où les interneurones commissuraux post-mitotiques
débutent leur différenciation. L’analyse du mutant Boc à E11.5 montre que les axones
commissuraux sont très dispersés et envahissent la moelle épinière ventrale, un phénotype
comparable à celui des animaux mutants Smo (Figure 23A). In vitro, l’inhibition de l’expression
de Boc à l’aide d’ARN interférents dans des explants de moelle épinière dorsale compromet la
capacité des axones commissuraux à être attirés vers des cellules COS surexprimant Shh et la
Netrin-1 (Okada et al., 2006).

Grâce à la mise au point d’un test in vitro de guidage axonal permettant d’imager les
neurones commissuraux alors qu’ils sont en train de répondre à un gradient bien défini de
molécules chimiques, Yam et collaborateurs montrèrent que Shh transmet cette activité de
guidage axonal en induisant l’activité des enzymes de la famille des Src kinases (SFKs)

77
 Introduction

permettant une réponse rapide ne faisant pas appel à la transcription de gènes. Cette réponse
rapide dépend non seulement de Smo, mais aussi de Boc, puisque l’expression de Boc est
requise pour conduire à une forte activation des enzymes SFKs en réponse à Shh (Yam et al.,
2009).

3.7. Boc est indispensable à la ségrégation des axones

ipsilatéraux des cellules ganglionnaires de la rétine
Dans le chiasma optique, le guidage des axones d’une sous-population de cellules
ganglionnaires de la rétine (RGC) est également régulé par Shh via Boc (Fabre et al., 2010). La
majorité des axones des RGCs croisent la ligne médiane et continuent leur progression vers le
cerveau dans le tractus optique contralatéral. Cependant chez les animaux ayant une vision
binoculaire, un nombre restreint de ces axones évitent le chiasma optique et continuent leur trajet
de façon ipsilatérale. Shh est présent dans la zone chiasmatique et sa capacité à induire la
rétraction des axones des RGCs est connue depuis de nombreuses années (Sanchez-Camacho
and Bovolenta, 2008; Trousse et al., 2001).

Néanmoins des données plus récentes utilisant des explants rétiniens enregistrés par
des approches d’imagerie en ‘time-lapse’ indiquent que cette activité de Shh est spécifique des
axones exprimant Boc. Chez la souris, les RGCs exprimant Boc co-expriment les marqueurs Zic2
et EphB1 et correspondent à la sous-population des RGCs projetant du côté ipsilatéral. La
rétraction des axones induite par Shh dépend de Smo, mais aussi de Boc comme indiqué par la
diminution du nombre d’axones dans le tractus optique ipsilatéral (Figure 23B) dans les embryons
mutants Boc (Fabre et al., 2010). D’une manière intéressante, Boc se révèle être un récepteur
de guidage axonal bifonctionnel pour Shh. En effet, d’une part, il est nécessaire pour l’attraction
des axones commissuraux de la moelle épinière (Okada et al., 2006) et d’autre part, il est
indispensable pour la rétraction des axones des RGCs ipsilatéraux l’une et l’autre induites par
Shh (Fabre et al., 2010). Ainsi, Boc (comme d’autres récepteurs du guidage axonal) est important
pour transmettre les effets positifs (attraction) et négatifs (rétraction) de Shh. Ces effets opposés
pourraient être dus à l’existence de facteurs intrinsèques ou extrinsèques capables de moduler
la réponse induite par Shh ou à l’existence de différents complexes incluant le récepteur Boc.

78
 Introduction

Figure 23: Le récepteur de Shh Boc est impliqué dans le guidage axonal dans le tube
neural et le chiasma optique
(A) Au niveau du tube neural, les axones commissuraux exprimant Boc sont attirés par Shh,
nétrine-1 et VEGF. Les axones commissuraux des souris sauvages partent de la partie dorsale
de la moelle épinière (rouge) en direction de la plaque du plancher dans la partie ventrale (bleue).
Dans les souris Boc -/-, les axones dérivent latéralement avant d’atteindre la plaque de plancher.
(B) Au niveau du chiasma optique des souris sauvages, les axones exprimant Boc (rouge)
proviennent de la rétine ventro-temporale (VT) et évitent le domaine d’expression de Shh dans le
chiasma optique. Chez les souris Boc mutantes, les axones provenant de la rétine ventro-
temporale n'expriment pas Boc et ne parviennent pas à détecter Shh au niveau de la ligne
médiane. Au lieu d'être repoussés par Shh, ils traversent le chiasma et projettent de façon
contralatérale (ligne en pointillés). Adapté de (Okada et al., 2006 ; Fabre et al., 2010).

79
 Introduction

3.8. Shh via son récepteur Boc participe à la formation des

microcircuits corticaux durant le développement postnatal
précoce.

Dans le cortex post-natal précoce, au cours de la période où la majorité des synapses se

développent, les profils d’expression complémentaires de Boc et Shh ont incité Harwell et
collaborateurs à engager une analyse fonctionnelle précise de Shh et de son récepteur Boc
(Harwell et al., 2012). Dans le cortex cérébral, Boc est exprimé dans une population de neurones
des couches II/III, IV et Va dans lesquelles Cdo n’est pas exprimé. Au cours du développement
post-natal, l’expression de Boc s’accroît très fortement entre P4 et P14 et la majorité des
neurones Boc+ co-expriment SATB2, un marqueur des neurones calleux de projection (Figure
24A). De façon intéressante, les neurones exprimant Shh sont essentiellement localisés dans la
couche V du cortex post-natal (Figure 24B).

Contrairement aux neurones exprimant Boc, les neurones Shh+ co-expriment le facteur
de transcription CTIP2, fortement exprimé dans les neurones corticofuges. L’invalidation
conditionnelle de Shh dans les neurones corticofuges Emx1+ indique que Shh est requis pour la
croissance de ces neurones et le développement des circuits corticaux. En parallèle, l’analyse
des mutants Boc indique une réduction significative de la densité des épines dendritiques, de la
croissance et de la complexité des dendrites spécifiquement dans la couche V des animaux
mutants. En utilisant une approche d’optogénétique par électroporation de la canal-Rhodopsine-
2 dans les neurones de la couche II/III, Harwell et collaborateurs montrèrent que les courants
post-synaptiques excitateurs dans la couche V sont amplement réduits en cas de perte du ligand
Shh ou de son récepteur Boc. Gli1 n’étant pas détecté dans les neurones du cortex post-natal, il
est possible que la transmission du signal Shh via Boc mette en jeu des voies intracellulaires
non-canoniques ou alternativement que les astrocytes du cortex cérébral exprimant Gli1
interviennent dans la régulation de la formation des synapses (Harwell et al., 2012).

80
 Introduction

Figure 24: Shh et son récepteur Boc régulent la formation spécifique des synapses
pendant le développement cortical.
(A) Des sections coronales de Boc +/- LacZ-ires-PLAP au jour postnatal 14 indiquent l'expression
de LacZ (Boc) principalement dans les neurones calleux SATB2 positifs situés dans les couches
II, III, IV et Va. (B) L’expression de Shh par les neurones corticofuges de la couche 5 guide la
formation du circuit cortical en collaborant avec les neurones de projections calleux exprimant
Boc au niveau de la couche II/III du cortex. Adapté de (Harwell et al., 2012)

81
Objectifs

82
 Objectifs

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans la
prévention des épisodes de démyélinisation qui surviennent au cours de la sclérose en plaques,
mais beaucoup moins dans le domaine de la régénération de la myéline détruite. L’identification
des mécanismes moléculaires et des voies de signalisation impliquées dans le processus qui
conduit spontanément à la réparation de la myéline, mais aussi l’investigation du rôle des
différents types cellulaires mis en jeu sont essentielles à l’élaboration de nouvelles approches
thérapeutiques des maladies démyélinisantes

Les données obtenues avant mon arrivée par l’équipe où j’ai effectué ma thèse, ont
permis d’identifier la protéine Shh comme étant un facteur nécessaire à la remyélinisation et
jouant un rôle positif d’une part en augmentant la survie, la prolifération et la différenciation des
OLs et d’autre part en réduisant l’astrogliose et l’infiltration des macrophages (Ferent et al., 2013).
Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore largement méconnus. Mon
travail de thèse a permis de focaliser nos investigations sur le rôle de l’un des récepteurs de Shh,
Boc, notamment en raison de sa forte induction transcriptionnelle pendant le processus de
réparation de la myéline. Ce projet repose sur l’utilisation du mutant murin Boc knockout
précédemment développé (Okada et al., 2006) et vise principalement à :

i. Caractériser le rôle de Boc dans la production des cellules du lignage oligodendrocytaire

et la myélinisation postnatales précoces.

ii. Déterminer les conséquences de l’absence de Boc sur le maintien du lignage

oligodendrocytaire et de la myéline dans le cerveau des animaux adultes.

iii. Caractériser la capacité de remyélinisation des animaux démyélinisés par injection

stéréotaxique de lysolécithine dans le corps calleux.

iv. Evaluer l’implication de Boc dans la réaction gliale inflammatoire étroitement associée au
mécanisme de régénération de la myéline (travail de collaboration avec le laboratoire
INSERM U1217-CNRS UMR5310 – Lyon - France)

83
Résultats

84
 Résultats

Le manuscrit suivant est le fruit de données originales répondant aux trois premiers
objectifs du projet et permettant de caractériser l’implication de Boc au cours du développement
de la myéline et de sa réparation dans le système nerveux central. Nos principaux résultats
peuvent se résumer de la façon suivante :

1) Tout d’abord, nous caractérisons l’expression de Boc au cours des quatre

premières semaines post-natales pendant lesquelles la maturation des progéniteurs
oligodendrocytaires (OPCs) et la production de la myéline ont lieu. L’étude menée en parallèle
dans deux régions cérébrales (le cervelet et le cerveau antérieur) où le rôle de la signalisation
Hedgehog dans le lignage oligodendrocytaire commence à être connu, montre qu’en dehors de
son expression neuronale précédemment rapportée, Boc est exprimé dans une population
restreinte d‘oligodendrocytes (OLs) matures uniquement dans le cerveau antérieur.
2) Ensuite, nous montrons qu’au moment où la myélinisation des axones est
maximale (autour du quinzième jour post-natal), l’absence de Boc dans la lignée Boc KO induit
une augmentation de la production de myéline à la fois dans le cervelet et dans le cerveau
antérieur. Cette augmentation est cohérente avec l’augmentation de la densité des OLs matures
dans le cervelet, mais est vraisemblablement liée à un mécanisme différent dans le cerveau
antérieur où la densité des cellules appartenant au lignage oligodendrocytaire n’est pas
significativement modifiée par l’absence de Boc.
3) De plus, nos résultats révèlent que Boc contrôle négativement la spécification des
OPCs (un processus péri-natal dans le cerveau antérieur). Par ailleurs, Boc est positivement
impliqué dans la prolifération de ces cellules et constitue à l’inverse un frein à leur
maturation/différenciation en particulier dans le cervelet. Ces données suggèrent que Boc
pourrait transmettre les effets induits par Sonic Hedgehog sur le lignage oligodendrocytaire.
4) Dans le cerveau des animaux adultes, l’absence de Boc déséquilibre les densités
relatives des OPCs et des OLs matures dans le cerveau antérieur, en particulier dans le cortex
et le corps calleux, aboutissant à une augmentation des OLs matures et à la persistance de
l’hypermyélinisation précédemment détectée au cours du développement post-natal.
5) L’analyse ultrastructurale de la myéline dans le corps calleux des animaux Boc
KO nous conduit à suggérer que Boc constitue un frein à la myélinisation des axones de petit
diamètre et qu’il régule l’épaisseur de la gaine de myéline autour de cette même population
d’axones

85
 Résultats

6) Enfin, en utilisant le modèle de démyélinisation par injection stéréotaxique locale

de lysolécithine dans le corps calleux des souris, nous montrons que Boc est un régulateur positif
de la maturation des OPCs et qu’il contribue à la régression de la taille de la lésion au cours du
processus régénératif. Ces effets mimant ceux de Shh, Boc pourrait donc transmettre les effets
réparateurs du morphogène. Cependant Boc et Shh présentent un effet opposé sur la densité
des cellules microgliales.

Le dernier volet du projet concernant l’évaluation de l’implication de Boc dans la réaction

gliale inflammatoire nécessaire à la réparation de la myéline nous a conduit à croiser les animaux
homozygotes de la lignée Boc KO avec les animaux d’une lignée exprimant un rapporteur
fluorescent inductible sous le promoteur Cx3cr1 exprimé par les cellules microgliales. Ce projet
mené en collaboration avec un laboratoire INSERM à Lyon consiste pour notre part à fournir à
nos collaborateurs des animaux Boc-/- ;Cx3cr1-CreER-YFP et Boc+/+;Cx3cr1-CreER-YFP traités
par le Tamoxifen et alimentés pendant 12 semaines par une nourriture supplémentée ou non par
0,2% de cuprizone. Celle-ci permet une démyélinisation notamment du cortex cérébral, qui
contrairement au corps calleux, est accessible à l’imagerie sur l’animal anesthésié. L’analyse de
ces animaux est complètement externalisée dans le laboratoire avec lequel nous collaborons.
Des enregistrements de la microglie seront réalisés sur les souris anesthésiées afin de mettre en
évidence les conséquences de l’absence de Boc sur cette population cellulaire au niveau des
régions démyélinisées.

86
Unique Roles for Sonic Hedgehog Receptor, Boc, in Regulating Myelin Production in The

Central Nervous System

Mary Zakaria et al.

U1195 Inserm and University Paris-Sud and University Paris-Saclay, Kremlin-Bicêtre, France
Abstract

Starting during the early postnatal period, the production of myelin that surrounds the axon is

a highly dynamic and fine-tuned process mediated by the oligodendrocytes in the central

nervous system (CNS). One important feature of myelin formation is its maintenance

throughout the adult life. In the healthy or pathological brain, myelin remodeling or repair takes

place in the purpose of cognitive adaptation or tissue regeneration. In order to maximize the

efficiency of axonal conduction, an optimal ratio exists between axon size and myelin thickness.

Here, we report that the type I transmembrane protein Boc (Brother of cell-adhesion-molecule-

related/downregulated by oncogenes) related to axon guidance receptors of the

immunoglobulin superfamily, may act as a brake to control the myelination level in the early

postnatal and adult brain. Boc may also participate in the determination of the diameter

threshold of axons which are myelinated. Interestingly, in the context of myelin repair, Boc

promotes the maturation of oligodendrocyte progenitors instead of preventing it as observed

during the development. In conclusion, Boc stands as a regulator of CNS myelin production

likely endowed with a dual activity in the transmission of the Sonic hedgehog signaling

according to the developmental or pathological context.

Key words: Myelin, oligodendrocyte, axon, hedgehog signaling.

Myelination in vertebrates is fundamental for the rapid conduction of action potentials along

the axons. In the central nervous system (CNS), this complex process relies on reciprocal

interactions between neurons and oligodendrocytes (OLs), the cells synthesizing myelin.

During development, the thickness and the length of the myelin segments are optimized to

achieve a fine-tuning of the conduction speed along the myelinated axons (Fields, 2008;

Tomassy et al., 2016; Ullen, 2009). In the CNS, which comprises myelinated and unmyelinated

axons, even small calibre axons can be myelinated (Hildebrand et al., 1993; Lee et al., 2012).

Recently, magnetic resonance imaging has allowed the detection of variations in the structure

of the white matter in people performing complex visuomotor skills such as juggling (Scholz

et al., 2009) or piano practise (Bengtsson et al., 2005). In the same line, learning complex motor

task requires the formation of new myelin sheaths in mice (McKenzie et al., 2014). Thus,

adaptative myelination is a major aspect of neural plasticity.

Demyelinating insult, which can occur upon injury or during demyelinating diseases,

has been shown to have a tremendous functional impact. A spontaneous process of myelin

regeneration impeding axon degeneration has been observed in the adult brain but this process

is not always efficient and may fail for still poorly understood reasons. In this context, the

identification of the factors / pathways contributing to myelin production during development

and in the adult brain in physiological and pathological conditions is extremely important (El

Waly et al., 2014; Lopez Juarez et al., 2016). Many factors and morphogens have been shown

to be key regulators of oligodendrogenesis and myelin formation in both contexts as for

example the secreted molecule Sonic hedgehog (Shh) (Ferent et al., 2013; Tong et al., 2015).

Cell adhesion molecules are obvious candidates for the transmission of cues between

the OLs and the axon to be myelinated as previously shown for the polysialylated form of the

neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) acting as an inhibitor of myelination at the surface

of axons (Coman et al., 2005) or more recently for the integrin receptors which play an
instructive role to initiate myelination in the CNS (Camara et al, 2009). The type l

transmembrane receptor Boc (Brother of cell-adhesion-molecule-related/downregulated by

oncogenes so-called Cdon), related to the cell adhesion molecules of the immunoglobulin

superfamily, has initially been implicated in enhancing muscle differentiation (Kang et al.,

2002). However, Boc mostly functions at the cell surface by binding Shh and by transducing

the Shh signal (Courchet and Polleux, 2012; Yam and Charron, 2013) well-known for its

ventralizing effects in the developing CNS (Ferent and Traiffort, 2015; Fuccillo et al., 2006).

Nevertheless, the Boc mutant mice do not exhibit the lethal phenotypes observed in the other

mutants targeting the key elements of Shh signaling including holoprosencephaly and

ventralization of the neural plate (Fuccillo et al., 2006). Instead these dramatic phenotypes, the

Boc mutant mice are viable and display a series of discrete phenotypes related to Shh signaling

such as misguided axons (Okada et al., 2006), decrease of the cerebellum size (Izzi et al., 2011)

or abnormal microcircuitry in the cerebral cortex (Harwell et al., 2012).

Here, we further investigated the contribution of Boc function in the essential process of

myelination in the CNS. Significantly, we find evidence that Boc controls the myelination level

of the early postnatal and adult brain. Boc is also involved in the establishment of the thickness

of myelin sheaths according to the diameter of the axon, exclusively around the smallest calibre

axons and, it participates in the mechanism determining the axon diameter threshold required

for initiating myelination. In addition, we provide arguments indicating that the absence of

functional Boc may be deleterious for the spontaneous ability of the brain to repair myelin both

by preventing OL maturation and altering the response of microglia to the demyelinating events.
Materials and methods

Animals

The Boc knockout mouse strain (Okada et al., 2006) was received and maintained on a C57BL/6

background. Surgeries and perfusions were performed under ketamine (100 mg/kg) / xylazine

(10 mg/kg) anesthesia. Adult C57BL/6 and homozygous Boc knockout males were used for

evaluating the impact of Boc disruption on the oligodendroglial lineage / myelin status and on

remyelination. For developmental studies, males and females were used until postnatal age P15

whereas only males were selected for the later time points. All animal studies were carried out

according to the guidelines established by the European Communities Council Directive

(86/806/EEC) for the care and use of laboratory animals. All experimental and surgical

protocols were approved by the Regional Ethics Committee CEEA26, Ministère de

L’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. Animals were housed

under standard conditions with access to water and food ad libitum on a normal 12 hr light/dark

cycle.

LPC-induced focal demyelination.

The lysolecithin (LPC)-induced demyelination was as previously described (Ferent et al, 2013).

Briefly, demyelinating lesions were induced unilaterally by stereotaxic injections of 2 μl of 1%

LPC (Sigma) into the right corpus callosum of WT and Boc-deficient male animals by using a

Hamilton syringe specifically dedicated for neural surgery. The injection was performed at the

following coordinates (to the bregma): anteroposterior (AP) +1.3 mm, lateral +1 mm,

dorsoventral (DV) -2.2 mm. Mice were sacrificed at different survival time points: 5, 10, 15

and 21 days postlesion (dpl). The brain was removed, frozen in liquid nitrogen and cryostat

sections (16 µm) were performed. 3-8 mice were used per time point for each genotype.

Organotypic slice cultures.

Slice cultures were processed as described previously (Hussain et al., 2011). Briefly, using a
McIlwain tissue chopper, 350 μm thick sagittal cerebellar slices of postnatal day 0–1 pups from

each genotype were cultured on Millicell-CMTM culture inserts (Millipore) displaying a 0.4μm

pore size. Slices were maintained in culture in a six-well plates containing 1 ml of culture

medium at 35°C in a 5% CO2 atmosphere. Cultures were kept for 7 or 14 days in vitro (DIV)

and then fixed for 1 hr with 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffer saline (PBS).

Slices were blocked with 0.1M Lysine solution in PBS supplemented with gelatin and 0,25%

Triton X-100 for 1 hr at room temperature, followed by an overnight incubation with the

primary antibodies at 4°C. Confocal Z-stacks were acquired (9-12 slices) and only slices with

intact cytoarchitecture were chosen for analysis.

Primary mixed glial cell cultures

Primary glial cell cultures were prepared from newborn mouse P1-P2 brain hemispheres

derived from each genotype as described previously (Feutz et al., 2001). Briefly, meninges were

removed, and cerebral hemispheres were mechanically dissociated in DMEM supplemented

with 10% calf serum, penicillin (50 U/ml), and streptomycin (50 μg/ml) (Thermo Fisher

Scientific). The cell suspension was plated in a six-well plates containing 1.5 ml of cultured

medium coated with 30 μg/ml poly-l-lysine (Sigma). Cultures containing astrocytes,

oligodendrocytes and microglia cells were then incubated in 5% CO2 and 95% air in a

humidified atmosphere (90%) at 37°C. The cultures were kept for 12 DIV. Cells were fixed for

20 min with 4% PFA in PBS, then permeabilized with 0.025% Triton X-100 for 10 min and

blocked for 1 hr with the Sea Block buffer (Thermo Fisher Scientific) before an overnight

incubation with the primary antibodies at 4°C.

Histological procedures.

Except for the demyelinated animals, the other mice were deeply anesthetized before perfusion

with a 4% PFA/PBS solution. Brains were post-fixed with PFA for 4 h and incubated overnight

in a 30% sucrose solution. Hemispheres were then freezed into a Shandon Cryomatrix and
stored at −80°C. Frontal sections (for LPC model) and sagittal sections (for basal

characterization) from early postnatal and adult brains were carried out. For

immunohistochemistry the primary antibodies were as follows: anti-Boc (goat polyclonal,

R&D), anti-NeuN (mouse monoclonal, Millipore), anti-Calbindin D-28k (mouse monoclonal,

Swant), anti-Sox2 (goat polyclonal, Santa Cruz), anti-Olig2 (Rabbit polyclonal, Millipore;

mouse monoclonal, Millipore), anti-myelin basic protein (MBP) (Rabbit polyclonal, Millipore),

anti-NG2 (rabbit polyclonal, Millipore), anti-Adenomatus Polyposis Coli (APC/CC1) (mouse

monoclonal, Calbiochem), anti-Ki67 (mouse monoclonal; BD Pharmingen), anti-BrdU

antibody (Rat monoclonal, Abcam), anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) (Rabbit

polyclonal, Dako; mouse monoclonal, Sigma). The isolectin GS-IB4 conjugated to Alexa

Fluor® 568 (Thermo Fisher Scientific) was used for microglia detection. The secondary

antibodies were: donkey anti-goat Alexa 488, anti-mouse 647, and anti-Rabbit 546 (Thermo

Fisher Scientific); goat anti-rabbit cyanine 3 conjugated (Jackson Immunoresearch); goat anti-

mouse Alexa 488, anti-rabbit Alexa 633 (Thermo Fisher Scientific).

In situ hybridization experiments were performed as previously described (Ferent et al, 2013).

The Boc riboprobe was kindly provided by Dr R.S. Krauss (Mount Sinai, New York, USA).

Image Acquisition and Analysis. Images were taken using the microscope analyzing system

Axiovision 4.2 (Carl Zeiss, Inc.), the confocal Zeiss LSM 510-Meta Confocor 2 and Leica TCS

SP8 with LAS AF software. Analyses were performed with ImageJ software.

Immunofluorescent-positive cells were counted in one every other 5 sections throughout the

whole demyelinated lesion per mouse and averaged for each animal. Cell counts are the result

of at least 3 animals or independent cultures and are expressed per surface unit. MBP and NG2

immunofluorescence was expressed as the percentage of the studied area. The lesion surface

was determined by measuring the area of the nuclear densification (correlated with myelin loss

visualized by MBP or PLP staining) one every other 5 slices through the whole demyelinated
lesion per mouse. For the 21 dpl time point, the lesion surface was determined as the area of

the corpus callosum devoid of small chains of cells compared to the unlesioned corpus

callosum.

Electron microscopy. Three 12 week-old male mice per genotype were perfused with 2% PFA

and 2% glutaraldehyde. Ultrathin slices of resin embedded, osmium post-fixed corpus callosum

(related to the genu part) were examined using transmission electron microscope (1011 JEOL)

equipped with a Gatan digital camera. The g ratio (the ratio between the axon diameter and

fiber diameter corresponding to myelin sheath + axon diameter) was estimated by measuring

the minimum and maximum axon diameter and fiber diameter for each axon using ImageJ

software. At least 50 randomly chosen myelinated axons were evaluated for each animal.

RT-qPCR analysis. At least four animals per group were sacrificed by decapitation. Brains

were dissected and frozen in liquid nitrogen for further processing. Total RNA was isolated by

using the Trizol Technique (Thermo Fisher Scientific) and RNeasy Mini Kit (Qiagen). Reverse

Transcription was performed using the High Capacity cDNA Reverse Transcription kit

(Applied Biosystems). Quantitative real-time PCR was carried out by using the Power SYBR-

Green Master mix (Applied Biosystems) and gene expression was analyzed with the 7300

Systems SDS Software (Applied Biosystems) normalized to reference genes GAPDH and

Cyclophilin A. The primers used were as follows:

GAPDH: Fwd: 5’-GTCGGTGTGAACGGATTTGG-3’,

Rev: 5’-GACTCCACGACATACTCAGC-3’

CycloA: Fwd: 5’-GTCAACCCCACCGTGTTCTT-3’,

Rev: 5’-CTGCTGTCTTTGGGACCTTGT-3’

MBP: Fwd: 5’-GTACAAGGACTCACACACGAGAACTAC-3’,

 Rev: 5’-TTGAAGAAATGGACTACTGGGTTTT-3’

Olig2: Fwd: 5’-GCAGCGAGCACCTCAAATCT-3’,

Rev: 5’-GGGATGATCTAAGCTCTCGAATG-3’

Gli1: Fwd: 5'-ACAAGTGCACGTTTGAAGGCTGTC-3’,

Rev: 5’-GCTGCAACCTTCTTGCTCACACAT-3'

Western blotting. The total protein isolation procedure from brain tissue was performed from

the phenol-ethanol organic layer left over after the RNA and DNA isolation steps by the Trizol

Reagent (Sigma), adapted from the original procedure described by the supplier. The protein

extract concentration was measured using the BCA method (Thermo Fisher Scientific). Proteins

(25-35μg) were separated using a 12% polyacrylamide gel followed by blotting onto a methanol

activated PVDF membrane using a dry blotting system (Pierce G2 Fast Blotter). Blots were

incubated with rabbit antibody anti-MBP (1:2000, Millipore), and with mouse antibody anti β-

actin (1:200000, Sigma). Goat anti-mouse and anti-rabbit Dylight-conjugated secondary

antibodies were used (Thermo Fisher Scientific) and membranes were scanned with the

Odyssey InfraRed Scanner (Li-Cor). The bands of interest were quantified by measuring their

integrated intensities using the Odyssey software V3.0. The densitometric values were

normalized to β-actin expression.

Statistical analysis. For cell counts, the mean number of immunopositive cells was evaluated

per image area to determine the density of cells/surface area. Data are expressed as means ±

S.E.M. Statistical analysis was performed with GraphPad Prism 4.0. The significance of

differences between means was evaluated by the Mann-Whitney test for two independent group

comparisons. The levels of significance were *p < 0.05, **p <0.01, ***p < 0.001.
Results

Boc-expressing cells in the postnatal developing brain are mostly neurons and to a much

lower extent cells of the OL lineage

Given OL heterogeneity throughout the CNS, we first analyzed Boc expression in the caudal

and rostral brain, specifically in the early postnatal cerebellum and forebrain, from P0 to P30

which correspond to an intense period of oligodendrocyte progenitor (OPC) production and

maturation. Quantitative RT-PCR revealed a dynamic regulation of Boc transcription in both

structures, with a significant up-regulation starting from P8 and peaking by P15 and P30 in the

cerebellum and forebrain, respectively (Fig. 1A,B). At the cellular level, Boc protein was

detected as previously shown (Izzi et al., 2011) in the external granule cell layer, the site where

the cerebellar granule neuron progenitors proliferate in a Shh-dependent manner and in the

calbindin+ Purkinje cells synthesizing Shh (Fig. 1C) (Ferent and Traiffort, 2015). In contrast,

Boc was not detected in cells of the OL lineage expressing the transcription factor Olig2 (Fig.

1C). In the forebrain, Boc-expressing cells were observed in layers II to V of the cerebral cortex

as shown in P15 animals (Fig. 1D) and most of these cells (97.1±1.0%) co-expressed the marker

of mature neurons, NeuN (Fig. 1F) in agreement with previously published data (Harwell et al,

2012). Nevertheless, a small fraction of Boc+ cells (2.6±1.1%) expressed the OL lineage marker

Olig2 (Fig. 1D,F). As a whole, in the cerebral cortex, Boc-expressing cells represented

58.5±4.9% of the neuron population and 2.2±0.7% of the OL population (Fig. 1G,H). In

addition, the percentage of Boc+ cells expressing Olig2 further decreased representing only

1.2±0.6% of the Olig2+ cells in the P30 cerebral cortex (not shown). In the P15 corpus callosum,

we detected a small number of Boc+ cells. 75.7±4.3% of these cells belonged to the OL lineage

as indicated by the co-expression of the Olig2 marker. However, these cells represented only

14.8±2.1% of the Olig2+ cells of the corpus callosum (Fig. 1H). As in the cortex, Boc+ cells

became quite undetectable in the corpus callosum at P30 (not shown). Interestingly, most if not
all Boc+ Olig2+ cells were mature OLs expressing the adenomatous polyposis coli (APC) (Fig.

1E). Moreover, at high magnification, the Boc antibody allowed the detection of thin filaments

within the corpus callosum (Fig. 1E) likely reflecting the axonal expression of Boc as

previously reported by using the transgenic mouse expressing a reporter gene in the Boc locus

(Harwell et al., 2012). Altogether these data indicate that during the period of early postnatal

myelination, Boc displays mostly a neuronal expression while its transient expression detected

in a highly restricted population of mature OLs progressively disappears at the end of this

period.

Boc controls myelin production in the developing CNS

We investigated the consequences of Boc disruption on the production of myelin by comparing

Boc mutant with control animals. The kinetics of myelin binding protein (MBP) transcription

was first determined in the cerebellum and forebrain between P0 and P30 by using quantitative

RT-PCR. In both areas, the absence of Boc transiently up-regulated MBP transcripts at P8 stage

when myelination has barely started in the wild-type (WT) mice (Dai et al, 2015). This

induction occurred after a small and transient downregulation observed at P0 in both regions,

but nevertheless only significant in the forebrain (Fig. 2A,B). To evaluate whether MBP up-

regulation resulted in a higher amount of protein, we prepared cerebellum and forebrain

homogenates from P15 animals and performed Western blot analysis to detect MBP expression

as an indicator of myelin contents. MBP immunoreactivity was significantly increased in both

regions of the Boc mutants compared to the WT mice (Fig. 2C,D) suggesting that Boc may be

a negative regulator for the production of MBP. Then, we analyzed the densities of Olig2+ OL

lineage cells and mature APC+ OLs in slices from P15 animals at the level of the cerebellum

and forebrain. A significantly higher density of Olig2+ cells was detected in the cerebellum and

appeared to be related to the increase in the density of mature APC+ OLs as shown by the
comparable order of magnitude of both increases. In contrast, Olig2+ and APC+ cells did not

differ significantly in the cerebral cortex and corpus callosum (Fig. 2E-G). These data suggest

that Boc may be involved in the control of myelination in both the caudal and rostral brain.

Since Boc is not detected in the OL lineage in the cerebellum, the increase in the number of

mature OLs in this region appears to be the consequence of the absence of Boc in the neurons

and may account for the higher level of MBP expression. A different mechanism is likely

implicated in the hypermyelination observed in the forebrain.

Boc is involved in the control of OPC specification, proliferation and differentiation in the

early postnatal brain

First, we used neonate forebrain slices to address OL specification in the presence and the

absence of Boc (Kessaris et al., 2006). At P0-P1, in both genotypes, we observed Olig2+ cells

with high or low Sox2 expression reflecting pre-OPCs and presumably cells starting to

differentiate into OPCs, respectively (Fig. 3A; Dai et al., 2015). The quantification of pre-OPCs

indicated a slight but significant increase in the density of these cells in the mutant compared

to the WT animals (Fig. 3A,B) suggesting that Boc negatively regulates OPC specification in

the forebrain.

Then, we investigated the impact of Boc absence on OPC proliferation by using a mixed

glial cell culture containing astrocytes, OPCs/OLs and microglia derived from the forebrain of

P1-P2 WT and mutant pups. Cultures were maintained for 12 DIV and fixed just after a short

pulse of BrdU. We detected a decreased number of Olig2+BrdU+ OPCs in the culture (Fig.

3C,D) suggesting that Boc is a positive regulator of OPC proliferation in the forebrain. To

determine whether Boc may transduce Shh signal in this context, we evaluated whether the

recombinant Shh protein up-regulates its main target gene, Gli1, in a Boc-dependent or

independent manner. In the WT mixed glial cell culture, Shh induced a 4-fold increase in Gli1
transcription whereas in the Boc mutant, no significant Gli1 up-regulation was detected (Fig.

3E) suggesting that the Gli1 up-regulation induced by Shh in the glial cells of the postnatal

forebrain is Boc-dependent.

Finally, we investigated OPC maturation by using the model of organotypic cultures of

cerebellar slices. This model was previously used to demonstrate that Shh synthesized by the

Purkinje cells (Traiffort et al., 1998) is the signal which stimulates the proliferation of OPCs

and inhibits their differentiation when those cells up-regulate the expression of vitronectin

(Bouslama-Oueghlani et al., 2012). In addition, it is appropriate to evaluate the myelination

process. Therefore, we prepared organotypic slices from P0 WT and Boc -/- mice, maintained

them for 7 or 14 days in vitro (DIV) and performed MBP immunostaining. In P0-DIV7 slices,

MBP signal was found increased although in a non significant manner in the Boc mutant (Fig.

S1A). In contrast, slices analyzed at DIV14 displayed MBP+ signals occupying an area

significantly much larger in the mutant than in the WT slices (Fig. 3F,G). In addition, the

number of calbindin+ Purkinje neurons was similar in both genotypes (Fig. 3F,H) indicating

that the increase in MBP was not due to an increase in the Purkinje axons. These data are in

agreement with the hypothesis that Boc may transduce the inhibition of OPC differentiation

previously shown to be induced by Shh (Bouslama-Oueghlani et al., 2012). In order to check

whether Boc may also mediate the previously shown Shh effect on OPC proliferation in the

cerebellum (Bouslama-Oueghlani et al., 2012), we immunostained the P0-7DIV slices with the

cell proliferation marker Ki67 and the oligodendroglial cell marker Olig2 (Fig. S1B). The first

observation was that Boc KO slices maintained for 7DIV displayed a dramatic decrease in the

density of Ki67+ proliferating cells (Fig. S1C). This decrease was consistent with the role of

Boc in the proliferation of the cerebellar granule neuron progenitors representing the main

population of proliferating cells at this stage (Izzi et al., 2011). Interestingly, despite a normal

density of Olig2+ cells, the restricted subset of Olig2+ Ki67+ proliferating OPCs was also highly
reduced in the Boc mutant (Fig. S1D,E) in agreement with the hypothesis that Boc may mediate

Shh-induced proliferation of OPCs in the cerebellum as well. Altogether, these results indicate

that Boc negatively regulates OPC specification in the forebrain, positively regulates OPC

proliferation as shown in the first neonatal days in the forebrain and the cerebellum and finally

prevents OPC differentiation as demonstrated in the early postnatal cerebellum.

Boc controls oligodendrogenesis and myelin production in the adult brain.

To further investigate the role of Boc in OL maturation and myelin formation in the adult brain,

we performed immunostaining using NG2 proteoglycan and the adenomatous polyposis coli

(APC) to label OPCs and mature OLs, respectively. While no difference in cell densities was

observed in the cerebellum (Fig. 4A,B), we observed drastic changes in the corpus callosum

and cerebral cortex (Fig. 4C-G). Indeed a significant decrease in OPC density was observed

while mature OL density was found increased suggesting an imbalance between

oligodendroglial cells which are maintained in the cell cycle and those committed into the

differentiation stage. Consistent with this hypothesis, the total number of the Olig2+ OL lineage

cells did not differ in the Boc mutant compared to the WT animals. Since the increased density

of mature OLs in the forebrain could lead to an increased myelin synthesis, we quantified MBP

by Western blot. We observed a significantly higher level of MBP protein in the mutant

indicating that hypermyelination persists in the adult forebrain (Fig. 4H) as well as in the adult

cerebellum (not shown). Altogether, these data indicate that besides its role in the early

postnatal generation of oligodendroglial cells, Boc also regulates adult oligodendrogenesis both

by promoting OPC proliferation and blocking their differentiation and, subsequently by

controlling the level of myelination.

The absence of Boc is associated with a shift in the distribution of the caliber of myelinated

axons and a thickening of the myelin sheath around small size axons

To investigate whether brain hypermyelination observed in Boc mutants was a consequence of

the higher number of myelinated axon or the thickening of myelin sheath, we performed an

ultrastructural electron microscopy analysis of adult corpus callosum, which contains a high

percentage of unmyelinated axons (Sturrock, 1980) and a majority of small calibre axons

displaying a diameter lower than 0.8 µm (Hildebrand et al., 1993) and present data). As

expected, the corpus callosum of WT adult mice had myelinated and unmyelinated axons (Fig.

5A). In contrast, the same structure in the mutant displayed an apparent higher number of

myelinated small diameter axons (Fig. 5B). Quantification showed that the total number of

axons between the WT and mutant conditions was the same (Fig. 5C). However, the density of

myelinated axons was significantly higher in the mutant at the expense of the unmyelinated

ones (Fig. 5D). Interestingly, the diameters of the majority of myelinated axons ranged between

0.3 and 0.8 µm in the WT corpus callosum whereas the values were shifted to the left ranging

from 0.1 to 0.5 µm in the mutant (Fig. 5E). In a consistent manner, in the population of axons

displaying a diameter less than 0.8 µm, the absence of Boc led to the myelination of axons with

a significantly (p=0.001) smaller diameter (0.48±0.02 µm) compared with the WT (0.57±0.02

µm). Conversely, the absence of Boc did not influence the myelination of axons displaying a

diameter higher than 0.8 µm (1.01±0.05 for the mutant vs 1.06±0.03 for the WT) (Fig. 5F).

Moreover, the analysis of the myelin sheath at a higher magnification revealed a higher

thickness in the mutant than in the WT corpus callosum (Fig. 5G,H) as confirmed by the g-ratio

calculation (axon diameter /total outer diameter of myelinated fiber) which is significantly

decreased (p=0.02) again only in the smallest diameter axons of the Boc -/- mice (0.739±0.012)

compared to the WT (0.771±0.007) (Fig. 5I). As previously described (Guy et al., 1989) the g-

ratio for the large diameter axons was found slightly higher than for the small ones in each
genotype (Fig. 5I). Altogether, these data show that Boc is a regulator of mechanisms

controlling preferential myelination of small diameter axons in the corpus callosum. In addition,

Boc may participate in the control of the optimal axonal myelination aimed at adjusting the

myelin sheath thickness to the axon diameter specifically around the small diameter axons.

The absence of Boc impedes spontaneous remyelination

Previously, we reported that the adenoviral transfer of Shh into LPC-mediated demyelinated

mice promotes remyelination together with decreasing the level of inflammatory glial cells

(Ferent et al., 2013). Therefore, we addressed the question of the possible involvement of Boc

in the spontaneous regeneration of myelin. Stereotaxic injection of LPC was performed into the

corpus callosum of WT and Boc -/- mice and remyelination was analyzed 5, 10, 15 and 21 days

post-lesion (dpl) corresponding to the steps of OPC proliferation (5 dpl), OPC differentiation

(10 dpl) and new myelin production (15 and 21 dpl). At 5 dpl, Olig2+ staining indicated that

cells from the OL lineage are mobilized into the lesion of WT animals. In contrast, only rare

Olig2+ cells were observed in the brain lesion of the mutant (Fig. 6A). The quantification

confirmed a significantly lower density of Olig2+ cells in the mutant compared to the control.

The decrease in Olig2-expressing cells persists until the step of myelin production at 15 and 21

dpl (Fig 6B) despite a clear recovery in cell number strongly suggesting that Boc delays rather

than impedes OPC mobilization (Fig. 6B). To evaluate the capacity of OPCs to differentiate in

the absence of Boc, we quantified the density of Olig2+ APC+ mature OLs in both conditions.

We detected a clear significant decrease in mature OL density in the lesion of the mutant (Fig.

6A) compared to control. Interestingly, mature OL density in mutant reached a plateau between

15 and 21 dpl at a level representing 40-50 % of the level observed in the WT animals (Fig. 6C)

suggesting that Boc regulates OPC differentiation. We evaluated the progression of the lesion

size by measuring the area of the corpus callosum in which either cell nuclei are still
concentrated or small OL chains cannot be detected. The lesion area significantly decreases

from 10 to 21 dpl in the WT animals whereas it remains quite stable and significantly larger in

the mutant mice (Fig. 6D). These data show that upon demyelination, Boc delays OPC

mobilization and impedes the differentiation of these cells into mature OLs as well as the

subsequent lesion regression.

The absence of reduction in lesion size, the delay in OPC mobilization and the defect in

OL maturation observed in Boc mutant context were really similar to the phenotype observed

in Shh signaling blockade during demyelination (Ferent et al, 2013). To further investigate the

functional link of Shh and Boc in this process, we analysed whether Boc may transduce the

previously described decrease in microglia induced by the adenovirus-mediated transfer of Shh

close to the demyelinated area (Ferent et al., 2013). Interestingly, in situ hybridization

experiments performed in the WT mice revealed a high up-regulation of Boc in the lesionned

corpus callosum compared to the unlesionned side (Fig. 6E). At 10 dpl, around 21% of Boc+

cells were found to colocalize with Olig2 whereas a tiny number was detected in GFAP+

astrocytes. Because microglia are the most abundant cells in the lesion at this time point (not

shown), the remaining Boc+ cells conceivably belonged to this cell population. Therefore, we

stained WT and Boc -/- brain slices derived from 10 dpl animals with the Ib4 isolectin notably

labelling microglia. Ib4+ cells were significantly less numerous in the mutant mice than in the

WT (Fig. 6F,G) suggesting that Boc does not mediate the decrease in microglia previously

observed upon transfer of Shh close to the lesion (Ferent et al., 2013). Altogether these data

suggest that during the remyelination process, Boc may be a positive regulator of OPC

maturation, thus mimicking Shh activity. Moreover, besides specifically regulating the

mobilization of OL lineage cells, Boc does not seem to regulate the Shh-dependent

inflammatory response.
Discussion

Besides being an incredible physiological process relying on the interaction of the axons and

the cells which synthesize myelin - OLs in the CNS and Schwann cells in the PNS, myelination

is a crucial regulator of CNS plasticity, function, and repair (Li and Richardson, 2016; Seidl,

2014; Tomassy et al., 2016). Our work shows that the transmembrane protein Boc both related

to cell adhesion molecules / axonal guidance receptors and, tightly associated with the

transduction of Shh signaling pathway is implicated not only in the production of the cells

belonging to the OL lineage but also in the developmental and regenerating processes of

myelination. Our main finding is that Boc acts as a brake to control the myelination level in the

early postnatal and adult brain. Boc activity specifically targets small calibre axons by

restricting the number of myelin wraps required to precisely adjust the thickness of the myelin

sheath to the axon diameter, a necessary parameter for optimizing the axonal conduction. The

protein also participates in the determination of the diameter threshold of axons which are

myelinated. In addition, Boc is an essential element in the context of myelin repair in which it

unexpectedly promotes the maturation of OPCs instead of preventing it as observed in

physiological conditions. As a whole, our data identify Boc as a regulator of CNS myelination

likely endowed with a dual activity in the transmission of Shh signal according to the

physiological or pathological context.

In the PNS, the axonal ligand Nrg1 type III for the Schwann cell receptor ErbB2 (Nave

and Salzer, 2006) is the necessary factor which initiates myelination and regulates myelin

sheath thickness for axons above the normal threshold (1 µm) in the PNS (Michailov et al.,

2004; Taveggia et al., 2005). The mechanisms implicated in CNS myelin regulation start to be

uncovered as well. However, they appear to be likely more intricate than in the PNS may be

due to the fact that axons displaying a wider calibre range can be myelinated in the CNS

(Hildebrand et al., 1993). Recently, integrin signaling was found to play a key role in the
axoglial interactions that sense axon size and initiate myelination, such that loss of integrin

signaling leads to a delay in CNS myelination of small-diameter axons without controlling

myelin thickness (Camara et al., 2009). Interestingly, the present work reveals a different role

for Boc since the protein is involved in the mechanism that allows the production of a myelin

sheath whose thickness is accurately adjusted to the calibre of axons in order to reach the

optimal g-ratio (Chomiak and Hu, 2009; Waxman and Bennett, 1972) specifically around the

small axons. In contrast to the PNS where a single factor (Nrg1) regulates myelin thickness of

all axons above the diameter threshold, it is conceivable that myelin thickness in the CNS is

regulated by distinct factors according to the small or large calibre of axons. As a consequence,

yet unknown factors might play a similar role for the large calibre axons in the CNS. However,

the hypothesis remains to be investigated.

An additional interesting observation is that in the absence of Boc, the distribution of the

diameters of the myelinated small calibre axons is shifted towards the smallest values. This is

notably shown by the collapse of the number of myelinated axons in the range 0.4-0.8 µm in

favour of axons in the 0.1-0.4 µm range in the Boc mutant. Previously, the engineering of

nanofibers with diameters varying between 0.2 and 4.0 µm led to demonstrate that the minimum

diameter threshold is 0.4 µm and that OLs show a preference for wrapping and ensheathing

fibers larger than 0.5 µm with a 5-fold increase in the frequency of myelin-like segments formed

by OLs in these fibers (Lee et al., 2012). By taking into account this observation, we may

conceivably assume that Boc may be part of the recognition signals that determine whether

myelination occurs in the smallest axons. Because Boc expression is mainly neuronal, we

cannot exclude that the global shift in the diameter of myelinated axons could be due to the

alteration of the axonal radial growth, a maturation process induced by OL which include

changes in neurofilament and microtubule organization in the axons (Sanchez et al., 1996). In

this regard, the distribution of the diameters of the non-myelinated axons in the Boc mutant
mice compared with the WT should be informative. Moreover, the expression of SMI-32, a

marker of non-phosphorylated neurofilaments expressed in ‘damaged’ axons would also merit

to be investigated.

In the forebrain of the adult mutant mice, the slight but significant imbalance between the

densities of OPCs and mature OLs (in favour of the latter) is consistent with the higher density

of myelinated axons detected at the expense of the non-myelinated ones. However, the absence

of Boc may in addition likely alter the intrinsic functions of the neurons or the OLs devoid of

its activity. Hypermyelination related to an increased number of myelinating cells has been

previously reported in p27-/- mice which display a cerebellar hypermyelination resulting from

a reduction in the efficiency of OPC cell cycle exit, which generates more myelinating cells and

thereby more myelin (Casaccia-Bonnefil et al., 1997). The p27 status would thus deserve to be

investigated in the OL lineage derived from the Boc mutant. Other pathways such as the

PI3K/Akt/mTor signaling and the ERK/MAP kinase have also been associated with

hypermyelination. Although the modulation of these pathways by Boc cannot be excluded, the

OL/myelin phenotype observed in the Boc mutant is less consistent with the phenotypes

associated with the dysregulation of those pathways. Indeed, mice overexpressing the

constitutively active form of the Akt kinase exhibit a dramatic increase in the amount of myelin

per OL, but a normal number of OLs as well as a g-ratio decrease in large diameter axons of

the corpus callosum (Narayanan et al., 2009). On the other hand, the transgenic mice exhibiting

a sustained activation of ERK1/2 display significantly thicker myelin sheaths during the period

of active developmental myelination that is likely related to a significant OL hypertrophy

(Fyffe-Maricich et al., 2011; Ishii et al., 2012). Another mechanism deserving to be investigated

to account for the Boc mutant phenotype relies on the recent demonstration that myelin

wrapping of axons coincides with the increase of actin disassembly proteins. These proteins

including the cofilin / gelsolin family members, are released via the competitive binding of
MBP to their binding site, which make them able to induce the disassembling of the OL actin

cytoskeleton, a required step before initiation of myelin wrapping (Zuchero et al., 2015).

Considering the MBP up-regulation observed in the early postnatal Boc mutant, we can assume

that Boc might negatively regulate actin disassembly proteins by limiting MBP expression.

Further analyses of the involvement of Boc in the myelination process include the determination

of the kinetics of cofilin or gelsolin expression, the characterization of the onset of myelin

formation in the early postnatal Boc mutant compared to the WT animals and the evaluation of

the role of the neuronal or oligodendroglial Boc in initiating myelination in dorsal root

ganglia/OL cocultures alternatively derived from the WT or Boc mutant animals.

Our data are consistent with the hypothesis that Boc may transduce Shh signal in the

promotion of OPC proliferation and the inhibition of OPC differentiation in the early postnatal

cerebellum (our present data) (Bouslama-Oueghlani et al., 2012). However, the statement is

less evident in the forebrain. First, the proliferation / maturation imbalance that we observed in

the adult forebrain is intriguingly not detectable in the forebrain of P15 animals although the

mixed glial cell cultures derived from the P0 forebrain clearly indicate a lower ability of Boc -

/- OPCs to proliferate likely in a Gli1-dependent manner (present data). Moreover, data reported

by other groups show that Shh induces the proliferation of OPCs in cultures derived from the

neonatal rat forebrain (Lelievre et al., 2006). In addition, the removal of the positive transducer

of Shh signal, Smo, in the subventricular Gli1+ progenitors bordering the corpus callosum

decreases the production of the OL lineage cells (Tong et al., 2015) whereas the disruption of

Gli1 induces a precocious myelination of the corpus callosum (Samanta et al., 2015). If we

consider these data altogether, a possible model might be that the Smo-dependent OPC

specification / proliferation induced by Shh is likely Gli-independent while the inhibition of

OPC differentiation depends on Gli. Boc may conceivably be implicated in the Gli-independent

induction of OPC proliferation and Gli-dependent inhibition of OPC differentiation. Further

investigations based on the over-expression of Boc in primary OPC/OL cultures derived from

the Boc KO mutant in the presence or the absence of Shh are required for supporting these

hypotheses.

During myelin repair, the partial failure of OPC maturation into mature OLs and the

absence of lesion regression observed in the Boc mutant are consistent with the idea that Boc

may transduce Shh signal since our previous work demonstrated that Shh blockade by its

physiological antagonist Hip is deleterious for the regression of the lesion (Ferent et al., 2013).

Intriguingly, Boc (and consequently Shh) appeared to be endowed with opposite activities in

the developmental and repairing production of OPCs/OLs and myelin. Thus, Shh signaling

would not fit with the theory according which myelin regeneration is a recapitulation of the

developmental process (Fancy et al., 2011). Data regarding the Wnt signaling endowed with

similar dual activities led to propose models in which either high or low levels of the Wnt

morphogen may be responsible for such opposite activities or alternatively canonical versus

non-canonical Wnt signaling may be involved (Fancy et al., 2014; Hammond et al., 2015). The

question remains fully opened for the Shh pathway especially, as we mentioned above, because

Shh is well-known to induce its effects via both canonical (Gli-dependent) and non-canonical

(Gli-independent) pathways (Ferent and Traiffort, 2015; Robbins et al., 2012). Moreover, Boc

is recognized as a bifunctional receptor for Shh in other contexts including the transmission of

the axon guiding activity of Shh which leads in embryo to the attraction of commissural neurons

in the neural tube (Okada et al., 2006) but the retraction of ganglion cell axons in the retina

(Fabre et al., 2010).

Although Boc phenotype is consistent with the pro-differentiating effect of Shh on OPCs

in a demyelinating context, it disagrees with the decreased infiltration of microglial cells

induced by Shh in the lesion, possibly reflecting the ability of Boc to transduce signals other

than Shh as shown for instance by the Shh-independent activity of Boc in the induction of
myogenic differentiation (Kang et al., 2002). In agreement with this hypothesis, Boc was

characterized as a class 1 Shh target gene in embryo meaning that Boc is transcriptionally

repressed by Hh signaling (Tenzen et al., 2006). Interestingly, in the context of demyelination,

in which we previously demonstrated the activation of the Shh target genes Gli1 and Ptc

(Ferent et al., 2013) we now report the up-regulation of Boc as well. Although we cannot fully

extrapolate data from embryo to adult, this observation challenges the initial theory according

which the Shh pathway is controlled by the transcriptional up-regulation of negative feedback

components such as Ptc, and the concomitant down-regulation of positively acting Shh-binding

proteins such as Boc/Cdon (Allen et al., 2007). Regardless the molecular mechanism leading to

the high up-regulation of Boc in microglia, this result may suppose a potentially important role

of Boc in the regulation of these inflammatory cells essential for myelin repair.

As a whole, our present data implicate Boc in the regulation of the white matter during

both developmental and regenerative processes. These data may assume greater significance if

we consider that Boc was recently proposed as a potential modifier locus for holoprosencephaly

in human populations and that holoprosencephaly has been associated with a deletion close to

the chromosomal position 3q13.2 where the Boc gene is located (Seppala et al., 2014). Because

myelination is accurately tuned according to a precise spatiotemporal pattern, which coincides

with the appearance of cognitive and behavioural functions (Dean et al., 2016; Fields, 2008;

Nagy et al., 2004) and given the importance of myelin thickness for neuronal communication,

the absence of Boc should be interesting to relate with specific cognitive deficits in patients

presenting with the mild (and thus viable) forms of holoprosencephaly, the most common

malformation of the forebrain in humans (Roessler and Muenke, 2010). Moreover, the detection

of inactivating mutations of Boc in patients presenting with a demyelinating disease should

likely be considered in the therapeutic strategy used in such patients in particular when the Shh
pathway is known to contribute to the remyelinating effects of the selected treatment as recently

shown for Fingolimod (Zhang et al., 2015).

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Figure 1
Figure 1. Boc-expressing cells in the postnatal developing brain are mostly neurons and

to a lesser extent cells of the OL lineage. (A,B) Analysis of Boc transcript expression

performed by qRT-PCR in the developing mouse cerebellum (A) and forebrain (B) during the

period of myelin formation between P0 and P30. *, p0.05; **; p0.01. (C,D) Boc protein

expression in P8 cerebellum (C) and P15 cerebral cortex and corpus callosum (D). In the

developing cerebellum, Boc is mainly observed in the external granule cell layer (EGL) and is

co-expressed with the calbindin protein (CaBP) in the Purkinje cells at the level of the Purkinje

layer (PL). Boc+ oligodendroglial cells can be detected neither in the developing internal

granular layer (IGL) nor in the fiber tract (fi) (C). In panel D, the cortical layers IV / Va and Vb

/ VI are indicated in the left and right pictures, respectively. The limit between the cerebral

cortex (top) and the corpus callosum (bottom) is delineated by the white dotted line. Boc

immunostaining visualized in the cerebral cortex (layers IV to VI) and corpus callosum is

mainly co-localized with the mature neuronal marker NeuN and to a lower extent with the OL

lineage marker Olig2 as shown in the magnified insets (D). (E) Triple immunostaining

performed in the corpus callosum by using Boc (orange), Olig2 (red) and APC (green)

antibodies indicating that Boc+ oligodendroglial cells are mature OLs expressing APC (white

arrows). Remarkably, the Boc antibody also labels thin filaments throughout the corpus

callosum likely corresponding to axons. (F-H) The histograms reflect the quantification of the

percentage of Boc+ cells which co-express NeuN, Olig2 or none of these markers (F) and the

percentage of NeuN+ neurons (G) or Olig2+ OPCs/OLs (H), which co-express Boc. The

quantifications are derived from n=2-3 animals (4-5 slices each). Scale bars: 50 µm (B,C); 15

µm (E).
Figure 2
Figure 2. Boc KO mice display an increased production of myelin in the developing CNS.

(A,B) MBP transcript level was determined by qRT-PCR in the developing cerebellum (A) and

forebrain (B) from P0 to P30 in WT and Boc -/- mutant mice. (C) Western blot analysis of

forebrain homogenates derived from P15 WT and Boc-/- mice. (D) Quantification of MBP

signal indicates that the protein is significantly increased in the cerebellum and forebrain of

Boc-/- animals. (E) Immunostaining performed in P15 mouse brain slices visualizes

Olig2+/APC+ mature OLs in the cerebellum (top) or cerebral cortex and corpus callosum

(bottom). (F,G) Quantifications of the density of Olig2+ OL lineage cells and Olig2+ APC+

mature OLs indicate an increase in the density of mature OLs in the caudal but not in the rostral

brain. The values are the mean ± SEM from 3 mice in each phenotype (4-5 slices per animal).

*, p0.05; **,p<0.01.
Figure 3
Figure 3. Boc is involved in the control of OPC specification, proliferation and

differentiation. (A,B) Visualization of pre-OPCs generated in the dorsal forebrain of WT and

Boc -/- P0 mice. The Olig2+ cells which highly express the Sox2 marker appear as

yellow/orange cells and are indicated by white arrows (A). The histogram shows the

quantification of Sox2High+/Olig2+ cells expressed per surface unit and derived from 3-4 animals

per genotype (B). (C-E) Primary mixed glial cell cultures derived from the forebrain of P0-P1

WT and Boc KO mice were cultured for 12 DIV and cell proliferation was assessed after a 2-

hr incorporation of the proliferation marker BrdU (C). Olig2+BrdU+ cells (white arrowheads)

were quantified and are expressed as % of the total population of Olig2+ cells (D). Similar

cultures performed in the presence or in the absence of the recombinant Shh protein (10 nM)

were evaluated for Gli1 transcription by using quantitative RT-PCR. The significant up-

regulation of Gli1 induced by Shh is lost in cultures derived from the Boc mutant (E). (F-H)

Visualization of MBP and Calbindin protein (CaBP) immunofluorescence detected in

organotypic cultures of cerebellar slices derived from postnatal (P0-P1) WT or Boc -/- mice

maintained for 14 days in vitro (F). The quantification of the area occupied by MBP+ signal is

significantly higher in the mutant (G). In contrast the CaBP+ Purkinje cell density is not

significantly different (H). Values are the mean ± SEM from at least 3 independent cultures per

condition in each genotype. Scale bars: 50 µm (A,C), 200 µm (F). *, p0.05; **, p0.01; #,

p<0.05.
Figure 4
Figure 4. In the adult brain, the absence of Boc imbalances OPCs and mature OLs and

increases myelin production in the forebrain. (A-F) Visualization of NG2+ (red) OPCs in

the cerebellar cortex (A), corpus callosum (C) and cerebral cortex (E) derived from adult WT

(left) and Boc -/- (right) mice. Nuclei are labelled in blue (Dapi). The quantification of NG2+

stained area and Olig2+/APC+ cell density in the cerebellum (B), the corpus callosum (D) and

the cerebral cortex (F) shows an imbalance between OPCs and mature OLs in the forebrain,

while no difference can be detected in those cell populations in the caudal brain. The values are

the mean ± SEM derived from n=3 animals (5-7 slices per animal). (G) Illustration of Olig2+

OL cells (red) and APC+ mature OLs (green) in the corpus callosum of WT and Boc -/- mice.

A higher number of cells co-expressing both markers (white arrows) are detected in the absence

of Boc. (H) Quantification of Western blot analysis performed on homogenates derived from

the cerebral cortex of 6-month old WT and Boc-/- mice by using the MBP antibody. Scale bars:

50 µm (A,C,E), 25 µm (G). *, p0.05.

Figure 5
Figure 5. The absence of Boc increases the density of small myelinated axons and the

thickness of their myelin sheath. (A,B) Visualization of coronal sections of the corpus

callosum derived from WT (A) or Boc -/- (B) adult mice using electron microscopy. Non

myelinated small size axons indicated by red arrows are more numerous in WT than in the

mutant sections. (C) The total number of axons does not significantly differ in the WT and

mutant mice. (D) In the absence of Boc, the number of myelinated axons is significantly higher

while the number of non-myelinated axons is lower. (E) The distribution of the diameter of

myelinated axons is shifted to the left towards smaller sizes in the Boc -/- mice (black dots)

compared to the diameters observed in the WT animals (open dots). (F) Scatter plots of the

diameter of myelinated axons larger (left) or smaller (right) than 0.8 µm in WT (open dots) and

Boc -/- (black dots) mice. The mean diameter of the large myelinated axons (>0.8 µm) does not

differ according to the genotype of the animals. In contrast, a highly significant decrease in the

mean diameter of the small myelinated axons (<0.8 µm) is observed in the mutant animals.

(G,H) The visualization of the myelin sheath at a higher magnification shows a higher thickness

of the sheath in the absence (H) than in the presence (G) of Boc. (I) Analysis of the g-ratio

(axon diameter / axon + myelin diameter) indicates no difference according to the mouse

genotype within the population of large size axons whereas a significant decrease is observed

in the population of small axons in the mutant (n=3 animals/group, 4-5 sections were evaluated

per animal). *, p0.05; ***, p0.0001 compared to WT. #, p0.05, ###, p0.0001 when the g-

ratio of small and large axons are compared within the same genotype.
Figure 6
Figure 6. The absence of Boc delays the mobilization of OPCs, impedes the generation of

mature OLs and decreases microglia upon demyelination. (A) Visualization of Olig2+ (left)

and APC+ cells in the lesion after the stereotaxic injection of LPC into the corpus callosum,

respectively of WT and Boc mutant mice. At 5 days post-lesion (dpl), Olig2+ cells (red) have

already started to populate the lesion in the WT but not in the mutant animal. The lesion is

indicated by the white dotted line. At 10 dpl, the density of APC+ mature OLs appears to be

highly lower in the mutant than in the WT lesion. The nuclei are in blue (Dapi). (B,C) The

histograms present the densities of Olig2+ OL lineage cells (B) and of APC+ mature OLs (C)

within the lesion of WT and mutant mice at the indicated time points which correspond to the

main steps of the remyelination. In the absence of Boc, the mobilization of the Olig2+ cells is

delayed and their maturation into mature OLs appears to reach a plateau between 15 and 21 dpl.

(D) The evaluation of the lesion size at 10, 15 and 21 dpl reveals that while the size of the lesion

significantly decreases from 10 to 21 dpl in the WT animals, it remains quite stable and

significantly larger in the mutant mice. (E) Double ISH / immunostaining in the lesion of a WT

mouse brain shows that few Boc+ cells coexpress Olig2 (white arrows), a tiny number coexpress

GFAP (black and white arrow) and many coexpress neither Olig2 nor GFAP (white

arrowheads).
Supplementary Data

Figure S1. Boc promotes OPC proliferation and prevents maturation in the early

postnatal cerebellum. (A,B) Immunofluorescence detected in organotypic cultures of

cerebellar slices derived from postnatal (P0-P1) WT or Boc -/- mice and maintained for 7 days

in vitro (DIV). (A) MBP and Calbindin protein (CaBP) staining. The quantification of the area

occupied by MBP+ signal tends to be higher in the mutant (B) Visualization of Olig2 and Ki67

cells. The histograms show a high decrease in the density of Ki67+ proliferating cells as well as

in the Olig2+/Ki67+ OPCs. In contrast the total number of Olig2+ OL lineage cells is not

significantly different in the WT and Boc mutant mice. Values are the mean ± SEM from 3-6

pups for each genotype per condition. Scale bars: 50 µm *, p0.05; **, p0.01; #, p<0.05.
Review
Hedgehog: A Key Signaling in the Development of
the Oligodendrocyte Lineage
Elisabeth Traiffort 1,*, Mary Zakaria 1, Yousra Laouarem 1 and Julien Ferent 2
1 INSERM—Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, Neuroprotective, Neuroregenerative and
Remyelinating Small Molecules, U1195, 80 rue du Général Leclerc,
Kremlin-Bicêtre F-94276, France; [email protected] (M.Z.); [email protected] (Y.L.)
2 IRCM, Molecular Biology of Neural Development, 110 Pine Avenue West,

Montreal, QC H2W 1R7, Canada; [email protected]

* Correspondence: [email protected]; Tel.: +33 1 49 59 19 02

Academic Editors: Henk Roelink and Simon J. Conway

Received: 15 July 2016; Accepted: 31 August 2016; Published: date

Abstract: The Hedgehog morphogen aroused an enormous interest since it was characterized as an
essential signal for ventral patterning of the spinal cord two decades ago. The pathway is notably
implicated in the initial appearance of the progenitors of oligodendrocytes (OPCs), the glial cells of
the central nervous system which after maturation are responsible for axon myelination. In
accordance with the requirement for Hedgehog signaling in ventral patterning, the earliest
identifiable cells in the oligodendrocyte lineage are derived from the ventral ventricular zone of the
developing spinal cord and brain. Here, we present the current knowledge about the involvement
of Hedgehog signaling in the strict spatial and temporal regulation which characterizes the
initiation and progression of the oligodendrocyte lineage. We notably describe the ability of the
Hedgehog signaling to tightly orchestrate the appearance of specific combinations of genes in
concert with other pathways. We document the molecular mechanisms controlling Hedgehog
temporal activity during OPC specification. The contribution of the pathway to aspects of OPC
development different from their specification is also highlighted especially in the optic nerve.
Finally, we report the data demonstrating that Hedgehog signaling-dependency is not a universal
situation for oligodendrocyte generation as evidenced in the dorsal spinal cord in contrast to the
dorsal forebrain.

Keywords: oligodendrocyte; neural tube; forebrain; optic nerve; Smoothened; Patched; Gli

1. Introduction
Oligodendrocytes (OLs) are the myelinating cells of the central nervous system (CNS). These
cells are consistently found in vertebrates in which they appeared relatively late in evolution in
hinge-jawed fishes [1,2]. Contrasting with the wide distribution of OLs in the mature CNS, OL
progenitor cells (OPCs) originate at early stages of development in restricted sites bordering the
cerebral ventricles and spinal canal before they subsequently migrate into adjacent regions. OPCs
express a characteristic set of markers, including the platelet-derived growth factor receptor alpha
(Pdgfrα) and the neuron/glial antigen 2 (NG2) proteoglycan. Both markers are rapidly
downregulated when the cells differentiate into OLs, unlike other lineage markers as the
transcription factors SRY-Box (Sox) 10 and Olig2, which are expressed in both OPCs and OLs. The
mature OLs can be identified by their expression of adenomatous polyposis coli (APC) and the
myelin basic protein (Mbp), among others (Figure 1). Like neurons and astrocytes, OLs derive from
radial glial cells (RGCs), themselves the progeny of the neuroepithelial cells constituting the
primitive neuroepithelium [3]. At early stages of neurogenesis, the potential of these primary

J. Dev. Biol. 2016, 4, x; doi: FOR PEER REVIEW www.mdpi.com/journal/jdb

J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 2 of 20

progenitors becomes regionally restricted through the activity of organizing signals. The latter
involve gradients of secreted proteins such as Hedgehog and BMP/Wnt proteins, which emanate
from the ventral or dorsal regions of the developing CNS, respectively. The different signals provide
positional information to nearby progenitors by upregulating specific sets of transcription factors
which will then control cell fate decisions [4].
The generation of the first OPCs takes place in the ventral regions of the CNS and follows the
early production of neurons. Additional sources of OPCs subsequently emerge during fetal
development in the dorsal CNS and therefore support the existence of different spatiotemporal
waves of OL production in the spinal cord as in the brain. The present review describes the
involvement of Hedgehog proteins in the development of the OL lineage in the vertebrate spinal
cord and brain from the early embryonic stages of development until the neonatal period. While the
role of Hedgehog signaling in the ventral oligodendrogenesis has been thoroughly delineated
during the last twenty years, the involvement of the pathway in the dorsal oligodendrogenesis was
only recently reported in the forebrain and is not a universal situation as shown by the
Hedgehog-independent generation of OPCs in the dorsal spinal cord.

Figure 1. Schematic representation of the developmental stages of the OL lineage. The morphological
(top) and antigenic (bottom) features of OPCs, pre-OLs, mature OLs and myelinating OLs are
shown. The list of stage-specific markers is restricted to the markers quoted in the present review.

2. Hedgehog Signaling and the OL Lineage in the Spinal Cord

2.1. Hedgehog, a Key Signaling for OPC Specification in the Ventral Spinal Cord
In 1991, Warf and collaborators published the first results suggesting a ventral origin of OLs in
the spinal cord [5]. A few years later, separate cultures of the ventral and dorsal regions of the
embryonic day (E)14 rodent or E4 chick spinal cord revealed that cells able to generate OLs are
restricted to the same domain of the neural tube that gives rise to motor neurons (MNs), the pMN
domain [6–9] (Figure 2A). Based on this observation, two independent groups demonstrated that
development of the OL lineage depends on the presence of the notochord (the mesoderm that
underlies the ventral spinal cord) and/or the floorplate (the ventral-most spinal cord cell type).
Consistently, the Danfourth’s short tail mouse mutant lacking these structures does not display any
OPCs at the ventricular surface [10], while chicken embryos possessing a second surgically
introduced notochord or floorplate at an ectopic position, show ectopic production of OPCs [10,11].
Since both the notochord and floorplate comprise Sonic hedgehog (Shh)-expressing cells [12], the
hypothesis of Shh involvement in the specification of OPCs was proposed. The hypothesis was
confirmed by the appearance of OLs in explants of chicken or quail intermediate neural plate (which
does not normally give rise to OLs) cultured in the presence of purified recombinant Shh protein.
These data were the first ones to strongly support the idea that the specification of the OL lineage
depends, at least initially, on ventral inducing signals, including Shh [10,11]. In agreement with this
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 3 of 20

conclusion, the analysis of transgenic mice in which Shh is ectopically expressed in the dorsal
midline under the control of the Wnt-1 regulatory element, revealed the induction of numerous
Pdgfrα+ and O4+ oligodendroglial cells in the region adjacent to the source of ectopic Shh [13].
Moreover, the specific Shh antibody mAb5E1 led to detect Shh-expressing cells in the chicken
ventral spinal cord immediately prior to and during the appearance of OPCs [14]. The time-window
during which Shh is required for the specification of OPCs was evaluated by independent groups by
using floorplate ablation and/or blocking Shh antibody. Slightly different results were reported since
the period of Shh requirement was alternatively determined as E3–E7.5 [14] and E4.5–E5.5 [15]. The
studies also led to suggest that Shh effect is likely direct since at that time, first, the progenitors have
lost their competence to generate MNs or floorplate cells in response to Shh and second, the Shh
receptor Patched (Ptc) is expressed by the neuroepithelial cells of the ventricular domain producing
OPCs [15]. Nevertheless, the mechanisms through which Shh was involved in the emergence of
spinal cord OPCs still remained to be investigated.

2.2. Hedgehog Transcriptional Targets Leading to OPC Specification in the Ventral Neuroepithelium
The finding that the genes encoding the basic helix-loop-helix transcription (HLH) factors,
Olig1 and Olig2, are the first Shh-regulated genes associated with the OL lineage, constituted a
substantial progress. Both genes are strongly induced in the ventricular zone (VZ) of mice
ectopically expressing Shh in the dorsal neural tube at E14.5, just before the appearance of numerous
O4+ and Pdgfrα+ OL cells in positions adjacent to this domain. The morphogen appeared to be both
necessary and sufficient for normal Olig expression. Indeed, the recombinant Shh protein induces a
10-fold upregulation of Olig1 expression when it is added into cultures of neuroepithelial cells
derived from E14.5 rat embryos. Moreover, Shh null mice display a complete absence of Olig
transcripts in areas classically known to express Shh in the CNS ventral midline [16]. Other
investigations led to propose a model according which Shh acts first on multipotential cells to induce
Olig1 and Olig2 and, second on committed OPCs co-expressing Olig1, Olig2 and the HLH proteins
E2A and HEB. The latter were suggested to facilitate appropriate Olig gene function through a
heterodimerization process and to contribute to the control of proliferation and differentiation in the
OL lineage. However, the hypothesis still remains to be demonstrated [17].
In a similar manner, Olig gene expression and OL development also require Hedgehog
signaling in the zebrafish. In the Smoothened (Smo) mutant (Smub641) where most Hedgehog
signaling is absent, a complete disappearance of trunk expression of Olig2 was first observed in 24
hours post fertilization (hpf) embryos. The mutant also completely lacks spinal cord OLs expressing
Plp/dm20 and most MNs consistent with the requirement of Olig2 function for both OL and MN
development [18]. The characterization of a second Smo mutant (Smonv122) similarly revealed the
absence of Olig2 expression in the neural tube of 48 hpf-embryos, but also the absence of Olig1
expression which is classically restricted to the OL lineage and starts from 36 hpf while Olig2 is
already strongly expressed before 20 hpf [19]. Complete abolition of Olig1, Olig2 and Sox10
expression was also observed in the Dispatched1 mutant Dispnv108 indicating that the loss of
long-range Hedgehog signaling mediated by Dispatched blocks OL development [19]. In addition,
embryos treated with the Smo inhibitor cyclopamine during various time windows from 6 to 50 hpf
exhibit a high to complete absence of Sox10+ OLs in the spinal cord. In contrast, when cyclopamine is
added from 50 to 62 hpf (after the first Olig1+ cells can be detected), no defect in OL formation is
observed despite the downregulation of Olig1 indicating that the maintenance of Olig1 expression is
Hedgehog-dependant. Remarkably, overexpression of Olig1, Olig2 or both is unable to rescue the
lack of OL formation in the absence of Hedgehog signaling, which suggests that the latter has
additional critically important roles other than inducing Olig1 and Olig2 expression [18,19].
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 4 of 20

Figure 2. Hedgehog-dependent production of the OL lineage in the developing spinal cord. (A)
Cross-sectional view of the neural tube indicating the production of the secreted Hedgehog proteins
(red) from the notochord (NC) and the floorplate (FP). The roofplate (RF) secretes BMP and Wnt.
Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are produced as successive waves, which occur in mice at
E12.5 and E15.5, respectively. The first wave arises from the pMN domain and the second one from
progenitors expressing either Pax7/Gsh1/2/Mash1 or Dbx1/2. The ventral (p0–p3, pMN) and dorsal
(dp1–6) neuroepithelial domains are indicated on the right side of the neural tube while the gene
expression patterns for the different ventral progenitor domains are indicated on the left side; (B)
Schemes of the ventral neural tube during Hedgehog-dependent MN (left, in green) and OL (right,
in blue) generation from the pMN domain. At the time of OPC specification, Hedgehog signaling
maintains Olig2 expression in the pMN domain whereas it promotes the dorsal extension and
regression of the Nkx2.2 and Pax6 domains, respectively; (C) Schematized views of the neural tube in
E13.5 wild-type or knockout mice indicating the distribution of OPCs derived from the pMN. OPCs
(blue) have already invaded the ventral neural tube in the wild-type mouse. In the absence of Shh,
no ventralization of the neural tube is observed and OPCs are completely absent. In the Gli2 mutant,
the ventral production of OPCs is highly decreased while it is unaffected in the Gli3 mutant. Finally,
the Gli3 mutation partially rescues the ventral oligodendrogenesis in the Shh mutant.
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 5 of 20

2.3. Do MNs and OLs Arise from a Common Population of Progenitor Cells in Response to Hedgehog
Signaling?
The observation that nanomolar concentrations of Shh are as efficient for up-regulating Olig
genes or inducing OLs as for inducing MNs from neural tube explants [10,14,16] suggested that both
cell types may be derived from a common precursor. Other arguments were also consistent with this
hypothesis. First, in the mouse E12.5 embryo, Pdgfrα and Olig-expressing OPCs originate from the
ventral most region of the Pax6+ domain from which MNs emerge [16]. Then, the analysis of the
Olig2−/− mutant mice [20] as well as fate mapping experiments in zebrafish spinal cord [18] showed
that Olig2 act as a transcriptional regulator in both MN and OL development.
However, the fact that OLs are generated in spinal cord explants derived from embryos older
than those giving rise to MNs and therefore that OLs and MNs are not generated at the same time
questioned the previous hypothesis. A first answer to this questioning was provided by the analysis
of ventral neuroepithelial explants isolated at various developmental stages of chick embryos. The
study showed that the OPC domain comprising O4+ and Pdgfrα+ cells lies within the most ventral
Nkx2.2-expressing domain of the neuroepithelium, and not in the adjacent domain characterized by
Pax6 expression from which MNs emerge [15]. Therefore in the chick spinal cord, OL and MN
precursors appeared to not share the same transcription factors and consequently to not originate
from the same site in the neuroepithelium in contrast to the data obtained in the mouse [16,21]. This
was proposed to reflect a species difference in mechanisms of OPC specification in chicken and
mouse.
Further investigations in the chicken neuroepithelium partially solved this apparent divergence
by showing that the expression of both Olig2 and Nkx2.2 undergoes dynamic changes at the time of
OPC specification (Figure 2B). These transcription factors are first expressed in mutually exclusive
domains, but then Nkx2.2 expression domain extends in the dorsal direction, resulting in partial
overlap of both regions [22,23]. By investigating the mechanisms that initiate and control these
changes, Agius and collaborators showed that Shh is sufficient to promote the coexpression of Olig2
and Nkx2.2 in cells of neuroepithelial explants isolated from E5 chick cervico-brachial spinal cord.
Shh activity is also necessary for this coexpression since it is required to maintain Olig2 expression in
the pMN domain, to promote the dorsal extension of the Nkx2.2 domain and to induce the
regression of the Pax6 domain that occurs between E5 and E6. Despite the existence of Shh-mediated
proliferation of neuroepithelial cells at these developmental stages, cell proliferation is not the
reason for the dorsal extension of the Nkx2.2 domain as shown by the use of the DNA polymerase
inhibitor, aphidicolin. Instead, the expansion and regression of Nkx2.2 and Pax6 domains,
respectively, result from the repatterning of ventral neuroepithelial cells. In addition to the
stimulation of OPC specification, Shh simultaneously restricts the ventral extension of the astrocyte
progenitor domain by down regulating the neuroepithelial expression of early markers of the
astrocyte lineage [24].
The most recent works, which addressed the question of the uncertain lineage relationship of
MNs and OPCs, support the segregating model through which the neuroepithelial cells are
intrinsically committed to generate either neurons or glial cells. Wu and collaborators reported a
normal number of OPCs after conditional ablation of MN progenitors in the mouse and concluded
that MNs and OLs do not share a common lineage-restricted progenitor [25]. Along the same line, in
other territories of the mouse CNS such as the diencephalon, the fate mapping of the Plp-expressing
cells indicates that the glial cells occurring at E13.5 arise from a new pool of neuroepithelial
progenitors distinct from the neuronal progenitor cells [26]. Even more recently, in the zebrafish, the
use of a photoconvertible Kaede fluorescent protein expressed by an Olig2 transgene and time-lapse
imaging led to the conclusion that the majority of MNs and OPCs arise from distinct progenitor cell
lineages and that the MN to OL segregation results from Hedgehog-mediated recruitment of
glial-fated progenitors to the pMN domain subsequent to neurogenesis. Concomitantly with MN
differentiation, the neuroepithelial cells that originate dorsal to the pMN domain move ventrally
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 6 of 20

and progressively initiate Olig2 expression, characteristic of the pMN identity. Thus, OPCs acquire
pMN identity after those that produce MNs. In other words, the ventral sliding of the
neuroepithelium brings new cells in range of Hedgehog signals to replenish pMN progenitors that
differentiate as MNs [27]. The role of progenitor recruitment from more dorsal populations to
maintain the pMN domain remains nevertheless an open question in rodents and birds.

2.4. Molecular Mechanisms Associated with the Hedgehog-Dependent MN/OL Segregation

The requirement for Shh to specify OPCs, at a long time after dorsoventral neuronal patterning
is completed [14,15,24,28] raised the question of how a single signaling molecule can confer
chronologically distinct identities on the same set of ventral neural progenitors. The high increase in
O4+ cells induced by the artificial rise in the concentration of Shh (25–100 nM compared to 2–25 to
classically induce MNs) in the early E1.5 chick neural tube led to propose that the accumulation of
the Shh protein at the surface of the ventral neural progenitors is a decisive step in the MN/OL
transition [29]. This increase was accompanied by a dose-dependent reduction in the number of
MNs differentiating in these cultures suggesting segregation toward an OL fate at the expense of
MN production. Similar results were obtained in vivo, after in-ovo electroporation of a
Shh-expressing vector at E1.5. In this experimental condition, the Nkx2.2+ domain of the VZ was
invariably expanded dorsally in the electroporated side. In addition, a premature decrease in
expression of the Ngn2 transcription factor involved in neuron differentiation (at E4 instead E5–E6)
was observed in the ventral neural progenitors. The detection of a progressive increase in Shh
immunoreactivity from E3 to E5 at a level overlaping with Nkx2.2+ cells just before OPC induction
together with a high level of Ptc expression in this domain were also strong arguments for proposing
the involvement of Shh accumulation in the MN/OL segregation [29].
Shh accumulation was attributed to the activity of the sulfatase (Sulf) 1, an enzyme which
modulates the sulfation state of heparin sulfate proteoglycans (HSPGs) and starts to accumulate just
before OPC specification. In agreement with this hypothesis, Sulf1 overexpression in E4–E4.5
chicken spinal cord dorsally extends the domain of strong Shh staining, highly upregulates Ptc1
transcripts and increases the number of Olig2+ cells. On the other side, the addition of Sulf1 blocking
antibody at the time of neural plating led to the inhibition of Ptc1 expression usually detected as two
bilateral domains in the ventral progenitor zone between E4 and E6. Similarly, OPC specification is
severely affected in E12.5 Sulf1-deficient mouse embryos which display abnormal expression
profiles for the Shh target genes Ptc1 and Gli1. The absence of Sulf1 expression in Olig2+ progenitors
as well as the reduction in the number of Olig2+ and Sox10+ OPCs significantly higher in the double
Sulf1−/−; Shh+/− mutant than in the single Sulf1−/−; Shh+/+ mutant led to propose that Sulf1 may act in a
non-cell autonomous manner and as a positive regulator of Shh. By eliminating 6O-sulfate groups
on heparan sulfate chains, Sulf1 may locally lower Shh/HSPG interaction and promote Shh release
from the surface of the progenitors located below the pMN domain. This may increase the amounts
of the morphogen subsequently provided to neighboring Nkx2.2+ cells before their segregation to an
OL fate [29,30]. Sulf1 investigation in the zebrafish spinal cord provided additional data which
characterized Sulf1 activity as a timer able to activate a high-threshold response to Hedgehog at the
critical time points of neuronal (14 hpf) and OL (36 hpf) generation as indicated by Sulf1
upregulation in the medial and lateral floorplate cells expressing Shh at these time points [31]. Other
classes of glycosaminoglycans probably regulate Shh-dependent MN/OL segregation as suggested
by the analysis of the keratan sulfate synthesizing enzyme GlcNAc6ST-1 mouse mutant [32].
Shh-mediated regulation of the Notch ligand Jag2 expression is also likely essential to control
the timing of the MN to OL segregation. Indeed, Shh restricts Jag2 expression to the pMN domain
during the period of MN generation (Figure 2B) as shown by the lack of Jag2 expression in this
domain in Shh−/− mice or by the dorsal expansion of Jag2 when a constitutive activation of the Shh
pathway is triggered by the use of an activated version of Gli3. Actually, Jag2 activity splits the Olig2
progenitors into two different identities. It prevents a pool of Olig2-expressing progenitors from
entering the neuronal differentiation pathway and at the same time, it maintains high expression
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 7 of 20

levels of the Notch effector Hes5 that in turn directly inhibits OPC generation during the neurogenic
phase (Rabadan, 2012).

2.5. Local Sources of Hedgehog Proteins Contributing to OPC Specification

Although the production of Shh is present in both the notochord and floorplate, the notochord
is no longer in contact with the overlying neural tube by E10.5–E11.5. An elegant study led to better
evaluate the individual contribution of the floorplate to oligodendrogenesis. The selective
inactivation of Shh in the floorplate was performed via mutagenesis approaches using a conditional
floxed Shh mouse line and a transgenic strain expressing the Cre recombinase under the Nkx2.2 or
Foxa2 cis-regulatory modules (CRMs). In both Nkx2.2CRM::Cre;ShhFlox/Flox and
Foxa2CRM::Cre;ShhFlox/Flox mutants, Shh expression was detected in the notochord but never in the
floorplate region of the ventral neural tube. The study of the mutant animals showed that
floorplate-derived Shh (ShhFP) is required to maintain Shh-Gli target gene and Olig2 expression in
the pMN cells between E11.5 and E12.5. As expected by the loss of Olig2 expression at E12.5 in these
mutants, the number of Olig2+ OPCs is dramatically decreased at E15.5 both in the ventral and
dorsal funiculus of the developing spinal cord. During the E10.5–E12.5 time window, the phenotype
of these mice is comparable to the phenotype observed in animals exihiting Smo inactivation in
Nestin+ neural cells indicating that the floorplate is the sole source of Hedgehog proteins required
during this period. In contrast, an additional source might be involved in signaling to OPCs destined
to migrate to the dorsal spinal cord between E15.5 and E18.5 given the slightly more severe
phenotype observed in the dorsal funiculus of the Smo mutant during this time window [33].
In the zebrafish, several Hedgehog proteins other than Shh co-exist in the notochord and
floorplate including Indian Hedgehog (Ihhb, previously known as Echidna Hedgehog) in both areas
and, Tiggy winckle Hedgehog (Twhh) in the floorplate. The partial compensation of the lost Shh
function by Hedgehog homologs throughout the period of MN and OPC specification was proposed
accounting for the apparent normal level of Olig2 expression observed in the spinal cord of the syu−/−
mutant embryos [18,34–36]. In agreement with this hypothesis, in embryos deficient for both Shh
and Twhh, spinal cord cells do not express Olig2 and consequently do not produce MNs and OLs as
previously observed in embryos deficient for Smo [18,28]. Despite the presence of Olig2+ cells in the
syu−/− mutant, these cells are nevertheless located more ventrally than normal and do not give rise to
OPCs. Thus, Shh and Twhh together appear to induce and position the Olig2+ precursor domain.
Consistent with these data, the blocking of Hedgehog signaling by a continuous exposition to the
Smo antagonist cyclopamine during various time windows including 6–36 hpf (prior to initiation of
Olig2 expression), 30–36 hpf (after dorsoventral pattern was established) or 14–26 hpf (during the
period of birth of most MNs) also shows that Hedgehog signaling is successively required to induce
and position the Olig2+ precursor domain, then to maintain Olig2 expression and finally to control
the balance between MN and OPC production [28].
More recently, the analysis of Ihhb loss-of-function showed that this protein is also required for
OPC specification from the pMN precursors. Indeed, the Ihhb morphant fails to specify Sox10+ OPCs
at 48 hpf. However, it displays normal Olig2 expression levels suggesting that Ihhb (in contrast to
Shh) is dispensable for the maintenance of Olig2 expression. Instead, Ihhb is required for the cell
cycle inhibition of the spinal precursors involved in OPC specification as indicated by the increased
proliferation of neural precursors and overproduction of neurons at the expense of OPCs during the
phase of oligodendrogenesis upon inhibition of Ihhb function. Interestingly, Shh cannot replace Ihhb
function in OPC specification confirming that these proteins do have separate functions. The relative
expression levels of Ihhb and Shh might be involved in maintaining a precise balance between the
proliferation and differentiation of spinal precursors. The underlying mechanism might be that Ihhb
behaves as a potent competitive inhibitor of Shh for binding to the Ptc receptor. However, more
direct evidence is still needed [34].
Hedgehog expression in the floorplate is a conserved feature in human as well. A high
immunoreactive Shh signal can be detected in the floorplate cells at 45 days post coitum (dpc). Shh
remains restricted to this region before becoming progressively more weakly expressed at later
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developmental stages. The first OPCs emerge dorsal to the floorplate at 45 dpc in two discrete
regions on each side of the VZ. Later they appear in the ventral and lateral cord, and finally in dorsal
regions of the presumptive white matter. Thus, human oligodendrogenesis in the spinal cord
apparently displays similarities with chick, rodent or zebrafish oligodendrogenesis [37].

2.6. Involvement of the Gli Transcription Factors in OPC Specification

The involvement of the Gli zinc-finger transcription factors in Shh-mediated induction of OPCs
was investigated through the analysis of the Gli2 and Gli3 mutants. In the wild-type mouse
embryos, Olig1/2 genes are expressed in the pMN domain during neurogenesis (E9.5–E10.5), then
downregulated at E11.5 and upregulated again during oligodendrogenesis stages. In the Gli2
mutant, Olig1/2 expression is maintained during the neurogenic step, but its upregulation fails at the
oligodendrogenic step (Figure 2C). Therefore, Gli2 activity appears to regulate the size and duration
of the Olig1/2+ oligodendrogenic domain in the ventral spinal neuroepithelium and the subsequent
production of OPCs. Is Gli2 activity directly responsible for the upregulation and maintenance of
Olig gene expression during OPC production or does it depend on the supply of Shh from the
floorplate? This remains to be determined. Despite a drastic decrease of OPCs at early stages, the
steady-state number of these cells in the Gli2 mutant is however quite comparable to that in
wild-type littermates at late gestation stages. Gli2 is thus likely not required for the proliferation of
OPCs after their initial production. Similarly, Gli2 is probably dispensable for OL differentiation and
maturation in the spinal cord since OPC differentiation can be detected in the Gli2 mutant in vivo
even though the process is reduced and delayed [38].
The non-essential role of Gli3 in ventral oligodendrogenesis was then suggested by the
comparable expression profiles of Olig/Pdgfrα or Pdgfrα/Mbp transcripts dertermined at E13.5 and
E17.5, respectively, in the wild-type and Gli3−/− mice [39]. Such a conclusion was quite in agreement
with the observation that Gli3 expression becomes restricted to the dorsal spinal cord at E9.5 before
the initiation of oligodendrogenesis. However, the Gli3 null mutation was interestingly found to
induce a substantial rescue of the defect observed in the Shh−/− mice or in the mutant diplaying a
specific removal of Shh in the floorplate. Therefore, Shh is proposed to maintain Olig2 expression in
OPCs via the repression of the antagonistic Gli3 repressor activity [33,39]. In contrast, Nkx2.2
expression being not influenced by the presence or the absence of Gli3 in embryos lacking Shh in the
floorplate, ShhFP is likely primarily required to induce Nkx2.2 expression in OPCs via the Gli
activators rather than via inhibition of the Gli3 repressor [33]. Finally, the suppression of OL
differentiation reflected by the absence of Mbp+ Plp+ OLs in the E18.5 double Shh−/−Gli3−/− mutant
supports the involvement of components other than Gli3 in the last steps of OPC maturation [39,40].

2.7. Sources of OPCs Outside the pMN Domain Are Hedgehog-Independent

The exchange of isotopically and isochronically defined sectors of the E2 spinal cord between
quail and chick embryos led to the first description of a pool of OPCs arising in the dorsal spinal
cord [41]. This finding was consistent with the generation of OPCs observed in vitro upon exposure
of the dorsal neural tube to notochord explants or to Shh [8,14]. The existence of a second wave of
OLs (Figure 2A) was then independently reported by several groups. The data supporting this
hypothesis were based on the detailed expression profiles of the Plp/dm20 marker [42,43], the
existence of FGF2-responsive stem cells able to generate OLs [44], the description of a subpopulation
of Dbx-derived OPCs three days later than the majority of OPCs generated from the pMN [45] and
the report of OPCs arising at E15.5 and differing from their ventral counterparts in the requirement
for Nkx6. These latter progenitors co-express Pax7, Gsh1/2, Mash1 and were proposed to potentially
result from a dorsal evasion of BMP signaling [46,47], in agreement with the tightly regulated
balance between ventral Shh and dorsal BMP activities, which influence the position at which OPCs
are specified in the neural tube [48,49]. The Shh-dependent induction of Olig1/2 expression in the
pMN domain first raised the possibility that Shh also mediates the induction of Olig1/2 expression in
the dorsal neural tube. However, OL generation from the dorsal domains appears to be independent
of Shh signaling. First, the Smo antagonists, cyclopamine or KAAD-cyclopamine, do not prevent the
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differentiation of the FGF2-responsive stem cells into O4+ Galc+ OLs. In the same line, Olig2+/Nkx2.2+
OPCs are induced in the presence of FGF2 in primary cultures of embryonic spinal cords derived
from Shh−/− mice [44]. In this mutant where most of the ventral structures including the pMN are
missing, no early OPCs are produced at or before E13.5. However, a small number of Olig1/2+ cells
start to appear in the dorsal spinal cord at E14.5. A larger number is observed by E18.5 with
nevertheless a delay in OL lineage progression as indicated by the late appearance of Pdgfrα and
Sox10 expression at this developmental stage and by the complete absence of Mbp expression at
perinatal stages [46]. Finally, dissociated spinal cord cells derived from E12.5 embryos which express
an inducible GFP reporter under the Dbx1 promoter give rise to GFP+Sox10+ OL cells in the presence
of cyclopamine, but not in the presence of an inhibitor of the FGF receptor [45]. Recently, the
generation of a dual reporter mouse line to color code ventrally and dorsally-derived OPCs and their
differentiated OL progeny led to show that 80% of OL lineage cells in the postnatal spinal cord are
ventrally-derived in a Hedgehog-dependent manner. Ventral OPCs appear early and spread
uniformly throughout the cord, whereas dorsal OPCs arrive later and remain mainly in the dorsal
and dorsolateral funiculi. Remarkably, ventrally and dorsally-derived OPCs/OLs do not display
distinct electrical properties [50].

3. Hedgehog Signaling and the OL Lineage in the Brain

The origin of OLs at more anterior levels of the neuraxis has long remained less well established
than in the spinal cord. Plp/dm20+ cells were first described in the ventral neuroepithelium of the
embryonic mouse diencephalon at E9 [51]. Then, a cluster of Pdgfrα+ presumptive OPCs able to
proliferate and migrate was reported at E14 in the ventral forebrain of the rat embryo [9]. Like the
developing spinal cord, the developing brain exhibits signaling centers, including the ventral center
and cortical hem which constitute a source of Hedgehog and BMP/Wnt proteins, respectively
(Figure 3A). Therefore, as previously done in the spinal cord, the implication of Hedgehog signaling
in OPC generation was progressively investigated at the different caudo-rostral levels of the
developing brain.

3.1. Hedgehog-Dependent Generation of OPCs in the Hindbrain and Midbrain

As previously observed in the spinal cord, the ventral VZ is the site where the first OPCs are
detected in the chick metencephalon, the embryonic part of the hindbrain that differentiates into the
pons and the cerebellum [52,53]. In this region, O4+ cells are present rostrally in bilateral ventricular
foci adjacent to the ventral midline at stage 26 (E5). Subsequently, OPCs populate lateral and dorsal
regions in a rostral to caudal manner. At stage 30 (E6), these cells reach rostrally the area of the
presumptive lateral pons whereas they dispersed caudally at the transitional area between the
lateral pons and the cerebellar anlagen. OPCs are then detected in the dorsal parenchyma (cerebellar
anlagen) by stage 32 (E7.5) and in the entire metencephalon by stage 34 (E8). Thus, the avian
metencephalon is characterized by a rostro-caudal and a ventro-dorsal pattern of OPC appearance
[52]. The ventral VZ is not the unique source of OPCs detected in this brain region, since additional
discrete ventricular domains are detected in more lateral and dorsal locations that subsequently
develop O4+ cells. In those domains, OPCs appear several stages later after those in the ventral VZ
and in vitro studies suggest that approximately 20% of OPCs are induced during these later stages
[52].
Interestingly, all these OPC domains are correlated with the transient expression of Shh in
adjacent tissue suggesting that Shh signaling may regulate the spatial restriction of OPC appearance.
In agreement with this hypothesis, Shh signaling is first required for the proper development of the
earliest OPCs in the chick metencephalon since the injection of mAb5E1-producing hybridomas at
stage 19 led to a dramatic decrease of OPCs throughout the tissue. In contrast, exposure to the
neutralizing antibody at stage 23 inhibited the subsequent appearance of O4+ cells in the lateral and
dorsal VZ but not in the ventral midline suggesting that the former zones contribute to the dorsal
pool of OPCs. Dissociated cells derived from the metencephalon of embryos at stage 20, 24 or 26 and
then cultured in the presence of mAb5E1 led to a reduction of O4+ cells by 92, 80 and 19%,
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respectively, indicating that the initial appearance and survival of most OPCs become independent
of Shh signaling between stage 24 and 26 in vitro. In purified cultures of OPCs, Shh promotes cell
survival and proliferation, which suggests that the morphogen can act directly on these cells. Finally,
the spatial restriction of OPC appearance can be disrupted by the addition of exogenous Shh [52].
Similarly, in the rodent hindbrain, OLs are first generated from ventral progenitor domains
while a subset of OPCs also derives from the dorsal hindbrain in a region located immediately
dorsal to the Dbx2 expression domain co-expressing Pax3, Pax7 and Gsh1 [47]. The specification of
ventral hindbrain OPCs was more accurately analyzed and showed to have a similarity with the
ventral spinal cord OPCs with respect to their dependence on Shh signaling and requirement for
Olig1/2, the expression of which extends until the second rhombomere of the hindbrain [16,54].
However, Vallstedt and collaborators revealed crucial differences in the intrinsic programs that
control Olig1/2 expression in the rodent ventral spinal cord and anterior hindbrain. Indeed, Nkx6
proteins mediate opposing effects on the generation of OPCs in both regions since they are required
for OPC generation in the ventral spinal cord while they instead suppress OPC production in the
ventral anterior hindbrain. This differential regulation appeared to be tightly linked to the
expression of Nkx2.2. Consistent with this hypothesis, Olig2+ cells are generated dorsal to the Nkx2.2
domain in the spinal cord whereas in the anterior hindbrain where they are first detected at E12.5,
these cells co-express Nkx2.2 indicating that activation of Olig1/2 expression at different positions of
the developing neural tube is regulated by distinct genetic programs [47].
In the zebrafish, the homozygous Smo mutant completely lacks hindbrain OLs expressing
Plp/dm20 [18]. In addition to the expression of Olig2, Nkx2.2a expression also depends on
Hedgehog signaling in the zebrafish hindbrain as shown by the complete absence of Nkx2.2a
transcripts in this region in the same mutant. Interestingly, the homozygous histone deacetylase 1
(Hdac1) mutant also displays a complete absence of Olig2+ and Sox10+ cells at 50 hpf, but on the
contrary an upregulation of Nkx2.2a expression. As the double Smo;Hdac1 mutant also fails to
express Nkx2.2a in the ventral hindbrain, Nkx2.2a expression seems to require Hedgehog signaling
irrespective of whether embryos are deficient in Hdac1 function or not. Thus, Hdac1 likely facilitates
Hedgehog-mediated expression of Olig2 in the ventral hindbrain and represses the expression of
Nkx2.2a in the ventral neural progenitors en route to the production of Sox10+ OPCs [55]. An
additional unexpected target of Shh signaling during OPC specification in the zebrafish hindbrain is
Disrupted-in-schizophrenia1 (Disc1). In agreement with this observation, cyclopamine blocks Disc1
expression in Olig2+ midline progenitor cells and also mimics the effect of Disc1 knockdown on OPC
specification. Interestingly, these data led to suggest for the first time that altered Shh signaling may
be a potential important developmental factor in the pathobiology of mental illnesses [56].
The development of OPCs in the chicken midbrain or mesencephalon has also been examined.
It starts ventrally at around E6 when some Olig2+ cells emerge from the Nkx2.2+ neuroepithelial cells
in ventrolateral positions. At around E11, Olig2+ OPCs then emerge from the VZ and subventricular
zone (SVZ) of the dorsal midbrain. Unlike Olig2 staining, Nkx2.2 expression is not detected in the
VZ/SVZ, but in Olig2+ cells migrating away from their origin. These Olig2+ Nkx2.2+ cells coexpress
the OL markers Pdgfrα and Sox10 and a small number continues to cycle during the migration
process. In both the ventral and dorsal VZ of the midbrain, Shh is expressed in the vicinity of Olig2+
OPCs consistent with the possible Shh involvement in the generation of these cells [57]. Moreover, a
small region of the mesencephalic neuroepithelium called the parabasal band, was recently
proposed to be the source of most OPCs present in the cerebellum [58]. Hedgehog implication in the
specification of this main population of OPCs remains to be precisely addressed. However, insight
on the molecular mechanisms underlying OL development in this brain area was provided by a
recent study showing that during early postnatal development, Shh stimulates the proliferation of
Olig2+ OPCs and downregulates their differentiation. Thus, Shh may prevent cerebellum OPC from
exiting the cell cycle and inhibit the effects of factors promoting their differentiation. In agreement
with this hypothesis, by the end of the first postnatal week, Purkinje cells downregulate Shh and
produce vitronectin which induces OL maturation [59].
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Figure 3. Hedgehog-dependent generation of the OL lineage cells in the brain. (A) Scheme
visualizing the ventral (red) and dorsal (blue) organizing centers of the forebrain which secrete
Hedgehog and BMP/Wnt, respectively; (B) Cross-sectional view of the mouse telencephalon
indicating the regions of the ventricular zone where the different waves of OPCs are generated. The
earliest wave (E12.5, red) arises from Nkx2.1-expressing precursors, which appear in the anterior
entopeduncular area (AEP) and medial ganglionic eminence (MGE) and then migrate into all parts of
the telencephalon. The second wave derives from Gsh2+ precursors located in the lateral ganglionic
eminence (LGE, green) at E15.5. The last wave emerges from Emx1-expressing cortical precursors
(blue) around birth; (C) Sagittal view of the brain indicating the position of the developing
hypothalamus which also generates OPCs in E12.5 mouse embryo; (D) Coronal view of the
hypothalamic region indicated by the boxed area in (C). The localization of the Shh protein (red)
transported through the optic nerves (ON) towards the optic chiasm (oc) is shown. The OPCs (blue)
generated in the floor of the third ventricle (3V) in a Hedgehog-dependent manner at E12.5 in mice
are aimed at colonizing the optic nerves. D, diencephalon; Hb, hindbrain; LV, lateral ventricle; Mb,
midbrain.

3.2. Hedgehog-Dependent Production of OPCs in the Ventral Telencephalon

At the end of the 1990s, several publications started to investigate OPC genesis in the forebrain.
Precursor cells derived from E15 rat striatum either cultured in vitro or transplanted into the eye
were shown to have a greater capacity to generate OPCs than precursors from the neocortex [60,61].
Moreover, histological evidence for a ventral source of OLs in the rodent and chick forebrain was
reported by establishing the expression profiles of the Plp/dm20 and Pdgfrα OPC markers,
respectively [42,62]. Since a region of the ventral forebrain was appearing to be specialized for the
generation of OPCs, several groups were incited to further define the location of this region and
started to explore more accurately its establishment. The data which are presented below support
the idea that in the ventral telencephalon, as previously shown in the developing ventral spinal cord
and caudal brain, Shh is likely one of the factors which are important for the generation of OPCs
with nevertheless a higher level of complexity [54,63–65].
The first argument was the localization of the Pdgfrα expression domain within a region of the
anterior hypothalamic neuroepithelium that co-express Shh and Ptc from E13.5 to E17 in the rat.
These expression profiles suggested that Pdgfrα+ progenitors, before spreading to the forebrain into
J. Dev. Biol. 2016, 4, x FOR PEER 12 of 20

areas where Shh is not expressed (such as the cerebral cortex), are exposed and respond to Shh. Loss-
and gain-of-function experiments supported this hypothesis. The Nkx2.1 null mutant mice which
lack the telencephalic Shh expression domain display no Pdgfrα+ OPCs in the forebrain VZ. In
contrast, early OL markers are not lost in areas of the Nkx2.1 mutant forebrain where Shh persists
such as the zona limitans intrathalamica and the amygdaloid region [63]. Consistent data were
obtained in the zebrafish with a lower level of Olig2 expression in the brain of the syu−/− mutant
embryos, which are deficient for Shh [18]. In vivo gain-of-function experiments using the ectopic
expression of Shh in the telencephalic neuroepithelium of E9.5 mouse embryos led to the production
of a majority of OLs at the expense of neurons. Interestingly, in P21 postnatal mice, Shh-infected cells
express myelin markers in the white matter but rarely in the grey matter, suggesting that while Shh
can direct cells to an OL fate, local cues are involved in allowing these cells to adopt a mature OL
phenotype. In addition, in favor of the role of Shh in OPC production in the ventral telencephalon
was the observation that in vivo Shh gain-of-function can partially rescue the failure of OL
development in the Nkx2.1 mutants and notably induce Olig2 and Pdgfrα+ expression ectopically in
the dorsal cortical regions in the mutant as in the wild-type animals [63].
Complementary culture systems revealed nevertheless a higher level of complexity for the
Shh-dependent generation of OPCs in the forebrain. As expected, the Smo antagonist cyclopamine
inhibits OPC development in cultures of mouse ventral telencephalon. However, OPCs were found
to develop in cultures of Nkx2.1−/− basal forebrain which lack Shh expression. Even more surprising
was the ability of cyclopamine to block OPC generation in those cultures. Similar results were
obtained when different regions of the telencephalon including the median ganglionic eminence
(MGE), the lateral ganglionic eminence (LGE) and the cortex were cultured as either explants (from
E13.5 embryos) or dissociated cells (from E17.5 embryos). All regions were qualitatively similar in
their ability to generate OPCs regardless the embryo genotype thus suggesting that Shh is
apparently not required for OPC production in vitro [63,65]. Several hypotheses were proposed to
account for these results including the presence of Shh and Ihh in the cultures. However, the reasons
for Shh-independent generation of OPCs in vitro remained nothing less than surprising.

3.3. Cooperation between Shh and Fibroblast Growth Factors in the Generation of Ventral Telencephalon OPCs
The revisiting of Shh-dependency of forebrain OPC production allowed the identification of a
population of Pdgf-responding precursors (PRPs) isolated from E14 mouse MGE and able to
respond to Shh signaling. In concert with Pdgf signaling, Shh induces proliferation and/or survival
of these cells. In addition, these precursors are able to generate neurospheres which give rise both to
neurons and OPCs suggesting that a common precursor can generate these two cell types in the
ventral forebrain. The self-renewal of these precursors is cooperatively increased in the presence of
both Pdgf and Fgf2. This effect being reduced by the presence of cyclopamine, the self-renewal of
PRPs was finally proposed to depend on the effective activation of Shh signaling by both Pdgf and
Fgf2 [66]. In the same line, Shh and Fgf2 induce E13.5 mouse neocortical precursors to express the
transcription factor Olig2 and to generate OPCs in culture. These shared activities for inducing OPCs
involve overlapping intracellular signals. Indeed, the induction of Olig2 by Shh or Fgf2 is strongly
inhibited by specific inhibitors of MEK / MAPK or PI3K pathways indicating that these pathways are
crucial for the first step of OPC specification. However, only Fgf2 is able to increase MAPK activity.
Since Shh effect is strongly inhibited by both cyclopamine and a specific inhibitor of the FGF
receptor tyrosine kinase, Shh effect likely depends on Fgf activity for maintaining a basal level of
phosphorylated MAPK [67]. The conditional deletion of Fgf receptors (Fgfr) 1 and 2 in the mouse
embryonic forebrain then revealed that in vivo Fgf signaling through the cooperation between both
receptors is required for the initial generation of OPCs in the ventral forebrain. Since the failure of
OPC generation in the Fgfr mutants occurs without loss of Shh signaling and the pharmacological
inhibition of either Fgfr or Hedgehog signaling in parallel cultures strongly inhibits OPC generation,
it was concluded that Fgfrs cooperate with Shh to generate OPCs [68]. Crosstalk between Shh and
Fgf signaling pathways is not restricted to the rodent forebrain, since in the zebrafish, Fgf16 which is
required for OL development notably in the forebrain, is induced by the Hedgehog signaling [69].
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However, a notable difference might exist in human since FGF2 was there proposed to inhibit the
transition of pre-OPCs to OPCs by repressing SHH-dependent co-expression of OLIG2 and NKX2.2
[70].

3.4. OPC Production is Gli2-Independent in the Forebrain

The role of the Gli2 transcription factor in Shh-mediated induction of OPCs was investigated in
the mouse forebrain. In contrast to the spinal cord, OL development in the forebrain remains
unaffected by Gli2 mutation despite Gli2 expression in this brain area [38]. At E12.5, Shh expression
is mainly detected in the mantle zone of the MGE, anterior entopeduncular area (AEP) and
hypothalamus both in the wild-type (Figure 3B, C) and the Gli2 mutant embryos with nevertheless a
slight difference in the hypothalamus where Shh expression is restricted to the midline in the mutant
likely due to the loss of some ventral tissue. No obvious difference is detected in the number or
distribution pattern of Olig2+ and Pdgfrα+ OPCs. The latter are highly detected in the VZ of MGE
and to a lesser extent in the LGE. A few migratory OPCs are also observed in the mantle of the MGE.
At E14.5, numerous Olig2+ and Pdgfrα+ OPCs are found in the striatal and septal regions in both
phenotypes with some OPCs already spreading dorsally into the neocortex. If Gli2 activity thus
appears to be dispensable for Shh expression in the ventral telencephalon and OPC specification in
the forebrain, it remains nevertheless unclear whether Gli2 can play a role in the terminal
differentiation of OLs. The apparent unaltered generation of OPCs in the Gli2 mutant forebrain was
proposed to be consistent with the possible redundant functions of Gli1 and Gli2 in regulating Shh
expression [71] and thus oligodendrogenesis in the forebrain [38].

3.5. The Dorsally-Derived Third Wave of OPC Production in the Telencephalon Depends on Shh
Numerous questions remained unanswered in the forebrain such as the existence of a single
homogenous population of OPCs or the involvment of Shh in the generation of all OLs. The finding
that competitive waves of OLs exist in the forebrain corresponded to an important progress in our
understanding of OPC production in this brain area. By using a Cre-lox fate mapping approach in
transgenic mice expressing the Cre recombinase under the control of Nkx2.1, Gsh2 and Emx1,
Kessaris and collaborators showed that the first OPCs originate in the AEP and MGE in the ventral
forebrain at E12.5. From these regions, they populate the entire embryonic telencephalon including
the cerebral cortex just before the appearance of a second wave of OPCs from the LGE at E15.5. A
last wave finally arises within the perinatal cortex (Figure 3B). The destruction of one of these
populations surprisingly induces the remaining cells to take over and compensate for the lost
population [72]. Consistent with the much expanded cortex in the mammalian, the dorsal wave of
OPC production exists in rodents but not in birds where all OLs in the cortex were found to arise
from ventrally-derived, migratory OPCs [73]. The dual reporter mouse line previously described in
the context of the spinal cord and which allowed tracing ventrally and dorsally-derived OPCs and
their progeny, led to show that only 20% of OLs in the postnatal corpus callosum are
ventrally-derived. This pattern is thus different from the observation done in the developing spinal
cord, where most OPCs arise from the ventral VZ under the influence of Hedgehog signaling,
whereas a minority is generated from the dorsal VZ in a Hedgehog-independent manner [50].
The hypothesis that ventral OPC appearance depends on Hedgehog signaling while dorsal
OPC do not (as previously proposed in the spinal cord but possibly not in more caudal regions of the
brain) was questioned by several publications in the telencephalon. For instance, Smo removal in the
neural progenitors which express the ubiquitous marker Nestin as soon as E12.5, leads to OL
deficiency in the early postnatal telencephalon suggesting Smo involvement in the generation of
pallial-derived OLs [74]. Moreover, in vitro data reported that neonatal purified cortical OPC
cultures are able to respond to Shh which induces a dose-dependent increase of thymidine
incorporation in these progenitors [75]. More recent data now provide the demonstration that a
dorsal Shh-dependent domain in the SVZ produces large numbers of OLs in the neonatal brain [76].
This domain borders the developing corpus callosum and transiently expresses the Shh target gene
Gli1 and the transcription factor Pax6. The use of adenoviral lineage tracing to label dorsal RGCs
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expressing Gli1 in neonates led to detect 28 days later, fluorescent cells expressing Olig2, Sox10 and
APC (a marker of mature OLs). In addition, the genetic ablation of Smo or in contrast, the expression
of the constitutively active Smo M2 receptor in dorsal RGCs resulted in a high reduction or increase,
respectively, in the production of OPCs/OLs in the corpus callosum [76]. In parallel and in an
unexpected manner, the Gli1 null mice were reported to start myelination in the corpus callosum
earlier than the wild-type animals suggesting that Gli1 delays the onset of myelination [77]. This
apparent discrepancy will obviously have to be clarified. Interestingly, in adulthood, the ectopic
activation of Smo in the dorsal SVZ or the delivery of Shh into the lateral ventricle still promotes
oligodendrogenesis in the corpus callosum. In that case, the Shh protein detected in the SVZ is likely
produced by various areas of the ventral forebrain and transported through projecting axons or the
cerebrospinal fluid [76,78].
In human at midgestation, OPCs originate both in the ventral telencephalon and in the cortical
SVZ [79,80]. The OL lineage cells can be detected by markers similar to those used in other
vertebrates. The human fetal RGCs isolated from the cortical SVZ are also able to generate OLs in
vitro and the production of these cells is enhanced by Shh [79,81,82]. However, the inhibition of
endogenous Shh signaling with the Smo antagonist cyclopamine does not reduce the density of
Olig2+ cells suggesting the existence of an additional Shh-independent mechanism for human OL
generation at least in vitro [82].

3.6. Antagonistic Activities of Shh and BMP on the Transcriptome of Telencephalon OPCs
A tightly regulated balance between Shh and BMP has been reported for OPC differentiation in
the spinal cord where BMP represses Shh-target genes Olig2 and Nkx2.2 [48]. In a similar manner,
investigation of the effects of those morphogens was performed on A2B5+ OPCs prepared from rat
neonatal cortices. In the presence of Shh and BMP4, A2B5+ OPCs give rise to O4+ late OPCs and
GFAP+ astrocytes, respectively. These effects are associated with morphological changes including
the appearance of multiple thin processes and rounding up of the soma for Shh-treated precursors
and, few thick cytoplasmic expansions together with an enlargement and flattening of the cell body
for BMP4-treated cells. Shh also induces the occurrence of electron-dense aggregates distributed
along the nuclear periphery whereas BMP4-treated cells retain a dispersed and homogenously
distributed euchromatin. These opposite effects on chromatin compaction were proposed to be
likely mediated by a differential regulation of histone acetylation. Hdac1 and 2 appear to repress
astrocytic genes during Shh-induced OL differentiation, but to be dispensable for BMP4-induced
astrogliogenesis. In OPCs, Hdac activity would thus be responsible for the repression of other
lineage genes. Moreover, an interesting heat map representation of gene expression profiles revealed
that the progression from OPC to more mature OLs requires fewer transcriptional changes than the
conversion to astrocytes since 1200 and 14000 genes are regulated by Shh and BMP4, respectively
[83].

3.7. Shh-Dependent Generation of OPCs in the Optic Nerve

In the optic nerve, OPCs are derived from cells located in the diencephalon, especially in the
floor of the third ventricle directly dorsal to the optic chiasm (Figure 3C,D). These cells or their
progeny populate the optic nerve before becoming differentiating and myelinating OLs [53,84]. The
mechanism of the specification of optic nerve OPCs remained unclear until 2006 when Gao and
collaborators demonstrated that the appearance of chick OPCs is temporally correlated with and
dependent on retinal axon projection to the brain in vitro and in vivo [85]. The observation that the
arrival of retinal axons to the forebrain occurs at stages 27–29 (E5–E6) concomitantly with the initial
appearance of OPCs incited to perform co-cultures of dorsal spinal cord and retina explants. These
cultures indicated that signals derived from the developing retina are competent to induce OPCs in a
responsive tissue. One of the molecular cues expressed by retinal axons is Shh. Its expression is
correlated spatially and temporally with the axonal growth of the optic nerve towards the optic
chiasm. Shh is synthesized in the retinal ganglion cells which are the source of the protein which is
then transported via the retinal axons. The Ptc receptor is also strongly expressed in the floor of the
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third ventricle at the time of OPC specification. These expression profiles as well as the complete
inhibition of the OPC inductive activity of retinal conditioned medium by either cyclopamine or the
specific Shh antibody mAb5E1 led to propose that the axonal induction of OPCs depends on Shh. In
a consistent manner, in vivo injection of cyclopamine at embryonic stage 19 (E2) and analysis at
stage 31 (E7) when O4+ cells are clearly detectable at the ventral midline of the third ventricle,
revealed a dramatic reduction in these cells. The treatment of explants isolated at stage 27 (E5) also
led to a decrease in OPCs indicating that OPC induction depends on continued Shh signaling.
However, although Shh is likely required for the appearance of optic nerve OPCs, it is probably not
sufficient for the commitment of neural epithelial cells to the OL lineage [85].
The distribution of Shh signaling components at later stages of development notably when
OPCs colonize the optic nerve suggested that the pathway may contribute to other aspects of OPC
development such as their proliferation or migration. In the mouse, scattered precursors are first
detected in the proximal end of the nerve at E14.5. They reach the distal end at E16.5 and are
homogenously distributed along the entire nerve by E17.5 [86]. During this period, Shh is still
expressed by the retinal ganglion cells and transported along their axons [87–89]. The ventral
portion of the third ventricle of E14.5 mouse embryos expresses high levels of Gli1 transcripts which
are maintained in the committed OPCs therefore still competent to respond to Shh signaling. The
colonization of the optic nerve by OPCs occurs when the majority of the retinal ganglion cell axons
have already reached the forebrain. This process is under the control of several growth factors and
axon guidance molecules notably promoting OPC mobility along the optic nerve, while BMPs
prevent OPCs from invading the neural retina [90]. Cultures of optic nerve explants from E16.5
mouse embryos led to demonstrate that Shh induces the proliferation of optic nerve OPCs and acts
as a chemoattractant for their migration. OPC migration is blocked by the specific mAb5E1 Shh
antibody. Once they have colonised the optic nerve, OPCs lose their chemoattractive but not their
proliferative response to Shh. Shh-dependency of OPC migration was also shown in E4.5 chick
embryo by in ovo interference with Shh signaling. How newly generated OPCs are not retained in
the floor of the third ventricle where Shh protein is also present remains however an open question
[91].
The possible involvement of other components of Shh signaling was then addressed notably by
the investigation of the role of the multiligand receptor megalin, a member of the low-density
lipoprotein receptor family. An interesting observation is that the expression of megalin, Ptc and
Gli1 seems to parallel the OPC colonization of the optic nerve from the chiasm to the retina. In the
optic nerve, megalin is exclusively expressed in astrocytes at the time when OPCs colonize this
structure, whereas Ptc and Gli1 are found in Olig2+ cells. The capacity of megalin neutralizing
antibodies to block the effects of Shh on the migration and proliferation of optic nerve OPCs
suggests that megalin takes part in these effects. The proposed mechanism is that Shh is internalized
via the multiligand receptor before being released by astrocytes to promote the migration and
proliferation of OPCs. Megalin might thus control the level of Shh available for OPCs along a
defined gradient during the colonization of the optic nerve [92].

4. Conclusions
The data accumulated over the years on the role of Hedgehog signaling in the genesis of the OL
lineage clearly demonstrates that the pathway, among others, occupies an important position in this
developmental process. Hedgehog signaling involvement in OPC production is conserved across
vertebrates including human and regards the whole CNS. Despite that, several questions remain
notably in the brain where OPC production exhibits a level of complexity higher than in the spinal
cord due to the diversity of the cerebral structures. Interestingly, whatever the region of the CNS
which is considered, the ventrally (spinal cord) or dorsally (forebrain)-derived OL population that
predominates appears to be generated in a Hedgehog-dependent manner. Therefore, a better
understanding of the crosstalks existing between Hedgehog signaling and other signaling pathways
as well as the identification of the Hedgehog pathway components which transduce Hedgehog
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signals should improve our knowledge of the molecular mechanisms which are involved in OPC
development and ultimately open new perspectives in myelin diseases.

Acknowledgments: The review received the financial support of the French Multiple Sclerosis Foundation
(ARSEP) to E.T. (RAK14147LLA).

Author Contributions: E.T. and J.F. contributed to the redaction of the manuscript and the conception of the
figures. All authors commented on the manuscript.

Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interests.

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terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC-BY) license
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Discussion et perspectives…

87
 Discussion et perspectives

Tout au long du 20ème siècle, les neurosciences ont fait d’énormes progrès dans la
compréhension du système nerveux (SN) notamment en raison de l’évolution des techniques de
microscopie et d’histologie. Le développement de l’électrophysiologie en patch- ou voltage-clamp
a permis d’accéder aux phénomènes électriques et électrochimiques qui se produisent notamment
dans les neurones Aujourd’hui les nouvelles techniques d’imagerie comme le scanner, l’IRM, l’IRM
fonctionnelle, la TEP et l’EEG, permettent d’étudier d’une manière plus sensible le SN dans son
ensemble, en particulier les atteintes de la matière blanche avec l’IRM de tenseur de diffusion (DTI)
(Dennis and Thompson, 2013). Ces techniques servent au diagnostic et au suivi de la progression
des maladies neurodégénératives dans le temps. Plus récemment, elles ont aussi été utilisées
pour mettre en évidence des changements microstructuraux du cerveau humain dans l’optique de
recherches plus fondamentales (Chang et al., 2017; Zhang et al., 2016). C’est en particulier le cas
de l’IRM de tenseur de diffusion ou IRM pondérée en diffusion qui permet de mesurer la mobilité
des molécules d’eau notamment modifiée par la présence des fibres nerveuses. Grâce à ses
propriétés physiques, l’IRM de tenseur de diffusion a permis jusqu’à un certain point la
caractérisation anatomique de la substance blanche incluant le calibre des axones, la densité des
fibres et la myélinisation (Chen et al., 2017; Qiu et al., 2015) . Grâce à cette approche fut mise en
évidence l’existence d’une plasticité de la substance blanche lors de tâches d’apprentissage
complexes (Bengtsson et al., 2005; Scholz et al., 2009).

Mon projet de thèse s’intègre dans ce contexte puisqu’il vise à caractériser le rôle d’une
molécule transmembranaire reliée aux molécules d’adhésion de la superfamille des
immunoglobulines, Boc, dans les processus de myélinisation et remyélinisation. Deux
caractéristiques étaient initialement en faveur d’un rôle potentiel de cette protéine dans la mise en
place, le maintien, la plasticité et la régénération de la myéline : d’une part sa proximité structurale
vis-à-vis de la classe des molécules d’adhésion classiquement considérées comme
potentiellement importantes pour la communication cellulaire notamment celle qui doit s’établir
entre l’axone et la cellule myélinisante, et d’autre part le fait que l’une des principales fonctions de
Boc consiste à transmettre le signal du morphogène Sonic Hedgehog (Shh) lui-même impliqué
dans la production des cellules du lignage oligodendrocytaire et de la myéline en conditions
physiologiques et pathologiques (pour Revue, Traiffort et al., 2016).

Partant de ces constatations, nous avons mis à profit la disponibilité de la souris Boc KO qui
a été construite en ciblant le locus Boc avec une cassette comportant deux gènes ‘rapporteur’, la
-galactosidase et la phosphatase alcaline placentaire humaine permettant de marquer les corps
cellulaires dans le cas de la -galactosidase et les membranes et l’axone dans le cas de la

88
 Discussion et perspectives

phosphatase alcaline placentaire) (Okada et al., 2006).

1. Boc et la complexité de la signalisation Sonic Hedgehog

Depuis la découverte du gène de polarité segmentaire Hedgehog chez la drosophile

(Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980), un nombre considérable de protéines capables de
réguler les signaux induits par les protéines sécrétées Hedgehog ont été identifiées et ont permis
d’établir des modèles de signalisation particulièrement complexes. A la diversité des protéines
capables de lier Hedgehog à la surface de la cellule pour permettre sa sécrétion, transmettre son
activité à l’intérieur de la cellule réceptrice ou encore rétro-contrôler son activité se sont ajoutées
de multiples cascades de signalisation intracellulaires permettant la transmission soit d’effets
rapides (de l’ordre de la minute) notamment requis lors du guidage des axones et ne faisant pas
appel à la transcription de gènes, soit d’effets beaucoup plus lents et faisant appel à la
transcription de gènes notamment rencontrée dans les processus de spécification, prolifération
ou différenciation cellulaire (pour Revue (Briscoe and Therond, 2013; Ferent and Traiffort, 2015)).

Boc fait partie des protéines capables de lier les protéines Hedgehog à la surface de la
cellule et apporte elle-même un niveau de complexité supplémentaire à cette voie de
signalisation. En effet, Boc joue alternativement un rôle de régulateur positif ou négatif de la
signalisation Hedgehog, elle a la capacité d’interagir avec d’autres récepteurs (en particulier Cdo)
et de participer à la transmission des signaux Hedgehog par différentes cascades de signalisation
intracellulaires (canoniques ou non canoniques). Boc est dans la majorité des cas, un régulateur
positif de la voie Shh en particulier dans l’induction de la prolifération des cellules granulaires du
cervelet (Izzi et al., 2011) ou le guidage des axones commissuraux (Okada et al., 2006) ou
rétiniens (Fabre et al., 2010), mais la protéine est aussi capable d’agir comme un régulateur
négatif des signaux Hedgehog par exemple en séquestrant le ligand à la surface des cellules qui
le produisent en particulier dans les follicules de l’ovaire de drosophile afin de contrôler l’effet
prolifératif induit par les protéines Hedgehog sur les cellules souches locales (Hartman et al.,
2010). Cette inhibition non autonome a également été montrée après surexpression de Boc/ Cdo
dans le tube neural du poulet (Tenzen et al., 2006) mais aussi chez le mutant Boc de poisson
zèbre (uml) qui a permis de mettre en évidence la capacité de Boc à limiter l’effet prolifératif des
protéines Hedgehog sur les chondrocytes spécifiquement impliqués dans la formation de la
mâchoire (Bergeron et al., 2011).

89
 Discussion et perspectives

Dans le contexte de la régulation du lignage oligodendrocytaire, les données obtenues au

cours de cette thèse sont en faveur d’un rôle de régulateur positif de Boc sur les effets induits par
Shh. C’est en particulier le cas dans le cervelet où les expériences de cultures organotypiques
indiquent que Boc contrôle positivement la prolifération des OPCs aux dépens de leur
différenciation mimant parfaitement l’effet décrit pour Shh lui-même (Bouslama-Oueghlani et al.,
2012). Cependant, la situation est un peu plus compliquée dans le cerveau antérieur parce que
les effets de la signalisation Shh sur le lignage oligodendrocytaire ont été analysés globalement
sans distinguer les différentes étapes de spécification, prolifération et différenciation des OPCs.
Les données que nous avons obtenues à la période périnatale (in vitro ou sur coupes de tissu
cérébral) indiquent que Boc bloque la spécification et induit la prolifération des OPCs aux dépens
de leur différenciation en OLs matures. Des données obtenues par d’autres équipes ont montré
que des concentrations croissantes de la protéine Shh recombinante augmentent le niveau
d’incorporation de la thymidine tritiée dans des cultures d’OPCs issus du cortex néonatal de rat
(Lelievre et al., 2006) indiquant le rôle positif de Shh sur la prolifération des OPCs. Par ailleurs,
l’inhibition de la différenciation des OPCS en culture par la cyclopamine, un antagoniste de Smo,
suggère que Shh favorise aussi la différenciation des OPCs (Falcon et al., 2015).

En considérant l’ensemble de ces données, il apparaît que Boc pourrait transmettre

l’activité proliférative de Shh. A l’inverse, l’activité de Boc et Shh ne semblent pas cohérentes
dans le cas de la différenciation des OPCs à moins de considérer Boc comme un régulateur
négatif de la voie. Il faudrait alors supposer que le même co-récepteur, Boc, soit capable de
réguler l’activité de la voie Shh de façon opposée sur les mêmes progéniteurs et dans un même
espace temporel, ce qui est difficile à concevoir. De plus, la diminution de la transcription de Gli1
dans le cerveau antérieur des mutants Boc est en faveur d’un rôle plutôt positif (Figure S1).

90
 Discussion et perspectives

Figure S1: Expression de Gli1 dans le cerveau antérieur postnatal.

Transcription de Gli1 déterminée par qRT-PCR dans le cerveau antérieur en développement des
souris WT et Boc-/- de P0 à P30.

D’autres données viennent gêner la compréhension des mécanismes impliqués dans le

processus d’oligodendrogenèse et de myélinisation dans le cerveau antérieur. Ainsi, l’invalidation
du facteur de transcription Gli1 induit la myélinisation précoce du corps calleux suggérant que la
signalisation Shh canonique (Gli1-dépendante) est un inhibiteur de la différenciation des OPCs
(Samanta et al., 2015). D’un autre côté, l’inactivation du régulateur positif de la voie Smo dans
les cellules de la glie radiale conduit à l’effondrement du nombre d’OLs matures néo-générés
dans le corps calleux et le cortex cérébral suggérant vraisemblablement que Smo participe
positivement à la spécification et/ou la prolifération des OPCs dans la zône sous-ventriculaire
dorsale (Tong et al., 2015). Si Boc et Smo participent l’un et l’autre à l’effet de spécification induit
par Shh, cet effet serait alors indépendant de Gli1 étant donné le phénotype observé chez les
animaux Gli1 KO (Samanta et al., 2015). Des expériences qui permettront d’analyser l’activité de
Shh sur la prolifération et la différenciation des OPCs en présence et en l’absence de Boc sont
en cours pour tenter d’améliorer la compréhension de ces processus.

Parmi les protéines capables d’interagir avec Boc, Cdo est celle sur laquelle nous allons
nous arrêter plus particulièrement. De nombreux travaux ont montré que Cdo et son frère, Boc,
peuvent être co-exprimés dans plusieurs régions du SNC embryonnaire (Mulieri et al., 2002) et
au cours du développement post-natal précoce notamment dans le cervelet (Izzi et al., 2011). A
l’inverse, l’expression isolée de Boc est également observée par exemple dans les axones
commissuraux du tube neural (Okada et al., 2006). Dans ce travail de thèse, l’expression de Cdo
n’a pas été analysée. Cependant, une publication récente vient d’étudier le rôle de Cdo dans le
lignage oligodendrocytaire in vitro dans des cultures d’OPCs purifiés à partir du cortex de rats
nouveaux-nés (Wang and Almazan, 2016). Plusieurs arguments nous permettent de penser que

91
 Discussion et perspectives

contrairement à ce qui a été précédemment démontré, Boc et Cdo dans le lignage

oligodendrocytaire ne sont pas des co-récepteurs de Shh régulant ensemble les cellules de ce
lignage. La différence majeure entre les deux protéines est tout d’abord que Boc (mais pas Cdo)
est exprimé dans les neurones. Par ailleurs, dans les cultures mixtes de cellules gliales dérivées
du cerveau antérieur de souriceaux âgés de 1 ou 2 jours, nous avons identifié la co-expression
de Boc avec les marqueurs Olig2, GFAP et Iba1 indiquant que dans ces cultures, Boc est présent
non seulement dans le lignage oligodendrocytaire, mais aussi dans les astrocytes et dans la
microglie in vitro (Figure S2 ). De plus, nos données dans le cerveau des souris sauvages âgées
de 15 jours indiquent que la majorité des cellules du lignage oligodendrocytaire qui expriment
Boc sont des OLs matures APC+.

Les travaux de Wang et collaborateurs réalisés sur des cultures isolées à partir du cerveau
de rat (et non de souris) indiquent que contrairement à Boc, Cdo est majoritairement exprimé
dans les OPCs et n’est présent ni dans les astrocytes, ni dans la microglie in vitro (Wang and
Almazan, 2016). Par ailleurs, nos résultats suggèrent que Boc régule positivement la prolifération
et négativement la différenciation des OPCs, alors que Wang et collaborateurs en utilisant des
ARN interférents montrent que Cdo favorise la différenciation des OPCs in vitro (Wang and
Almazan, 2016). Des expériences de surexpression de Boc dans les cultures d’OPCs/OLs
purifiés permettront de vérifier l’hypothèse émise à partir de l’analyse du mutant à savoir que Boc
induit une augmentation de la prolifération et une diminution de la différenciation des OPCs.

92
 Discussion et perspectives

Figure S2: Caractérisation de Boc dans les cellules gliales in vitro.

Immunofluorescence réalisée sur des cultures primaires mixtes gliales de cerveau antérieur de
souris WT P1-P2 montrant l’expression de Boc (flèches) dans les oligodendrocytes Olig2+, la
microglie Iba1+ et les astrocytes GFAP+.

2. L’influence de Boc sur la distribution des différentes

populations oligodendrocytaires

Notre analyse de l’expression de Boc au cours de la période post-natale précoce montre

que la protéine est présente dans une sous-population réduite de cellules du lignage
oligodendrocytaire à l’âge post-natal P15 dans le cortex cérébral et le corps calleux, mais qu’elle
est absente du cervelet y compris à un âge plus précoce (P8) où l’on ne détecte pas de cellules
oligodendrocytaires exprimant Boc. Cette différence entre le cervelet et le cerveau antérieur n’est
donc sans doute pas due au fait que le processus de myélinisation débute plus précocement
dans le cervelet que dans le cerveau antérieur. A l’inverse, la différence observée pourrait être
liée à l’hétérogénéité récemment démontrée au sein de ce lignage (Marques et al., 2016). Ainsi,
une analyse de séquençage de fragments d’ARN après immunoprécipitation de la chromatine
sur cellules uniques a été effectuée sur plus de 5000 cellules oligodendrocytaires issues de 10
régions du SNC de souris juvéniles ou adultes. Les données obtenues montrent que des sous-
types d’OLs matures apparaissent de manière région-spécifique au cours de la maturation post-

93
 Discussion et perspectives

natale des OPCs et que chaque région cérébrale semble optimiser ses circuits locaux en
établissant des combinaisons spécifiques d’OLs matures (Marques et al., 2016).

L’hétérogénéité des OLs pourrait aussi être à l’origine des différences régionales que
nous avons détectées dans le mutant Boc. A la période périnatale, le cervelet et le cerveau
antérieur des animaux mutants présentent l’un et l’autre une diminution de la prolifération des
OPCs montrée respectivement dans les cultures organotypiques de tranches de cervelet et dans
les cultures primaires de cellules gliales mixtes dérivées du cerveau antérieur. Cependant, plus
tardivement, une augmentation de la densité des OLs matures est détectée dans le cervelet du
mutant Boc à P15, mais pas dans le cerveau antérieur. A l’inverse, chez l’adulte, l’augmentation
de la densité des OLs matures n’est plus détectable dans le cervelet, mais elle apparaît dans le
cerveau antérieur. Cette dynamique particulière de l’activité de Boc apparemment dépendante
du temps et de la région peut être liée à l’existence de populations d’OLs à des stades de
maturation intermédiaires dotés de fonctions spécifiques et transitoires à un moment donné. Ces
OLs à des stades intermédiaires vraisemblablement important pour l’établissement de circuits
régionaux spécifiques disparaîtraient ensuite. L’existence de ces stades transitoires d’OLs
pourrait également expliquer la disparition de l’expression de Boc dans les OLs (mais pas dans
les neurones) du cortex et du corps calleux à l’issue de la principale période de myélinisation vers
P30 chez la souris.

De façon intéressante, d’autres facteurs impactent de façon différentielle la myélinisation

en fonction de la région du SNC considérée. C’est en particulier le cas de la protéine liant la
sérine thréonine protéine kinase mTor, Raptor, dont l’ablation induite dans les cellules du lignage
oligodendrocytaire conduit à une réduction de la protéine MBP dans la moelle épinière et dans le
corps calleux au stade P14, alors que seule la moelle épinière présente une absence complète
de MBP à l’âge adulte (Bercury et al., 2014). Une différence régionale a aussi été montrée dans
le cas de l’ablation de la kinase Fyn appartenant à la famille des Src kinases qui conduit à une
hypomyélinisation dans le cerveau antérieur mais pas dans la moelle épinière (Sperber et al.,
2001). Yam et collaborateurs ont montré que dans le tube neural, l’activité de guidage des axones
commissuraux induite par Shh via Boc dépend de l’activation des membres de la famille des Src
kinases (Yam et al., 2009). L’activité médiée par Boc dans le processus de myélinisation ne fait
vraisemblablement pas appel à la Scr kinase Fyn étant donné la discordance des phénotypes
observés dans les mutants Fyn et Boc.

94
 Discussion et perspectives

3. Le rôle unique de Boc dans le contrôle de la myélinisation

des petits axones du SNC

Comme nous l’avons déjà mentionné, le développement du lignage oligodendrocytaire

comme l'initiation de l’enroulement de la gaine de myéline, son épaisseur et la longueur des
segments de myéline entre deux nœuds de Ranvier sont étroitement contrôlés aussi bien
temporellement que spatialement (Baumann and Pham-Dinh, 2001; Trapp et al., 1997) par des
signaux neuronaux et oligodendrocytaires (Emery, 2010; Hughes and Appel, 2016)

Les données obtenues au cours de cette thèse permettent de proposer Boc comme un
élément majoritairement axonal agissant comme un frein à la myélinisation des axones
présentant les plus faibles diamètres et comme un régulateur de l’épaisseur de la gaine de
myéline pour cette même population d’axones. Cette découverte est originale si l’on considère
que dans le SNC, l’identité et le rôle des signaux participant à la régulation de la production de la
gaine de myéline sont encore largement méconnus.

La contribution de la Neuréguline, très impliquée dans le processus de myélinisation dans

le SNP, n’est pas très claire dans le SNC. Ainsi, bien que les souris Nrg1 hétérozygotes
présentent une épaisseur des gaines de myéline réduite dans le corps calleux (Taveggia et al.,
2008), une myélinisation normale apparaît dans les animaux dont le gène Nrg1 a été excisé dans
le SNC (Brinkmann et al., 2008). Ces données suggèrent que d’autres signaux doivent contribuer
à l’interaction entre l’OL et l’axone. Par ailleurs, la voie médiée par Nrg1 joue vraisemblablement
des rôles différents selon que l’on considère le développement, le maintien ou la plasticité de la
myéline du SNC ou du SNP. Nrg1 a aussi été proposé comme un interrupteur moléculaire dans
la détermination du type de myélinisation adaptée à un circuit neuronal donné (Brinkmann et al.,
2008).

D’autres facteurs impliqués dans la myélinisation du SNC commencent à être identifiés.

C’est le cas de la molécule d’adhésion cellulaire, l’intégrine 1, qui détecte la taille de l’axone et
initie la myélinisation de telle manière que la perte de fonction de la voie de l’intégrine 1 conduit
à un retard de myélinisation des axones de petit diamètre sans modification de l’épaisseur de la
gaine de myéline (Camara et al., 2009). De la même façon, l’invalidation de la protéine de polarité
Scribble induit une diminution du nombre des axones myélinisés de tout diamètre dans la moelle
épinière à la période post-natale précoce, mais chez l’adulte, seul le nombre des axones
myélinisés de petit diamètre (<0.7 µm) est réduit suggérant que les déficits causés par la perte

95
 Discussion et perspectives

de Scribble ne persistent que dans cette sous-population d’axones. Dans ce mutant, de façon
inattendue, une hypermyélinisation paradoxale est observée pour l’ensemble des axones (Jarjour
et al., 2015). L’invalidation de Boc ne mime aucun de ces deux phénotypes. Cependant on peut
noter que la cible commune à ces trois mutants est la population des axones de petit diamètre
qui sont myélinisés plus tardivement que les axones de grand diamètre (Hildebrand et al., 1993).
Dans le cas des animaux dépourvus de l’intégrine 1 et de la protéine Scribble qui sont l’une et
l’autre exprimées dans les OLs, l’initiation de la myélinisation ne se fait que si les axones ont un
diamètre supérieur au seuil classiquement reconnu pour que les axones soient myélinisés dans
le SNC. Par conséquent, l’intégrine 1 et Scribble sont nécessaires à la myélinisation des petits
axones. A l’inverse, la protéine Boc, essentiellement neuronale, est un frein à la myélinisation
des axones de taille comprise entre 0.4 et 0.8 µm suggérant l’existence de mécanismes de
contrôle vraisemblablement plus précis qu’initialement imaginés.

Il sera intéressant de déterminer si le mécanisme moléculaire associé à l’activité de Boc

repose sur la régulation de l’une des voies connues pour induire une hypermyélinisation à savoir
l’inhibition de l’inhibiteur de kinase cycline-dépendant p27 (Casaccia-Bonnefil et al., 1997), ou
l’activation des voies PI3K/Akt/mTor (Goebbels et al., 2010) et ERK/MAP kinase (Fyffe-Maricich
et al., 2011; Jeffries et al., 2016), Le phénotype associé au blocage de p27 met en jeu une
production accrue d’OLs matures à l’inverse de l’activation des deux autres voies qui ne modifie
pas le nombre de cellules myélinisantes, mais conduit à une production accrue de myéline par
OL ou à une hypertrophie des OLs. Enfin, on peut supposer que Boc pourrait interférer avec le
mécanisme qui conduit les prolongements émis par les OLs à s’enrouler autour de l’axone. Boc
pourrait ainsi empêcher l’induction de la production de la MBP qui conduit à la libération des
protéines Gelsolin ou Cofilin, qui permettant le désassemblage des filaments d’actine nécessaire
à l’initiation de l’enroulement de la gaine autour de l’axone (Zuchero et al., 2015). Cette hypothèse
est cohérente avec l’induction de la transcription de la MBP que nous avons détectée dans le
cerveau du mutant Boc à P8.

L’analyse des conséquences de l’absence de Boc sur l’initiation de la myélinisation est en

cours dans des co-cultures de ganglions de la racine dorsale de la moelle épinière (DRGs) et
d’OLs alternativement dérivés d’animaux sauvages ou mutants pour Boc. Ces expériences
permettront également de déterminer les rôles respectifs de l’expression de Boc dans les OLs et
dans les axones. Bien que les DRGs ne soient pas la cible habituelle des OLs, ces cellules
conduisent en culture à des axones de taille comparable à ceux majoritairement présents dans
le corps calleux et qui peuvent être myélinisés par les OLs. Nos expériences préliminaires

96
 Discussion et perspectives

suggèrent que Boc soit exprimé dans les DRGS. Nous comparerons également l’initiation de la
myélinisation sur les coupes de cerveau des animaux sauvages et mutants à l’âge post-natal P8
au niveau du corps calleux à l’aide d’immuno-marquages MBP/PLP et NF200 pour visualiser
respectivement les gaines en formation et les axones à la période où les premières gaines de
myéline se forment dans le corps calleux.

Par ailleurs, nous déterminerons si l’hypermyélinisation est due à une augmentation du

nombre de tours ou à un changement de périodicité de l’enroulement. Afin d’exclure la possibilité
d’un effet de l’absence de Boc sur la croissance axonale radiale, nous déterminerons la
distribution du diamètre des axones non myélinisés en plus de celui des axones myélinisés. Enfin,
nous mesurerons la longueur des segments de myéline entre deux nœuds de Ranvier en
immuno-marquant la protéine associée à la contactine (Caspr). Dans le SNC, plusieurs
arguments laissent penser que le nombre de gaines de myéline formées ainsi que l’épaisseur de
la gaine sont régulées de manière indépendante. Les souris dépourvues de ERK1/2 ont un défaut
d’épaisseur de la gaine mais pas de l’initiation de l’enroulement de la myéline autour de l’axone
2 (Ishii et al., 2012) alors que l’inverse est observé dans le mutant dépourvu de l’activité 1-
intégrine (Camara et al., 2009).

97
 Discussion et perspectives

4. Boc et la théorie de la « récapitulation » du processus

développemental au cours de la réparation de la myéline

Nos résultats suggèrent un rôle différent de Boc au cours du développement de la myéline

et pendant la remyélinisation puisque Boc apparaît comme un frein à la myélinisation
développementale, mais un facteur nécessaire à la remyélinisation. Par conséquent, la
signalisation médiée par Boc ne suit pas la théorie établie il y a plus d’une dizaine d’années selon
laquelle la remyélinisation est une récapitulation du processus développemental de myélinisation
(Fancy et al., 2011a). A l’heure actuelle, d’autres voies de signalisation se révèlent ne pas
répondre à cette théorie. C’est notamment le cas de la signalisation Wnt/β-caténine, une voie
initialement considérée comme capable de valider la théorie de la récapitulation par son activité
inhibitrice de la maturation des OPCs à la fois au cours du développement et de la régénération
de la myéline. Cependant, progressivement des discordances sont apparues avec la
démonstration d’un effet positif de la voie Wnt sur la transcription des gènes de myéline au cours
du développement (pour revue,(Xie et al., 2014)). Afin d’expliquer ces discordances, plusieurs
modèles ont été proposés. L’un d’eux suggère qu’un niveau élevé de la signalisation Wnt
canonique (-caténin-dépendante) inhibe la différenciation des OPCs alors qu’une activité
modérée de cette voie induit la différenciation des OPCs au cours du développement et du
processus régénératif (Fancy et al., 2014; Guo et al., 2015; Xie et al., 2014). Un modèle alternatif
est que Tcf4, le facteur de transcription clé de la voie Wnt canonique pourrait induire la
différenciation des OPCs de façon indépendante de cette voie (Fancy et al., 2009; Hammond et
al., 2015). Le compromis final à toutes ces données est qu’un faible niveau d’activité de la voie
Wnt/-caténine médiée par Tcf4 induirait la transition entre le stade OPCs et le stade OLs
matures pendant le développement, tandis que dans les conditions pathologiques, l’élévation
importante de l’activité Wnt inhiberait cette transition peut-être par la mise en jeu d’une voie non
canonique.

La mise en jeu de voies canoniques et non-canoniques dans le contexte de la

signalisation médiée par Boc est envisageable pour expliquer les actions opposées de Boc sur
la maturation des OPCS au cours du développement et au niveau d’une lésion. L’hypothèse
nécessite néanmoins des investigations plus approfondies. Par ailleurs, il est important de noter
qu’au cours du développement, l’axone subit des changements dynamiques propres à cette
période et n’existant pas au niveau de l’axone mature (Franklin and Hinks, 1999; Mason et al.,
2001b)(Franklin and Hinks, 1999; Mason et al., 2001a). De même, les OLs produits dans le

98
 Discussion et perspectives

cerveau adulte n’ont pas les mêmes propriétés que ceux issus de la période post-natale précoce
(Li and Richardson, 2016; Tomassy et al., 2016; Young et al., 2013). Une autre différence majeure
entre le développement et la régénération est liée au microenvironnement lésionnel qui contient
les astrocytes réactifs et la microglie activée. La transcription de Boc semble particulièrement
importante dans les cellules microgliales de la lésion comme précédemment montré pour un autre
récepteur clé de la voie, Smo (Ferent et al., 2013). Le phénotype des cellules microgliales pro-
inflammatoires (microglie de type M1) ou anti-inflammatoires (microglie de type M2) présentes
dans la lésion des animaux sauvages et mutants devra être déterminé en utilisant des marqueurs
spécifiques (Miron et al., 2013). Enfin, alors que Boc et Shh semblent l’un et l’autre promouvoir
la différenciation des OPCs en OLs matures au cours de la remyélinisation, Boc semble réguler
la microglie de façon opposée à Shh (ce manuscrit et Ferent et al., 2013) suggérant que Boc
pourrait transmettre l’activité de Shh dans le lignage oligodendrocytaire, mais pas dans la
microglie. L’investigation du rôle de Boc dans cette population cellulaire méritera aussi d’être
réalisée.

99
 Conclusion
La voie de signalisation Sonic Hedgehog a fait l’objet de certaines publications récentes
rapportant le rôle de cette voie non seulement dans le contrôle des progéniteurs
oligodendrocytaires (Tong et al., 2015 ; Samanta et al., 2015), mais également dans la réparation
de la myéline après démyélinisation (Seifert et al., 2005 ; Wang et al., 2008 ; Bambakidis et al.,
2009 ; Ferent et al., 2013 ; Samanta et al., 2015). Cette thèse constitue la première
caractérisation d’un co-récépteur de la signalisation Hedgehog impliqué dans le processus
régénératif associé aux pathologies démyélinisantes.

En conclusion, l’activité de la protéine Boc dans les processus de myélinisation et

remyélinisation pourrait être vraisemblablement importante à considérer dans le futur dans des
contextes pathologiques chez l’Homme allant de certaines formes de malformations
développementales aux pathologies démyélinisantes.

100
Bibliographie

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Titre : Caractérisation des rôles du co-récepteur de Shh, Boc, dans le développement et la réparation de la myéline du
système nerveux central.
Mots clés : Boc, sonic hedgehog, co-récepteur, oligodendrocyte, myéline, régénération
Résumé : Au cours des dernières années, des progrès présentent un phénotype d’hypermyélinisation qui
significatifs ont été réalisés dans la prévention des apparaît au cours des premières semaines post-natales et
épisodes de démyélinisation qui surviennent au cours de persiste à l’âge adulte. Dans un second temps, nous avons
la sclérose en plaques, mais beaucoup moins dans le déterminé l'effet de l'absence de Boc sur les processus de
domaine de la régénération de la myéline détruite. Notre démyélinisation et de réparation de la myéline. En
équipe a précédemment démontré que la protéine Sonic utilisant le modèle d’injection focale de lysolécithine dans
Hedgehog (Shh) est un régulateur positif des progéniteurs le corps calleux, nous avons démontré un retard dans la
oligodendrocytaires ou OPC favorisant la réparation de la maturation des OPC et une réduction de la régression des
myéline dans un modèle de démyélinisation induite par lésions chez les souris dépourvues de Boc. Nos résultats
injection focale de lysolécithine dans le corps calleux chez indiquent ainsi un rôle positif de Boc dans le processus de
la souris. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en régénération faisant suite à une démyélinisation. Par
jeu restent encore largement méconnus. Mon projet de ailleurs, l’absence de Boc diminue la réaction gliale
thèse consiste à explorer le rôle d'un co-récepteur de Shh, inflammatoire étroitement associée au mécanisme de
Boc, une glycoprotéine reliée aux molécules d'adhésion régénération de la myéline. L’ensemble de nos résultats
cellulaire (CAM) et fortement induite à l’issue d’une indique une activité différente du récepteur au cours des
démyélinisation. Dans un premier temps, nous avons processus de myélinisation et de remyélinisation du
focalisé nos investigations sur la caractérisation du mutant système nerveux central. Ces données originales
Boc knockout au cours de la myélinisation contribuent à la caractérisation d’une composante de la
développementale. Nos résultats révèlent des activités signalisation Hedgehog impliquée dans le processus
région et temps spécifiques de Boc sur les mécanismes de régénératif associé aux pathologies démyélinisantes. Ces
prolifération et de maturation des progéniteurs résultats seront importants à considérer dans le cadre de
oligodendrocytaires. De plus, les souris Boc knockout l’approche thérapeutique des maladies démyélinisantes.

Title : Characterization of the Sonic Hedgehog co-receptor, Boc, in the development and regeneration of myelin in the
central nervous system
Keywords : Boc, sonic hedgehog, oligodendrocyte, myelin, regeneration

Abstract: During the last years, significant progress have in the first postnatal weeks and persists until adulthood. In
been made in preventing demyelinating events that occur a second step, we determined the effect of the absence of
during multiple sclerosis, but much less in the field of Boc in the processes of demyelination and myelin repair.
regeneration of the lost myelin. Our team has previously Using the model of focal injection of lysolecithin into the
demonstrated that the Sonic Hedgehog (Shh) protein is a corpus callosum, we demonstrated a delay in
positive regulator of oligodendrocyte progenitors oligodendrocyte maturation and a decrease in lesion
enhancing myelin repair in a demyelination model relying regression in the Boc knockout mice. Thus, our results
on the focal injection of lysolecithin into the corpus indicate a positive role for Boc in the regeneration process
callosum. However, the molecular mechanisms that are following demyelination. Furthermore, the absence of Boc
involved are still largely unknown. My thesis project was decreases the inflammatory glial reaction closely
aimed at exploring the role of a co-receptor of Shh, Boc, associated with myelin repair. Altogether, our results
a glycoprotein linked to the cell adhesion molecules indicate a different activity of the receptor during the
(CAM) and strongly induced during myelin repair. First, processes of myelination and remyelination in the central
we focused our investigations on the characterization of nervous system. These original data contribute to the
the Boc knockout mutant during developmental characterization of a component of the Hedgehog signaling
myelination. Our results reveal region and time specific pathway involved in the regenerative process associated
activities for Boc in the mechanisms of proliferation and with demyelinating pathologies. Those results will be
maturation of oligodendrocyte progenitors. In addition, important to consider in the context of the therapeutic
Boc knockout mice exhibit hypermyelination that occurs approach of the demyelinating diseases.

Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France