3.propriétés Et Techniques

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Chimie et Biochimie générale - Biochimie

Chapitre 3 :
Acides aminés et protéines :
propriétés générales et technique
de purification et d’identification

Docteur Jean Charles RENVERSEZ

PCEM1 - Année universitaire 2007/2008


Faculté de Médecine de Grenoble (UJF) - Tous droits réservés.
PLAN
V - PROPRIETES GENERALES DES PROTEINES -
TECHNIQUES DE PURIFICATION ET
D’IDENTIFICATION

a) - Etapes préliminaires : solubilité


b) - Filtration moléculaire: gel-filtration
c) - Sédimentation: ultracentrifugation
d) - Ionisation: électrophorèses
e) - Propriétés antigéniques: immunoanalyse
a - Etapes préliminaires

Extraction/purification
Broyage, homogénéisation, désintégration par ultrasons,
solubilisation par détergents

Nombreuses étapes de fractionnement: degré de


purification ou rendement
Solubilité
Dialyse - précipitation par les sels et les solvants -
lyophilisation
relarguage par le sulfate d’ammonium
COHN 1942 - fractionnement des protéines du plasma

Dialyse
Force ionique

Influence du
pH et de la
force ionique
sur la
solubilité
Précipitation réversible
d’une protéine
Lyophilisation des protéines

La structure
tridimensionnelle
des protéines est
conservée

Lyophilisateur
b - Filtration moléculaire - chromatographie
tamis moléculaire – évaluation des masses moléculaires
Filtration sur gel ou gel-filtration

Exclusion des MM >


au diamétre des pores
Aspects microscopiques des billes de
SEPHADEX utilisées en filtration sur
gel

SEPHADEX = dextran polymérisé - Aspect au microscope électronique


billes de 300 µm G x 7000
• Type de billes utilisées en Gel-filtration en
fonction de la masse moléculaire des protéines
à séparer
c - Sédimentation - centrifugation
Ultracentrifugation (50000 à 500000g)
constante de sédimentation (s)– SVEDBERG
M= RTs / D (1- v p)
(M masse de la protéine,R cste des gaz parfaits,
T température,D coefficient de diffusion,
v vol.spécifique partiel,
p masse volumique du solvant)

Ultracentrifugation préparative
2 types d’ultracentrifugation préparative

(A )En gradient de saccharose


(sédimentation différentielle)

Le gradient est réalisé


avant la centrifugation

Séparation des protéines


en fonction de leur masse
moléculaire

(B )En gradient de CsCl


(équilibre de sédimentation)
ou isopicnique

Le gradient est réalisé


durant la centrifugation

Séparation des protéines


en fonction de leur densité
d - charge électrique - Chromatographie
d’échange d’ions
Idem acides aminés
Types de résine utilisées en
chromatographie d’échange d’ions
Chromatographie d’affinité
Ligand biospécifique:
Enzyme, anticorps,
lectine, acide nucléique 1 - Immobilisation du ligand
Hormone, vitamine,
cellule
2 - Adsorption

Matrice

3 - Désorption

4 - régénération du ligand
d - Charge électrique - électrophorèses
Electrophorèse sur support
Migration dans un champ électrique

Appareils
d’électrophorèse:
- horizontal
- vertical +

Séparation de 3 protéines de
pHi différents
Séparation des protéines du sérum humain par
électrophorèse sur acétate de cellulose

Albumine

%
Globulines
55
5
10
14
16

Profil électrophorétique ou électrophorégramme


Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS
(PAGE-SDS) Protéine

+ SDS

Sodium dodecyle sulfate (SDS)


Protéine à 2
sous-unités Protéine à
liées par un une sous-
pont disulfure unité

Chauffage en présence de SDS et de β mercaptoéthanol

MM

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - SDS

2 bandes 1 bande
Analyse du protéome

Electrophorèse bidimensionnelle Identification de chaque spot


2D Spectrométrie de masse
e - Propriétés antigéniques:
L’immunoanalyse
Toute protéine d’une espèce animale(= antigène:
Ag) introduite chez une autre espèce génère la
formation de protéines spécifiques de
reconnaissance ou anticorps (Ac)

Associations stéréospécifique Ag - Ac

In vitro ----- > complexes précipitants à la base des


techniques de l’immunochimie qualitative et
quantitative
le signal mesuré est proportionnel à la quantité
d’Ag dans un rapport très étroit de concentrations
entre l’Ag et l’Ac
1 - Techniques
d’immunoprécipitation
Immunoprécipitation
Immunodiffusion radiaire (IDR)

Electroimmunodiffusion (techn. de LAURELL)


2 -Techniques d’immunoanalyse
avec marqueurs

• Marqueurs radioactifs

• Marqueurs enzymatiques
Dosage immunochimique avec
marqueur
Dosage radioimmunologique (RIA)

Signal mesuré inversement proportionnel à


la quantité d’Antigène
Dosage immunoenzymatique (EIA)
1 marqueur enzymatique ex: la peroxydase
1 substrat chromogénique ------ > mesure de D.O.
Technique ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
Sandwich en phase hétérogène

Mesure de D.O.

H2O2 ---- > H20 + O2


Chromogène réduit incolore + 02 -----> chromogène oxydé coloré
(OPD : ortho phénylène diamine)
Technique ELISA
Signal proportionnel à la concentration en Ag.

kUI/l Ig E
3 - Technique d’électrophorèse
combinée à une immunoanalyse
Electroimmunotransfert ou Immunoblotting
Western blot
1
2

3
PAGE - SDS
Transfert sur membrane

Ajout de l’Ac primaire

5 Ajout de l’Ac secondaire


6

Lavages Détection – ajout du substrat


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