Le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche

Scientifique
Université 8 mai 1945
Faculté : S.N.V S.T.U

: DépartementE.G.E
Master1 : Microbiologie Applique
Module : Méthodologie de recherche et techniques de
laboratoire

projet
La chromatographie liquide à haute performance
)HPLC(
GROUPE : 03
Encadré par : Mme Hamdikane

Réaliser par :

BENMABROUK Manar

DJAHMI Djihane

MEKHANCHA Sarra

2019/2020

1
 Liste des figures

Fig .1 : chromatogramme d’un constituant………………………….………..10

Fig.2 : chromatogramme montrant la serapartion de trois constituant…….15

Fig.3 : courbe de Van Deemter …………………………………………….….15

Fig.4 : Principe de fonctionnement de l’HPLC……………………………….19

Fig.5 : Représentation schématique d’un système de pompage………...……20

Fig.6 : Injecteur à boucle………………...………………………………..……21

Fig.7 : Injection avec une boucle……………………………………………….22

Fig.8 : Colonne CLHP…………………………………………………………..22

Fig.9 : Colonne dans un thermostat…………………………………………....23

Liste des tableaux

Tableau.1 : comparaison entre CPL et CPG…………………..……………...18

2
 Sommaire

Introduction

CHAPITRE 1 : GENERALITE SUR LA CHROMATOGRAPHIE

1. .Définition……………………...…………………………………………….…..7
2. .Historique………………………………………………………………………..7
3. Principe …...……………………………………………………………..……. ...7
4. Classification des techniques chromatographiques…………………..……..........8
4.1Classification selon la nature physique des phases……………………………8
4.2. Classification selon le mécanisme de rétention………….………………….9
4.3. Classification selon la technique mise en jeu ………………………………9
5. Terminologie et grandeurs de rétention…..……………….…………….……….9
5.1 Chromatogramme……………………………………………………………9
5.2 . Elution ……………………………………………………………………...9
5.3 Le temps mort ………………………………………………………………10
5.4. Le temps de rétention ………………………………………........................10
5.5. Le temps de rétention réduit…………………………………………..……10
5. 6. Le volume de rétention.……………………………………………………10
5.7. Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile………………….11
5.8. Le facteur de capacité………………………………………………………11
5.9. Facteur de sélectivité……………………………………………………….12
6. Efficacité d’une colonne………………………………………………………...12
7. Résolution………………………………………………….……………………14
8. . Equation de Van Deemter …………………….……………………………….15
9. . Optimisation d’une analyse chromatographique ……..……………………….16

CHAPITRE 2 : GROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE

(HPLC)

1. Définition……………………………………………………………………….18
2. Comparaison avec la chromatographie en phase gazeuse……………………...18
3. Appareillage.....................................................................................................…19
3.1 Réservoir de solvants……………………………………………………….20
3.2 Dispositif de dégazage……………………………………………………...20
3.3 Pompe………………………………………………………………………20
3.4 Injecteur……………………………………………………………….……21
3.5 Colonne………………………………………………………………….....22
3.6 Détecteurs…………………………………………………………………..23
3.6.1. Photomètre UV-visible……………………………………………....23
3.6.2. Réfractomètre différentiel.…………………………………………...24
3.6.3. Détecteur fluorimétrique……………………………………………..24
1.8.4 Détecteur électrochimique……………………………………………24
1.8.5 Détecteur par spectroscopie de masse………………………………...25
4. Interactions moléculaire entre phase mobile et soluté………………………….25
5. Force éluant et polarité……………………………………………………….....25
6. Classification des methodes de la clhp………………………………………....26

3
 7. Application de la chromatographie à l’analyse……………………………...….27
7.1Analyse des chromatogrammes………….……………………………….….27
7.2 Analyse qualitative………………………………………………………….27
7.3Analyse quantitative……………………………………………………...….29

Conclusion

Référence bibliographique

4
 Introduction :

La chromatographie est une méthode physique d’analyse basée sur la

séparation de constituants d’un mélange ; les différents constituants de ce mélange
appelés solutés sont séparés et entraînés par un fluide (un liquide ou gaz) que l’on
appelle phase mobile ; ils interagissent ou au contraire n’interagissent pas avec une
phase fixe que l’on appelle phase stationnaire qui exerce sur eux un effet retardateur.
L'origine du mot chromatographie vient peut-être de la séparation de composés
colorés puisque chroma en grec, signifie couleur et graphein signifie écrire.

La chromatographie est une science très ancienne. Aristote décrit les

propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Au XVIème
siècle, le strasbourgeois Brunswig purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à
travers une éponge imprégnée d'huile d'olive et réalisait une expérience de
chromatographie gaz-liquide, 400 ans avant la découverte de cette technique. En
1931, la publication de Kuhn et Lederer sur la séparation des isomères du carotène et
de la xanthopylle apparue. En effet, c’est Kuhn qui, en 1938 reçut le Prix Nobel sur
la chromatographie en phase mince.

En 1952, les travaux de Martin ont mis en évidence la chromatographie

d’échange ionique et en 1941 la naissance de la chromatographie de partage par
Martin-Synge. En 1955 la chromatographie gaz-liquide sur le marché et en 1965
l’apparition la chromatographie liquide moderne (HPLC). L’excellente séparation
des molécules, aussi bien les grosses que les petites rend la chromatographie une
technique largement répandue.

5
 CHAPITRE 1

GENERALITE SUR LA CHROMATOGRAPHIE

6
 1. Définition

La chromatographie Elle est utilisée dans divers domaines, tels que la chimie
fine, la parfumerie, l’œnologie, l’industrie pétrolière, la biologie, l’industrie des
matières plastiques, etc.

C’est une technique d'analyse qualitative et quantitative dans laquelle

l'échantillon contenant une ou plusieurs substances est entraîné par un courant de
phase mobile, qui peut être liquide, gaz ou fluide supercritique, le long d'une phase
stationnaire, qui peut être du papier, de la gélatine, de la silice, un polymère, de la
silice greffée etc. Chaque substance se déplace à une vitesse donnée, dépendant de
ses caractéristiques (polaire, non polaire, ionique, etc., et de celles des deux phases.

La chromatographie est utilisée pour connaître la concentration de chaque

composé d'un mélange (qualité et quantité) et même leur structure quand elle est
couplée (GC-MS, LC-MS, LC-RMN, etc.).

2. Historique

Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à

utiliser le terme chromatographie.

À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des
pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot chromatographie à partir
du grec khrôma- pour couleur et donc pigment

3. Principe

La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un

mélange même très complexe.

Il existe trois principaux types de chromatographie :

• la chromatographie en phase gazeuse (CPG)

• la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

• la chromatographie en couche mince (CCM).

7
 Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des
théories communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un
tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne
remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les
deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à
séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui
l'entraîne à travers la colonne.

Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange,

appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la
colonne.

De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange

injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de
déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les
autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet

d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un
signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage
de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention"

(temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise
qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par
ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de
chaque soluté dans le mélange injecté.

4. Classification des techniques chromatographiques

Les méthodes chromatographiques se classent en trois façons :

4.1. Classification selon la nature physique des phases

 Selon la nature de la phase mobile on distingue :
 la chromatographie en phase liquide (CPL)
 la chromatographie en phase gazeuse (CPG)
 la chromatographie en phase supercritique (CPS)
 Selon la nature de la phase stationnaire on distingue :
 la chromatographie liquide/solide (CLS)

8
  la chromatographie liquide/liquide (CLL)
 la chromatographie gaz/solide (CGS)
 la chromatographie gaz/liquide (CGL)
4.2. Classification selon le mécanisme de rétention

Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son

interaction avec les molécules à séparer. On distingue ainsi : la chromatographie
d'adsorption, de partage, d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie
d'affinité.

4.3. Classification selon la technique mise en je

 Selon la technologie mise en jeu on distingue :
 la chromatographie sur colonne
 la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou
chromatographie sur couche mince).

5. Terminologie et grandeurs de rétention

5.1. Chromatogramme

Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du

détecteur (par rapport à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution
(plus rarement du volume d’élution). Ce graphique est utilisé à la fois en analyse
qualitative et quantitative.

Analyse qualitative : permet l’identification des composés par la position du pic

Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en utilisant

l’aire des pics

5.2. Elution

L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le

mouvement de la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile
peut être appelée éluant.

5.3. Le temps mort

9
 Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase
stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la
colonne (ou temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne).

5.4. Le temps de rétention

Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à
analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le
temps de rétention est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse
données et peuvent servir à l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est
fonction de la quantité du constituant. Le temps de rétention est indépendant de la
quantité d’échantillon injectée. Il est fonction de la nature et la vitesse de la phase
mobile (Fig.1).

5.5. Le temps de rétention réduit

Le temps de rétention réduit (tr’) représente le temps passé par le soluté dans
la phase stationnaire.

tŕ = tr-tm

Fig.1 : Chromatogramme d’un constituant

5.6. Le volume de rétention

Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on

définit le volume de rétention (Vr)

Vr=tr×D

Vr=tr×u.s.ɛ

U : vitesse linéaire moyenne de la phase mobile

10
 s : sélection droite de la colonne

ɛ = porosité de la phase stationnaire (≈0,75 pour la silice poreuse)

Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort)

peut être calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non
retenu par la phase stationnaire. Cette grandeur est exprimée par :

Vm=tm×D

Le volume de la phase stationnaire désigné par Vs est calculé en retranchant

du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile.

5.7. Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile

La vitesse linéaire moyenne de progression du soluté v est égale à :

V= L/tr

L : longueur de la colonne

La vitesse linéaire moyenne de la phase mobile u est égale à :

U=L/tm

5.8. Le facteur de capacité

Le facteur de capacité (ou facteur de rétention) k’ exprime le rapport de la

quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase
mobile. Ce facteur sans dimension, peut être relié au temps de rétention par
l’expression :

K'= (tr-tm)/tm

K’ est aussi le rapport du temps passé par une espèce dans la phase
stationnaire au temps passé par cette même espèce dans la phase mobile.

De faibles valeurs de k’ indiquent des composés peu retenus. Des valeurs

élevées de k’ indiquent des composés fortement retenus, en pratique 1 ˂ ḱ ˂10.

11
 Le temps et le volume de rétention sont liés au facteur de capacité par les
relations :

Tr = Tm (1+ḱ )

et

Vr =Vm (1+ḱ )

5.9. Facteur de sélectivité

Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on

utilise le facteur de sélectivité ou de séparation α. Ce facteur est égal au rapport des
facteurs de capacité de deux solutés dont on veut réaliser la séparation. Il s’exprime
par :

(tr ₂−tm) k ' ₂

α= =
(tr ₁−tm) k ' ₁

Avec k₂́ > k₁́

Il s’agit du rapport des temps de rétention réduits

k₂́ : facteur de capacité du composé 2

k₁́ : facteur de capacité du composé 1

α= 1 aucune séparation ne s’effectue aussi le temps de rétention est le même.

La sélectivité doit être supérieure à 1. Deux composés ne peuvent être séparés sauf
s’ils ont k’≠ 0

6. Efficacité d’une colonne

L'efficacité d'une colonne chromatographique est mesurée, pour chaque

composé, par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne et la hauteur
équivalente à un plateau théorique H. Cette théorie est née de la recherche d'un
modèle statique permettant de décrire le fonctionnement d'une colonne
chromatographique comme celui d'une colonne à distiller. Au lieu de considérer le
déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci progresse par
sauts successifs et se met en équilibre avec la phase stationnaire entre deux transferts,

12
ce qui permet de découper fictivement la colonne en un certain nombre de zones
dans lesquelles les équilibres sont réalisés et que l'on appelle plateaux théoriques.

Les pics d'élution peuvent être assimilés à des courbes de Gauss. Les
caractéristiques géométriques de la courbe de Gauss (Fig.1) permettent de calculer,
pour un soluté donné, N à partir du chromatogramme.

N=16(tr/l)²

l: largeur du pic à la base

N=5.54(tr/ω)²

Avec l= 1,7 ω

ω: largeur du pic à mi-hauteur

Pour comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs on définit la

hauteur équivalente à un plateau théorique.

N=L/H

H : est la distance ou l’équilibre chromatographique est atteint.

En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm

L’efficacité des colonnes chromatographiques augmente si le nombre de

plateaux théoriques augmente ou si la hauteur équivalente à un plateau théorique
diminue à longueur constante.

Lorsqu’on double la longueur de la colonne ou la vitesse de la phase mobile,

le temps de rétention est multiplié.

Il y’a des facteurs extra-colonne qui peuvent influer sur l’efficacité de celle-ci
est d’utiliser des tubes trop larges ou trop long (tube de liaison qui influe sur la
largeur du pic mais pas sur le temps de rétention).

Afin de juger des performances d’une colonne chromatographique en tenant

compte du diamètre des particules (dp) de la phase stationnaire, on définit la hauteur
de plateaux réduites h.

13
 h = H/dp

Deux colonnes de mêmes efficacités possèdent le rapport L/dp semblable

7. Résolution

La résolution de deux pics voisins est définie par le rapport de la distance

entre le maximum des deux pics et la moyenne arithmétique.

Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics

a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2-tr1

b) la largeur des pics à la base l

(tr ₂−tr ₁)
Rs = 2
(l ₂+ l₁)

Plus la résolution est grande, meilleure est la séparation Deux pics sont bien
résolus, si R ≥ 1,5 (Fig.2).

Pour des valeurs de Rs beaucoup plus grande que 1, la séparation des pics
n’est pas meilleure, mais le temps de la séparation devient inutilement long.

La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation et pour

l’optimiser, il est important de relier les facteurs de sélectivité et capacité à la
résolution.

En supposant l₁=l₂, en combinant les expressions on obtient la relation de

Purnell :

1 (α −1) k'₂
Rs = × × ' ×√ N ₂
4 α (k ₂+1)

On pourra améliorer une séparation en faisant varier l’un au moins des trois
facteurs précédents.

14
 Fig.2 :Chromatogramme montrant la séparation de trois constituants

8. Equation de Van Deemter

L’équation ci-dessus correspond à celle proposée par Van Deemter et al.

(1956) pour la chromatographie en phase gazeuse

B
H=A+ +C.u
u

La courbe représentant l’équation de Van Deemter est donc une hyperbole ou

A, B, C sont des constantes.

u: vitesse moyenne de la phase mobile (gaz vecteur).

A : est l'influence de la diffusion turbulente due aux hétérogénéités dans

l'écoulement.

B : est un facteur de la diffusion moléculaire dans la phase mobile.

C : dépend de la résistance au transfert de masse en phase liquide

Le tracé de la courbe HEPT en fonction de la vitesse moyenne du gaz

vecteur, permet de déterminer le débit minimum donnant la meilleure efficacité de la
colonne

15
 .

Fig.3 : Courbe de Van Deemter.

Variation de la hauteur d’un plateau théorique en fonction de la vitesse

moyenne du gaz vecteur

Aux faibles valeurs de u, le terme B/u prédomine (la courbe devient

asymptote à une droite de pente négative) et explique la perte d’efficacité vers les
très faibles vitesses. Aux grandes vitesses, le terme C.u prédomine (la courbe devient
asymptote à une droite de pente positive) et explique la perte d’efficacité aux très
grandes vitesses. Dans la région intermédiaire, le terme A est prépondérant et H
passe par un minimum (Hmin). Elle montre que la variation de H en fonction de u
passe par une valeur minimale calculée en cherchant la valeur de u correspondant à
l’annulation de la dérivée première de cette fonction :

Uopt=√ B /C

9. Optimisation d’une analyse chromatographique

La résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les

plus importantes à considérer. Dans toute optimisation, le but est de réussir une
séparation suffisante des composés intéressants en un minimum de temps. Dans la
pratique, on s'efforcera d'abord de choisir les conditions chimiques de la séparation
(nature et composition chimique de la phase stationnaire, nature et composition
chimique de l'éluant, modification éventuelle des produits à séparer) pour que le
facteur de sélectivité ne soit pas trop proche de 1 et pour que les facteurs de capacité
soient compris entre 1 et 10.

Applications de la chromatographie

16
 La chromatographie est un outil puissant et polyvalent pour séparer des
espèces chimiques très voisines. Elle peut également être utilisée tant pour
l’identification qualitative que pour l’analyse quantitative d’espèces individuelles.

CHAPITRE II :

LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

17
 1. Définition

La chromatographie liquide haute performance appelé CLHP est une

technique instrumentale qui permet de séparer les composants d’un mélange non
volatile, thermosensible, de polarité élevée afin de les identifier et les quantifier. Elle
met en œuvre, selon la nature de la phase stationnaire, des phénomènes de partage,
d’adsorption, d’échange d’ions ou d’exclusion. Son développement très rapide, à
partir de 1970, réside dans le fait qu’elle n’a pas les inconvénients de la
chromatographie liquide classique ; cette dernière a toujours été peu utilisée, en
raison de la lenteur de la séparation ; de l’absence de détecteur qui aurait permis de
suivre facilement le développement de chromatogramme et la quantité considérable
d’échantillon nécessaire

2. Comparaison avec la chromatographie en phase gazeuse (CPG):

-Les deux méthodes ne sont pas unanimes mais complémentaires.

Tableau.1. Comparaison entre CPG et CPL.

CPG CPL

-Substances volatiles (20% des substances -Masse moléculaire élevée ;

organiques).
-Substances thermolabiles ;
-Interactions : soluté, phase stationnaire.
-Substances ionisées ;
-On opère par chromatographie de partage.
-Interactions : phase mobile, phase
-Séparation à T élevées.
stationnaire ;
-Détecteurs universels.
-Adsorption, échange d’ions….

18
 -Température moins élevée ;

-Absence de détecteurs universels.

3. Appareillage

Un appareil CLHP (Fig.4) comporte différents modules : un réservoir

contenant la phase mobile, un système de pompage, un injecteur, une colonne, un
détecteur à travers lesquels un liquide entraîne les substances d’un mélange à séparer
et un système d’acquisition de données. Il nécessite également un dispositif de
dégazage. Les différents modules sont reliés par des canalisations courtes et de très
faible diamètre interne (0,1 mm).

Fig.4 : Principe de fonctionnement de l’HPLC

3.1. Réservoir de solvants

Pour l’éluant on emploi un vase clos pour éviter l’évaporation. Le solvant

utilisé doit nécessairement :

a) Maintenir la stabilité de la colonne

b) Etre compatible avec le détecteur

19
 c) Solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.

Il est recommandé de toujours employer des solvants traité spécifiquement

pour CLHP. Ils doivent être dégazé et filtré avant usage sur filtre spécial (0,45 m).
Le choix du solvant constitue habituellement la partie la plus difficile de ce type de
chromatographie. Il est préférable de faire quelques essaies en CCM.

3.2 Dispositif de dégazage

Durant le pompage, dans la chambre de mélange ou dans la colonne elle-

même, si les solvants ne sont pas dégazés, l’air dissout dans le liquide soumis à de
forte pression, forme des bulles à l’intérieur du système, c’est là un inconvénient
majeur pour le fonctionnement de la plupart des détecteurs en particulier ceux qui
utilisent des propriétés optiques. En règle générale, plus le liquide est polaire, plus la
tendance de l’air à se dissoudre est forte. Il convient donc d’éliminer au maximum
l’azote et l’oxygène qui peuvent être présents. Le dégazage de la phase mobile se fait
par barbotage d’hélium, par ultrasons ou par un dégazeur.

2.3. Pompe

La pompe d’un chromatographe a pour rôle d’assurer l’écoulement de la

phase mobile dans la colonne. Tout appareil CLHP comporte au moins une pompe en
mode isocratique (éluant) de composition fixe tout au long de l’analyse donc la phase
mobile peut être préalablement préparée et disposée dans un seul réservoir) ou en
gradient d’élution (éluant de composition variable). L’élution gradué lors de la
séparation de mélanges complexes permet, en modifiant la composition de l’éluant,
d’optimiser les facteurs de capacité et de réduire les temps d’analyse. Les pompes les
plus utilisées sont les pompes de types piston avec lesquelles les débits sont
constants, la pression peut atteindre environ 500 bars.

Phase mobile Pompe Injecteur (a)

Phase mobile A Pompe A

Chambre de Injecteur
mélange (b)
Phase mobile B Pompe B

20
 Fig.5 Représentation schématique d’un système de pompage

(a) mode isocratique (b) mode gradient d’élution

3.4. Injecteur

L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se

faire à l’aide une vanne (boucle d’échantillonnage) : on introduit d’abord
l’échantillon dans une boucle de volume connu (position chargement ou Load) après
rotation de la vanne de 60° d’un levier qui permet d’inverser le sens de circulation
dans la boucle (position Inject), la phase mobile entraîne l’échantillon en tête de la
colonne le volume injecté est constant, cela permet donc de travailler en étalonnage
externe pour une analyse quantitative. Le volume prélevé avec la seringue est donc
toujours largement supérieur à celui de la boucle. Aujourd’hui on utilise des
injecteurs automatiques.

Fig.6. Injecteur à boucle

21
 Fig.7. Injection avec une boucle. a) Remplissage de la boucle. Dans cette étape, la seringue est
introduite à la position n ◦ 4 ; b) injection dans la colonne (noter la nouvelle position de la
manette). Vanne modèle 7125. Les vannes sont motorisables.

3.5. Colonne

Les colonnes CLHP sont généralement courtes et droites en acier inoxydable

se caractérise par leur géométrie (diamètre intérieur de 4 mm et une longueur de 5 à
30 cm) et par la nature des phases qu’elles contiennent (Figure 8). Elles doivent
capables de résister aux fortes pressions. Le débit de la phase mobile ne peut
dépasser quelques mL/min. Ces colonnes ont l’avantage de la rapidité de l’analyse,
consomment moins de solvant et conduisent à une meilleure résolution de l’analyse.
Dans la plupart des analyses une pré-colonne ou colonne de garde qui ne diffère de la
colonne analytique que par sa très faible longueur (1 à 2 cm pour une colonne de 25
cm) permet de protéger la colonne et d’en augmenter la durée de fonctionnement.

22
 Fig. 8. Colonne CLHP

3.5.1. Les thermostats des colonnes

La plupart des appareils commerciaux récents sont équipés de dispositifs de

régulations de la température ; qui la contrôle de la température ambiante jusqu’à
150°C (Fig.9). On obtient souvent de meilleurs chromatogrammes en maintenant la
température constante à quelques dixièmes de degrés Celsius.

Fig. 9. Colonne dans un thermostat

3.6. Détecteurs

3.6.1. Photomètre UV-Visible

Le détecteur UV-Visible mesure l’absorption de la lumière par le produit à la

sortie de la colonne et opère à longueur d’onde constante, celle-ci ayant été fixée par
l’operateur. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :

Le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d’onde accessible à

l’appareil, et que son coefficient d’absorption soit suffisamment grand

La phase mobile n’absorbe pas la lumière à la longueur d’onde choisie par

l’opérateur.

23
 Ce détecteur détecte seulement les changements dans le soluté donc on peut
l’utiliser dans l’analyse par gradient d’élution. Le détecteur est facile à opérer et ne
détériore pas l’échantillon. Il y’a plusieurs types de détecteurs :

 Détecteur à λ fixe : vapeur de Hg (254 nm)

 Détecteur à λ variable
 Détecteur à barrettes de diodes (DAD) : la cellule de mesure est
éclairée par une source polychromatique ; gamme de 190 à 800 nm
permettant l’enregistrement tridimensionnel absorbance-temps-
longueurs d’onde. Ce type de détecteur permet de sélectionner la
longueur d’onde optimale de détecteur pour chaque soluté.

3.6.2 Réfractomètre différentiel

Il mesure la variation de l’indice de réfraction entre la phase mobile contenant

le soluté et la phase mobile pure correspondant à la référence. La sensibilité optimale
correspond à un maximum d’écart entre les indices de réfraction des composants de
l’échantillon et de la phase mobile. Un composant dont l’indice est voisin de celui de
la phase mobile est alors pratiquement indétectable. Son utilisation est moins
répondue que celle du détecteur à UV à cause de sa plus faible sensibilité.

3.6.3 Détecteur fluorimétrique

Il mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation

ultraviolette.

L’émission de lumière est mesurée à angle droit du faisceau d’excitation. Ce

procédé sert pour les composés fluorescents ou les dérivés fluorescents de certains
composés. Ce mode de détection est plus sélectif et plus sensible de tous les
détecteurs optiques à condition que les composés présentent une fluorescence,
qu’elle soit naturelle ou obtenue par formation de dérivés.

3.6.4. Détecteur électrochimique

Cette méthode de détection ne s’adresse qu’à la détection de molécule douée

de propriétés oxydoréduction. Son principe repose sur la mesure du courant qui
circule dans une cellule d’électrolyse lors de l’oxydation ou de la réduction du soluté
contenu dans la phase mobile. Sur ce principe, on peut utiliser deux méthodes de
mesures :

24
 a) Soit effectuer une électrolyse partielle à potentiel fixe sur une fraction
constante de soluté et mesurer l’intensité du courant (détecteurs ampérométriques).

b) Soit réaliser l’électrolyse totale du soluté lors de son passage dans la

cellule et mesurer la quantité de courant (détecteurs coulométriques).

Les échantillons à détecter doivent pouvoir s’oxyder ou se réduire à un

potentiel suffisamment faible pour ne pas provoquer l’électrolyse de la phase mobile,
d’autre part la phase mobile ne doit contenir ni O2 en solution, ni contaminant
métallique, ni halogénures qui donneraient un courant résiduel et donc un bruit de
fond et une dérive de la ligne de base.

3.6.5 Détecteur par spectroscopie de masse

La chromatographie liquide couplée à la spectroscopie de masse (LC-MS) est

une technique d’analyse qui permet d’identifier clairement un composé grâce à son
rapport masse molaire/charge (m/z).

4. Interactions moléculaire entre phase mobile et soluté

Les interactions soluté-phase mobile correspond essentiellement à

l’établissement d’interactions diélectriques, de liaisons de type hydrogène ou de Van
der Waals.

5. Force éluant et polarité

La polarité d’un échantillon et d’un solvant est la tendance de ces deux

composés à interagir fortement par polarité. Les composés polaires interagissent très
fortement les uns avec les autres. Pour les composés polaires :

 Plus la phase mobile sera polaire, plus elle va entraîner les solutés
 Plus la phase mobile sera apolaire, moins elle va entraîner les solutés
Pour les composés moins polaires :
 Plus la phase mobile sera polaire, moins elle va entraîner les solutés

Applications

La CLHP est utilisée pour séparer et doser des espèces diverses d’analytes :
inorganiques, organiques et biologiques.

25
 6. Classification de la HPLC :

Classement arbitraire établi suivant la nature de la phase stationnaire et son

comportement (mode d’interactions) vis-à-vis des solutés.

6.1. Chromatographie d’adsorption (CLS)

Dans la colonne : ▲ Phase stationnaire : adsorbant (silice ou alumine)

▲ Phase mobile.

 Chromatographie liquide-solide.

5.2. Chromatographie de partage (CLL)

▲ Phase stationnaire : φS : Liquide fixé sur support inerte.

▲ Phase mobile : φM : Liquide

 Chromatographie liquide-liquide.

5.3. Chromatographie d’échange d’ions (CEI)

▲ Interactions avec des groupements fonctionnels fixes ioniques ou

ionisables greffés sur la phase stationnaire poreuse.
L’électroneutralité est assurée par un des ions mobiles, il s’échange avec ceux
de la phase mobile (silice greffée et hauts polymères).

6.4. Chromatographie de paires d’ions (CPI)

Formation de paires (entre le soluté ionisé et un contre ion) qui se distribuent

entre la phase mobile et la phase stationnaire greffée.

6.6. Chromatographie d’échange de ligands (CEL)

La phase stationnaire contient un ion complexant (Cu++, Zn++) de composés

organiques et certains polyols (SO-2).

6.7. Chromatographie d’exclusion ou de permeation de gel (CPG

Séparation sur un solide poreux de grosses moléculaires (PM ≥ 2000) éluées

en premier, de petites retenues dans les pores.

26
Phase mobile : eau.

7. Application de la chromatographie à l'analyse

7.1. Analyse des chromatogrammes

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant
à chacun des produits.

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible.

La composition de la phase mobile est un paramètre particulier à la HPLC. Il faut

donc préciser pour chaque analyse :

- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…

- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, débit,

mode de détection λ en nm.

- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité du

détecteur, etc…

6.2. Analyse qualitative

Le temps de rétention (tR en min) est une caractéristique de chaque soluté

dans les conditions opératoires fixées.

27
 On peut comparer le t R de deux solutés en définissant :

- le facteur de sélectivité α entre les deux solutés

- l’efficacité d'une colonne qui est mesure en nombre de plateau

théorique

Nombre de molécule sortant de la colonne en fonction du temps :

σ : écart type : distance entre le point d'inflexion (point où la dérivée

seconde s'annule) et la moitié de la courbe.

δ : largeur du pic à mi-hauteur

ω : largeur à la base (unité de temps)

28
 n = nombre de plateaux théoriques :

HEPT (hauteur équivalente de plateaux théoriques)

HEPT= L/n (L = hauteur de colonne, n nombre de plateaux théoriques) Résolution

de la colonne pour la séparation de deux solutés bien déterminés.

R>1 bonne séparation

R<1 mauvaise séparation ⇒ donc les paramètres appliqués à la colonne

ne sont pas les bons.

7.3. Analyse quantitative

Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

Méthode de l'étalonnage externe :

Il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante du produit afin de faire une
courbe d'étalonnage Aire = f(masse ou concentration du produit), pour un volume
injecté constant V. L'injection ultérieure du même volume V de l'échantillon à doser
permet, à l'aide de la mesure de l'aire du pic reportée sur la courbe d'étalonnage, de

29
connaître la masse ou la concentration recherchée. Cette méthode est plus précise que
celle qui consiste à ne faire qu'une mesure avec l'étalon et à utiliser une règle de
trois :

Ae/Me = Aet/met

A: Aire des pics

e : échantillon

et : étalon

m : masse du produit remplaçable par la concentration

Méthode des ajouts :

Comme la précédente, cette méthode nécessite de posséder le produit à analyser pur;

après avoir analysé l'échantillon, on ajoute à celui-ci des quantité connues ∆m du
produit avant de le chromatographie à nouveau ( faire au minimum deux ajouts), ce
qui entraîne une variation de l'aire du pic ∆A.

Si m est la masse contenue dans l'échantillon à analyser,

(∆A/∆m) = a/m soit m= A*(∆m/∆A)

Si le produit ajouté est en solution, il faut tenir compte des effets de dilution

Méthode de l'étalon interne (utilisée essentiellement en CPG) :

On compare la réponse du ou des produits à analyser à celle d'un étalon

interne, donc introduit dans le mélange à doser et convenablement choisi.

30
Une solution étalon est préparée avec le ou les produits que l'on veut doser. Les
masses sont connues m’1, m’2, et … me pur l'étalon ; à ces masses correspondent les
aires A’1, A’2, …, A'e, sur le chromatogramme.

Dans l'échantillon contenant les masses m1, m2, … de solutés on ajoute me de

l'étalon, ce qui donne les aires A1, A2, Ae.

On obtient :

m'1 = α1 A’1

m'2 = α2 A’2

me = αe A'e

avec α coefficient de proportionnalité

et k1 = (α1/αe) = (m'1 A’e /me A’1)

d'où la valeur k1 puisque toutes les données sont connues.

Dans l'échantillon inconnu on aura :

m1 = α1 A1

me = ae Ae

(m1/me) = (α1 A1/αe Ae) = k1(A1/Ae)

me, k1, A1, Ae sont connus.

31
 Conclusion 

Toutes les méthodes chromatographiques ont pour objectif essentiel la

séparation de deux ou plusieurs substances. Ces séparations sont basées sur la
distribution des composants d’un mélange entre une phase fixe ou phase stationnaire
et une phase mobile.

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 Bibliographie

[1] G. Mahuzier, M. Hamon. Abrégé de chimie analytique, Tome 2,2ème édition Masson Paris (1990).

[2] Skoog, West, Holler, Crouch, Chimie Analytique, 8ème edition Bruxelles (2013).

[3] F. Rouessac, A. Rouessac, Analyse Chimique, 6 ème édition Masson Paris (2004).

[4] Z. Kabouche, Cours et exercices de Chromatographie, OPU Constantine (2010).

[5] P. Petitjean, O. Henin, S. Ellias, G. Gruau. Application de l’électrophorèse capillaire au dosage des
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géosciences Rennes N°2 (2001).

[6] Jean-Louis CUQ, Chromatographie liquide, université Montpellier (2007)

[7] I. Lurie, Micellar electrokinetic capillary chromatography of the enantiomers of amphetamine.

methamphetamine and the hydroxyphenethylamine precursors. J.Chromatogr., 605, p. 269-275 (1992).

[8] N. Younan, Méthodes de Séparation (2011).

[9] D. Christophe, P. Michel, Méthodes d'analyses Spectroscopiques et Chromatographiques.

Bourgogne (2003).

[10] L. Lokiec, Techniques biochimiques de contrôle et d'analyse des aliments

[11] G. Steve, La chromatographie et l’lectrophorèse

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