Ce document décrit les biocapteurs à ADN. Il présente d'abord un aperçu de la nanotechnologie et de la définition de l'ADN, puis décrit l'extraction et l'amplification de l'ADN ainsi que les applications des biocapteurs à ADN.
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Ce document décrit les biocapteurs à ADN. Il présente d'abord un aperçu de la nanotechnologie et de la définition de l'ADN, puis décrit l'extraction et l'amplification de l'ADN ainsi que les applications des biocapteurs à ADN.
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Maitre assistant classe « B » Année universitaire : 2019/2020. Les étudiants concernés par le support : Master 1 « instrumentation ».
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Cours Bio instrumentation et biocapteurs Chapitre IV : Chapitre IV : biocapteurs à ADN
Chapitre IV : biocapteurs à ADN
IV.1 Aperçu sur la nanotechnologie
Échelle du nanomonde Pour imaginer la dimension d’un nanomètre (nm en abrégé), sachez qu’un nanomètre est 30 000 fois plus fin que l’épaisseur d’un cheveu ou 100 fois plus petit que la molécule d’ADN. Un nanomètre équivaut à un milliardième de mètre (1 nm = 0,000 000 001 m = 10-9m). L’échelle nanométrique couvre un spectre de dimensions allant de 1 nanomètre à 100 nanomètres.
IV.1.1 Définition Nanotechnologie
Le terme « nanotechnologie » est un terme générique qui désigne les procédés de fabrication et/ou de manipulation de structures à l’échelle nanométrique, c’est-à-dire de structures dont au moins une des dimensions se situe entre 1 et 100 nm. L’intérêt de travailler à cette échelle est que les éléments possèdent des propriétés complètement différentes de celles qu’ils auraient à
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l’échelle normale ou bien voient leurs propriétés renforcées. En effet, ils sont tellement petits qu’ils disposent d’une surface de contact plus grande par rapport à leur volume (pensez au sucre qui fond plus rapidement quand il est en poudre qu’en carré) et ont de fait des caractéristiques physico-chimiques différentes. Par exemple, le dioxyde de titane peut devenir transparent (d’où son usage sous forme nano pour les crèmes solaires pour enlever l’effet blanchâtre). Le cuivre, à l’échelle nanométrique, est trois fois plus résistant que le cuivre classique et peut également devenir transparent. Ces modifications des caractéristiques physico-chimiques permettent des développements dans toute une série de domaines : la santé, l’industrie, l’environnement, l’énergie, etc. Les nanomatériaux sont donc fabriqués intentionnellement par l’homme pour exploiter les caractéristiques spécifiques des matériaux à l’échelle nanométrique. Mais il existe aussi des nanoparticules naturelles : ce sont par exemple les poussières d’érosion ou les poussières issues d’éruption volcanique ou encore les embruns marins. D’autres nanoparticules sont produites involontairement lors de phénomènes de combustion : par exemple, lors de la combustion du bois ou de la combustion des moteurs diesel.
IV.1.2 Application et Nanotechnologie
Le tableau ci-après vous en présente un aperçu plus large
propriétés application optique Induit anti-réfection Surface à indice magnétique Support de Storage de densité accrue (flash Dick) technique Réduire la taille de photodiode Automobile Espace Peintures et revêtements destinés aux automobiles et aux avions, pièces détachées automobiles, additifs de carburant, batteries, pneus durables et recyclables Systèmes électroniques supportant les radiations Systèmes de nanocapteurs intégrés Capteurs optiques Biomédical, pharmaceutique Nanomatériaux pour l’administration de médicaments, ouverture à distance de microcapsules par rayon laser
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Revêtement de textiles hospitaliers, masques, blouses
de chirurgie, cathéters, pansements pour les plaies, imagerie moléculaire ; additifs dans les matériaux dentaires polymérisables, additifs dans le ciment osseux ; charge de résine en dioxyde de silicone, revêtement d’implants pour prothèses articulaires Chimie et matériaux Pigments, revêtements autonettoyants anti-éraflures, poudres céramiques, inhibiteurs de corrosion, surfaces et textiles antibactériens, isolation thermique, encres Cosmétiques et soins Écrans solaires, hydratants pour le visage, pâte personnels dentifrice, rouge à lèvres, traitement de l’acné, produits de soins pour bébé Shampooings, conditionneurs, sèche-cheveux, fers à cheve Défense Tenue de combat pour les soldats, systèmes de surveillance médicale et de soins médicaux Électronique et communication Électronique moléculaire et photonique Hardware informatique, mémoire et stockage de l’information à haute densité, catalyseurs multifonctionnels, micropuces, capteurs, écrans plats, transistors à nanotubes de carbone, panneaux d’affichage légers, inhibiteurs de corrosion Nanorobots, opérations automatiques à l’échelle nanométrique Énergie Cellules photovoltaïques, batteries, matériaux isolants Stockage de l’hydrogène dans du graphène Environnement Modélisation climatique Pesticides et fertilisants Traitement de l’eau et filtres Catalyseur pour une meilleure qualité de l’air Alimentation Emballages de plastique pour bloquer les rayons UV
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et assurer une protection antibactérienne
Bouteilles, cartons et films contenant des nanocomposites en argile faisant obstacle au passage de gaz ou d’odeurs On développe actuellement des nanocapteurs capables de détecter des bactéries et d’autres contaminants comme la salmonelle dans les installations de conditionnement Sports Textiles sportifs Revêtement pour bateaux et kayaks Cannes à pêche en résine époxy Raquettes de tennis, clubs de golf, battes de base- ball, équipement de ski, cadres et composants de bicyclettes
IV.2 Biocapteur d’ADN
IV.2.1 Définition de l’ADN
Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont les principaux constituants du noyau de la cellule vivante et servent pour le stockage et la transmission des codes génétiques. Chaque brin d’ADN est composé des bases azotées entourées par deux groupements phosphate chargés négativement. Ces bases sont au nombre de quatre : l’adénine (A), la guanine (G), la thymine (T) et la cytosine (C) ; elles sont complémentaires et peuvent s’associer deux à deux : l’adénine (A) s’associe avec la thymine (T) et la guanine (G) s’associe avec la cytosine (C) pour former l’ADN.
IV.2.2 Extraction et amplification de l’ADN
L’ADN peut être extrait facilement en éclatant les cellules. Il est possible d’effectuer l’amplification d’une séquence d’ADN d’un gène souhaitée en s’appuyant sur la réaction de polymérisation en chaine (PCR). Plusieurs protocoles ont été développés pour l’extraction des séquences spécifiques d’ADN. La première étape de ces procédures consiste à détruire les membranes cellulaires et nucléaires pour libérer l’ADN. Pour cela deux voies sont possibles, la première consiste à lyser les cellules
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en utilisant des billes magnétiques de tailles similaires à celles des cellules. Une simple centrifugation du mélange bille/cellule permet d’exploser les membranes cellulaires et de libérer l’ADN génomique. La deuxième voie repose sur l’utilisation de tampon chimique composée de détergents et des enzymes de digestion comme la protéinase K qui est capable de digérer des cellules et d'extraire les acides nucléiques (ADN ou ARN). La protéinase K est une endopéptidase qui coupe les liaisons peptidiques, de préférence au niveau du groupement carboxyle d'un aminoacide à chaine latérale hydrophobe ou aromatique. L'étape critique qui suit la lyse cellulaire est la purification afin d’éliminer les protéines et les contaminants récupérés avec l'ADN en solution. L'ADN récupéré subit différentes étapes de lavage à l'isopropanol ou à l'éthanol, puis des étapes de centrifugation. La PCR permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour pouvoir le détecter et l’étudier. Ce processus consiste à introduire l’ADN génomique dans une solution tampon contenant deux amorces oligonucléotides et une forte concentration des désoxynucléosides triphosphates et d’une enzyme appelée ADN polymérase thermostable. Il y a lieu de signaler que les extrémités 3’ des amorces pointent l'une vers l'autre et sont complémentaires des extrémités des séquences du brin d’ADN génomique qu’on souhaite amplifier. L’ADN polymérase thermostable est une enzyme de synthèse de l'extrémité 5’ vers l'extrémité 3’ de l’ADN. La PCR est réalisée en 3 phases effectuées à différentes températures : La dénaturation s’effectue à 94-96 °C qui consiste à dénaturer l’ADN des matrices pour obtenir deux simples brins. L’hybridation s’effectue à 68 °C et consiste à borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques. L’élongation s’effectue à 70-74 °C et consiste à réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. Ces étapes sont successives et de ce fait l'amplification obtenue est qualifiée d’exponentielle. Chaque brin d’ADN s’écrit toujours à partir de l’extrémité 5’, associée à un groupement phosphate vers l’extrémité 3’, associée à une fonction alcool. Cette succession de nucléotides correspond à une structure primaire simple brin, les deux brins complémentaires étant antiparallèles, ce qui signifie que pour un brin observé
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dans le sens 3’ vers 5’, le complémentaire est orienté de 5’ vers 3’. La
structure ainsi obtenue est alors dite double brin hélicoïdal. Cette orientation antiparallèle est nécessaire pour que les brins s’emboîtent dans l'espace à trois dimensions. IV.2.3 Définition du biocapteur d’ADN Les capteurs d'ADN consistent en une hybridation entre les chaînes d'ADN en solution après lyse cellulaire ou la réaction d’amplification par PCR avec un brin d’ADN immobilisé à la surface du biocapteur, ce dernier agit comme une sonde de capture dont la séquence est spécifique à une partie du gène à détecter. Dans le cas des biocapteurs électrochimique, l’appariement entre l’ADN sonde et l’ADN cible génère un signal qui sera transmis par l’électrode. Le développement de systèmes pour la détection de l'ADN est motivé par plusieurs applications dans de nombreux domaines comme le diagnostic et analyse génétique de la présence de pathogènes dans différents milieux.
Figure 1 schéma représente la réaction d'hybridation
Les approches électrochimiques de détection de l'ADN sont nombreuses et peuvent
être classées en deux catégories et la méthode avec amplification et la mesure directe sans étape supplémentaire d’amplification. Les méthodes indirectes comprennent : Le marquage enzymatique d’un ADN secondaire.
Le marquage avec des molécules redox d’un ADN secondaire.
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Intercalent redox dans l’ADN double brin formée.
Les mesures directes qui ont été développées pour la détection de l’ADN consistent en : La mesure de l'électro-activité intrinsèque de l'ADN par mesure de l’oxydation de la guanine. La mesure de la réponse d’une sonde redox associé à l’ADN sonde et dont la proximité ou non par rapport à la surface de l’électrode est contrôlée par la réaction d’hybridation. Les modifications des propriétés interraciales ou électriques de transducteurs électrochimiques tels que les polymères organiques conducteurs, les nanomatériaux à base de nanotube de carbone ou de graphène.
IV.2.4 Méthodes de détection de l’ADN
La détection des séquences d'ADN présente un intérêt particulier pour la génétique, la pathologie, la pharmacogénétique, l’analyse alimentaire et pour de nombreux autres domaines. Les capteurs d'ADN consistent généralement en la réaction d'hybridation entre une sonde d'ADN simple brin (ss) immobilisée sur un transducteur et une cible présente en solution, formant une hélice d'ADN double brin (ds). Il existe peu de stratégies de construction de biocapteurs électrochimiques pour la détection d'ADN, qui peuvent être généralement classés comme (1) indirects et (2) directs, et qui sont présentés dans cette partie . Détection indirecte La détection par la méthode indirecte concerne les capteurs où l'ADN est marqué avec une enzyme, un marqueur redox ou des nanoparticules. La réaction d'hybridation est ensuite suivie via le signal redox du produit de la réaction enzymatique, le signal redox du marqueur électroactif attaché à l'ADN ou par l'amplification du signal redox par la présence de nanoparticules conductrices. La stratégie indirecte peut également consister à utiliser un intercalateur d'ADN redox ayant une affinité pour l'ADNdb. Dans ce cas, la détection de l'ADNdb est observée par l'augmentation du signal d'intercalateur redox qui est proportionnelle aux brins d'ADNdb formés. Quelques exemples significatifs de méthodes indirectes typiquement utilisées dans la détection d'ADN sont présentés dans cette section.
La surveillance de la réaction d'hybridation peut être effectuée en utilisant des
molécules rédox qui ont une affinité avec certaines bases d'ADN ou certaines structures dsDNA. Ces interactions consistent en une intercalation ou une liaison électrostatique dans des sites de liaison bien définis. En tant que ligands spécifiques,
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des composés organiques ou complexes de métaux cationiques peuvent être utilisés.
La détection est basée sur une plus grande affinité de ces composés pour l'une des formes d’ADN : ADNsb ou ADNdb. Les intercalaires sont classés comme des ligands d'ADN qui s'insèrent ou s'intercalent entre des paires de bases adjacentes d'ADN double brin. Le mécanisme d'action des intercalateurs est basé sur l'empilement de groupes aromatiques planaires entre des paires de bases nucléotidiques dans une position approximativement perpendiculaire à l'axe de la double hélice. Ces interactions peuvent être très sélectives suivant le type d’intercalant.
Figure 2 Structure de différents intercalant redox utilisés pour la détection de l’ADN
ARN polymérase : une enzyme permettant la synthèse de ARN a partir d’une
matrice d’ADN. ADN polymérase : une enzyme de copie (réplication).
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