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‫الجم ورية الجزائ ية الديمق اطية الشع ية‬
RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE
Ministère de l’Enseignement ‫ار‬

Supérieur et de la ‫التعليم العالي‬
Recherche Scientifique ‫ال حث العلمي‬
Université de Mouloud Mammeri ‫جامعة مولود معم ي‬

Faculté de médecine ‫كلية الطب‬
Tizi Ouzou ‫تيزي‬
Département de Pharmacie
PROJET DE FIN D’ETUDES

N° D’ORDRE :
Présenté et soutenu publiquement
Le 14 juillet 2019
En vue de l’obtention du diplôme : Docteur en Pharmacie
Thème
Activité cholinestérasique : validation des intervalles

de référence sur COBAS integra 400 plus
Réalisé par :
-Melle AYADI Sabrina -Melle BERRAH Sabrina -Melle CHAOUCHE Sabrina
Encadrées par :
 Promotrice : Dr. KACI Lylia
 Co-promotrice : Dr .SADOU Salima
Composition du jury :
 BELAZOUGUI .O MAHU Faculté de médecine UMMTO Présidente

 MEHNI .M.E Ancien. MAHU Faculté de médecine UMMTO Examinateur
ANNÉE UNIVERSITAIRE : 2018/2019

Dédicace
A ma chérie maman, ma confidente, ma

force, qui m’encourage toujours dans ma
vie et son soutient tout au long des années
d’études. Tu représentes beaucoup pour moi, si
je suis arrivée là, c’est bien grâce à toi. Que dieu te
donne longue vie et te protège pour moi.
A mon cher père, qui a été et sera toujours un exemple pour moi, par ces
qualités humaines, son honnêteté et sa responsabilité. Mon héros, même si je
ne le dis pas toujours, sache que mon cœur et rempli d’amour pour toi.
A ma tante Drifa, ton encouragement m’a donné de la
force pour persévérer et continuer toujours vers l’avant.
A mes sœurs : Amel, Katia, Yasmine, Fatiha et
Farida.Et surtout mon frère Mohamed je vous remercie
pour tous, que dieu vous préserve pour moi.
A mes meilleurs amies et toute les personnes qui
m’ont aidé je les remercie de m’avoir accompagné
tout au long de mon parcourt.
Sabrina .C
Dédicace
Je dédie ce modeste travail à mes chers parents

À toute ma famille
À tous mes amis
Et à toute personne ayant cru en moi.
Sabrina .B
Dédicace
Je dédie ce travail à mes chers parents,

pour tous leurs sacrifices, leur amour,
leur tendresse, leur soutien et leurs prières
tout au long de mes études.
Je dédie aussi ce travail à :
Mes grands-mères.
Mon frère Anis et ma sœur Nadia.
Mes oncles, mes tantes.
Tous mes cousins et cousines.
Tous mes amis, mes collègues et
tous ceux qui m’estiment.
Sabrina .A
Remerciements
En premier lieu nous remercions le bon Dieu le tout puissant de nous avoir donné la santé, la force, le
courage, la volonté et la patience pour finir ce travail malgré toutes les difficultés. À lui seul la gloire.
Au terme de cette étude, nous tenons à exprimer nos vifs remerciements à notre promotrice Dr. KACI
Lylia maitre-assistante en Toxicologie à l’Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou, vos conseils et vos
orientations nous ont été précieux nous espérons être digne de votre confiance. Que votre compétence
pratique, votre rigueur au travail et vos qualités humaines et professionnelles soient pour nous un exemple à
suivre.
À notre co-promotrice Dr. SADOU Salima assistante en Toxicologie au CHU de Tizi Ouzou nous vous somme
très reconnaissantes pour votre patience, votre disponibilité et vos judicieux conseils tout au long de la période
de l’étude, qui ont largement contribué à l’aboutissement de ce travail.
Un grand merci aux membres du jury d’avoir accepté d’examiner notre travail et de l’enrichir par leurs
propositions ;
Au Dr. BELAZOUGUI maitre-assistante en Toxicologie à l’UMMTO, nos sincères remerciements pour

l’honneur que vous nous faites de bien vouloir présider le jury de notre soutenance, nous vous prions
d’accepter notre profond respect.
Au Dr. MEHNI Maître-assistant en Biochimie, veuillez accepter nos sincères remerciements de bien
vouloir juger ce travail et de l’enrichir par vos propositions et remarques.
À toute l’équipe du laboratoire de Toxicologie, où nous avons réalisé ce travail, nous tenons à vous
remercier pour votre sympathie, votre écoute et votre aide pour la réalisation de notre travail.
Nous tenons également à exprimer notre reconnaissance au Dr. BOUBRIT chef de service du
laboratoire de Microbiologie, au Dr. SELLAM chef de service de transfusion sanguine au niveau du CHU
de Tizi-Ouzou et au directeur de EPSP de DBK de Tizi Ouzou et toutes leurs équipes, pour leur accueil et
leur aide à effectuer les prélèvements.
Au Dr. DAHMANI chef de service du laboratoire de Biochimie au niveau du CHU de Tizi-Ouzou,
vous avez mis le matériel du laboratoire à notre disposition pour pouvoir réaliser l’étape analytique de ce
travail, veuillez accepter l’expression de nos vifs remerciements.
Nous adressons de sincères remerciements à nos collègues pour leurs aides, et à toutes les personnes qui
ont participé à cette étude.
Merci infiniment
TABLE DES MATIÈRES
-Remerciements personnels
-Remerciements
-Table des matières
-Liste des abréviations …………………………………………………………………………i
-Liste des figures………………………………………………………………………………iv
-Liste des tableaux…………………………………………………………………………….vi
-Liste des graphes…………………………………………………………………………….vii
-Introduction générale………………………………………………………………………..01
-Objectifs ……………………………………………………………………………………..03
PARTIE I : PARTIE THÉORIQUE

CHAPITRE I : ÉTABLISSEMENT ET VALIDATION DES INTERVALLES DE
RÉFÉRENCE AU LABORATOIRE DE BIOLOGIE MÉDICALE
1. Généralités………………………………………………………………………………… 04
1.1. Terminologie……………………………………………………………………… 05
1.2. Intérêt des intervalles de référence………………………………………………... 07
1.2.1. Intérêt dans le diagnostic médical………………………………………... 07
1.2.2. Intérêt dans le pronostic et le suivi thérapeutique…………………………08
1.2.3. Intérêt épidémiologique ………………………………………………….. 08
2. Recommandations des organismes internationaux ……………………………………….. 08
2.1. Pour la détermination des intervalles de référence………………………………...08
2.2. Pour le transfert des intervalles de référence …………………………………....09
3. Protocole de détermination des intervalles de référence…………………………………..09

3.1. Sélection des individus de référence……………………………………………....11
3.1.1. Types d’échantillonnage ………………………………………………….11
3.1.2. Facteurs de variations …………………………………………………….12
3.1.3. Les principaux critères de sélection ………………………………………13
3.2. Traitements statistiques et analyses des données……………………………….…14
4. Transférabilité…………………………………………………………………………...…15
4.1. Premier cas : comparaison des systèmes…………………………………………..16
4.2. Deuxième cas : comparaison de populations analytiques…………………………17
CHAPITRE II : L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE
1. Cholinestérases……………………………………………………………………………21
1.1. Acétylcholinestérase ou cholinestérase globulaire………………………………...21
1.1.1. Origine……………………………………………………………………. 21
1.1.2. Spécificité d’action………………………………………………………...21
1.1.3. Fonctions physiologiques…………………………………………………. 21
1.1.4. Structure ………………………………………………………………….. 22
1.2. Butyrylcholinestérases ou cholinestérases sériques ……………………………… 25
1.2.1. Origine……………………………………………………………………..25
1.2.2. Spécificité d’action……………………………………………………...…25
TABLE DES MATIÈRES
1.2.3. Fonctions physiologiques………………………………………………….26

1.2.4. Structure ………………………………………………………………….. 26
1.3. Mécanisme d’action des cholinestérases …………………………………………. 27
2. Principaux facteurs influençant l’activité des cholinestérases…………………………28

2.1. L’âge et le sexe …………………………………………………………………… 29
2.2. L’influence du poids corporel ……………………………………………………..30
2.3. Atteintes hépatiques ……………………………………………………………….30
2.4. Variantes génétiques………………………………………………………….……32
2.5. Grossesse et prise de contraceptifs oraux ………………………………………… 35
2.6. Inhibiteurs pharmaceutiques ………………………………………………………36
2.7. Les pesticides……………………………………………………………………....37
CHAPITRE III : ACTION DES ORGANOPHOSPHORÉS ET CARBAMATES SUR

L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE
1. Les organophosphorés……………………………………………………………………39
1.1. Structure…………………………………………………………………………...39
1.2. Relation structure-activité ………………………………………………………...39
1.3. Classification……………………………………………………………………....40
1.4. Propriétés physico-chimiques…………………………………………………….. 44
1.5. Usages ……………………………………………………………………………. 45
1.6. Sources d’expositions …………………………………………………………….. 45
1.7. Toxicocinétique…………………………………………………………………... 46
1.8. Mécanisme d'action toxique……………………………………………………….48
1.9. Symptomatologie…………………………………………………………………. 53
1.10. Diagnostic ………………………………………………………………………. 55
1.11. Traitement………………………………………………………………………….. 56
2. Les carbamates……………………………………………………………………………57
2.1. Relation structure/activité et usages ………………………………………………58
2.2. Propriétés physicochimiques………………………………………………………60
2.3. Sources d’exposition aux carbamates…………………………………………......60
2.4. Toxicocinétique……………………………………………………………………61
2.5. Mécanisme d’action toxique……………………………………………………….61
2.6. Symptomatologie…………………………………………………………………..62
2.7. Diagnostic………………………………………………………………………….62
2.8. Traitement des intoxications……………………………………………………….62
CHAPITRE IV : DOSAGE DE L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE
1. Dosage de l’activité cholinestérasique………………………………………………….. 64

1.1. Indication de la mesure de l’activité cholinestérasique……………………………64
1.1.1. La butyrylcholinestérase………………………………………………….. 64
TABLE DES MATIÈRES
1.1.2. L’acétylcholinestérase……………………………………………………..65
1.2. Modalité de prélèvement et préparation des échantillons………………………… 65
1.3. La détermination de l’activité cholinestérasique…………………………………..66
1.3.1. Méthodes manométriques………………………………………………… 67
1.3.2. Méthodes potentiométriques……………………………………………....68
1.3.3. Méthodes titrimétriques…………………………………………………... 69
1.3.4. Méthodes photométriques…………………………………………………70
1.3.5. Méthodes fluorométriques………………………………………………... 77
1.3.6. Méthodes polarographiques………………………………………………. 80
1.3.7. Méthodes radio-isotopiques………………………………………………. 81
1.3.8. Biocapteurs………………………………………………………………...82
1.4. Récapitulatif de l’ensemble des méthodes ………………………………………..83
2. Intérêt du dosage de l’activité cholinestérasique dans les intoxications aux

organophosphorés et carbamates………………………………………………………….. 88
2.1. Pour les organophosphorées……………………………………………………….88
2.1.1. Cholinestérases et organophosphorés…………………………………….. 88
2.1.2. Diagnostic de certitude de l’exposition aigue……………………………..89
2.1.3. Marqueur de l’efficacité thérapeutique…………………………………....90
2.1.4. Diagnostic des expositions professionnelles aux organophosphorés ……..91
2.2. Pour les carbamates……………………………………………………….……….94
PARTIE II : PARTIE PRATIQUE
CHAPITRE I : MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. Type de l’étude……………………………………………………………………………. 95
2. Population de l’étude………………………………………………………………………95
3. Échantillonnage…………………………………………………………………………… 95
3.1 Critères d’inclusion ………………………………………………………………...95
3.2. Critères d’exclusion………………………………………………………………..96
4. Analyse statistique……………………………………………………………………...….96
5. Critères de jugement……………………………………………………………………….97
5.1. Pour les intervalles de référence de l’activité cholinestérasique……………….…97
5.2. Pour l’indice de masse corporelle (IMC) ……………………………………….... 97
6. Matériels…………………………………………………………………………………... 98
6.1. Matériels utilisés pour le prélèvement……………………………………………. 98
6.2. Matériels utilisés pour l’analyse…………………………………………………...98
7. Protocole opératoire………………………………………………………………………102
7.1. Étape pré-analytique………………………………………………………...……102
7.1.1. Fiche de renseignements ……………………………………………...… 103
7.1.2. Déroulement du prélèvement ………………………………………….... 103
TABLE DES MATIÈRES
7.1.3. Centrifugation …………………………………………………………... 103

7.1.4. Transport ……………………………………………………………..…. 104
7.2. Étape analytique……………………………………………………………………..….104
7.2.1. Programmation…………………………………………………………...104
7.2.2. Présentation de l’appareil ……………………………………………..…104
7.2.3. Principe de mesure de l’automate…………………………………….….105
7.2.4. Domaine de mesure ……………………………………………………...108
7.2.5. Précision………………………………………………………………….108
7.2.6. Calibration………………………………………………………………..109
7.2.7. Contrôle…………………………………………………………………..109
8. Ethique……………………………………………………………………………………110
CHAPITRE II : RÉSULTATS
1. Caractéristiques de la population…………………………………………………………111
1.1. Distribution selon l’âge …………………………………………………………. 111
1.2. Répartition géographique………………………………………………………... 113
1.3. Distribution selon l’indice de masse corporelle (IMC)………………………..… 115
2. Résultats …………………………………………………………………………………. 116

2.1. Résultats de l’activité cholinestérasique………………………………………… 116
2.2. Étude de corrélation ……………………………………………………………...121
2.2.1. Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge ………… 121
2.2.2. Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC ……..… 122
-Discussion…………………………………………………………………………………..124
-Conclusion …………………………………………………………………………………128
-Références bibliographiques
-Annexes
-Résumé
LISTE DES ABRÉVIATIONS
- ACH : Acétylcholine
- AChE : Acétylcholinestérase
- ADN : Acide Désoxyribo Nucléique.
- ADNc : Acide Désoxyribonucléique Complémentaire
- Ala : Alanine
- AMM : Autorisation de Mise sur la Marché
- ATCh: Acétylthiocholine
- BCh: Butyrylcholine
- BChE: Butyrylcholinestérase
- C.f.a.s: Calibrator For Automated Systems
- CE: Communauté Européenne
- CH : Choline
- CHE: Cholinestérase
- CHE2 :Cholinesterase Gen 2
- CHO :Choline Oxydase
- CHU: Centre Hospitalo-Universitaire.
- CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute.
- CMB : Carbamates
- CMP : N- [4- (7-diéthylamino-4-méthylcoumarine-3-yl) phényl] maléimide
- CN : Cyanure
- CTS : Centre de Transfusion Sanguin
- DBK : Draa Ben Khedda
- DL 50 : Dose létale 50%
- DTNA: Acide 6’-dithiodinicotinique
- DTNB : Acide 5,5’-DiThio-Bis-(2-Nitrobenzoique)
- EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique.
- EN : Norme Européenne
- EPSP : Etablissement Public de Santé de Proximité
- F : Fluor
- GABA : Acide Gamma Aminobutyrique
- Glu : Acide glutamique
i
- Gly : Glycine
- His : Histidine
- HPLC: High-Performance Liquid Chromatography
- Hz: Heartz
- IC: Intervalle de Confiance
- ICSH : International Councilfor Standardization in Haematology
- IFCC-LM : International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
- IHC : Insuffisance HépatoCellulaire
- IMAO : Inhibiteur de la MonoAmine Oxydase
- IMC : Indice de Masse Corporel
- INRS : Institut National de Recherche en Sécurité
- IR : Intervalle de Référence
- IRSST : Institut de Recherche en Santé et en Sécurité du Travail
- ISO : Organisation Internationale de Normalisation
- Kg : Kilogramme
- LCt50 :The median Lethal Dose
- LG: Lavage Gastrique
- M : Mètre
- NF : Norme Française
- NMDA : N Méthyl-D-Aspartate
- NOP : Neurotoxiques Organophosphorés
- NTE : Neuropathy Target Esterase
- OMS : Organisation Mondiale de la Santé
- OP : Organophosphorés
- OPN : Organophosphorés Neurotoxique
- OPP : Organophosphorés Pesticides
- OPWC: Convention on the Prohibition of Chemical Weapons
- P: Percentile
- PCC1: PreciControl ClinChem Multi 1
- PCC2:PreciControl ClinChem Multi 2
- PCR : Polymerase Chain Reaction
ii
- PFC : Plasma Frais Congelé

- Phe : Phenyl alanine
- QA-KA : Quisqualate-Kainate
- SCN : Thiocyanate
- SER : Serine
- SN : Système Nerveux
- SNA : Système Nerveux Autonome
- SNC:Système Nerveux Central
- TCH: Thiocholine
- TEPP:Tetraethyl-Pyrophosphate
- TNB: 3-carboxy-4-nitrothiolate
- TOF: Train of Four
- Trp :Tryptophane
- Tyr:Tyrosine
- UV : Ultra-Violet.
- VR : Valeurs de Référence.
iii
LISTE DES FIGURES
Figure 01 : Relations entre les différents termes employés dans la définition du concept de
valeurs de référence…………………………………………………………….. 06
Figure 02 : Les étapes de détermination des intervalles de référence……………………….10

Figure 03 : Protocole de validation des intervalles de référence…………………………….19
Figure 04 : Rôle de l’AChE au niveau des synapses ……………………………………….. 22
Figure 05 : Réaction d’hydrolyse de l’ACH catalysée par l’AChE……………………… ....22
Figure 06 : Représentation schématique de l’acétylcholinestérase………………………….23
Figure 07 : Représentation schématique du site actif de l’AChE …………………………...25
Figure 08 : Variations de l’activité des cholinestérases en fonction du type de l’atteinte
hépatique…………………………………………………………………………31
Figure 09 : Séquençage de Sanger du gène BCHE ………………………………………….34

Figure 10 : Structure chimique générale des organophosphorés…………………………….39
Figure 11 : Voies de bio-transformation du Parathion……………………………………… 48
Figure 12 : L’hydrolyse de l’acétylcholine à l’état normal…………………………………. 50
Figure 13 : Fixation d’un OP sur l’acétylcholinestérase…………………………………….51
Figure 14 : Le blocage des cholinestérases par les OP…………………………………….... 51
Figure 15 : Phénomène d’Aging……………………………………………………………..52
Figure 16 : Structure chimique générale des carbamates, thiocarbonates et
dithiocarbamates ………………………………………………………………...58
Figure 17:Structure du Chlorpropharm………………………………………………………59

Figure 18 : Structure du Thiodicarb………………………………………………………… 59
Figure 19 : Les principaux principes des méthodes de détermination de l’activité
cholinestérasique…………………………………………………………………67
Figure 20: Principe de la méthode potentiométrique……………………………………….. 68

Figure 21 : Principe de la méthode titrimétriques…………………………………………...70
Figure 22 : Les indicateurs acide-base utilisés dans les méthodes photométriques…………71
Figure 23 : La photométrique d’Hestrin pour le dosage de l’activité cholinestérasique…….71
Figure 24 : La méthode photométrique d’Ellman utilisant l’Acétylthiocholine…………….72
Figure 25:Inhibiteurs sélectifs de la BChE ethopropazine et l’iso-OMPA…………………..73
Figure 26 : Dosage photométrique introduit par Uete……………………………………….74
Figure 27 :Un test photométrique avec l'acide 6’-dithiodinicotinique………………………75
Figure 28 : Un test photométrique pour les analogues de la benzoylcholine………………..75
Figure 29 : Dosage selon Abernethy avec la cholinoxidase et la peroxydase de raifort…….76
iv
LISTE DES FIGURES
Figure 30 : Dosage basé sur l’accumulation d’indigo en présence d'oxygène………………76

Figure 31 : Hydrolyse des esters de résorufine……………………………………………....78
Figure 32 : Dosage des esters de naphtyle par hydrolyse……………………………………78
Figure 33 : Test fluorométrique utilisant l'iodure de 7-acétoxy-1-méthylquinoléinium ……79
Figure 34 : Analyse fluorométrique avec l’acétylthiocholine et CMP………………………79
Figure 35 : Un dosage chimioluminescent selon Birman……………………………………80
Figure 36 : Principe des biocapteurs potentiométriques……………………………………..83
Figure 37 : Biocapteur selon La Rosa ……………………………………………………….84
Figure 38 : Inhibition des cholinestérases par les neurotoxiques de guerre (NOP)………….88
Figure 39 : Interprétation de la baisse de l’activité cholinestérasique dans le cadre du suivi
des expositions professionnelles…………………………………………………92
Figure 40 : Surveillance des travailleurs exposés aux neurotoxiques de guerre (NOP)……..93

Figure 41 : Schéma de la validation des valeurs de référence ………………………………96
Figure 42 : Automate COBAS INTEGRA 400plus…………………………………………..99
Figure 43: A : Centrifugeuse ROTOFIX 32A. B : Centrifugeuse EBA 20………………… 99
Figure 44 : Micropipette…………………………………………………………………....100
Figure 45:Embouts de pipettes…………………………………………………………..… 100 .
Figure 46 : Reactif Cholinesterase Gen 2 (CHE2)…………………………………………101

Figues 47: PerciControl ClinChem Multi 1 (PCC1)………………………………………. 102
Figure 48: PerciControl ClinChem Multi 2 (PCC2)………………………………………. 102
Figure 49: Calibrator For Automated System (C.f.a.s)……………………………………..103
Figure 50: Principe de la photométrie d’absorption……………………………………...... 108
Figure 51: Principe de dosage de l’activité cholinesterasique (BChE) sur COBAS intégra
400 plus …………………………………………………………………………….. ……..109
v
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 01 : Comparaison entre limites de référence et limites de décision médicale …….. 07

Tableau 02 : Facteurs de variations biologiques……………………………………………. 13
Tableau 03 : Influence de la puberté sur l’activité cholinestérasique pour des filles entre 10 et
14 ans…………………………………………………………………………...30
Tableau 04 : Influence de la ménopause sur l’activité cholinestérasique chez des femmes

entre 45 et 55 ans………………………………………………………………. 30
Tableau 05 :Activité de la cholinestérase plasmatique selon les syndromes hépatiques…… 32

Tableau 06 : Les principales variantes génétiques de déficit en pseudo cholinestérase……..33
Tableau 07 : Taux de blocage selon le nombre d’adductions au TOF…………………….... 34
Tableau 08 : L’effet des contarceptifs oraux sur l’activité cholinestérasique ……………… 36
Tableau 09 : Liste de certains médicaments influençant l’activité cholinestérasique……….37
Tableau 10 : Toxicité des OP selon le X……………………………………………………. 40
Tableau 11: Classification recommandée par l’OMS des pesticides en fonction de leur
dangerosité, le nombre et des exemples qui leur sont associés………………... 41
Tableau 12: Dénomination, structure et létalité des principaux neurotoxiques

organophosphorés………………………………………………………………43
Tableau 13 : Les effets de l’inhibition de l’acétylcholinestérase ………………………. …. 54

Tableau 14 : Le tableau répertoriant les pesticides à base de carbamate et leurs principales
utilisations pour chacune des trois catégories structurelles…………………….60
Tableau 15 : Prélèvements sanguins des cholinestérases……………………………………65

Tableau 16 : Résumé des méthodes examinées…………………………………………….. 85
Tableau 17 : Comparaison des différentes méthodes de dosage ………………………….... 86
Tableau 18 : L’interprétation de l’IMC selon l’OMS………………………………………. 97
Tableau 19 : Quelques spécifications de système COBAS INTEGRA 400plus …………... 105
Tableau 20 : Précisions de COBAS INTERGRA 400PLUS………………………………...109
Tableau 21 : Distribution du groupe des hommes selon l’IMC ……………………………115
Tableau 22: Distribution du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de
contraceptifs oraux des selon l’IMC ………………………………………….116
Tableau 23 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique du groupe

des hommes……………………………………………………………………117

des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux……….....118
vi
LISTE DES TABLEAUX

des femmes enceintes………………………………………………………….119
Tableau 26 : Résultats de la validation des intervalles de référence sur COBAS INTEGRA

400 PLUS fournis par ROCHE…………………………………………125
vii
LISTE DES GRAPHES
Graphe 01: Répartition du groupe des hommes selon l’âge………………………………..111

Graphe 02: Répartition du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de
contraceptifs oraux selon l’âge………………………………………………… 112
Graphe 03 : Répartition du groupe des femmes enceintes selon l’âge……………………. 112

Graphe 04 : Répartition géographique du groupe des hommes…………………………… 113
Graphe 05 : Répartition géographique du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas
de contraceptifs oraux ………………………………………………………...114
Graphe 06 : Répartition géographique du groupe des femmes enceintes………………….114

Graphe 07 : Distribution du groupe des hommes selon l’IMC……………………………. 115
Graphe 08 : Distribution du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de
contraceptifs oraux selon l’IMC………………………………………………116
Graphe 09 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique pour le

groupe des hommes…………………………………………………………... 117

groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux…... 119

groupe des femmes enceintes…………………………………………………120
Graphe 12 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique pour les trois
groupes………………………………………………………………………...121
Graphe 13 : Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge chez le groupe des
hommes………………………………………………………………………. 121
Graphe 14 : Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge chez le groupe des
femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux… ………….. 122
Graphe 15 : Étude de corrélationde l’activité cholinestérasique avec l’IMC chez le groupe

des hommes………………………………………………………………....... 122
Graphe 16 : Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC chez le groupe

des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux………….123
viii
INTRODUCTION
GÉNÉRALE
INTRODUCTION
La Toxicologie est une discipline qui s’intéresse à l’étude des substances susceptibles de
nuire à l’organisme ou aux systèmes biologiques mais aussi à la prédiction du risque et la
prise en charge des intoxications.
L’intoxication est un processus dynamique et parfois multifactoriel. Elle relève souvent

d’une procédure d’urgence mobilisant le clinicien, le toxicologue et le biologiste dans une
démarche d’évaluation des variations qualitatives et/ou quantitatives des constituants des
milieux biologiques et/ou des substances exogènes.
Les résultats produits par un laboratoire n’ont de signification que s'ils peuvent être
interprétés par comparaison avec une série de valeurs dites « de référence» obtenues sur des
individus sélectionnés dans ce but. L'interprétation est une mission aussi essentielle pour le
biologiste que celle de produire des valeurs.
L’aide à cette interprétation est l’une des préoccupations majeures des biologistes
médicaux, notamment dans le cadre de la phase post-analytique. La présentation des comptes
rendus de laboratoire revêt donc une importance toute particulière notamment la mention
d’intervalles de référence pour chaque paramètre.
Les intervalles de référence ne peuvent être adaptés systématiquement d’un pays à un

autre car les populations concernées ont des caractéristiques nutritionnelles, socio-
économiques et environnementales qui distinguent les unes des autres, d’où l’intérêt de la
détermination et/ou de la validation des intervalles de référence de chaque paramètre pour
chaque population.
Les laboratoires de biologie médicale sont invités par la norme ISO 15189 pour
répondre à un ensemble d’exigences en termes de management de la qualité qui est un
élément indispensable pour la fiabilité des résultats. Parmi ces exigences, le laboratoire doit
fournir sur le compte rendu, un intervalle de référence. Et selon les recommandations de
l’IFCC-LM et CLSI ces intervalles de références sont soit établis soit transférés d’un autre
laboratoire après validation.
1
INTRODUCTION
Afin de garantir une interprétation meilleure et fiable des résultats obtenus au

laboratoire de toxicologie dans le cadre de la prise en charge des intoxications, il convient de
valider les intervalles de référence de l’activité cholinesterasique fournis pour la population
concernée.
2
OBJECTIFS
L’objectif principale de l’étude est la validation des intervalles de référence de l’activité

cholinesterasique au laboratoire de toxicologie du CHU NEDIR MOHAMED par rapport aux
intervalles de référence établis par le fournisseur Roche sur COBAS INTEGRA 400 PLUS et
cela chez trois populations : hommes, femmes enceintes âgées de 18 à 41 et les femmes non
enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux âgées de 16 à 39 ans.
L’objectif secondaire est d’étudier la corrélation de l’activité cholinestérasique avec

l’âge puis avec l’indice de masse corporelle (IMC) chez les hommes et chez les femmes non
enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux âgées de 16 à 39 ans.
3
PARTIE I :
PARTIE THÉORIQUE
CHAPITRE I :
ÉTABLISSEMENT ET VALIDATION
DES INTERVALLES DE RÉFÉRENCE
AU LABORATOIRE DE BIOLOGIE
MÉDICALE
PARTIE THÉORIQUE CHAPITRE I : ÉTABLISSEMENT ET
VALIDATION DES INTERVALLES DE RÉFÉRENCE
AU LABORATOIRE DE BIOLOGIE MÉDICALE
1. Généralités
Le premier concept de la valeur de référence a été proposé par Grasbeck et Saris en

1969 dans l’objectif de mieux décrire les fluctuations des concentrations sanguines de
différents paramètres chez des groupes d’individus. L’idée était d’exploiter les données
biologiques afin d’interpréter les observations médicales.
Ce concept a remplacé celui des valeurs dites normales qui apparaissait alors comme
imparfait car reposant sur l’hypothèse fausse que la distribution de l’ensemble des paramètres
biologiques était normale ou gaussienne. Les valeurs normales étaient simplement
déterminées à partir de la moyenne et de l’écart-type de la distribution (moyenne ±2 écart-
types).
Entre 1980 et 2000, des recommandations internationales ont été publiées par l’IFCC-
LM (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) sur la
production des intervalles de référence, puis révisées en 2008. Les experts réunis proposaient
alors l’utilisation de méthodes statistiques non paramétriques pour déterminer des valeurs de
référence car non basées sur l’hypothèse d’une distribution normale.
Ils définissaient une valeur de référence comme étant une valeur observée chez un seul
individu dit « de référence » car sélectionné pour son appartenance à la population ciblée,
pour un paramètre donné et à un moment donné. Ils proposaient alors la notion de « limite de
référence » définie comme une valeur dérivée à partir de l’ensemble des valeurs de référence
obtenues sur chacun des individus de référence (constituant la population de référence ou
population ciblée dans ce cas). Cette « limite de référence » est une donnée utilisable à des
fins de caractérisation de la population de référence.
Par consensus, les limites de référence correspondent à des bornes inférieures et

supérieures de l’intervalle de référence dans lequel se retrouvent 95 % de l’ensemble des
valeurs de référence, à savoir les percentiles (P) 2,5 et 97,5. [1, 3, 8, 9, 10,58]
4
1.1. Terminologie
Les définitions qui suivent ont été approuvées par la Fédération Internationale de
Chimie Clinique et de Médecine de Laboratoire (IFCC-LM), l’International Council for
Standardization in Haematology(ICSH) ainsi que par l’Organisation Mondiale de la Santé
(OMS), puis par le CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institue).
-Valeur observée : valeur d'un analyte obtenue par observation ou mesure d'un sujet à tester,
qui doit être comparée à des valeurs de référence, une distribution de référence, une limite de
référence ou un intervalle de référence.
-Individu de référence : une personne sélectionnée sur la base de critères bien définis ;
-Population de référence : groupe constitué de tous les individus de référence ;
-Valeurs de référence : la valeur obtenue par observation ou mesure d'une quantité définie sur
un individu de référence ;
-Distribution de référence: la distribution des valeurs de référence ;
-L’intervalle de référence : c’est l’intervalle entre deux limites de référence (celles-ci

incluses) spécifié dans la distribution des valeurs obtenues à partir de populations de sujets
sains. Ceci est généralement défini comme un intervalle correspondant à 95% de la
population. La détermination de l'intervalle de référence est basée sur des calculs statistiques ;
-Les limites de référence : c’est les valeurs qui définissent un intervalle de référence. Dans
certains cas, une seule limite de référence peut être utilisée, généralement une limite
supérieure. [1, 3]
La relation entre les différents termes employés pour la définition du concept des intervalles
de référence est illustrée à la figure 1 au-dessous.
5
Figure 01 : Relations entre les différents termes employés dans la définition du concept de
valeurs de référence [7]
-Entre limites de référence et limite de décision médicale :

• Les limites de référence sont associées à une population de référence bien définie,
généralement constituée de personnes en bonne santé. Elles permettent de comparer une
valeur observée aux données de référence obtenues à partir de ce groupe de sujets bien
définis. Elles constituent un des éléments contributifs à la prise de décision médicale en tenant
compte des spécificités propres à la personne examinée. Les limites de référence sont
6
descriptives d’un état de santé donné et peuvent, parfois, dans des conditions bien définies
servir de limites de décision.
• Les limites de décision médicales sont utilisées par le clinicien comme un seuil en-
dessous ou au-dessus duquel une action médicale est recommandée. Alors que les limites de
référence sont généralement au nombre de deux, supérieure et inférieure, le nombre de limites
de décision est variable suivant l’examen de laboratoire concerné et le contexte clinique.
Dans certains cas, pour quelques paramètres, les limites de référence sont remplacées par des
limites de décision établies par un consensus national ou international (ex. : cholestérol total,
hémoglobine glyquée…). Pour ces paramètres, il est inutile de déterminer des limites de
référence ou de valider celles de la littérature. (Tableau 01) [1]
Tableau 01 : Comparaison entre limites de référence et limites de décision médicales [07]
Limites de références Limites de décision

Définition •Statistique •Seuil au-dessus ou en dessous
•Descriptive d’une population duquel une décision clinique est
spécifique recommandée (bonnes pratiques)
•Généralement en bonne
santé
Méthodologie •Sélection d’individus de •Consensus (national ou
référence international)
•Population de référence •Valeurs prédictives
•Intervalle de référence
central : 95% de la
distribution
Nombre de •Généralement deux : limites •Une ou plusieurs, dépendantes du

valeurs basse et élevée (associée à IC) contexte clinique
1.2. Intérêt des intervalles de référence

1.2.1. Intérêt dans le diagnostic médical
Les valeurs de référence ont un intérêt diagnostic évident. En effet pour dire qu'un sujet est en
bonne santé apparente pour un paramètre biologique donné, il faut comparer la valeur
observée de ce paramètre à celle d'un groupe de référence bien homogène après avoir maîtrisé
au maximum tous les facteurs de variations. L'établissement des valeurs de référence permet
au clinicien:
- De fixer une limite de décision adaptée à chaque cas particulier ;
7
- De confirmer un diagnostic ;
- De dépister une affection cliniquement silencieuse et d'alerter le patient sur les
risques encourus.
1.2.2. Intérêt dans le pronostic clinique et le suivi thérapeutique

La comparaison de population saine et malade pour un paramètre biologique donné ne
met pas totalement en lumière la gravité d'une pathologie. Pour dire qu'un sujet est atteint d'un
syndrome il faut comparer la valeur mesurée à celle d'un groupe de référence de sujets atteints
du même syndrome, afin d'avoir une vision clarifiée du pronostic clinique.
Les valeurs de référence permettent également d'évaluer l'effet thérapeutique, et de surveiller
une situation à risque dû à la prise de médicaments.
1.2.3. Intérêt épidémiologique

Les centres de santé doivent définir les intervalles de référence des populations saines
mais également celles des groupes pathologiques.
L'étude comparative de populations saines et des populations malades permettra de classer les
examens suivant leur pouvoir discriminant en ce sens que les valeurs de référence permettent
de définir des priorités pour les examens de santé, d'autre part l'étude de valeurs de référence
des populations donne le sens et l'importance des déviations des paramètres biologiques sous
l'effet des différents facteurs précédemment décrits.
L'établissement des valeurs de référence est un impératif pour contourner les difficultés
d’interprétation des examens de laboratoire. Cependant il est nécessaire de maîtriser tout
d’abord les facteurs de variations dues au prélèvement, puis aux techniques d'analyse
proprement dites, et enfin ceux liés aux variations intra et interindividuelles afin de ne pas
biaiser l'interprétation clinique. [4,13]
2. Recommandations des organismes internationaux

2.1. Pour la détermination des intervalles de référence
La Fédération Internationale de Chimie Clinique (IFCC) a été proactive dans
l’établissement de recommandations pour clarifier la véritable signification du terme
intervalle de référence (IR) ; pour sélectionner la population de référence appropriée et
analyser statistiquement les données.
8
La ligne directrice C28-A3 publiée par le Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) et l'IFCC est toujours la source de référence la plus largement utilisée dans ce
domaine.
2.2. Pour le transfert des intervalles de référence

Les difficultés rencontrées dans l’utilisation de la procédure de base ont été reconnues
par les experts de l’IFCC et du CLSI (voir annexe XIII) qui ont indiqué que «les laboratoires
individuels devraient s’attacher en priorité à vérifier des intervalles de référence déterminés
ailleurs ». [8, 63,64]
3. Protocole de détermination des intervalles de référence

Pour un nouvel examen ou une nouvelle méthode, en l'absence de données fiables dans
la littérature, le laboratoire utilisera le protocole de base pour déterminer l’intervalle de
référence. Lorsque les informations sont disponibles, il peut être préférable de valider les
intervalles de référence publiés ou fournis.
Le protocole de base comprend une série d'étapes successives décrites en détail dans des
documents publiés par l'IFCC et CLSI. En voici un résumé (voir figure 02):
- Énumérer les facteurs de variations biologiques et analytiques (à partir des données de
la littérature) ;
- Déterminer les critères d'exclusion et de partition sur la base d'un questionnaire
adapté ;
- Faire un formulaire de consentement écrit et le faire signer par les individus
sélectionnés ;
- Catégoriser les personnes de référence potentielles sur la base des données du
questionnaire et d'autres évaluations des modes de l'état de santé ;
- Exclure les individus de l'échantillon de référence en fonction de critères
prédéterminés ;
- Définir le nombre approprié d'individus de référence ;
- Préparer les individus sélectionnés pour la collecte des échantillons selon les
procédures normalement utilisées pour les patients en laboratoire ;
- Recueillir et traiter des échantillons ;
9
- Recueillir des valeurs de référence : analyse des échantillons selon des méthodes bien
définies ;
- Vérifiez les valeurs de référence. Établir un histogramme pour évaluer la distribution
des données ;
- Identifier les erreurs possibles et/ou les valeurs aberrantes ;
- Analyser les valeurs de référence : sélectionner une méthode statistique et calculer les
limites de référence et l'intervalle de référence ;
- Documentez toutes les étapes et procédures suivies. [1, 2,3 ,15]
Etablir la liste des facteurs de variation
Etablir la liste des critères de sélection et de partition
Informer les personnes
Recueil du consentement
Excluredes individus selon les critères d’exclusion
Sélectionner les individus de référence

(questionnaire)
Prélèvement et prétraitement
Analyse biologique et recueil des valeurs de référence
Nettoyage des données et identification des valeurs aberrantes
Examen des données, construction d’un histogramme(Distribution)
Sélectionner la méthode d’estimation des LRs (para vs non paramétriques)

partition
Calculer RIs et LRs
Documenter toutes les étapes de la procédure
Figure 02 : Les étapes de détermination des intervalles de référence [07]
10
3.1. Sélection des individus de référence

La sélection d’un groupe de référence composé d’individus sains conformément à des
critères bien définis est la tâche la plus difficile mais essentielle lors de l’établissement des
intervalles de référence. La sélection d’un échantillon consiste à choisir des individus de
référence aussi comparables que possible aux patients, mis à part leur maladie (donc pour
l’âge, le sexe, les conditions de vie, …).
La définition de l’état de « bonne santé » est particulièrement complexe à établir et
suppose qu’une multitude de conditions soient réunies. Dans une première étape, les individus
« malades » ou présentant des « facteurs de risques » seront exclus de l’échantillon. Dans une
deuxième étape, on divisera l’échantillon de référence en sous-classes représentatives (on se
limite, en pratique, le plus fréquemment au sexe et à l’âge).
Les valeurs de référence ne peuvent être adaptées systématiquement d’un pays à l’autre car
les populations concernées ont des caractéristiques nutritionnelles, socio-économiques et
environnementales qui distinguent les unes des autres. [1, 3, 8, 10, 17,18]
3.1.1. Types d’échantillonnage

3.1.1.1. Technique d’échantillonnage directe (recommandée par le comité IFCC /CLSI)
On distingue deux types de sélection :
a. Sélection a priori : lorsque les critères d’exclusion et de partition sont bien définis avant la
sélection des individus de référence, ces critères sont basés sur les données de la littérature. Le
processus de sélection sera mis en place avant le prélèvement. On résume ci-dessous les
principales étapes :
- Déterminer le nombre d’échantillon à prendre en compte ;
- Ensuite procéder à l’étape de sélection selon les critères d’inclusion et d’exclusion ;
- Réalisation du prélèvement dans des conditions bien définies ;
- Effectuer l’analyse des spécimens biologiques recueillies ;
- Traitement des résultats et détermination des intervalles de référence. [1,8]
b. Sélection a posteriori : lorsque ces mêmes critères sont appliqués après que le
prélèvement ait été fait. On préfère cette dernière méthode pour tout nouvel analyste ou
lorsque les données de la littérature sont peu riches en informations pour déterminer les
critères de sélection.
11
- Sélectionner un nombre important de sujets à partir de la population (généralement

1000 sujets) ;
- Un questionnaire devra être au préalable rempli afin de procéder à l’étape de
prélèvement ;
- Effectuer ensuite le prélèvement qui est traité et analysé ;
- Et c’est à partir des résultats obtenus, que la sélection de l’échantillon de référence
selon les critères d’inclusion et d’exclusion sera faite ;
- Après le traitement statistique des résultats, établir les intervalles de référence.
[1,8 ,11]
3.1.1.2. Technique d’échantillonnage indirecte
Dans ce cas on utilise les informations contenues dans une base de données d’un
laboratoire ou d’un hôpital. Cette technique peut être employée principalement s’il est trop
difficile de recueillir des échantillons de personnes en bonne santé (par ex. : pédiatrie). Ce
procédé est relativement simple et peu coûteux.
L’extraction des données est réalisée par des méthodes statistiques sophistiquées, nécessitant
le recours à des statisticiens chevronnés. En revanche, des précautions particulières seront
prises pour éviter d’inclure des valeurs d’individus « malades » ou « à risques ».
Le comité IFCC/CLSI est très réservé quant à l’usage de cette technique qui peut
conduire à une « estimation grossière » des intervalles de référence. [1 ,11]
3.1.2. Facteurs de variations

Les différentes variables mesurées en biologie sont influencées par différentes variation
biologique (inter et intra individuelle), pré-analytique et analytique. Il n'existe pas de liste
universelle de ces facteurs de variation. Chaque grandeur biologique peut être influencée par
l'un ou l'autre de ces facteurs. [7]
a. Variations biologiques
Dans le tableau 2 ci-dessous une liste non exhaustive des facteurs de variations biologiques
susceptibles d'influencer les examens de laboratoires.
12
Tableau 02 : Facteurs de variations biologiques [07]

Le jeûne Apesanteur Exercice physique
Médicaments Position Rythme circadien
Age Café ou caféine Exposition à la lumière
Ménopause Cycle menstruel Rythme hebdomadaire
Nicotine et tabac Race Fièvre
Alimentation Déficience nutritionnelle Rythme saisonnier
Obésité Repas Grossesse
Alitement Environnement Sexe
Poids Rythme biologiques Groupe sanguin
Stress
b. Variations pré-analytiques
Concerne la préparation du sujet avant le prélèvement, la collecte et le traitement de
l’échantillon (manipulation et conservation). Ces facteurs doivent être contrôlés et maîtrisés
afin de minimiser leurs effets [1]
c. Variations analytiques
Les intervalles de références sont liés à la méthode de mesure employée. Il convient de la
décrire soigneusement et de bien maîtriser les facteurs de variations au cours du temps
(notamment la variation de lot-à-lot). [3]
3.1.3. Les principaux critères de sélection

Pour déterminer les intervalles de référence en biologie, il faut tout d’abord recueillir un
certain nombre d’informations générales sur le sujet.
a. Critères d’inclusion
Ce sont les caractéristiques que doivent présenter les sujets pour être inclus dans l’étude et
visent à classer les individus de référence en différentes sous-classes. L’âge et le sexe sont les
principaux critères de partition.
b. Critères de non inclusion

Ce sont les caractéristiques que ne doivent pas présenter les sujets pour être inclus dans
l’étude. Si un sujet présente l’un de ces critères, il sera exclu. Les critères d’exclusion visent à
13
sélectionner des groupes d’individus en bonne santé en éliminant les individus malades ou à
risques.
Les recommandations des sociétés savantes imposent d'exclure les sujets prenant
régulièrement des médicaments, ceux présentant des facteurs de risque : surcharge pondérale,
tabagisme, une consommation excessive d'alcool, les sujets malades ou dans un état
physiologique particulier (grossesse, exercice physique important). Cette liste n'est pas
limitative, elle dépend des connaissances scientifiques et surtout de la disponibilité de
l'information, ce dernier point étant crucial. [1,2]
3.2. Traitements statistiques et analyses des données

Trois méthodes statistiques différentes ont été décrites dans les documents officiels de
l’IFCC-LM et du CLSI. Les méthodes présentées ci-dessous ont fait leurs preuves et font
l’objet à ce jour d’un consensus international.
a. La méthode paramétrique
- Applicable à des populations dont la distribution est normale « gaussienne » ;
- En cas de doute sur la nature de la distribution, les tests de normalité permettent de
trancher : s’ils sont négatifs, on applique l’une ou l’autre transformation statistique
afin de la normaliser ;
- Ensuite on vérifie que la nouvelle distribution suit bien une loi normale ;
- Déterminée entièrement par deux paramètres : la moyenne (m) et l’écart-type (s) ;
- L’intervalle de référence est exprimé par m±1,96 au risque α=5% ;
- Cette méthode est peu utilisée en biologie, les distributions observées étant le plus
souvent asymétriques.
b. La méthode non paramétrique
- N’exige rien des lois de probabilités, elle est toujours applicable ;
- Elle requiert cependant une sélection soigneuse des individus de référence et un
nombre d’individus suffisant (≥120) ;
- C’est la méthode que recommande actuellement l’IFCC-LM.
c. La méthode robuste
- Elle a été introduite récemment dans le dernier document de l’IFCC/CLSI ;
- Elle peut rendre des services lorsque le nombre de sujets est limité ;
14
- Elle ne requiert pas que la distribution soit gaussienne ni un effectif ˃ 120 C’est une
méthode proche de la méthode paramétrique, sauf qu’elle mesure la position et la
dispersion au lieu de la moyenne et de l’écart-type.
D’autres méthodes statistiques sont décrites dans la littérature et de nouveaux travaux sont
publiés chaque année (méthodes paramétriques traditionnelles, technique de boot-strap, etc.),
mais elles nécessitent le recours à des statisticiens expérimentés. [1, 8, 12,14]
Nombre minimum de valeurs de référence

Les méthodes statistiques conventionnelles nécessitent un nombre minimum d'au moins 120
valeurs par classe ou sous classe. En effet, le nombre de valeurs affecte directement la
précision du calcul des limites de référence. Il est parfois difficile d’atteindre ce nombre (tests
coûteux, pédiatrie, échantillonnage difficile, etc.) et il est recommandé d’utiliser uniquement
des méthodes non paramétriques (ou une méthode robuste au lieu de cela).
Le calcul de l'intervalle de confiance pour chaque limite de référence permet de valider le
nombre d'individus sélectionnés. Il est généralement admis que l'intervalle de confiance pour
chaque limite de référence doit être <0,2 fois la largeur de l'intervalle de référence concerné.
[1]
4. Transférabilité
Le protocole de l’IFCC pour l’établissement des intervalles de référence est considéré
comme le gold standard, mais il est inadapté à la pratique courante des laboratoires de
biologie médicale parce qu’il est trop lourd et trop complexe à mettre en œuvre. Aussi il paraît
peu réaliste que chaque laboratoire détermine ses propres intervalles de référence pour chaque
nouveau test, méthode ou système analytique introduit au laboratoire.
La principale difficulté vient de la sélection de la population et de la définition d’un
individu en « bonne santé » ; si le recrutement n’est pas correctement fait, les limites de
référence calculées peuvent être faussées quelle que soit la méthode statistique employée.
Pour tenter de contourner cette difficulté, il est proposé de procéder seulement à une «
vérification » des limites de référence publiées à l’usage des laboratoires. Le transfert de
données produites par d’autres laboratoires ou de fabricants du diagnostic in vitro, associé à
un processus de validation simple pourrait ainsi être d’une grande utilité.
15
En revanche, il convient de respecter certaines conditions pour que le processus de transfert

soit acceptable, notamment une sélection soigneuse de la population de référence et le respect
des conditions pré-analytiques et analytiques. [1,2, 3, 5,7 ,16]
4.1. Premier cas : comparaison de systèmes

Des limites de référence ont été déterminées à partir de la population du laboratoire pour un
système analytique donné : si le laboratoire décide de changer de méthode, la transférabilité à
l'intérieur du même laboratoire vers un autre couple méthode-instrument se résume à une «
comparaison de systèmes analytiques ». Il n'est donc pas nécessaire, dans ce cas, de
sélectionner des individus de référence. L'opération se résume à une comparaison de
méthodes suivant un protocole reconnu. On calculera l'équation de la droite de régression
(pente, ordonnée à l'origine, leur incertitude). On utilisera des sérums frais de patients en
veillant à respecter l'étendue du domaine de mesure de la méthode concernée. La fidélité de
chaque méthode devra être du même ordre de grandeur, et les étalons similaires.
Deux cas peuvent se présenter :
• Il n'existe pas de différence systématique entre les deux méthodes :
- La pente de la droite de régression est voisine de 1 (± x %) ;
- L'ordonnée à l'origine (positive ou négative) est faible, inférieure aux
critères définis ;
- L'étendue du domaine de mesure est similaire.
En conséquence, les résultats obtenus avec l'une ou l'autre méthode sont compatibles.
L'intervalle de référence de la méthode antérieure peut être utilisé pour la nouvelle méthode.
• Il existe une différence systématique caractérisée entre les deux méthodes : les
données des comparaisons sont homogènes ;
- La pente de la droite de régression s'écarte de 1 de plus de ± x % ;
- L'ordonnée à l'origine (positive ou négative) est faible, inférieure aux
critères définis ;
- L'étendue du domaine de mesure est similaire ;
En conséquence, les limites de référence pour la nouvelle méthode peuvent être recalculées en
utilisant l'équation de la droite de régression.
16
La comparaison de systèmes analytiques suppose que :

o Le protocole de comparaison de méthodes est suivi de manière stricte,
notamment la répartition uniforme des valeurs sur toute l'étendue du domaine
de mesure, au risque de conduire à des calculs statistiques erronés ;
o Si l'ordonnée à l'origine est trop importante, le transfert direct n'est pas
recommandé ;
o La régression linéaire n'est pas toujours la meilleure méthode pour comparer
deux groupes de valeurs. Par exemple, si l'étendue des valeurs est trop
restreinte, l'évaluation du biais entre les moyennes des deux méthodes est
certainement mieux adaptée pour recalculer les limites de référence de la
nouvelle méthode. [1,2, 3, 5,7]
4.2. Deuxième cas : comparaison de populations analytiques

Lorsqu’un laboratoire souhaite transférer les intervalles de référence établis par un autre
laboratoire (publication, laboratoire voisin ou ayant le même système analytique, groupe
d'utilisateurs, etc.) ou par un fabricant de matériel ou de réactifs, la transférabilité de
l'intervalle de référence dépasse le cadre strict d'une comparaison de systèmes analytiques,
elle devient une question de comparaison de populations de référence. Plusieurs approches
sont proposées dans les dernières recommandations de l'IFCC-LM et du CLSI.
• Méthode subjective
On vérifie que les éléments essentiels de l'étude originelle sont en cohérence avec les
conditions de travail et la population du laboratoire. Les principaux éléments à prendre en
compte sont :
o Les critères géographiques et démographiques ;
o Les procédures pré-analytiques ;
o Les performances analytiques ;
o La description de la population de référence et du protocole utilisé ;
o La méthode statistique de détermination de l'intervalle de référence.
Si tel est le cas, l'intervalle de référence de l'étude originelle peut être transféré sans
vérification.
La difficulté à disposer de l'ensemble des informations requises reste la principale limite.
17
• Vérification de l'intervalle de référence à partir d'un échantillon de sujets

apparemment sains
Si la méthode subjective n'est pas applicable, le laboratoire vérifie l'intervalle de référence

communiqué ou publié.
Protocole
Ø Sélection de 20 individus apparemment sains en tenant compte des critères d'exclusion
et de partition requis (sexe, âge, absence de pathologies, prise de médicaments, etc.).
Ø Détermination des valeurs de référence avec la méthode à tester. On vérifie
l'homogénéité du groupe (en éliminant si nécessaire les valeurs aberrantes). Les
conditions pré-analytiques et analytiques seront en cohérence entre la méthode testée
et celle originelle.
o Les intervalles de références à vérifier sont acceptés si le nombre de résultats en
dehors des limites est inférieur ou égal à 2.
o Une nouvelle sélection de 20 échantillons biologiques est analysée si le nombre de
résultats en dehors des limites proposées est égal à 3 : le même protocole que
précédemment est appliqué. Dans ces conditions, les intervalles de référence à vérifier
sont acceptés si le nombre de résultats de la nouvelle sélection en dehors des limites
est inférieur ou égal à 2.
o Dans le cas où 4 résultats ou plus sont en dehors des limites proposées, il est conseillé
de revoir la procédure analytique, d'envisager la présence de possibles différences
biologiques et/ou démographiques et de déterminer les intervalles de référence de la
méthode utilisée suivant le protocole originel (Figure 3). [1, 2, 3, 5,7]
18
Figure 03 : Protocole de validation des intervalles de référence [07]
19
CHAPITRE II :
L’ACTIVITÉ
CHOLINESTÉRASIQUE
PARTIE THÉORIQUE CHAPITRE II :
1. Les cholinestérases
Les cholinestérases sont des protéines exprimées dans les différents systèmes nerveux et
sanguin des eucaryotes supérieurs. Il existe chez l’homme deux cholinestérases différant par
leur origine, leur lieu de synthèse, leur structure, leur spécificité d’action, leur fonction
physiologique et l’indication de la mesure de leur activité. [28]
1.1. Acétylcholinestérase(AChE) ou cholinestérase globulaire

1.1.1. Origine
Elle est synthétisée dans le globule rouge (où son rôle n’est pas connu) et le tissu
nerveux. Elle est présente essentiellement au niveau des synapses dans le tissu nerveux et la
jonction neuromusculaire, dans la substance grise, les poumons et la rate. Elle est aussi
présente de façon anormale dans le liquide amniotique au cours du défaut de fermeture du
tube neural [20,28]
1.1.2. Spécificité d’action

Elle a une affinité presque exclusive et spécifique pour son substrat naturel
l’acétylcholine (ACH). [20 ,28]
1.1.3. Fonctions physiologiques

L’acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme clé de la neurotransmission. En
hydrolysant le neurotransmetteur cationique acétylcholine (Figure 05), elle permet aux
neurones cholinergiques de retrouver leur état de repos, et notamment aux muscles de cesser
de se contracter après la transmission de l’influx nerveux.[34]
Les principales fonctions physiologiques de l’acétylcholinestérase sont bien connues.
Elle intervient dans le système nerveux périphérique et central et joue ainsi un rôle majeur au
niveau de la transmission de l’influx nerveux en éliminant l’acétylcholine (ACh), un
neurotransmetteur cationique (Figure 4).L’ACh est libéré par le neurone pré-synaptique sous
l’effet d’un potentiel d’action et diffuse dans la synapse pour se fixer à un récepteur
cholinergique. Le potentiel d’action est ainsi transmis au neurone post synaptique. A ce
moment, l’AChE hydrolyse rapidement l’ACh, interrompant la transmission de l’influx
nerveux.
Dans le système nerveux périphérique, lorsque l’ACh se lie à l'un de ses récepteurs sur
les fibres musculaires notamment, des canaux à calcium s'ouvrent dans la membrane
cellulaire, ce qui permet l'entrée d'ions calcium dans la cellule. S'ensuit alors une série
21
d'étapes qui mènent à la contraction musculaire. Dans le système nerveux central,

l'acétylcholine intervient notamment dans l'apprentissage et la mémoire à court terme. Au sein
du système circulatoire, son rôle physiologique reste encore à élucider. [20,34]
Figure 04 : Rôle de l’AChE au niveau des synapses [34]
Figure 05 : Réaction d’hydrolyse de l’ACH catalysée par l’AChE [20].
1.1.4. Structure
Comme toute protéine, l’AChE possède quatre niveaux de structuration :
- La structure primaire correspond à la succession linéaire des acides aminés constituant
la protéine.
- La structure secondaire décrit le repliement local de la chaîne principale de la protéine
(hélice, feuillet…).
22
- La structure tertiaire ou tridimensionnelle correspond au repliement de la structure

secondaire dans l'espace.
- La structure quaternaire des protéines regroupe l'association d'au moins deux chaînes
polypeptidiques, identiques ou différentes, par des liaisons non covalentes (liaison H,
liaison ionique, interactions hydrophobes et force de Van der Waals).
L’AChE de Torpedo californica (Raie électrique)a été la première dont la structure

primaire a été déterminée. Quelques années plus tard, la structure primaire de l’AChE
humaine a aussi été caractérisée. Sussman et al. en 1991 ont été les premiers à caractériser la
structure tridimensionnelle de l’AChE de Torpedo californica. Les structures primaires des
différentes AChE sont très proches : plus de 60% des résidus sont identiques entre l’AChE de
Torpedo californica et celle de mammifères, et en particulier au niveau du site actif.
L’AChE de mammifères contient 543 résidus. Elle est cristallisée sous une forme
homodimérique et constituée de 12 feuillets s’entourant 14 hélices (Figure 06). [34]
Figure 06 : Représentation schématique de l’acétylcholinestérase. [41]
Le site actif de l’AChE est principalement organisé autour de la triade catalytique

constituée des résidus Ser203, His447 et Glu334 (Figure 7).La fonction de ces résidus a été
montrée par mutagénèse : si l’on remplace l’un de ces trois résidus par une alanine, une baisse
23
importante de l’activité de l’enzyme est observée. Cette triade est similaire à celles des sérines
hydrolases et protéases, dans lesquelles le glutamate est remplacé par un aspartate. La triade
catalytique est au fond d’une étroite gorge de 20 Å de profondeur. Pour que l'hydrolyse ait
lieu, il faut donc que l'acétylcholine pénètre d'abord dans cette gorge et se positionne
correctement vis-à-vis de la triade catalytique. Des interactions des cations avec les résidus
aromatiques qui tapissent la gorge facilitent la pénétration du substrat dans celle-ci.
Au-delà de la triade catalytique, trois principales régions peuvent être définies au niveau
du site actif (Figure 07) :
- Le sous-site anionique : ou site de fixation de la choline est constitué du Trp86,

Glu202 et Phe337. Le Trp86 est particulièrement important dans la fixation du substrat
puisque l’affinité de l’enzyme pour le substrat est divisée par 1000 lorsque le Trp86 est
remplacé par une alanine. Par contre, si l’on remplace le Glu202 par une glutamine, l’activité
de l’enzyme ne diminue que d’un facteur 5, ce qui semble montrer que le Glu202 n’a pas de
rôle direct dans la catalyse.
- La poche acyle : région hydrophobe proche du site actif, permet de stabiliser la partie
méthyle du groupe acyle et de délimiter la position du substrat. Elle est constituée des résidus
Ph295, Phe297, Trp236, Phe338. Ceux-ci sont responsables de la sélectivité de l’AChE vis-à-
vis de l’acétylcholine. En effet, du fait de l’encombrement stérique qu’ils induisent, seuls des
groupements acétyl ou propanoyl peuvent venir s’y fixer. Ces résidus servent également à
stabiliser l’His447, et participent donc par ce biais à l’efficacité catalytique de l’AChE.
- Le trou oxyanionique : composé des résidus Gly121, Gly122 et Ala204, est une zone
très importante pour la réactivité de l’AChE. Ces résidus établissent des liaisons hydrogènes
avec le substrat, et stabilisent fortement l’intermédiaire acyl-enzyme, et la charge négative sur
l’oxygène.
Une quatrième région peut également être définie. Il s’agit du site périphérique anionique qui
se lie aux substrats cationiques, et notamment aux ligands trop gros pour pénétrer dans la
gorge. Ce site est notamment constitué des résidus Tyr72, Tyr124 et Trp286. Il permet au
substrat de se fixer avant de glisser vers le site actif où il sera hydrolysé. [21,34]
24
Figure 07 : Représentation schématique du site actif de l’AChE. [34]
1.2. Butyrylcholinestérase ou cholinestérase sérique ou pseudo cholinestérase

1.2.1. Origine
La butyrylcholinestérase (BChE), encore nommée cholinestérase sérique, plasmatique,
ou pseudocholinestérase, est extracellulaire. La forme plasmatique, est synthétisée par le foie.
Retrouvée dans la plupart des tissus et organes : cerveau, jonction neuromusculaire, foie,
muscle, pancréas, intestin. Elle existe également sous différentes formes moléculaires,
solubles ou ancrées à la surface des cellules. [28]
BChE est présente dans des régions du cerveau dans des positions non liées à l'AChE,
notamment dans les cellules endothéliales capillaires, dans les cellules gliales et dans les
neurones. La BChE humaine est clairement synthétisée dans le cerveau et ne provient pas du
plasma, car des clones d'ADNc ont été découverts dans des banques d'ADNc de cellules du
cerveau [65].
1.2.2. Spécificité d’action

Elle a une affinité large ; elle peut hydrolyser un grand nombre d’esters synthétiques et
naturels, y compris l’acétylcholine et la succinylcholine. [20, 23,28]
25
1.2.3. Fonctions physiologiques

Bien que la BChE soit présente dans différent tissus et suspectée de jouer un rôle dans la
différenciation cellulaire, le développement du système nerveux et des maladies
neurodégénératives, voire dans la transmission cholinergique au niveau du système nerveux
central, aucune fonction physiologique n’a pu lui être encore attribuée de façon claire. Les
individus déficients en BChE (nullizygotes, de phénotype dit « silencieux ») ne développent
pas de pathologie particulière, sinon une plus grande sensibilité à certains toxiques.
La BChE joue en effet un rôle important dans le métabolisme de nombreuses substances
à action pharmacologique comportant une fonction ester. C’est le cas par exemple de la
succinylcholine (myorelaxant), de la cocaïne, et d’autres esters naturels (poisons) ou artificiels
(des médicaments anti-Alzheimer) et des prodrogues comme le bambutérol dont l’hydrolyse
libère la terbutaline. Les individus dépourvus de BChE ou porteurs de variantes de l’enzyme
aux propriétés catalytiques altérées sont exposés à des effets de surdosage car ils éliminent
beaucoup moins rapidement ces composés toxiques [22]
Son importance en tant qu'enzyme de désintoxication a de plus en plus d’intérêt. La
BChE humaine hautement purifiée peut être administré sous forme de biopharmaceutique
pour protéger l'AChE contre l'empoisonnement par les pesticides OP et agents neurotoxiques
de guerre chimique. [22]
BChE est un modèle pour la conception et le développement de biocatalyseurs de
détoxification (Bioscavengers catalytiques contre la toxicité de la cocaïne et de l'héroïne et
OP). [24]
1.2.4. Structure
La BChE a une structure globulaire formée d’un feuillet β entouré d’hélices α. Elle appartient
à la famille des α/β hydrolases à sérine. Le résidu acide de la triade catalytique n’est pas un
résidu aspartate comme chez les protéases à sérine, mais un glutamate comme chez les
AChEs. La triade catalytique (Ser198/His438/ Glu325) est localisée au cœur de la protéine.
La sérine catalytique est accessible par une gorge assez profonde. Globalement, la structure
de la BChE ressemble à celle des AChE. La principale forme moléculaire circulante de la
BChE est un tétramère, chaque monomère possède neuf chaînes glycanes capées par des
acides sialiques
26
En raison de protéolyse partielle, une petite fraction du tétramère est coupée du coté C-
terminal, cette coupure entraine la perte des ponds disulfure et génère des tétramères instables,
des dimères et des monomères. [22, 24, 30,34.]
1. 3. Mécanisme d’action des cholinestérases

Les sérines hydrolases dont font partie les cholinestérases sont considérées comme des
enzymes relativement rapides et efficaces. Toutes les enzymes de cette famille présentent une
triade catalytique, impliquant une sérine, une histidine et un acide aspartique ou glutamique
qui, quant à lui, sera toujours trouvé dans une poche inaccessible au substrat. Le mécanisme
catalytique des sérines hydrolases, est le suivant :
- Après fixation du substrat dans le site actif, la sérine catalytique, nucléophile, attaque
son groupement carbonyle et forme un complexe nommé intermédiaire tétraédrique.
En effet des études ont été faites sur plusieurs sérines hydrolases montrent que la
sérine catalytique est toujours positionnée idéalement dans le site actif, en vue de
permettre cette attaque nucléophile. Le noyau imidazole de l’histidine catalytique, en
constante liaison hydrogène avec l’hydroxyle de la sérine catalytique, prend en charge
le proton libéré par cette dernière et forme ainsi un ion imidazolium (catalyse basique
générale). La protonation de l’histidine catalytique sera maintenue jusqu’à la
dégradation de l’intermédiaire tétraédrique.
- L’intermédiaire tétraédrique se décompose rapidement en un intermédiaire « enzyme
acylée » et un groupement partant. Dans le cas de l’AChE, c’est la portion choline
(Ch) du substrat ACh qui est libérée après acylation de la sérine catalytique. La force
d’entraînement qui mène à la formation de cet intermédiaire est le don d’un proton,
par l’histidine catalytique, au groupement partant à la choline.
- L’intermédiaire « enzyme acylée » est enfin dégradé via un processus inverse à celui
qui a mené à sa formation ; cette fois-ci, c’est une molécule d’eau, nucléophile, qui
attaquera la sérine catalytique, permettant par ailleurs la reprotonation de l’histidine
homonyme. Cet événement sera suivi par la libération du produit acétate, dans le cas
de l’AChE, ou d’un autre carboxylate, dans le cas plus général des sérines hydrolases.
Loin de suivre une cinétique de type « Michaelis-Menten », l’AChE sera tour à tour
activée puis inhibée par son propre substrat, l’ACh, selon qu’elle soit mise en présence de
faibles ou d’importantes concentrations en celui-ci, respectivement. L’activation par le
27
substrat fut initialement observée, puis caractérisée, sur une enzyme structuralement
homologue à l’AChE, la butyrylcholinestérase. L’inhibition par le substrat, quant à elle, fut
observée pour la première fois sur l’AChE. Jusqu’il y a peu, d’ailleurs, cette différence de
comportement cinétique était utilisée, de pair avec leurs spécificités de substrats respectives,
pour distinguer les deux enzymes. Cependant, il a été montré que selon les conditions
expérimentales et les substrats utilisés, l’AChE et la BChE pouvaient toutes deux être activées
et inhibées par leurs substrats, à basse et haute concentrations en ces derniers, respectivement.
[34]
2. Principaux facteurs influençant l’activité des cholinestérases

La variabilité intra individuelle de la butyrylcholinestérase plasmatique est plus
marquée que celle des AChE érythrocytaires. En dehors de toute intoxication, l’activité BChE
est soumise à de larges variations physiologiques au cours de la journée, et avec l’âge chez un
même individu. Elle diminue chez les femmes sous contraception orale et en cas de grossesse.
Elle augmente avec le poids et la taille des individus. Elle est également soumise à des
variations en cas de pathologies. Elle augmente en cas d’élévation du métabolisme de base,
d’hyperthyroïdie, d’hémolyse, syndrome néphrotique, diabète. Elle diminue dans les cas
suivants : infection, allergie, cancer, dénutrition, collagénose, infarctus du myocarde, brulures
étendues, hépatopathie , atteinte rénale sévère, épilepsie, maladie chronique débilitante et avec
certains médicaments : anesthésiques locaux à fonction ester, procaïne en particuliers ,
fluorures (endoflurane et sevoflurane) , lithium, IMAO, chlorpromazine , métoclopramide,
anti glaucomateux (l’eseridine), antimyasthénique (abénomium, néostigmine ou
pyridostigmine), traitements anticholinestérasiques de la maladie d’Alzheimer (Donepezil,
Rivastigmine ou Galantamine) ou la radiothérapie .
L’activité BChE présente aussi une importante variabilité interindividuelle. Elle est plus
élevée de 10–15 % chez l’homme que chez la femme. Dans la population occidentale 3 à 4 %
des personnes présentent une activité BChE basse d’origine génétique. Certains individus sont
même totalement dépourvus de BChE sans présenter aucun symptôme.
La variabilité intra-individuelle de l’activité AChE de base peut atteindre 10 %. La variabilité
interindividuelle peut être nettement plus importante. L’activité peut être plus élevée dans les
thalassémies (par la polyglobulie secondaire) ou en cas de réticulocytose (par augmentation
de la production de globules rouges). Elle est toutefois plus stable que celle de la BChE. Les
causes de baisse de son activité sont rares, hormis lors de leucémies et de certains autres
28
cancers, dans l’anémie de Biermer (diminution du nombre de globules rouges) ou après

traitements anti malariques. [28]
On cite les principaux facteurs influençant l’activité cholinestérasique :
2.1. L’âge et le sexe

L’âge et le sexe représentent une source potentielle de variation de l’activité
cholinestérasique.
D’après une étude réalisée sur les facteurs influant la variation biologique de l’activité totale
des cholinestérases dans le plasma dans une population de 3372 sujets en bonne santé
apparente au moins pour quatre ans :
- L’activité cholinestérasique n’est pas significativement corrélée avec l’âge chez les
hommes, tandis qu’il y a une corrélation significative avec l’âge chez les femmes ;
- Il y a une diminution significativement de l’activité cholinestérasique d'environ 14%
de 10-15 à 15-25 ans et atteignant une valeur minimale de 25 à 35 ans ;
- La maturation sexuelle affecte néanmoins l'activité des cholinestérases chez les
femelles, les valeurs de l’activité des cholinestérases est significativement plus basses
d’environ 10% chez les filles âgées de 10 à 14 ans qui avaient leur cycle menstruel
que chez les filles du même âge qui n’en avaient pas (Tableau 3);
- À l'âge adulte, entre 35 et 45 ans, il y a aucune variation substantielle des valeurs
plasmatiques des cholinestérases, mais ces valeurs sont plus élevées chez les hommes
que chez les femmes d’environ 18% ;
- Après 45 ans, les valeurs des cholinestérases augmentent chez les hommes et plus
encore chez les femmes. Cette augmentation chez les femmes semble être liée
principalement à la ménopause.
- L’activité cholinestérasique chez les femmes ménopausées est plus grande que chez
celles non ménopausées d’environ 15% pour la même classe d'âge (45 à 55 ans)
(Tableau 04). [46]
29
Tableau 03 : Influence de la puberté sur l’activité cholinestérasique (U/L) pour des filles
entre 10 et 14 ans [46]
Centiles
n 2,5 50 97,5
POST-puberté 62 3710 6114 9890
PRE-puberté 154 4385 6766 9830
Tableau 04 : Influence de la ménopause sur l’activité cholinestérasique chez des femmes

entre 45 et 55 ans [46]
Centiles
n 2,5 50 97,5
POST-ménopause 76 3890 6800 10 025
PRE-ménopause 136 3080 5854 8600
2.2. L’influence du poids corporel

L’influence du poids corporel sur l’activité des cholinestérases a été étudiée dans la même
étude que précédemment (âge et le sexe) en utilisant comme index le degré de surcharge
pondérale et le pli cutané sous-scapulaire. L'excès du poids a été calculé et exprimée en
pourcentage d’écart par rapport au poids idéal.
Dans ces conditions, l’indice de pondération et pli cutané sous-scapulaire sont en corrélation
significative avec l’activité des cholinestérases chez l’homme. En revanche, les coefficients
de corrélation n'étaient pas significatifs chez les femmes. [46]
2.3. Atteintes hépatiques

Étant donné que c’est la ChE plasmatique (BChE) qui est synthétisée par l’hépatocyte
c’est la valeur de cette dernière qui est influencée par les atteintes hépatiques.
En effet d’après une étude réalisée sur l’activité cholinestérasique plasmatique au cours des
atteintes hépatiques, l’activité de cette dernière est significativement plus basse chez les
patients présentant une atteinte hépatique et elle varie différemment selon le type de l’atteinte.
La figure 08 illustre les variations de l’activité cholinestérasique selon le type d’atteinte
hépatique. Cette étude a démontré que la BChE est plus basse chez les patients cirrhotiques.
La différence n’est significative qu’entre les patients atteints d’hépatite et les cirrhotiques.
L’activité de la BChE varie en fonction des principaux syndromes hépatiques. Elle est
30
plus basse chez les patients présentant une cholestase ou une insuffisance hépatocellulaire
(IHC), mais la différence n’est significative que chez les malades ayant une IHC par rapport à
ceux qui ne présentent pas ce syndrome (Tableau 05). [25]
Figure 08 : Variations de l’activité cholinestérasique en fonction du type de l’atteinte

hépatique [25]
Les pathologies hépatiques, tant aiguës que chroniques, sont extrêmement fréquentes.
Leur diagnostic, la recherche de leurs étiologies et le suivi des traitements nécessitent un
ensemble d’examens biologiques pour les confirmer ou les exclure, incluant notamment les
transaminases sériques, la bilirubine et les phosphatases alcalines. Cependant, certains
paramètres du bilan hépatique classique peuvent être perturbés dans des situations
pathologiques qui n’ont aucune relation avec le fonctionnement du foie. Une alternative est
représentée par la mesure de l’activité de la BChE, qui pourrait être intégrée dans le bilan
d’exploration hépatique, permettant de mieux mettre en évidence le dysfonctionnement de
l’hépatocyte et contribuer ainsi au diagnostic des atteintes du foie[25]
L’étude de corrélation entre l’activité de la BChE avec les autres paramètres
biochimiques en fonction du type d’atteinte hépatique, montre que la BChE est inversement
corrélée avec la bilirubine totale chez les cirrhotiques ou ceux atteints d’une hépatite.
Cependant, elle présente une corrélation positive significative avec l’albuminémie et la
31
protidémie. Cette corrélation est meilleure avec l’albuminémie. La comparaison de l’activité

de la BChE entre les intervalles de valeurs usuelles et de valeurs pathologiques pour les
différents paramètres biochimiques a permis de constater que l’activité de cette enzyme est
plus basse dans les zones de valeurs pathologiques des différents paramètres étudiés. [25]
Tableau 05 :Activité cholinestérasique plasmatique selon les syndromes hépatiques. [25]
2.4. Variantes génétiques

Nombreuses situations physiopathologiques peuvent affecter la synthèse ou l’activité de
la butyrylcholinestérase, mais la principale cause du déficit enzymatique en BChE est
génétique. En effets, les variabilités génétiques concernent plus la butyrylcholinestérase que
l’acétylcholinestérase. [26,27]
Les individus déficients en BChE ne présentent pas d’anomalies métaboliques ou
d’effets indésirables sinon une plus grande sensibilité à certains toxiques. En effet, la BChE
joue un rôle important dans le métabolisme de nombreuses substances à action
pharmacologique comportant une fonction ester. C’est le cas par exemple de la cocaïne, du
bambutérol (pro drogue de la terbutaline), de l’acide acétylsalicylique ou encore de la
succinylcholine ou du mivacurium (curare).Les individus dépourvus de BChE ou porteurs de
variantes de l’enzyme aux propriétés catalytiques altérées sont exposés à des effets de
surdosage car ils éliminent beaucoup moins rapidement ces composés toxiques. [27]
La succinylcholine est un curare de courte durée d’action dont la dégradation dépend de
son hydrolyse rapide par la butyrylcholinestérase. Ainsi, un déficit en butyrylcholinestérase,
congénital ou acquis, est à l’origine d’un bloc neuromusculaire prolongé.
Chez un individu avec une concentration et une fonction normale de la butyrylcholinestérase,
90–95% de la succinylcholine intraveineuse administrée est hydrolysée et inactivée avant
qu’elle n’atteigne la jonction neuromusculaire (plaque motrice). Le reste de la succinylcholine
agit sur les récepteurs de l’acétylcholine localisés sur le côté post synaptique de la jonction et
crée ainsi une dépolarisation prolongée de la musculature squelettique. [26]
La paralysie flasque induite se développe dans la 1ère minute. Chez une personne sans
déficit en cholinestérase plasmatique, la curarisation disparaît après environ 5 minutes après
32
l’injection du succinylcholine. Cependant chez les patients déficients en cholinestérase, la

concentration résiduelle d’acétylcholine dans la plaque motrice mène à une paralysie qui peut
durer jusqu’à 8 heures.
L’origine d’un déficit en pseudo cholinestérase peut être acquise ou héréditaire. Il est
important d’en déterminer l’étiologie dans la perspective d’une intervention ultérieure sous
anesthésie générale avec utilisation de succinylcholine. [24,26]
Parmi les cas héréditaires, la forme atypique (A) ou résistante à la dibucaïne, typiquement
autosomique récessive et associée au gène butyrylcholinestérase, est localisée sur le bras long
du chromosome 3. Quant aux formes variantes, il en existe environ 65. Les formes les plus
étudiées sont la résistance au fluor (ou forme «F»), la forme silencieuse (ou «S») et la forme
Kallow ou «K». (Tableau 06) [28]
Tableau 06 : Les principales variantes génétiques de déficit en pseudo cholinestérase [29]
Pour retenir un diagnostic, les symptômes cliniques doivent être confirmés par des
examens cliniques appropriés tels que la neurostimulation par TOF (Train of Four), des
examens biologiques et génétiques.
Le «train de quatre» (Train of Four en anglais) est une technique de monitorage
neuromusculaire préopératoire de la curarisation qui consiste à appliquer une succession de
quatre stimulations électriques supra maximales de 2 Hz sur un nerf périphérique, puis
apprécier la réponse du muscle ou du groupe musculaire correspondant. En général, le muscle
choisi pour l’enregistrement est l’adducteur de pouce. Le nombre d’abductions reflète le
niveau de paralysie (Tableau 07). [29]
33
Tableau 07 : Taux de blocage selon le nombre d’adductions au TOF. [29]
L’analyse par PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’identifier la localisation de la

mutation au niveau de l’ADN et ainsi de définir la forme.(Figure 09)
Figure 09 : Séquençage de Sanger du gène BCHE : électrophorogrammes révélant la

présence (A) de la mutation (c 293A>G, p.Asp70Gly, rs1799807, ou variant atypique) et (B)
(c.435de linsAG, p.Phe118Valfs*12, rs398124632, ou variant Sil-1). [28]
34
Il existe plusieurs recommandations pour la prise en charge d’un patient avec paralysie
prolongée après administration de succinylcholine. La plus importante est la ventilation
mécanique jusqu’à ce que les muscles respiratoires reprennent spontanément leur fonction.
La transfusion prophylactique de plasma frais congelé (PFC) qui augmente l’activité
cholinestérase plasmatique endogène n’est pas recommandée en raison des risques éventuels
d’infections. L’administration d’inhibiteurs des cholinestérases (par ex. néostigmine) pour
reverser l’apnée liée à la succinylcholine est controversée car l’effet peut être transitoire et
potentiellement suivi d’un blocage intensif neuromusculaire. Concernant le pronostic,
différentes observations cliniques ont montré une excellente récupération après une
ventilation artificielle.
En résumé un réveil prolongé pathologique suite à une curarisation doit faire suspecter
un déficit en pseudo cholinestérase. Le bilan complet comprend un examen clinique,
notamment le TOF (Train of Four), des examens biologiques et des tests génétiques. Sur le
plan de la prise en charge, le patient doit être ventilé mécaniquement avec surveillance aux
soins intensifs jusqu’à la reprise d’une ventilation spontanée. La communication du diagnostic
au patient ainsi qu’au médecin traitant est primordial afin d’éviter un problème d’extubation
lors d’une prochaine anesthésie générale. [29]
2.5. Grossesse et prise de contraceptifs oraux

• Grossesse
Les effets de la grossesse sur les composantes protéiques du sérum sanguin sont
complexes et non facilement compris. Certaines protéines sont connues pour l’augmentation
de leur concentration tout au long de la gestation en réponse aux changements dans le
métabolisme de l’œstrogène, d’autres protéines comme l’albumine voient leur concentration
diminuer. La cholinestérase plasmatique est également influencée par la grossesse mais il
n’existe pas d’accord général sur les changements intervenus.
Une étude témoigne, qu'une baisse significative de la concentration de la cholinestérase
sérique survient chez les femmes enceintes. La chute semble commencer après la 10ème
semaine de grossesse.
Les raisons possibles de cette chute sont difficiles à évaluer. Les uns suggèrent
que ces changements sont principalement dus à l’hémodilution. D’autres considèrent que cette
hémodilution n’explique pas entièrement cette diminution s’appuyant d’une part sur des
études qui ont montré, qu’il y avait peu ou pas de changement de volume sanguin avant la
35
10ème semaines et d’autre part sur le fait que même avec des valeurs normales de
l’hématocrite, l'activité moyenne des cholinestérases est diminuée. [43,44]
• Prise de contraceptifs oraux

D’après une étude sur les facteurs influençant la variation biologique de l’activité
cholinestérasique totale dans une population de 3372 personnes, l’utilisation des contraceptifs
oraux contenant des œstrogènes entraîne une diminution significative de l’activité
cholinestérasique (Tableau 08).[46]
Tableau 08 : L’effet des contarceptifs oraux sur l’activité choliestérasique .[46]

Centiles
N 2,5 50 97,5
Femmes sous contraceptifs oraux 202 2905 5060 6998
Femmes non sous contraceptifs oraux 481 3401 5667 8597
2.6. Inhibiteurs pharmaceutiques

A l’heure actuelle, un bon nombre d’inhibiteurs de l’AChE sont mis en évidence pouvant être
classés selon leur origine comme suite :
• Origine naturelle ex : - Les alcaloïdes : Galantamine, Physostigmine, Huperzine A
- Les flavonoïdes
• Origine Hémi synthétique ex : Miotine
• Origine synthétique ex : Donepezil, Rivastigmine, Tacrine
L’administration de certains médicaments est également associée à la modification de
l’activité cholinestérasique (Tableau 09). [21]
36
Tableau 09 : Liste de certains médicaments influençant l’activité cholinestérasique [21]
Liste des médicaments influençant l’activité cholinestérasique

Bambutérol (β-agoniste de longue durée d’action)
La chlorpromazine (antagoniste des récepteurs dopaminergiques D2 et
sérotoninergiques 5HT2A)
Le cyclophosphamide
L’esmolol (β-bloquant cardioséléctif) ;
Les gouttes oculaires contenant de l’echothiophate (inhibiteur irréversible de
l’acétylcholinestérase utilisé dans le traitement du glaucome),
Les glucocorticoïdes
L’hexafluorenium (antagoniste des récepteurs nicotiniques)
Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase
Les inhibiteurs de la monoamine oxydase tels que la phénelzine
Le métoclopramide,
Le pancuronium (curare non dépolarisant)
Les pilules contraceptives
La tétrahydroaminacrine (inhibiteur de la cholinestérase utilisé dans la maladie
d’Alzheimer).
2.7. Les pesticides

L’utilisation des produits phytosanitaires s'est considérablement accrue depuis la fin de
la seconde guerre mondiale du fait du développement de l'industrie chimique et de la nécessité
d'augmenter les rendements agricoles.
Cependant les insecticides sont des biocides destinés à détruire les insectes : largement utilisés
en agriculture et en santé communautaire (lutte anti vectorielle), ils sont également présents
dans l’environnement domestique sous forme de spécialités contre les poux, de médicaments
vétérinaires, d’insecticides ménagers, de produits de jardinage ou encore de xyloprotecteurs.
Les insecticides sont – et de loin – la famille de produits phytosanitaires la plus souvent
responsable d’effets sur la santé. Ce sont en effet des substances puissamment toxiques pour
le système nerveux, central et/ou périphérique : inhibition des cholinestérases pour les
organophosphorés et les carbamates, action sur le canal sodique pour les pyréthrinoïdes de
synthèse, interaction avec le récepteur de l’acide gamma aminobutyrique (GABA) pour le
fipronil, blocage des récepteurs nicotiniques pour l’imidaclopride. Leur neurotoxicité explique
à la fois leur efficacité sur les insectes et leurs effets toxiques chez l’homme.
Des évolutions réglementaires sont à l’origine du retrait de nombreuses substances actives,
notamment organophosphorées et carbamates. Classe bénéficiant du meilleur rapport
efficacité/toxicité, les pyréthrinoïdes sont les insecticides actuellement le plus souvent
37
employés dans les formulations à usage agricole et vétérinaire, mais aussi dans les
préparations à usage domestique.
L'activité cholinestérasique, un des biomarqueurs d'effets, est de plus en plus utilisée

dans les études épidémiologiques pour l'évaluation du risque lié à l'exposition aux insecticides
organophosphorés et carbamates. Elle constitue un indicateur fiable et sensible d’exposition
[32,37]
38
CHAPITRE III :
ACTION DES ORGANOPHOSPHORÉS
ET CARBAMATES SUR L’ACTIVITÉ
CHOLINESTÉRASIQUE
PARTIE THÉORIQUE CHAPITRE III : ACTION DES
ORGANOPHOSPHORÉS ET CARBAMATES
SUR L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE
1. Les organophosphorés
Les OP constituent une grande classe de substances chimiques organiques avec plus de 50
000 congénères. En 2007 il y avait plus d’une centaine d’OP vendus sur le marché sous forme
de milliers de produits différents dans le monde. Quoiqu’on leur connaisse de multiples
usages : insecticides, rodenticides, nématocides, herbicides, gaz de guerre, traitement de la
myasthénie gravis et du glaucome chez l’humain, additifs dans certains produits de plastique
et de pétrole, aujourd’hui, ces produits sont principalement utilisés comme insecticides sur les
plantes, et contre les poux, les mites et la malaria chez les animaux et l’humain.[67]
1.1. Structure
Ce sont des esters et amides d’acides (thio) phosphorique ou (thio) phosphonique
constitués d’un atome de phosphore pentavalent, lie à quatre substituants : un atome
d'oxygène ou de soufre via une double liaison, un groupe partant (X), un groupement alkoxyle
(O-R1) et un autre groupement (R2), selon la structure générale suivante :
Figure 10 : Structure chimique générale des composés organophosphorés. [62]
1.2. Relation structure-activité

• Le mécanisme d’action diffère selon que le Y est un oxygène (O) ou un soufre (S),
plus rarement un azote (N) ou un carbone (C), il est soit direct soit indirect. D’une
façon générale, les OP possédant la fonction P-O sont des inhibiteurs directs et rapides
des enzymes. Les OP contenant la fonction P-S sont des inhibiteurs indirects qui sont
métabolisés en leur composé actif P-O comme le parathion (Figure : 11) qui se
transforme en paraxon, son métabolite actif; ces produits sont caractérisés par une
forte liposolubilité et une grande affinité aux tissus, en particulier au niveau du
39
système nerveux central. Ces caractéristiques sont à l’origine d’une inactivation

prolongée de l’enzyme et par conséquent d’intoxications graves et surtout de
complications neurologiques sévères en rapport avec l’anoxie cérébrale, rencontrées
surtout avec le parathion et le dichlorvos. [69]
• Une toxicité différente est également observée selon le X, on distingue 4 classes

détaillées dans le tableau suivant.
Tableau 10: Toxicité des OP selon le X [69]

Groupe X= Caractéristiques et Exemple
I Ammonium Puissant pouvoir toxique et ne sont pas utilisés en
quaternaire agriculture (Ecothioline)
II F (Fluor) Aussi toxiques que classe I + une forte tension de
vapeur => ce qui explique leur utilisation comme gaz
de combat : ex : sarin
Le diméthoate, fenthion utilisés en agriculture =>
responsable de la majorité des décès
III OCN, CN, SCN Toxicité intermédiaire entre les classes II et IV.
ou halogène autre Certains utilisés comme gaz de combat (tabun)
que F
IV Autres Regroupent la plupart des produits utilisés en
substituants agriculture (Parathion, ..)
• Ils peuvent être également classés selon que le X est une chaine aliphatique
(hautement toxiques et peu stables), un groupement aromatiques (plus stables avec une
meilleure rémanence) ou un groupement hétérocycliques. [66]
1.3 .Classification
Parmi ces composés Organophosphorés, on retrouve différentes classes, les pesticides,
les neurotoxiques de guerre et les médicaments :
40
1.3.1. Les pesticides organophosphorés

En 1854, le chimiste français P. de Clermont décrit, pour la première fois, la synthèse
du tetraethyl-pyrophosphate (TEPP), qui deviendra, en 1944, le premier pesticide
organophosphoré commercialisé en Allemagne.
Les progrès des pratiques agricoles et des connaissances scientifiques amènent à la
découverte du parathion, par le chimiste allemand G.Schrader, également en 1944. Du fait de
sa forte toxicité tant pour les animaux que pour les insectes, de nombreux autres pesticides,
moins toxiques, verront le jour à partir des années 50. Dans les années 1970, l'interdiction de
l'utilisation des pesticides organochlorés à favoriser la diffusion des organophosphorés, plus
efficaces mais moins persistants. [37, 41,62].
Employés essentiellement comme insecticides ou acaricides, leur forte toxicité à
entrainer leur substitution par les carbamates et les pyréthrinoïdes. Selon la classification
publiée en 2010 par l'Organisation Mondiale de la Sante (OMS), presque la moitie des
pesticides appartenant aux deux classes les plus dangereuses (Ia et Ib) sont des
organophosphorés (Tableau 11)
Tableau 11:Classification recommandée par l’OMS des pesticides en fonction de leur

dangerosité, le nombre et des exemples qui leur sont associés [64]
Selon le règlement CE 1107/2009 du Parlement Européen et du Conseil du 21 octobre

2009 concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques, 9 pesticides
organophosphorés restent autorisés par l'Union Européenne dont le fenamiphos (classe Ia) et
l'ethoprophos (classe Ib).
41
Malgré la réglementation prise par certains pays, les intoxications, accidentelles ou

volontaires, sont fréquentes, particulièrement en Asie, avec une fréquence approchant les 3
millions d’intoxications par an dans le monde entier et une mortalité de l’ordre de
200 000 personnes par an. [62]
1.3.2. Les neurotoxiques de guerre

Issus de la recherche sur les insecticides, c’est dans la deuxième moitié des années 30
que les chimistes allemands ont mis au point la synthèse du tabun ou GA (1936), suivi du
sarin ou GB (1937) puis du soman ou GD (1944). Aux agents G pour ≪German≫ à suivi la
synthèse du VX par les Britanniques en 1953 à partir d’un insecticide, le Tetram.
Aujourd’hui, la Convention sur l’Interdiction des Armes Chimiques(OPWC),signée le
13 Janvier 1993, vise à interdire la mise au point, la fabrication, le stockage et l'usage des
armes chimiques et à détruire les stocks existants. Selon l’Organisation d’Interdiction des
Armes Chimiques, sur 195 Etats, 190 l’ont signée mais 5 ne l’ont pas encore ratifiée. Seuls
l’Angola, la Corée du Nord, l’Egypte, la Somalie et la Syrie demeurent en dehors de la
Convention. [62]
Le tableau ci-dessous les principaux agents neurotoxique organophosphorés
42
Tableau 12:Dénomination, structure et létalité des principaux neurotoxiques

organophosphorés. La DL50 (Dose Létale 50 %) estime la dose entraînant 50 % de décès
après intoxication percutanée chez l’Homme. La LCt50 estime la létalité après intoxication
par inhalation chez l’Homme, en fonction du temps. (n.c: non communiqué) [62]
1.3.3. Les médicaments

Des médicaments organophosphorés sont utilisés pour le traitement du glaucome et de la
maladie d’Alzheimer :
- L’echothiophate (Iodure de Phospholine ®) et le diisopropylfluorophosphate ou
DFP (Fluostigmine ®) utilisé dans le traitement du glaucome ;
- Métrifonate, initialement employé comme antihelminthique, et qui apparaissait comme
un candidat intéressant des études de phase I et de phase II avait été réalisée en vue d’obtenir
l’autorisation de mise sur le marché du metrifonate comme traitement de la maladie
d’Alzheimer. Néanmoins, des dysfonctionnements neuromusculaires et des paralysies
respiratoires ont été constatés sur des patients lors des essais cliniques. La compagnie
43
pharmaceutique Bayer à retiré sa demande d’AMM et le développement du métrifonate

comme traitement de la maladie d’Alzheimer a été arrêté.
Comme tous les composés organophosphorés, les médicaments organophosphorés agissent

en tant qu’inhibiteurs irréversibles de l’acétylcholinestérase cette irréversibilité entraine des
effets secondaires plus ou moins incommodants. [62]
1.4. Propriétés physico-chimiques

Il apparaît que les organophosphorés présentent des caractéristiques physico-chimiques dans
l’ensemble assez proches, avec quelques spécificités :
- De masses moléculaires élevée (220 à 368 g/mol), ils sont plus ou moins stables selon
la nature du groupe X et de la présence d’un atome de soufre : aromatiques et
composés sulfurés sont plus rémanents.
- Leur grande solubilité dans l’eau induit l’hypothèse de leur présence dans ce milieu,
d’autant plus que la rémanence globalement faible des organophosphorés oblige à
plusieurs applications, dont la majeure part n’atteint même pas la plante.
- Le coefficient de sorption au carbone organique est peu élevé, ce qui traduit une faible
affinité pour les sols riche en matière organique, et une faible rémanence dans les sols
(35 jours pour le chlorpyrifos, selon les conditions plus ou moins aérobiques .
- Leur pression de vapeur est relativement faible, ce qui implique une faible volatilité ;
le chlorpyriphos, le dichlorvos et le fenthion sont toutefois à considérer au vu des
résultats plus élevés. Cette volatilité fait prendre en compte le milieu aérien comme
milieu possible d’exposition.
- Enfin, les organophosphorés sont très lipophiles, plus ou moins selon les substances.
Cette caractéristique en fait une source de contamination des organismes vivants, par
accumulation dans les graisses. Certains composés en particulier peuvent être stockés
en partie dans les graisses, c’est le cas du diazinon, du fénitrothion et du parathion.
- Le milieu alimentaire est un milieu probable d’exposition de la population générale.
[66]
44
1.5. Usages
En 1996, la consommation européenne était estimée à 5000 tonnes/an, dont 1200
tonnes/an en France. Aujourd’hui, les OP sont beaucoup moins utilisés qu’auparavant avec
des usages très restreints, en particulier en ce qui concerne les usages agricoles.
Au niveau mondial, on leur connaisse de multiples usages :
- Insecticides, rodenticides, nématocides, herbicides ;
- Traitement direct sur l’humain (cas des glaucomes) ;
- Additifs dans certains produits de plastique et de pétrole ;
- Les OP sont principalement utilisées aujourd’hui comme insecticides sur les plantes,
les animaux et les humains (contre les poux, les mites et la malaria dans les pays de
forte endémie) ;
- Ils sont utilisés en agriculture, horticulture et entretien paysager, autant dans le milieu
industriel que dans le milieu domestique ;
- Le milieu industriel se prête essentiellement à la désinsectisation des surfaces
agricoles, en traitement de sol et de parties aériennes des végétaux, ainsi que des
locaux agricoles ;
- En milieu domestique, les OP se retrouvent principalement dans les jardins personnels,
en traitement de la maison, et dans les colliers antipuces et tiques des animaux
domestiques. [66]
1.6. Sources d’expositions

1.6.1. Exposition environnementale
Il existe une exposition de la population générale aux OP, essentiellement par le biais
des résidus alimentaires : les teneurs maximales en résidus sont fixées réglementairement, par
composé et par type de culture. Il n’y a pas indication que cette exposition ait un
retentissement sanitaire. La désinsectisation des locaux représente également une source
potentielle de contamination. [37]
1.6.2. Exposition professionnelle

Les intoxications accidentelles survenant lors de la synthèse des OP sont
exceptionnelles. Car leur synthèse se fait en milieu clos avec des personnels protégés.
Cependant le conditionnement, le stockage, le transport peuvent être à l'origine de
45
contaminations accidentelles, par voie cutanée, digestive ou respiratoire. La contamination par

voie transcutanée semble être la plus répandue, le risque toxique potentiel par inhalation étant
moins important que par voie transdermique. La dilution avec des solvants et des émulsifiants
réduit la pression de vapeur et minimise le risque inhalatoire, mais en revanche facilite
l'absorption cutanée. Les employés manipulant des OP nécessitent une surveillance médicale,
une éducation sanitaire spécifique et une surveillance régulière de leur taux de cholinestérases
sériques. Il existerait en effet une baisse significative de l'activité cholinesterasique
plasmatique, indicateur d'exposition plus sensible que l'activité cholinesterasique intra-
érythrocytaire, chez les sujets ainsi exposés. [39]
1.6.3. Exposition domestique

La population générale est exposée de façon accidentelle durant l'utilisation domestique
ou le jardinage que ce soit par inhalation ou par voie percutanée. Ces accidents surviennent
essentiellement de juin à septembre période durant laquelle les conditions climatiques
représentent un facteur favorisant par la sudation, facteur de pénétration cutanée et par le
manque de protection en raison de la chaleur. L'ingestion accidentelle est plus rare, on la
rencontre essentiellement chez les enfants. En revanche, l'incidence des intoxications
volontaires par ingestion n'est pas négligeable, en particulier dans les pays en voie de
développement. L'épandage est un mode d'intoxication fréquent, les particules aéroportées
après épandage étant retrouvées à plus de 1 à 2 km du lieu de l'épandage. [39]
1.6.4. Exposition militaire

Les agents G, aisément entraînés par le vent et détruits sans difficulté par hydrolyse,
sont des toxiques non persistants. Les agents V ont une faible volatilité et une plus grande
résistance à l'hydrolyse, ce qui en fait des toxiques persistants. La contamination du sol, de la
végétation et du matériel crée un danger de contact qui peut persister à long terme [39].
1.7. Toxicocinétique
a. Absorption
Dépend de plusieurs facteurs : type de formulation, technique de préparation, modalités
d’application. La pénétration dans l’organisme des OP est possible par toutes les voies :
digestive, respiratoire, conjonctivale et percutanée. En milieu professionnel, la peau
représente la voie de contamination prédominante : plus que les mains ou les avant-bras, la
46
tête, le cou et les plis représentent les sites privilégiés d’absorption. Chez le volontaire sain, la
pénétration percutanée apparaît relativement modeste : 6 % de la quantité déposée sur les
téguments dans le cas du malathion, 4,3 % pour le chlorpyriphos, 3 à 4 % seulement dans le
cas du diazinon. En situation de travail, l’absorption transcutanée est vraisemblablement bien
supérieure, favorisée par la sudation, d’éventuelles excoriations de la peau, ainsi que par les
solvants organiques et les adjuvants huileux des formulations liquides. La voie respiratoire ne
concerne que les dérivés volatils, le dichlorvos surtout, plus accessoirement le chlorpyriphos
et le pyrimiphos-méthyl ; elle n’est pas quantifiée. L’absorption par voie orale est rapide et
importante, portant sur 70 à 100 % de la dose ingérée. [35,37]
b. Distribution
Les OP se distribuent dans tous les tissus ; ils traversent facilement la barrière hémato
méningée. Les composés les plus liposolubles comme le Diazinon, le Fénitrothion ou le
Parathion font l’objet d’un stockage dans les graisses, à l’origine de phénomènes de
redistribution expliquant des symptômes retardés et des évolutions prolongées. [37]
c. Métabolisme
Les thiophosphates (-P = S) doivent subir une activation métabolique par les
cytochromes P-450 hépatiques en oxons (-P = O) pour devenir anticholinestérasiques : ainsi,
le chlorpyriphos est biotransformé en Chlorpyrifosoxon, le malathion en Malaoxon, le
parathion en Paraoxon(Figure11), la Phosalone en Oxophosalone. Molécules-mères et
métabolites actifs sont ensuite rapidement hydrolysés, avec formation d’alkylphosphates et de
divers dérivés hydrosolubles qui sont conjugués (acide glucuronique, sulfate, glycine) [37,40]
47
Figure 11:Voies de bio-transformation du Parathion. [40]
d. Elimination
Les dérivées hydrosolubles sont éliminés dans les urines, et, à un moindre degré, dans
les selles : p-nitrocrésol pour le fénitrothion, p-nitrophénol pour le parathion, etc. Il n’y a pas
d’accumulation significative : pour la majorité des composés, plus de 80 % de la dose
absorbée est éliminé dans les 48 heures, du moins lors d’expositions faibles ou modérées.
Certains composés ont cependant une demi-vie un peu plus longue : c’est le cas du
chlorpyriphos, pour lequel la T1/2 est de 41 heures. Lors d’une ingestion massive, au
contraire, les métabolites peuvent être détectés dans les urines pendant plusieurs semaines,
vraisemblablement du fait d’un relargage de l’OP à partir du tissu adipeux. [37,40]
1.8. Mécanisme d'action toxique

Les OP sont des toxiques létaux, à action systémique prédominante, dont le mécanisme
principal est de bloquer la dégradation de l’acétylcholine (ACH) au niveau de la synapse
cholinergique par inhibition irréversible des cholinestérases (en se liant à leur site
esterasique). L’enzyme, ne pouvant plus être hydrolysée, subit alors un phénomène de
« vieillissement » (Figure 15) et devient non fonctionnelle et non réactivable après 24 à 48h.
48
Cette inhibition provoque l’accumulation du neurotransmetteur acétylcholine au niveau de la

synapse, provoquant une sur-stimulation cholinergique et ainsi une paralysie du système
nerveux entraînant la mort. Une fois l’enzyme a subit le phénomène de vieillissement, seule la
synthèse de nouvelles cholinestérases peut permettre le retour à une activité fonctionnelle
normale. Cependant, l’enzyme peut être réactivée par l’action d’oximes (dont le methylsulfate
de pralidoxime) avant que la liaison ne soit définitive et ainsi contrebalançant le phénomène
de vieillissement. [39,41, 45]
a. Activation
Après absorption, de nombreux OP doivent être activés par des oxydases, des
hydrolases et des transférases au niveau hépatique avant d'être toxiques pour l'homme, la
connaissance de ces mécanismes permettant de déterminer le délai d'apparition des
manifestations toxiques. Par exemple, les phosphorothioates sont sans effet avant d'être
activés en phosphrodithioates par oxydation de leur liaison P= S, et leurs effets cliniques
seront toujours d'apparition plus tardive que les phosphates qui ont toujours une liaison P= O.
[39]
b. Action sur la synapse cholinergique : inhibition des cholinestérases

Les OP, très lipophiles, franchissent aisément toutes les barrières biologiques et se
fixent de façon covalente aux cholinestérases que ce soient les acétylcholinestérases du
système nerveux central, des muscles et des globules rouges ou les pseudos cholinestérases
plasmatiques. Même si une faible quantité franchit la barrière hémato encéphalique, elle suffit
pour inhiber en quelques secondes pratiquement toute l'activité cholinesterasique.
Il s'agit d'une véritable lésion biochimique puisque les OP viennent occuper le site estérasique
de l'enzyme en la phosphorylant, s'opposant ainsi à l'hydrolyse physiologique de
l'acétylcholine en choline et en acide acétique. Soixante-quinze grammes d'acétylcholine sont
normalement hydrolysables en une heure par 1 mg d'enzyme. La déphosphorylation de
l'enzyme inhibée par l'OP est très lente et varie selon la structure de l’OP, mais peut être
accélérée par un réactivateur des cholinestérases (oxime) qui fait partie du traitement actuel de
l'intoxication.
Dans un deuxième temps, la phosphorylation devient irréversible par désalkylation, c'est
le phénomène vieillissement de l'enzyme(Aging) qui d'une part n'est plus fonctionnelle et qui
d'autre part, n'est pas réactivable. Dans ce cas, c'est la synthèse de nouvelles cholinestérases
49
qui permettra le retour à une activité fonctionnelle normale. Cette difficulté, voire
impossibilité de réactivation des cholinestérases différencie les intoxications par OP de celles
par les carbamates au cours desquelles les cholinestérases sont spontanément et rapidement
réactivées. Dans certains cas, le blocage va concerner le site anionique de l'enzyme ou
l'ensemble de la structure quaternaire par blocage simultané des deux sites comme c'est le cas
pour les agents V.
Dans le cas du Soman, la déphosphorylation par les oximes du site estérasique est
incomplète et ne concerne que le groupement alcoyle du toxique, le groupement phosphoré
restant fixé à l'enzyme. Aucune oxime conventionnelle ne s'avérant efficace pour le Soman,
une équipe de Fribourg a synthétisé d'autres oximes dont l'efficacité in vitro ne s'est
malheureusement pas confirmée sur le muscle humain. La prémédication par le méthylsulfate
de pyridostigmine, parasympathicomimétique inhibiteur réversible des cholinestérases
n'entraînant pas d'altération de l'enzyme, les rend inaccessibles aux NOP. Cette prémédication
est donc une sauvegarde de l'intégrité structurale de l'enzyme qui, ainsi, ne peut plus être
définitivement détériorée par des NOP comme le Soman ou le VX. [39]
A l’état normal
Figure 12 :L’hydrolyse de l’acétylcholine à l’état normal. L’azote chargé positivement dans

la molécule d’acétylcholine est attiré vers le site anionique de l’acétylcholinestérase, et
l’hydrolyse est catalysée au site estérasique pour former de la choline et de l’acide acétique.
[40]
50
En cas d’intoxication par les pesticides organophosphorés
Figure 13: Fixation d’un OP sur l’acétylcholinestérase. L’inhibiteur des cholinestérases (OP)
se fixe sur le groupe hydroxyle de la sérine de l’acétylcholinestérase. Cela empêche
l’acétylcholine d’interagir avec l’enzyme cholinestérase et par conséquent d’être dégradée.
[40]
Figure 14 : Le blocage des cholinestérases par les OP. La cholinestérase est bloqué, mais elle
peut : S’hydrolyser et retourner à l’état d’origine (processus lent). Se régénérer en présence
d’une oxime (rapide). Demeure impossible de régénérer (phénomène d'”Aging” Figure 13).
[40]
51
Figure 15 : Phénomène d’Aging. Après addition d’une molécule d’eau à la liaison P-R3. Le
groupe R2 éloigne les électrons de “P”. Lors de son élimination au cours du
processus d’Aging, ces électrons sont partagés avec “O” – Serine, renforçant sa liaison, de
sorte qu’il ne peut plus être hydrolysé. [40]
c. Mécanismes d’action associés

• Effets sur d'autres systèmes enzymatiques
Certains OP peuvent phosphoryler une protéine du système nerveux central, la
Neuropathy Target Esterase (NTE) encore dénommée estérase neurotoxique en raison de ses
propriétés neurotoxiques. Cette enzyme se retrouve également dans les leucocytes et les
plaquettes. [39]
• Atteinte cérébrale et NOP
Il semble que les mécanismes d'action des NOP sur le système nerveux central ne se
limitent pas à l'inhibition de l'acétylcholinestérase centrale. En effet, celle-ci n'est corrélée à
l'apparition des différents symptômes que de façon très imparfaite, en particulier en ce qui
concerne les convulsions et les lésions cérébrales qui les accompagnent (oedème cellulaire,
nécrose neuronale). D'autres systèmes de neurotransmission semblent donc être impliqués
dans la genèse des convulsions entraînées par les NOP.
Au niveau du système GABAergique, il existe probablement un déséquilibre entre les
systèmes excitateurs (acétylcholine, glutamate) et les systèmes inhibiteurs du GABA, ce qui
52
explique le déclenchement des crises convulsives, la transmission GABAergique elle-même

ne semblant pas altérée.
Au niveau des acides aminés excitateurs, il semble que la libération excitotoxique de
glutamate par le Soman au niveau des récepteurs canaux de type quisqualate-kainate (QA-
KA) et N méthyl-D-aspartate (NMDA) soit la cause du développement et surtout du maintien
des crises généralisées, ainsi que de l'apparition des lésions cérébrales post convulsives, par
analogie aux lésions d'ischémie ou d'anoxie cérébrale.
L'efficacité anticonvulsivante dans l'intoxication aux NOP de substances inhibitrices
compétitives du récepteur canal NMDA, comme la phencyclidine, semble confirmer cette
hypothèse et ouvre la voie à de nouvelles modalités thérapeutiques [39].
1.9. Symptomatologie
1.9.1. Intoxication aiguë
Les dérivés à fonction ammonium quaternaire pénètrent peu dans les cellules ;
les signes neurologiques sont moins marqués. Les dérivés amines tertiaires sont liposolubles
pénètrent très facilement dans le SNC. La gravité de l’intoxication dépend non seulement
du degré d’inhibition de l’enzyme mais également de la vitesse à laquelle elle est inhibée. La
mort survient par : Insuffisance respiratoire, insuffisance circulatoire (hypoxie, irrégularité du
rythme cardiaque), paralysie de la plaque motrice, et dépression centrale [37,45]
a. Syndrome classique ou la crise cholinergique

Comme évoqué ci-dessus, les OP ne constituent pas une classe homogène de par leurs
propriétés physiques, chimiques et toxicologiques. Malgré cela, les intoxications aiguës aux
OP provoquent un tableau clinique similaire, évoluant classiquement en plusieurs phases et
dominé en premier lieu par la crise cholinergique, au cours de laquelle peut survenir à tout
moment le décès de la victime.
Elle correspond à une véritable intoxication à l’ACH (neuromédiateur excitateur), qui
va, en l’absence d’hydrolyse, aller sur-stimuler le système nerveux autonome (SNA) (par ses
récepteurs nicotiniques et muscariniques), les jonctions neuromusculaires et enfin le système
nerveux central (SNC) par leurs récepteurs nicotiniques. [45]
Les effets sont résumés dans le tableau 13.
53
Tableau 13: Les effets de l’inhibition de l’acétylcholinestérase. [37]
b. Syndrome intermédiaire
En raison du caractère très lipophile de certains organophosphorés les manifestations
cliniques peuvent resurgir après plusieurs jours et ce malgré une évolution initiale favorable,
voire une guérison apparente. Elle apparaît en général 1 à 4 jours après l’intoxication alors
que les symptômes cholinergiques ont disparu. Il se traduit par une atteinte des muscles
proximaux des membres fléchisseurs du cou et de certaines paires crâniennes. Il ne réagit ni à
l’atropine, ni aux oximes, mais régresse spontanément en 4 à 18 jours. [39,45]
c. Les neuropathies retardées

Des neuropathies d'apparition retardée par démyélinisation des nerfs périphériques, peuvent
être à l'origine d'une détresse respiratoire retardée ou d'un retard de sevrage ventilatoire. Elles
surviennent 1 à 5 semaines après une intoxication. De type sensitivomotrices, elles vont se
traduire par des paresthésies et une diminution de la force musculaire progressant de façon
ascendante. Leur résolution est très lente, parfois incomplète. Elles doivent être distinguées
des polyradiculonévrites type Guillain-Barré de symptomatologie proche. [39]
54
1.9.2. Intoxication chronique

- L’exposition répétée à certains
esters OP peut avoir un effet cumulatif : chaque exposition entraîne une augmentation
du degré d’inhibition d’ACHE du SN ; quand elle atteint un certain degré, des
symptômes similaires à ceux de l’intoxication aiguë apparaissent.
- Cancérogenèse : la plupart des études expérimentales sont négatives, quelques dérivés
comme le dichlorvos ont donné des résultats positifs (Groupe 2B depuis 1991),
Malathion (2A) en 2015.
- Reproduction : Il n’y a pas de données chez l’Homme. In vivo : certains composés

possèdent une toxicité testiculaire avec altération de la spermatogenèse. L’intoxication
maternelle aiguë s’accompagne d’une intoxication fœtale. [40]
1.10. Diagnostic
La confirmation analytique de l’intoxication repose sur le dosage de l’activité
cholinesterasique.
Le dosage de la BChE est réalisé en première intention (Indicateur le plus sensible) le
taux normal dépend de la méthode enzymatique utilisée par le laboratoire ; il est soumis à de
larges variations selon l’âge, le sexe, le poids et la taille, et surtout le phénotype.
En effet, 3 à 4 % de la population occidentale présente une activité BChE basse : ces sujets
n’en sont pas pour autant plus sensibles aux effets toxiques des OP ; ils sont en revanche
exposés à un risque d’apnée prolongée par paralysie respiratoire en cas de curarisation par le
suxaméthonium et le mivacurium, normalement hydrolysés par la BChE . La grossesse, la
prise de contraceptifs oraux, ainsi que certaines pathologies (insuffisance hépatocellulaire,
collagénoses, infections chroniques, etc.) sont également susceptibles de diminuer l’activité
de la BChE. Synthétisée au niveau du foie, la BChE est régénérée, en 3 à 4 semaines environ.
Le taux à l’admission n’a aucune valeur pronostique : sa corrélation avec les signes
cliniques, avec la durée de la ventilation assistée ou encore avec les doses d’atropine qui
seront nécessaires est médiocre. En revanche, le dosage est utile pour le suivi de
l’intoxication.
Le dosage de l’AChE permet de confirmer celui de la BChE, étant plus spécifique et
présente un meilleur reflet du degré d’inhibition de l’AChE du système nerveux. Le taux
normal est fonction de la technique utilisée. Le dosage de l’AChE globulaire n’a pas d’intérêt
55
pour le suivi de l’intoxication : sa régénération est lente, au rythme des globules rouges (1 %
par jour, soit environ 3 mois pour la totalité de l’enzyme), elle va donc rester abaissée malgré
la guérison clinique. En revanche, l’administration précoce de pralidoxime peut la corriger,
voire la normaliser.
L’interprétation des résultats doit être toujours faite par comparaison au taux basal d’un
l’individu.
Le dosage direct de l’OP ou de ses métabolites par méthodes colorimétrique, immunologique,
chromatographique ou par fluorescence n’a d’intérêt qu’à titre médicolégal. [37]
1.11. Traitement
La prise en charge de ces intoxications dépendra de la symptomatologie présentée par le
patient et donc de la gravité, du mode et des circonstances de la contamination.
1 .11.1. Décontamination et évacuation du toxique

L’une des priorités en cas d’intoxication aigue grave sera la réalisation d’une décontamination
et/ou d’une évacuation du toxique afin de réduire la dose d’OP absorbée et d’éviter la
transmission de l’intoxication. Elle sera adaptée au mode et aux circonstances de la
contamination.
- Lors d’une contamination par inhalation priorité sera donnée à l’extraction de la
victime et de l’entourage de la source toxique tout en veillant à la protection des secouristes.
- En cas d’exposition cutanée, le patient devra être déshabillé et un lavage cutané (par
eau savonneuse ou solution d’Eau de Javel à 12° diluée) sera réalisé (le Dakin sera
utilisé sur les plaies et muqueuses).
- Dans le cas particulier de l’ingestion, un lavage gastrique serait utile. Il devra être
rapide (en raison de la rapidité d’absorption des OP), et réalisé chez un patient
stabilisé, conscient ou intubé. [19].
1.11.2. Traitement symptomatique

L’objectif prioritaire, est d’éviter l’asphyxie par le rétablissement d’une ventilation efficace.
Le sulfate de magnésium pourra être utilisé afin de réduire les effets cardiovasculaires dans le
cas des intoxications aux OP ayant une activité inhibitrice sur les Na+/K+/ATPases pouvant
induire des troubles du rythme cardiaque. Les traitements anticonvulsivants seront surtout
56
nécessaires en cas d’intoxications aux NOP, qui provoquent de façon quasi systématique des
crises convulsives répétées du fait de leurs doses souvent très importantes. [38]
1.11.3. Traitement spécifique ou antidotique

La bithérapie atropine-pralidoxime, utilisée à posologie et durée adéquate, est à l’heure
actuelle la pierre angulaire de la prise en charge des intoxications aigues graves aux OP.
§ L’atropine : anti cholinergique et un véritable antidote des intoxications aigues
graves aux organophosphorés. Elle agit directement, part son entrée en
compétition avec l’ACH, sur le syndrome muscarinique et le syndrome central
engendré par l’intoxication. Cependant, elle n’a aucune action sur le syndrome
nicotinique neuromusculaire et l’inhibition des cholinestérases. Les doses
d’atropine peuvent être très importantes (des doses de 20 à 80 mg/24h sont
parfois nécessaires). Cependant, il n’y a pas à l’heure actuelle de consensus ou
de protocole standardisé sur les schémas thérapeutiques à utiliser.
§ La pralidoxime : sa fonction principale est la réactivation des cholinestérases
(inhibées par l’OP).Son efficacité est dépendante de plusieurs facteurs :
notamment du type d’OP, du délai d’administration (dans les 36 heures suivant
l’intoxication idéalement, avant la survenu du phénomène de vieillissement),
mais surtout de la dose administrée qui doit être élevée. En effet, la pralidoxime
ne sera efficace qu’utilisée à forte dose et pendant une période durable.
Chez l’adulte : administrer 2 g sur 30 minutes (ou 30 mg/kg), suivi d’une dose
d’entretien en continu de 1 g/h pendant 48h. Puis au delà 1 g toutes les 4 h
jusqu'à sevrage.
Chez l’enfant : 25-50 mg/kg IV sur 30 minutes puis 10 à 20 mg/kg/h en continu.
[45]
2. Les carbamates
Les carbamates sont des produits utilisés par les agriculteurs pour lutter contre les
larves, les insectes, les rongeurs et les champignons, mais aussi dans les ménages et dans les
agglomérations urbaines pour lutter contre les moustiques et les vecteurs.
Comparés théoriquement à leurs homologues organophosphorés, les carbamates(CBM)
anticholinestérasiques ont des propriétés physico-chimiques, des modalités d’utilisation, une
57
cinétique et un mode d’action globalement superposables de même que le tableau clinique de

l’intoxication aiguë (à part le syndrome intermédiaire et les neuropathies retardées) .
Cependant la liaison carbamate-enzyme est spontanément réversible, sans phénomène
de « vieillissement » de l’enzyme. Ceci est à l’origine d’une symptomatologie moins sévère
qu’avec les organophosphorés et surtout de plus courte durée, de l’ordre de 12 à 24 h, sans
toxicité cumulative. De plus, le passage à travers la barrière hémato-méningée est faible, ce
qui explique le fait que les cholinestérases cérébrales sont peu affectées et les signes
neurologiques centraux sont nettement moins marqué [20,31, 37]
2.1. Relation structure/activité et usages

Les pesticides à base de carbamate peuvent être divisés en trois grandes catégories
structurelles, illustrées par la figure 16, qui diffèrent selon que la liaison en R 3 est une liaison
oxygène (I) ou soufre (II, III); et selon que l’atome partageant la double liaison du carbone
des carbamates soit un oxygène (I, II) ou un soufre (III). Pour n'importe laquelle de ces
catégories, le R 3 peut être un groupe alkyle, un dérivé d'oxime, un groupe aryle ou 3 autres
fractions plus complexes.
Figure 16 : Structure chimique générale des carbamates, thiocarbamates et dithiocarbamates

[19]
- Pour les carbamates (I), R1 et R2 peuvent tous deux être des groupes méthyle
(carbamates de méthyle), ou R 1 peut être un atome d'hydrogène et R2 un groupe méthyle
(N-méthyl carbamates). Les pesticides contenant ces 2 substituants sont généralement de
puissants inhibiteurs de l’acétylcholinestérase (AChE) et sont couramment utilisés comme
insecticides. Lorsque R1 et R2 sont des groupes plus grands que l'hydrogène ou un groupe
méthyle, les carbamates substitués ont généralement une activité anti-cholinestérase minime
58
ou nulle. Ils sont généralement commercialisés sous forme d'herbicides ou de fongicides, ou

pour d'autres utilisations. Le chlorprophame, un herbicide au phénylcarbamate, où R1 est un
groupe phényle, appartient à cette catégorie (Figure 17).
Figure 17 : Structure du Chlorpropharm. [19]
Les pro-carbamates sont une autre sous-catégorie des insecticides à base de carbamate dans
lesquels le substituant R1 est un fragment ester d'oxygène ou de soufre et dans lesquels le
composé parent est transformé en un carbamate pesticide. Ils sont conçus pour être plus
facilement métabolisés en carbamates chez les insectes que chez les mammifères. Le
Thiodicarbe est un exemple de pro-carbamate dans lequel l'ester de soufre R1 est un autre
carbamate (Figure 18).
Figure 18 : Structure du Thiodicarb [19]
- Les thiocarbamates (II) sont utilisés comme herbicides et ont une puissance moindre
(le cas échéant) que les substances du groupe I en tant qu’inhibiteurs de l’AChE. Néanmoins,
ils répondent aux exigences structurelles générales pour l'inhibition de l'AChE de cette
classe et il a été démontré que certains provoquent l'inhibition de l'AChE chez les animaux à
des doses plus élevées. L'effet critique, ou le plus sensible pour ces thiocarbamates et d'autres,
peut ne pas être une conséquence de l’inhibition de l’AChE.
59
- Les dithiocarbamates (III) sont généralement utilisés comme fongicides, bien que
certains aient d'autres utilisations et qu'ils puissent également contenir des esters R3 qui, en
théorie, pourraient inhiber l'AChE. Au moins un d'entre eux, Thiram, s'est avéré le faire, mais
encore une fois, à des doses plus élevées que celles induisant d'autres effets critiques
préoccupants.[19]
Le tableau suivant répertorie les pesticides à base de carbamates et leurs principales
utilisations :
Tableau 14:Le tableau répertoriant les pesticides à base de carbamate et leurs principales
utilisations pour chacune des trois catégories structurelles. A = aphicide ; I = insecticide ; H =
herbicide ; F= fongicide ; GR= Régulateur de croissance ; SI = inhibiteur de germination ; WP
= préservateur de bois. [19]
Carbamates Thiocarbamates Dithiocarbamates

Aldicarb I, Carbaryl I ,Methomyl I Butylate H Mancozeb F
Trimethacarb I,Thiodicarb I Cycloate H Maneb F
Chlorpropham H EPTC H Metiram F
Desmidipham H Molinate H Zineb F
Propham H ,SI Pebulate H Metam, Na, K. F,I
Pirimicarb A Vernolate H NaDMDTC F, I
Thiophanate F Diallate H ThiramF,H,I
Fenoxycarb GR Triallate H Ferbam F
IPBC WP Thiobencarb H Ziram F
2.2. Propriétés physicochimiques

Les carbamates se présentent sous forme de cristaux ou de liquides huileux pratiquement non
volatils, lipophiles, peu hydrosolubles mais solubles dans la majorité des solvants organiques.
Le pyrimicarbe, modérémentvolatil, et le formétanate, très soluble dans l’eau, font exception.
[37] (voir annexe XII)
2.3. Sources d’exposition aux carbamates

a. Exposition professionnelle
Inhalation de gouttelette par dispersion du produit, contact cutané avec des vêtements souillés
en milieu de travail.
60
b. Exposition domestique
L’ingestion accidentelle provoque une intoxication sévère chez l’enfant, d’évolution parfois
fatale. Plusieurs « épidémies » d’intoxications par des fruits et légumes contaminés ont été
décrites, car ces insecticides sont absorbés par les feuilles, les fruits et les racines des plantes.
[37]
2.4. Toxicocinétique
Très voisine de celle des OP
a. Absorption
- Une absorption digestive rapide et quasi complète (>90%);
- Une bonne pénétration cutanée du fait de leur lipophilie importante ;
- L’absorption respiratoire est accessoire (produits non volatils) compte tenu de la non-
volatilité de la plupart des dérivés et de la taille des gouttelettes d’aérosols générées
par les pulvérisateurs, arrêtées au niveau des voies aériennes supérieures.
b. Distribution
La distribution se fait dans tous les organes et tissus ; les carbamates franchissent le placenta.
c. Métabolisme
Ils sont totalement et rapidement métabolisés, en moins de 24 heures, par des réactions
d’hydrolyse, d’oxydation (cytochromes P-450) et de conjugaison. L’aldicarbe-sulfoxyde,
principal métabolite de l’aldicarbe, est plus actif que la molécule mère. À l’exception du
thiodicarbe, qui nécessite une activation métabolique, les carbamates sont des inhibiteurs
directs des cholinestérases.
c.Elimination
Il n’y a pas d’accumulation dans l’organisme ; les métabolites sont éliminés dans les urines
[37]
2.5. Mécanisme d’action toxique

Les carbamates ne sont pas irritants pour la peau et les muqueuses mais certains de leurs
solvants peuvent l’être ; la sensibilisation est très exceptionnelle. Globalement, leur toxicité
aiguë est très importante, et même majeure dans le cas de l’aldicarbe, du carbofuran, du
formétanate et du méthomyl. Le carbaryl et le fénoxycarbe font exception avec une DL50 par
voie orale respectivement élevée et très élevée .Comme les OP, les carbamates inhibent les
61
différentes cholinestérases de l’organisme : l’AChE, la BChE, et les cholinestérases non

spécifiques présentes dans le foie et divers tissus. [36,37]
2.6. Symptomatologie
2.6.1. Aigue
Le tableau clinique de l’intoxication aiguë est très voisin de celui provoqué par les OP :
intrication de signes muscariniques, nicotiniques et centraux. La différence majeure réside
dans l’hydrolyse spontanée, théoriquement en quelques heures, de la liaison carbamate-ChE,
sans phénomène de « vieillissement » de l’enzyme mais avec destruction de l’insecticide (le
carbamate reste actif tant que la fonction ester n’est pas hydrolysé),la symptomatologie est
donc de courte durée, 12 à 24 heures usuellement, et il n’y a pas de toxicité cumulative. Les
carbamates ne sont pas génotoxiques ni repro-toxiques expérimentalement ; les études de
cancérogenèse animale sont négatives pour la plupart des dérivés [37]
2.6.2. Toxicité chronique

L’exposition chronique à certains carbamates (méthomyl, carbaryl) provoque des
dermatoses (eczéma) et l’utilisation du carbofuran est significativement associée à la
prévalence de l’asthme .Il n’y a pas d’étude de mortalité par cancer portant sur des cohortes
de travailleurs exposés exclusivement ou majoritairement à des carbamates. [37]
2.7. Diagnostic
a. Identification du produit
L’étude de certains métabolites urinaires peut être utilisée pour le diagnostic des intoxications
ou pour l’évaluation de l’importance d’une exposition récente.
b. Mesure de l’activité cholinesterasique
La mesure de l’activité cholinesterasique est un test de confirmation diagnostique utile pour
les intoxications (ou l’exposition) aux carbamates.
Cependant, la réversibilité très rapide de l’inhibition des cholinestérases, rend la mise en
évidence de cette inhibition beaucoup plus délicate que dans le cas des intoxications par les
OP. Ainsi, l’analyse doit être effectuée très rapidement après l’intoxication [31,36]
62
2.8. Traitement des intoxications

2.8.1. Décontamination
- En cas d'ingestion : LG (si possible dans les 30 minutes). L'administration de charbon
activé.
- En cas d’inhalation : Soustraction de la victime du milieu contaminé.
- En cas de projection : Déshabillage du sujet, lavage à l’eau légèrement savonneuse de
la peau et des muqueuses souillées.
2.8. 2. Traitement symptomatique

Assistance ventilatoire avec oxygénothérapie, aspiration des sécrétions bronchiques, le
remplissage vasculaire, la correction des convulsions par administration de diazépam
2.8. 3. Traitement spécifique

- Administration intraveineuse de l’Atropine (anti cholinergiques), jusqu’à apparition
des signes d’atropinisation (bouche sèche, mydriase, tachycardie…) ; (Pour la
posologie voir organophosphorés)
- L’utilisation des oximes (ex : pralidoxime ou contrathion®), lors des intoxications par
carbamates est controversée. [31,37]
63
CHAPITRE IV :
DOSAGE DE L’ACTIVITÉ
CHOLINESTÉRASIQUE
PARTIE THÉORIQUE CHAPITRE IV : DOSAGE DE L’ACTIVITÉ
CHOLINESTÉRASIQUE
1. Dosage de l’activité cholinestérasique

La détermination de l'activité des cholinestérases est devenue un outil important dans la
conception et la découverte de médicaments, ainsi en médecine qu’en toxicologie. Il existe un
grand nombre de composés capables de moduler l'activité des cholinestérases. Ces composés
peuvent être utilisés pour la gestion pharmacologique de divers troubles (par exemple, la
maladie d’Alzheimer, la myasthénie grave). De plus, l'intoxication aux organophosphorés est
fréquemment diagnostiquée via un dosage de l'activité des cholinestérases. Une grande variété
de méthodes a été développée au cours des dernières décennies pour la détermination de
l’activité cholinestérasique.
Il existe plusieurs méthodes basées sur les propriétés spécifiques des cholinestérases et
leurs interactions avec des substrats naturels ou artificiels, des méthodes manométrique,
potentiométrique, titrimétriques, photométrique, fluorométrique et radio-isotopique.
Les méthodes existantes permettent de résoudre la plupart des problèmes rencontrés lors
de la détermination de l'activité cholinestérasique. Selon Ellman, la colorimétrie s'est avérée
l'approche la plus utile et la plus polyvalente. Elle peut être utilisée dans divers protocoles
pour déterminer l’exposition aux pesticides ou aux agents neurotoxiques ou pour mettre au
point de nouveaux médicaments. Son amélioration possible réside dans l'optimisation des
échantillons riches en hémoglobine. Les progrès des méthodes les plus courantes (y compris
Ellman) dépendent de la miniaturisation et des plateformes physiques modernes (par exemple,
les fibres optiques, les méthodes utilisant des puces ou les nanotechnologies). [47,50,54, 55,
56,57]
1.1. Indication de la mesure de l’activité cholinestérasique

1.1.1. La butyrylcholinestérase
La mesure de l’activité de la butyrylcholinestérase est indiquée dans l’intoxication aiguë
ou l’exposition chronique aux produits organophosphorés, l’évaluation d’une insuffisance
hépatocellulaire et la recherche d’une anomalie de production qualitative se traduisant par une
curarisation prolongée. La mesure de l’activité des butyrylcholinestérases réalisée en urgence
garantit une prise en charge spécifique et rapide du patient, afin de réactiver au plus vite les
cholinestérases. Même si le niveau de diminution de l’activité des butyrylcholinestérases
n’apporte pas de valeur pronostique à l’intoxication, son suivi dans le temps permet de juger
de l’efficacité du traitement et de la rémission progressive du patient [33, 27,24]
64
CHOLINESTÉRASIQUE
1.1.2. L’acétylcholinestérase
L’AChE est en effet impliquée dans divers problèmes majeurs de santé publique comme
la maladie d’Alzheimer, myasthénie, intoxication aux insecticides, aux gaz neurotoxiques, au
venin de serpents Mamba ou au curare. La mesure de l’activité des acétylcholinestérases est
utile en routine, pour le suivi biologique des personnels exposés de façon chronique à des
phytosanitaires organophosphorés. [20]
1.2. Modalité de prélèvement et préparation des échantillons
Tableau 15 : Prélèvements sanguins des cholinestérases [28]
Prélèvements sanguins des cholinestérases

Matériels de
prélèvement
BChE Tube héparinate de lithium
AChE Tube EDTA
Précautions Effectuer les prélèvements à distance des locaux contaminés si
Eviter la contamination cela est possible et après nettoyage soigneux de la peau. Le sang
des échantillons par veineux doit être préféré au sang capillaire, facilement souillé par
des OP une contamination de la peau.
Conservation des
spécimens
BChE Le transport des tubes au laboratoire peut être réalisé à
température ambiante, mais les températures trop élevées peuvent
détériorer l’enzyme et son activité. L’activité BChE est stable
pendant sept jours si les échantillons sanguins sont réfrigérés (2-
8˚ C), plusieurs semaines après centrifugation et séparation, si le
plasma est conserve à 0-5˚C, le plasma séparé et congelé
(recommandé si l’analyse ne peut être effectuée le jour même).
Quelques cycles de congélation-décongélation peuvent être
réalisés sans conséquence importante.
AChE Les échantillons sanguins doivent être traités très rapidement Ils
peuvent être réfrigéré a 4˚ C le plus tôt, puis analysés rapidement
ou congelés après dilution très rapidement dans un tampon au
1/100.
Destinataires Laboratoires expérimentés ayant des contrôles de qualité,

utilisant la même technique de dosage, et si possible toujours au
même laboratoire.
• En l’absence de contamination de la peau, le port d’équipements de protection

spéciaux est inutile pour le préleveur.
• Le concentré globulaire doit être lavé par du sérum salé isotonique plusieurs fois puis
hémolysé par choc osmotique. Ces étapes de lavage permettent l’élimination du
65
CHOLINESTÉRASIQUE
plasma et préviennent donc la détermination concomitante des deux activités ChE.

Elles alourdissent les protocoles et s’opposent au traitement automatique expliquant le
faible nombre de laboratoires utilisant cette approche. Les appareils du type ChE
Check mobile 1 permettent une analyse quasi-immédiate sur sang total et permettent
donc de s’affranchir de cette étape si on en dispose.
• Sans réfrigération, la réaction de réactivation peut se poursuivre dans le tube de
prélèvement, en cas d’exposition avec un OP et traitement par une oxime. Si
l’inhibiteur est un carbamate, la réversibilité de la réaction d’inhibition entrainera une
normalisation progressive de l’activité enzymatique au cours du stockage. [28]
1.3. La détermination de l’activité cholinestérasique

Les méthodes de dosage des cholinestérases reposent sur leurs propriétés spécifiques
telles que le pouvoir hydrolytique de divers esters. Ainsi, la détermination de l'activité des
cholinestérases repose sur la réaction d'hydrolyse de l'acétylcholine soit par la quantification
du produit de décomposition soit du substrat n'ayant pas réagi au cours de la réaction.
En général, trois principes peuvent être utilisés lors de la détermination de l'activité
cholinestérasique. (Figure 19)
- Le premier principe utilise le substrat naturel - ACh. Lorsque le substrat naturel ACh
est hydrolysé, l'activité enzymatique peut être déterminée par une évaluation du ΔpH
(détermination de l'acidification par l'acétate libéré).
- Le deuxième principe consiste à utiliser un substrat artificiel - généralement
l’acétylthiocholine (ATCh). La thiocholine (TCh), un produit de décomposition du
substrat, peut être quantifiée par réaction avec des agents chimiques fournissant une
réaction colorée ou par voltampérométrie.
- Le troisième principe utilise également un substrat artificiel, mais le substrat
radiomarqué est généralement ACh avec la partie acétyle radiomarquée. Le substrat
décomposé ou le substrat n'ayant pas réagi est en outre déterminé par des techniques
de scintillation. [56,57]
66
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 19 : Les principaux principes des méthodes de détermination de l’activité

cholinestérasique [56].
1.3.1. Méthodes manométriques

• Principe général
Cette méthode permet d’étudier les réactions enzymatiques s’accompagnant d’un
dégagement ou d’une absorption de gaz (méthode directe) ou des réactions au cours
desquelles se forme un acide capable de déplacer (donc de dégager) le gaz carbonique d’un
tampon bicarbonate (méthode indirecte).Dans le cas des cholinestérases le dosage
manométrique est basé sur la mesure du dioxyde de carbone libéré à partir d'un tampon
hydrogénocarbonate. Ce tampon est décomposé par l'acide acétique libéré par l'hydrolyse de
l'ACh.
Les premiers tests de détermination de l’activité cholinestérasique utilisaient la méthode

manométrique. Lindstrom-Lang et Glick ont introduit la méthode manométrique
« Warburg »qui nécessitait une quantité importante d'homogénat de tissu et limitait le choix
du milieu au tampon hydrogénocarbonate.
Plus tard, Augustinsson et ses collègues ont introduit une modification de la méthode de
Warburg. Cette méthode optimisée comprenait un échantillon de sang séché sur du papier
67
CHOLINESTÉRASIQUE
filtre qui pourrait ensuite être envoyé à l'installation avec un appareil de mesure
manométrique.
L’approche manométrique a été encore miniaturisée par Giacobini et al. en 1958 pour la
détermination de l'activité cholinestérasique dans des cellules neuronales simples. La méthode
de « Warburg » permet de déterminer une activité cholinestérasique relativement faible dans
tous les tissus. Cette méthode permet une détermination relativement rapide de l'activité
cholinesterasique à partir d'échantillons assemblés dans n'importe quel environnement dans
lequel l'évaluation manométrique n'était pas disponible.
Les inconvénients de cette méthode résident dans l'utilisation limitée de tampons (seul
le tampon à l'hydrogénocarbonate convient) et dans l'impossibilité de modifier le pH pendant
la mesure. [54-56]
1.3.2. Méthodes potentiométrique

La potentiométrie repose sur la mesure du potentiel électrique d’une solution entre deux
électrodes, l’une appelée électrode de référence dont le potentiel reste constant tandis que le
potentiel de la seconde (électrode de travail) change en fonction de la composition de
l’échantillon. La différence de potentiel entre les deux électrodes permet alors d’évaluer la
composition de l’échantillon.
Les méthodes potentiométrique pour le dosage de l’activité cholinestérasique utilisent la
décomposition du substrat naturel ACh en choline et en acide acétique (Figure 20). L'activité
enzymatique est déterminée par la Δ pH dans le milieu réactionnel.
Figures 20. Principe de la méthode potentiométrique. [56]
Le premier dosage potentiométrique était communément appelé méthode de Michel

(1949). L'activité cholinesterasique a été déterminée en tant que la différence de pH (ΔpH)
68
CHOLINESTÉRASIQUE
évaluée après 1 h de début de l'expérience. Le système tampon phosphate /

hydrogénocarbonate a été conçu pour assurer une chute de pH linéaire dans le temps. Cette
méthode nécessitait un appareil sensible au pH ou deux appareils pH-mètres (première mesure
avant incubation et seconde après incubation).
Cette méthode est utile pour la mesure de routine des échantillons biologiques (cas des
intoxications par les pesticides anticholinestérasiques) et elle est relativement peu coûteuse et
simple. Une méthode électrométrique adoptée a été utilisée pour la détermination de l'activité
des cholinestérases du sang total, des érythrocytes et du plasma. Les échantillons ont été
incubés pendant 20 min en présence d'ACh et d'un tampon barbital-phosphate.
La méthode originale de Michel a été comparée à la photométrie Ellman standard, les

résultats de l’activité cholinesterasique étaient comparables, mais l'approche colorimétrique
s'est avérée plus précise.
L'électrométrie est une méthode indirecte. Par conséquent, le principal inconvénient de

cette méthode réside dans la mesure du pH, qui est une fonction logarithmique de la
concentration en acétate (et non de la production d'acétate elle-même). Ainsi, le pH pourrait
être affecté par un autre processus en cours pendant la mesure. Le changement rapide du pH
est un autre inconvénient de cette technique, car le pH peut chuter rapidement dans les
échantillons présentant une activité cholinestérasique élevée. Par conséquent, la variation du
pH peut affecter la mesure de l'activité cholinestérasique. Ce problème a récemment été
compensé par une nouvelle méthode utilisant une électrode sélective pour ACh. Une nouvelle
méthode potentiométrique basée sur la surveillance de l'épuisement du niveau d'ACh a été
rapportée. [48, 49, 52,54-57]
1.3.3. Méthodes titrimétriques

Les méthodes titrimétriques ont été adoptées à partir de la méthode potentiométrique
mentionnée précédemment. L'acide acétique libéré par la réaction enzymatique de l'ACh est
neutralisé en continu par une solution alcaline standard et un pH constant est maintenu.
(Figure 21)
69
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 21: Principe de la méthode titrimétriques [56].
Les premières méthodes titrimétriques ont permis une chute du pH pendant un temps
spécifique qui a été stoppé par l'ajout d'un inhibiteur de la ChE, puis le titrage a été effectué.
Le potentiomètre ou l’indicateur de couleur peut être utilisé pour reconnaître la ΔpH.
En raison des limitations importantes de la détermination de la couleur, seules quelques
études titrimétriques portant sur le pH ont été déterminées par le changement de couleur de
l'indicateur. Par ailleurs, les études potentiométrique utilisant une électrode de verre ont été
les plus utilisées parmi les méthodes titrimétriques.
L'approche titrimétriques a été utilisée pour la première fois par Wilson et Cabib en
1956 et Jorgensen en 1959. Les effets de la concentration du substrat, du pH et de la
température ont également été décrits par Nabb et Whitfield en 1967.Depuis leur introduction,
les méthodes titrimétriques ont été largement répandues pour diverses déterminations de
l’activité cholinestérasique. De plus, l'introduction du titreur automatique avec le dispositif
d'enregistrement a permis la production de résultats plus rapides et plus précis. La méthode
pH-stat automatisée pour le dosage des cholinestérases est l’un des tests les plus précis et les
plus pratiques sur le terrain.
Le plus gros inconvénient lié aux changements rapides de pH est similaire aux
méthodes électrométriques. Ces inconvénients sont également liés à la nécessité d’utiliser le
support non tamponné ou faiblement tamponné. Le volume d'alcali ajouté ne devrait pas
augmenter significativement le volume de réaction. [51, 54-57,59]
1.3.4. Méthodes photométriques

La détermination photométrique de l'activité cholinestérasique est basée sur le produit d'une
réaction chimique capable d'interférer avec la lumière d'une longueur d'onde spécifique.
L'importance des dosages optiques augmente avec le développement des fibres optiques et la
miniaturisation des spectromètres. Les méthodes basées sur les variation de pH et les
indicateurs acide-base tels que le rouge de phénol, le tournesol ou le bleu de bromothymol le
70
CHOLINESTÉRASIQUE
plus couramment utilisé ont été introduites au début du développement photométrique et font
partie des premières méthodes photométriques. (Figure 22)
Figure 22. Les indicateurs acide-base utilisés dans les méthodes photométriques [56].
L’approche colorimétrique d’Hestrin (1949) a décrit une réaction entre le substrat

restant (ACh) après hydrolyse et l’hydroxylamine formant ensemble un complexe
acétohydroxamique(Figure 23),qui en présence d'acide chlorhydrique et de trichlorure
ferrique forme un complexe rouge-violet. Ce produit a été quantifié par photométrie à 500-
540 nm. Cependant, cette technique ne fournit pas le taux de disparition du substrat, qui est
son inconvénient le plus important. La méthode d’Hestrin est utilisée dans le dosage sur
microplaque pour la détermination des agents neurotoxique. Ce test a été comparé à
l'approche colorimétrique standard d’Ellman et s'est révélé plus spécifique dans la
détermination pratique des OP.
Figure 23. La photométrique d’Hestrin pour le dosage de l’activité cholinesterasique [56]
L’adaptation de la méthode colorimétrique d’Hestrin au dosage de l’activité

cholinestérasique décrit par VINCENT et SEGONZAC en 1958 est une technique très
71
CHOLINESTÉRASIQUE
utilisée. Elle s'applique au plasma et aux globules rouges et même, grâce à l'inhibition
sélective de la pseudocholinestérase par le « diparcol », au dosage séparé des cholinestérases
globulaires et plasmatiques dans le sang total. Apres réaction de l’enzyme sur le substrat à
37C° à PH 7,4 pendant 30 mn, on mesure la quantité d'acétylcholine non hydrolysée qui
donne en milieu acide et sous l’action de l’hydroxylamine, l’acide hydroximique celui-ci
développe une coloration rouge en présence de FeCl3 dosée à 520nm.
La spectrophotométrie selon Ellman (1961) est la méthode photométrique la plus

utilisée. Cette méthode utilise des substrats artificiels (esters de thiocholine). La thiocholine
libéré réagit avec l’acide 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoique) (DTNB) pour former l’anion 3-
carboxy-4-nitrothiolate (TNB ), cet anion absorbe fortement à 412nm .(Figure 24)
Nombreux substrats ont été testés dans le but de trouver le substrat présentant le meilleur
rapport spécificité / stabilité et les substrats spécifiques se sont révélés être Acétylthiocholine
(ATCh) pour AChE et butyrylthiocholine (BTCh) pour BChE.
Figure 24. La méthode photométrique d’Ellman utilisant l’Acétylthiocholine [56]
Une revue par Worek et al.en 2012 de la méthode d’Ellman a montré que l'approche
colorimétrique d’Ellman peut être utilisée pour la plupart des objectifs lors d'études sur
l'activité cholinestérasique.
Cependant, la méthode d’Ellman a aussi quelques limitations, le taux d'hydrolyse du
thioester (ATCh, BTCh) peut être modifié de manière significative lors la mesure de l'activité
en présence de réactivateurs oximes. Car ces réactivateurs sont capables d'hydrolyser la
liaison ester dans les thiocholines et ça peut donner des résultats faussés lors de la mesure
d'Ellman. Par conséquent, la méthode Ellman ne peut pas être utilisée sans discernement pour
évaluer les réactivateurs oxime avec ATCh ou d'autres thioesters, en particulier lorsque cette
72
CHOLINESTÉRASIQUE
réaction (oxymolyse) est plus rapide que la réaction d’Ellman. De plus les esters de
thiocholine peuvent subir une hydrolyse spontanée, qui est accélérée par une température
élevée ou un pH supérieur à 8. L'interférence de l'anion TNB avec l'absorbance de
l'hémoglobine et la photosensibilité au DTNB sont également des limites de la photométrie
d'Ellman.
Worek et ses collègues ont adapté en 1999 la méthode d’Ellman pour les échantillons de
sang total avec l'option de mesure sélective de l’AChE. Étant donné que l'absorbance de
l'anion TNB interfère fortement avec l'absorbance de l'hémoglobine à 412 nm, seuls des
échantillons très dilués peuvent être utilisés pour atteindre la sensibilité acceptable. Ainsi, la
longueur d'onde de mesure a été adaptée à 436 nm. À cette longueur d'onde, l'absorption de
l'hémoglobine est réduite à 25% par rapport à son absorption à 412 nm, alors que l'absorption
de l'anion TNB est à 80% de son maximum. Par conséquent, une interférence inferieure avec
l’hémoglobine. L'utilisation d'une longueur d'onde plus longue est un outil important pour
surmonter l'interférence de l'hémoglobine. Le meilleur rapport TNB / hémoglobine a été
trouvé à 462,5 nm. L'activité AChE d'un échantillon de sang total est déterminée en présence
d'éthopropazine, inhibiteur sélectif de BChE (Figure 25)
Figure 25.Inhibiteurs sélectifs de la BChE ethopropazine et l’iso-OMPA. [56]
Padilla et ses collègues (1995) ont proposé une autre option possible pour limiter
l'interférence de l'hémoglobine avec l'absorbance de l'anion TNB. Comme on le savait,
l'AChE est fixée à la surface des érythrocytes par une ancre au phosphatidylinositol. Cette
technique utilise la lipase C spécifique du phosphatidylinositol pour libérer les molécules
d'AChE de la membrane érythrocytaire sans la lyse érythrocytaire. L'AChE libéré est séparé
du reste de l'échantillon par simple centrifugation. Les échantillons d'érythrocytes contenant
73
CHOLINESTÉRASIQUE
de l'AChE sans contamination par l'hémoglobine sont le principal avantage de cette

procédure. L'élimination de l'influence de l'hémoglobine évite la dilution de l'échantillon et
augmente la précision de l'activité AChE mesurée.
Uete et al. 1972 ont introduit un test très similaire à la procédure d’Ellman en essayant
d’éviter toute interférence avec l’hémoglobine. La thiocholine réagit avec la 2,2’ ou de 4,4’-
dithiopyridine avec la formation de 4-thiopyridine ou de 2-thiopyridine (Figure 26 ), qui
présentait une forte absorption dans l’UV à324 nm et à 343 nm respectivement.
Figure 26.Dosage photométrique introduit par Uete, adapté pour éviter l’interférence avec
l'hémoglobine.[56]
Il s'agit d'une technique rapide et précise utile pour une large gamme d'expériences, en
particulier pour les analyses d'échantillons de sang total. Le principal inconvénient de cette
méthode réside dans l'inhibition significative de la ChE par le réactif utilisé.
Une autre méthode a été introduite dans le but de remplacer le DTNB par de l'acide 6’-
dithiodinicotinique (DTNA)(Figure27 ). La méthode s'est révélée utile, car la DTNA n'affecte
pas Km contrairement à DTNB. L'aspect le plus pratique de la méthode DTNA était son
adaptabilité aux instruments automatisés, qui peuvent suivre l'évolution de l'absorbance à 340
nm différente du pic d’hémoglobine. De ce fait, le DTNA est un chromogène précieux pour la
détermination de l'activité cholinestérasique dans les tissus riches en hémoglobine.
74
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 27.Un test photométrique avec l'acide 6’-dithiodinicotinique.[56]
L'hydrolyse des dérivés de la benzoylcholine (BCh) par les cholinestérases a été décrite
pour la première fois par Ormerod en 1953 (Figure28). Une série de dérivés de
benzoylcholine avec différentes fractions sur le cycle aromatique a été testée. Les analogues
de benzoylcholine se sont avérés avoir une absorption UV plus forte que les produits de leur
hydrolyse.
Figure 28.Un test photométrique pour les analogues de la benzoylcholine. [ 56]
Kalow et Lindsay ont ensuite en 1955 utilisé cette découverte pour déterminer l'activité
cholinestérasique sérique en utilisant de la benzoylcholine comme substrat artificiel. Cette
méthode est basée sur la disparition du substrat lors d'une réaction enzymatique à 235 nm.
Les tests basés sur l'hydrolyse de divers esters de choline (succinylcholine, benzoylcholine ou
ACh) par des cholinestérases ont été introduit par Abernethy et ses collègues en 1984. La
génération d'acide cholinique est couplée à un système choline oxydase / peroxydase.Le
peroxyde d'hydrogène formé au cours du processus est déterminé par la réaction avec la
peroxydase-phénol-aminoantipyrine (Figure 29) donnant un chromophore ayant une
absorbance maximale à 500 nm.
75
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 29.Dosage selon Abernethy avec la cholinoxidase et la peroxydase de raifort [56].
Cette technique a été principalement développée pour prédire la sensibilité à la

succinylcholine. Cependant, cette procédure est également applicable à la détermination de
l'activité de routine. Cet essai indirect avec un nombre relativement élevé de modifications
post-essai perd de la sensibilité et de la précision par rapport aux méthodes moins
compliquées.
Un dosage direct de l'activité cholinestérasique peut être effectué en utilisant le substrat
indoxylacétate via la détermination de son produit de réaction enzymatique indigo (Figure30).
Les molécules d'indoxyle libérées réagissent rapidement en présence d'oxygène. Par
conséquent, cette réaction pourrait être considérée comme quantitative. L'indigo peut être
quantifié par analyse spectrométrique (420 - 450 nm) ou fluorimétrique (excitation 1 = 395
nm; émission 1 = 470 nm) à pH 6,5.
Figure 30.Dosage basé sur l’accumulation d’indigo en présence d'oxygène. [56]
L'indoxylacétate n'étant pas le substrat spécifique de l'AChE, il pourrait donc être utilisé
également pour la détermination du BChE dans le plasma. [53, 54,56 ,60]
1.3.5. Méthodes fluorométriques

76
CHOLINESTÉRASIQUE
C’est des méthodes de dosage utilisant la propriété de certaines molécules d’être

fluorescentes. La fluorescence fait partie de phénomènes physiques, qui consiste en
l’émission de photons lors du retour à l’état fondamental d’une molécule portée au préalable à
un état excité à une longueur d’onde donnée . Cette fluorescence est proportionnelle à la
concentration.
Le principe de dosage des cholinestérases basé sur la formation de produit fluorescent

est couramment utilisé. Le dosage fluorométrique est dans la plupart des cas plus sensible
(jusqu'à 100 fois) que la technique colorimétrique correspondante. De manière optimale, le
substrat est non fluorescent (par exemple, indoxylate d'acétate, esters de résorufine ou esters
de naphtyle) et fournit un produit hydrolytique hautement fluorescent. Lorsque le substrat et
le produit sont tous deux des composés fluorescents, leurs spectres ne doivent pas interférer
l'un avec l'autre.
Une autre approche possible est basée sur l'hydrolyse enzymatique couplée à une autre
réaction pour obtenir un produit hautement fluorescent. La sensibilité d'un tel test et la
possibilité de fournir des données pour la cinétique sont les avantages les plus importants. Les
limites possibles de l’utilisation des méthodes de substrats artificiels résident dans les
différents paramètres cinétiques de divers substrats.
Kramer et Guilbault en 1965 ont indiqué que des esters de résorufine (Figure 31)
peuvent être utilisés comme substrats pour la détermination de l'activité hydrolytique de
l'enzyme. Bien que l'acétate ou le butyrate de résorufine ne soit pas un substrat favorable pour
la détermination de l'activité cholinestérasique, les esters de résorufine non fluorescents
fournissent des produits hautement fluorescents. Cependant, la longueur d'onde d'excitation
trop proche de la longueur d'onde d'émission optimale, ce qui limite l'utilisation d'une telle
méthode de dosage. L'hydrolyse spontanée rapide semble constituer un autre inconvénient,
car la réaction non enzymatique ne peut être distinguée de la réaction enzymatique. De plus,
la réaction non enzymatique peut affecter les résultats cinétiques. Les raisons mentionnées
conduisent à exclure les esters de résorufine des protocoles de dosage de routine de l’activité
cholinesterasique.
77
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 31. Hydrolyse des esters de résorufine. [56]
Les esters de naphtyle étaient également des substrats fréquemment utilisés pour la
détermination de l'activité cholinestérasique (Figure 32). Les esters de 1- ou 2-naphtols étaient
généralement utilisés car leur produit d'hydrolyse (naphtol) est une fraction hautement
fluorescente. Cette méthode était auparavant développée comme un outil approprié pour la
mesure cinétique. Comme on pouvait s'y attendre, différents esters de naphtyle doivent être
utilisés pour la détermination de l'AChE (naphtyle acétate) et du BChE (naphtyle butyrate).
La fluorescence du 1-naphtol s'est avérée supérieure à celle du 2-naphtol. L'intensité de la
fluorescence est proportionnelle à la quantité de substrat hydrolysé. Comparé aux méthodes
de quantification à l’acétate, cet essai est capable de mesurer la cinétique en présence d’autres
substrats hydrolytiques.
Figure 32.Dosage des esters de naphtyle par hydrolyse. [56]
Une méthode fluorimétrique utilisant l'iodure de 7-acétoxy-1-méthylquinoléinium

comme substrat (l’excitation à 320 nm ; émission à 410 nm) a également été mise au point en
1966 (Figure 33). Le produit d'hydrolyse est l'iodure de 7-hydroxy-1-méthylquinoléinium
hautement fluorescent (l’excitation 406 nm ; l’émission 505 nm). Ce test permet des études
cinétiques ainsi que des mesures de dépistage rapides. Cette méthode n'est spécifique ni pour
AChE ni pour BChE, car les autres enzymes hydrolytiques peuvent également cliver ce
substrat, bien qu'il soit clivé à vitesse plus élevée par BChE.
78
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 33.Test fluorométrique utilisant l'iodure de 7-acétoxy-1-méthylquinoléinium comme

substrat [56].
La méthode fluorométrique adaptée aux très faibles quantités d’enzyme et à la

distribution enzymatique instable a été établie par Parvari en 1983. Cette méthode est très
sensible lorsque sa sensibilité est comparable à celle des méthodes radiométriques. Le dosage
est linéaire dans la plage allant des picomoles aux nanomoles de thiocholine. Au cours de la
réaction enzymatique, la thiocholine libérée (la méthode d’Ellman) se condense avec le N- [4-
(7-diéthylamino-4-méthylcoumarine-3-yl) phényl] maléimide (CMP )(Figure 34 ). Le produit
de réaction a un coefficient d'extinction élevé et une fluorescence bleue intense.
Figure 34. Analyse fluorométrique avec l’acétylthiocholine et le N- [4- (7-diéthylamino-4-

méthylcoumarine-3-yl) phényl] maléimide(CMP). [56]
En 1985, Birman proposa une méthode chimioluminescente pour doser l'activité de

l'AChE. Cette méthode utilisait le substrat naturel ACh. L'ACh a été hydrolysé en choline qui
a été convertie en choline bétaïne et en peroxyde d'hydrogène par la choline oxydase. Le
peroxyde d'hydrogène associé au luminol et à la peroxydase de raifort produit une émission
chimioluminescente. La peroxydase catalyse l'oxydation du luminol en 3-aminophtalate
(Figure 35).
79
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 35. Un dosage chimioluminescent selon Birman [56].
Diaz et ses collègues en 1995 ont amélioré cette méthode en utilisant du 2-

naphthylacétate, qui a été converti en 2-naphtol (activateur chimioluminescent). Cette réaction
a de nouveau été couplée à la réaction avec le luminol et la peroxydase de raifort. Cette
méthode a été miniaturisée par Guardigli et al en 2005. Cette miniaturisation a utilisé un
lecteur de microplaques à 96 puits. Une consommation de substrat significativement
inférieure, une meilleure limite de détection et des possibilités de mesure en parallèle
constituaient les principaux avantages de cette amélioration. Le 2-naphtylacétate joue le rôle
d'amplificateur positif pour la réaction luminol-H2O2-peroxydase de raifort. Après le clivage
du 2-naphtylacétate, le 2-naphtol libéré améliore la réaction chimioluminescente. Le 2-
naphtylacétate s'hydrolyse rapidement à pH=8,8 en l'absence d'enzymes hydrolytiques, ce qui
contitue un inconvénient. Cette mesure doit donc être effectuée en présence de tampon (pH
6,5). Cette technique convient à la détermination de BChE en raison de la faible spécificité du
substrat à AChE. [56]
1.3.6. Méthodes polarographiques

La polarographie est une forme particulière de la voltampérométrie qui utilise comme
électrode de travail une électrode à goutte tombante de mercure et dont laquelle la solution
n’est pas agitée. Le principe est d’obtenir un courant proportionnel à la concentration de
l’analyte à étudier. On observe donc le transfert d’électrons durant une réaction
d’oxydoréduction à la surface de la goutte de mercure.
Kramer et Guilbalut ont décrit 1962 l’un des premiers procédés polarographiques pour la
détermination de l’activité cholinesterasique. C’est un procédé électrochimique utilisant
l'ATCh avec des électrodes en platine à deux cartouches immergées ensemble dans un
échantillon à mesuré. Un courant constant de 25 µA est appliqué aux électrodes. La variation
80
CHOLINESTÉRASIQUE
du potentiel de réduction sur l'électrode de platine a été automatiquement enregistrée dans le

temps.
Ridgway et Mark ont publié une méthode polarographique similaire en 1965.
L’avantage de cette méthode réside dans la possibilité d’une surveillance rapide des réactions.
Cette méthode détermine l'augmentation de la production de thiocholine au cours de la
réaction enzymatique. La vitesse d'hydrolyse a été étudiée en appliquant une tension constante
entre l'électrode au calomel saturé et l'électrode au mercure tombant dans la cellule
polarographique. L'augmentation du courant oxydant en fonction du temps a été enregistrée.
La validation de la méthode a été effectuée par comparaison du taux de production de la
thiocholine au cours de la détermination spectrophotométrique et polarographique. Cette
détermination est limitée par une toxicité significative du mercure. [56]
1.3.7. Méthodes radio-isotopiques

Le marquage radio isotopique consiste à remplacer dans la molécule que l’on désir étudier, un
atome ou un groupe d’atomes par un atome radioactif de manière à pouvoir l’utiliser comme
traceur.
La détermination de l'activité cholinesterasique radio-isotopique est basée sur
l'évaluation de l'ACh marquée au 3H ou au 14C. Ces méthodes sont très similaires car elles ne
diffèrent généralement que par la quantification de l'ACh marquée non hydrolysée ou par la
quantification de l'acétate libéré marqué. Le dosage radiométrique est généralement la mesure
au point final. Ainsi, il ne convient pas aux études cinétiques. L’approche radiométrique est la
plus sensible permettant d’évaluer une très faible activité enzymatique. D'autre part, le coût
élevé du substrat radiomarqué et les complications liées à la manipulation de matières
radioactives doivent être pris en compte.
Winteringham et Disney ont introduit en 1962 une méthode sur la base de l’ACh
14 14
marqué au C restante. Ils ont incubé des échantillons biologiques avec du C-ACh et
14
quantifié la quantité de substrat non hydrolysé après élimination du C-acétate volatil sous
vide. C’est l’un des premiers procédés de dosage radio isotopique de l’activité
cholinesterasique.
Par la suite en 1966 Reed et ses collègues ont lié l’ACh à une résine échangeuse d’ions,
après centrifugation du mélange on mesure l'acétate marqué au 14C dans le surnageant. Cette
méthode permet une détermination rapide et précise de l'hydrolyse enzymatique à une
concentration de 10-9 M de 14
C-ACh. De plus, il permet l'utilisation de pH variable, d'une
81
CHOLINESTÉRASIQUE
large gamme de concentrations de substrat et de diverses concentrations d'échantillons

d'enzymes. Cette méthode est plus sensible que celle présentée par Winteringham et Disney
puisqu'elle mesure l'acétate plutôt que le substrat restant.
McCaman dans son travail en 1968 a sélectivement retiré le substrat marqué du
surnageant. Le procédé décrit utilise l'ACh radiomarqué comme substrat et mesure la
14
production d'acétate marqué au C dans le surnageant après précipitation quantitative du
substrat sous la forme du sel de Reinecke insoluble. Cette procédure pourrait être utilisée pour
déterminer l'activité AChE dans des échantillons biologiques tels que le cerveau, les
érythrocytes de rat ou les muscles squelettiques humains. La précipitation s'est révélée
remarquablement quantitative et la radioactivité après précipitation simple a été déterminée à
environ 1% de la valeur initiale.
Johnson et Russel en 1975 ont introduit un dosage rapide et simplifié basé sur
l'extraction liquide-liquide. Cette analyse est basée sur les travaux précédemment introduits de
Potter en 1967, qui a extrait l'acétate radiomarqué dans un système de solvant organique
consistant en un mélange toluène-alcool isoamylique à 5/1. Du l’ACh marqué au 3H a été
utilisé comme substrat pour l'hydrolyse enzymatique dans un flacon à scintillation. Après
l'hydrolyse, le mélange réactionnel a été arrêté par addition de tampon (pH 2,5). Cette étape a
conduit à la protonisation de l'acétate libéré et a permis son extraction efficace vers un liquide
de scintillation à base de toluène. L'acétate marqué 3H dans la couche organique peut être
efficacement compté. ACh non hydrolysé marqué 3H dans la couche aqueuse ne peut pas être
compté. Les particules bêta émises par un substrat non hydrolysé sont piégées en phase
aqueuse avant d'atteindre le scintillateur. Par conséquent, la seule radioactivité mesurée est
l’acétate marqué extrait dans la phase organique. Ce test ne diffère que légèrement de la
technique de Potter. Il utilise un substrat marqué au 3H, par opposition au 14
C-ACh, ce qui
permet d’éviter l’extraction post-dosage de Potter et d’utiliser un flacon de comptage comme
récipient de réaction. La technique de Johnsson et Russel a été adoptée pour convenir au
dosage des cholinestérases de la salive. L'activité de la salive cholinestérase s'est révélée être
un marqueur précieux d'intoxication à l'OP ou au carbamate. [56]
1 .3.8. Biocapteurs
Les biocapteurs sont les dispositifs d'analyse qui utilisent la sensibilité et la sélectivité d'un
biorécepteur fixé à la surface d'un transducteur physique.
82
CHOLINESTÉRASIQUE
Les biocapteurs à base de cholinestérase représentent une technique très utile à des fins
analytiques et cliniques. Bien que les biocapteurs à base de cholinestérase soient considérés
comme des outils d'analyse, ils peuvent également être utilisés dans des applications de
chimie médicale ou de toxicologie. Au cours des dernières décennies, les biocapteurs sont
devenus le système susceptible de remplacer les techniques de dosage classiques. Leur
miniaturisation, leur simplicité et leur portabilité représentent les avantages les plus
significatifs.
La première génération de biocapteurs cholinesterasique était un capteur bi-
enzymatique ampérométrique basé sur deux enzymes : la cholinestérase (ChE) et la choline
oxydase (ChO). La choline ne conduisant pas de courant électrique, la ChO est utilisé pour
produire du peroxyde d'hydrogène, qui peut être détecté par ampérométrie lors de sa réduction
en eau par une tension de niveau bas appliquée.
La deuxième génération de capteurs utilise des esters de thiocholine comme substrats.
La thiocholine libérée au cours de la réaction enzymatique est facilement oxydable en dithio-
forme (Figure 36).Le système est basé sur la détection ampérométrique directe de la
thiocholine.
Figure 36. Principe des biocapteurs potentiométriques. [56]
Outre les systèmes mentionnés, diverses autres techniques de biocapteurs peuvent

également être appliquées. Le capteur proposé par La Rosa et ses collègues en 1994 utilise
l'acétate de 4-aminophényle comme substrat. Le produit de la réaction enzymatique peut être
détecté par ampérométrie(Figure 37)Ce substrat présente certains avantages, liés à la moindre
utilisation du potentiel électrique.
83
CHOLINESTÉRASIQUE
Figure 37.Biocapteur selon La Rosa utilisant l'acétate de 4-aminophényle en tant que substrat
[56].
L'autre exemple de biocapteur à base de ChE est un système tri-enzymatique sans

médiateur développé par Ghindilis en 1996. Le capteur est très similaire à la configuration
ampérométrique bi-enzymatique, mais il utilise une troisième enzyme (peroxydase) pour
détecter le peroxyde d'hydrogène généré dans la réaction catalysée par ChO. Les trois
enzymes doivent être co-immobilisés sur la surface de l'électrode de travail. [56]
1.4. Récapitulatif sur les méthodes de dosage

Il est nécessaire de comparer les approches examinées en fonction des paramètres
définissant leur applicabilité à différents types de mesures. Chaque type d'expérience a des
exigences différentes en termes de sélectivité, de sensibilité, de possibilité de suivre l'activité
enzymatique dans le temps et du coût. Certains auteurs exigent un appareil miniaturisé (par
exemple, Test-mate ChE, ChE check mobile), portable et pouvant être utilisé sur le terrain. Le
tableau16 récapitule ces caractéristiques.
La technique la plus utilisée pour déterminer l’activité cholinesterasique est la

colorimétrie d’Ellman. C'est le gold-standard (étalon-or) pour l'évaluation de l’activité
cholinesterasique. Il permet la réalisation une large gamme d'expériences. Il convient à
l'évaluation d'échantillons biologiques, à l'identification de modulateurs des cholinestérases et
à la détermination de leur efficacité. Le principe de la colorimétrie d’Ellman peut être utilisé
dans diverses modifications. Il peut être miniaturisé dans un appareil portable capable
d'évaluer l'exposition aux pesticides ou aux agents neurotoxiques. Couplé avec HPLC, il
permet de mesurer l'activité cholinesterasique en temps réel. Adopté pour les microplaques à
96 puits, il convient aux mesures en parallèle de plusieurs échantillons. Sa limite réside dans
une forte interaction avec l'hémoglobine lors de l'analyse d'un échantillon de sang total, qui
semble être partiellement surmontée par l'adaptation réalisée par Worek et al.
84
CHOLINESTÉRASIQUE
En ce qui concerne les autres techniques, le dosage radiométrique selon Johnson et

Russel est une approche pratique pour les protocoles nécessitant une sensibilité élevée. Les
modifications de cette technique améliorent au minimum les étapes de pré-dosage et ce test
convient donc àla détermination multi-échantillons. En outre, il est également applicable aux
dosages sur tissus, car la compatibilité optique des échantillons n’est pas nécessaire. Les
protocoles fluorométriques sont un outil utile pour la détermination sensible dans les études
cinétiques à de très faibles concentrations en enzymes. La possibilité de déterminer l'agent
cholinergique directement dans des échantillons naturels via des biocapteurs peut être très
utile pour diverses études pharmacologiques et environnementales. La technique du
biocapteur semble être très prometteuse pour le développement futur en raison de sa
miniaturisation disponible, simplicité et portabilité. (Tableau 17)
L’approche optimale de la détermination de l’activité cholinesterasique doit répondre à

plusieurs exigences. Elle doit être suffisamment sensible, la sélectivité pour l’activité AChE et
BChE est nécessaire, elle devrait être capable d'évaluer des échantillons biologiques ainsi que
des études cinétiques et la découverte de nouveaux médicaments, sans coûter cher.
Au cours des dernières décennies, le dosage cholinesterasique a connu un grand
développement, en raison de la demande croissante en compréhension de l’effet de la
modulation enzymatique. Les techniques les plus anciennes ont été développées
principalement pour la détermination de l’activité globale des cholinestérases sans distinction
entre AChE et BChE, cela rend les techniques antérieures peu pratiques pour des expériences
avancées.
Les nouveaux protocoles font l'objet de nombreuses recherches. Cependant, les

principales améliorations concernent l’optimisation et la sélection de nouvelles plateformes
physiques plutôt que l’introduction de nouveaux substrats. Les kits de terrain commerciaux
pour la mesure de l’activité cholinesterasique en routine dans le sang doivent être développés
et optimisés. Un grand potentiel réside dans l'utilisation ultérieure de méthodes à base de
puces, de microélectrodes et de nanotechnologies qui ouvrent de nouvelles possibilités dans
ce domaine. [56]
85
CHOLINESTÉRASIQUE
Tableau 16 : Résumé des méthodes examinées. [56]

Objectif Les approches commodes
Études cinétiques d'inhibition / réactivation photométrie d’ELLMAN
Fluorométrie
Dosage en flux continu
Diagnostic d'intoxication aux Organophosphorés et / ou Titrimétrie
carbamates photométrie d’ELLMAN
Photométrie
Kits à utiliser sur le terrain
Évaluation clinique de routine (outil de diagnostic) Manométrie
Photométrie d’ELLMAN
Photométrie
Études environnementales Biocapteurs
86
CHOLINESTÉRASIQUE
Tableau 17: Comparaison des différentes méthodes de dosage de l’activité cholinesterasique

basée sur différents paramètres [56]
87
CHOLINESTÉRASIQUE
2. Intérêt du dosage de l’activité cholinesterasique dans les intoxications aux

organophosphorés et carbamates
2.1. Pour organophosphorés
2.1.1. Cholinestérases et organophosphorés

Les OP se fixent de façon covalente sur le site estérasique des ChE (Figure 38) et
phosphorylent ou phosphonylent (selon le toxique considéré) leur site actif.
Leur mécanisme d’action principal est le blocage de la dégradation de l’acétylcholine en
choline et en acide acétique par inhibition essentiellement irréversible des cholinestérases. Il
en résulte une accumulation d’acétylcholine à l’origine d’une véritable intoxication de
l’organisme plus connue sous le terme de crise cholinergique.
Quand elle est possible, l’hydrolyse spontanée de la liaison OP–enzyme est très lente et
ne permet pas de retour à la normale sans un traitement réactivateur adapté (oxime). Apres un
temps variable selon l’OP en cause, la liaison avec l’AChE peut devenir insensible à l’action
réactivatrice des oximes du fait d’une désalkylation de l’OP, entrainant une stabilisation du
complexe enzyme-OP : c’est le phénomène dit du vieillissement.
Une fois les ChE inhibées de façon irréversible, voire vieillies, le retour à la normale de
l’activité cholinesterasique est lent : 100 à 120 jours environ pour l’AChE (1 % par jour par
renouvellement des érythrocytes) ; il est plus rapide pour la BChE (environ 3–7 % par jour
par synthèse hépatique ; deux à trois semaines environ seraient nécessaires pour une
récupération totale) [28]
Figure 38. Inhibition des cholinestérases par les neurotoxiques de guerre (NOP). [28]
88
CHOLINESTÉRASIQUE
2. 1.2. Diagnostic de certitude de l’exposition aigue

La mesure de l’inhibition des ChE est le moyen de confirmation diagnostique le plus
fiable de l’intoxication aux OP. Aucune méthode de dosage direct des OP dans le sérum ne
permet en routine cette confirmation. [28]
a. Diagnostic en urgence
Le diagnostic en urgence de l’intoxication aux OP repose sur les circonstances
d’exposition et sur les signes cliniques. Il doit être confirmé au plus tôt par la biologie.
L’effondrement massifet rapide de l’activité cholinesterasique signe une intoxication par un
inhibiteur des ChE, généralement un OP. Une inhibition de l’activité de l’AChE
érythrocytaire de plus de 50 % s’accompagne d’une symptomatologie clinique, et celle de
plus de 90 % est rapidement mortelle.
La corrélation entre baisse de l’activité des ChE et effets toxiques n’est toutefois pas
toujours bonne car ces derniers dépendent non seulement de l’importance de la chute des ChE
mais aussi de sa rapidité. Le dosage de l’activité BChE surestime la sévérité de l’intoxication
pour beaucoup d’OPP qui inhibent d’avantage la BChE que l’AChE. Les NOP ont une
meilleure affinité pour l’AChE. Puisqu’il s’agit de la même enzyme, l’AChE érythrocytaire
est classiquement un meilleur marqueur de l’inhibition synaptique et donc de la sévérité de
l’intoxication même si l’état clinique du patient prime pour le diagnostic de gravité. [28] (voir
annexe XI)
b. Quelle activité cholinesterasique faut-il doser ?

Le dosage de l’activité BChE plasmatique est souvent préféré pour des raisons
techniques. La conservation et le traitement des prélèvements plasmatiques sont plus faciles et
le nombre de laboratoires capables de la doser en routine est plus élevé. L’activité BChE est
donc généralement déterminée en première intention. Puisqu’elle n’est pas impliquée
directement dans la toxicité des OP, l’inhibition de la BChE est un biomarqueurs qui signe
seulement l’exposition au toxique et sa présence dans la circulation. Lors des attentats de
Matsumoto et de Tokyo, plusieurs études ont montré les limites du dosage de l’activité BChE
par rapport à celui de l’activité AChE, plus sensible et meilleur marqueur de l’effet des NOP.
Le dosage de l’activité AChE érythrocytaire est l’indicateur le plus simple et le plus fiable de
l’inhibition de l’AChE synaptique, et donc le meilleur reflet des effets sur la santé. C’est le
meilleur indicateur de l’exposition aux OP.
89
CHOLINESTÉRASIQUE
Si l’activité de base de l’individu n’est pas connue, le dosage de l’activité AChE doit
être réalisé en complément du dosage de l’activité BChE plasmatique pour orienter le
diagnostic vers l’exposition à un inhibiteur de cholinestérase (OP ou carbamate notamment).
Plus que le toxique, c’est la voie de pénétration, et donc la nature des tissus touchés en
premier, qui conditionne l’inhibition des ChE sanguines. Quand le passage systémique est
faible, après exposition à des vapeurs par exemple, l’inhibition sanguine de BChE ou AChE
est limitée malgré des signes locaux parfois sévères (myosis, rhinorrhée ou
bronchoconstriction). Deux victimes de l’attentat de Tokyo ont par exemple été admises avec
des troubles de la conscience et une détresse respiratoire aigue sans modification de l’activité
BChE. Les intoxications ayant été majoritairement provoquées par exposition à des vapeurs
de sarin lors des attaques terroristes de Matsumoto et Tokyo, le myosis à été un marqueur
d’exposition plus sensible que l’activité ChE. [28]
c. Diagnostic de certitude a posteriori : le prélèvement conservatoire

Pour la plupart des OP, la majorité de la dose absorbée est rapidement éliminé dans les
urines, dans les 48 à 72 heures suivant l’exposition. Le dosage de leurs métabolites (acides
methylphosphoniques alkylés) sanguins et urinaires est un outil complémentaire pour le
diagnostic des intoxications. Les échantillons sanguins et urinaires à la prise en charge du
patient, permettent de confirmer la nature du toxique, d’évaluer une exposition, l’importance
d’une intoxication ou de détecter des intoxications aigues ou chroniques à faibles doses au
cours desquelles l’activité cholinesterasique peut rester normale. Ces techniques ne sont pas
disponibles en routine et ne guideront pas le clinicien en phase aigue. Elles pourront apporter
des éléments contributifs dans le cadre de l’enquête a posteriori dans un objectif médicolégal,
notamment pour prouver l’emploi d’arme chimique ou dans le cadre d’exposition
professionnelle. [28]
2.1.3. Marqueur de l’efficacité thérapeutique

L’activité AChE est un bon marqueur du besoin en atropine chez le patient intoxiqué par un
OP. Ce n’est pas le cas de l’activité BChE dont la récupération ne devrait pas être utilisée
comme critère décisionnel pour l’arrêt du traitement par atropine.
L’administration précoce d’une oxime (methylsulfate de pralidoxime) peut corriger, voire
normaliser l’activité AChE érythrocytaire, témoin de l’activité de l’AChE synaptique. La
BChE est beaucoup moins bien réactivée par les oximes. Elle est donc inappropriée pour le
90
CHOLINESTÉRASIQUE
suivi direct de leur efficacité. Cependant, puisque son dosage permet la mise en évidence
d’inhibiteurs circulants, il convient de traiter tant que le toxique circule.
Malgré l’aide apporté par la détermination des activités cholinestérasique, l’efficacité de
l’atropine et de l’oxime sera principalement jugée sur l’efficacité clinique, en particulier sur le
plan respiratoire. [28]
2.1.4. Diagnostic des expositions professionnelles aux organophosphorés

a. Indication
La mesure sanguine de l’activité BChE ou AChE est indiquée à l’embauche, régulièrement
selon le post et à chaque fois qu’une intoxication accidentelle est suspectée. L’institut de
recherche en santé et en sécurité du travail (IRSST) du Canada est en faveur du dosage de
l’activité AChE, tandis qu’en France, l’Institut national de recherche en sécurité (INRS)
préconise les deux types de dosage. La détermination périodique de l’activité BChE est
recommandée chez les travailleurs exposés pour mettre en évidence une exposition infra
clinique aux OP. Une exposition à faibles doses ne modifiera pas forcément l’activité
enzymatique de façon détectable (compte tenu des variabilités intra individuelles et
analytiques) et le dosage de produits du métabolisme des OP (acides phosphoniques urinaires
et sanguins) peut être préférable. [28]
b. Interprétation
Lors de l’exposition chronique, l’activité de l’AChE peut atteindre des niveaux faibles sans
symptômes apparents. Une faible exposition supplémentaire peut provoquer l’apparition des
symptômes. Ils ne sont alors pas uniquement associés au niveau d’inhibition atteint, mais
dépendent aussi de la rapidité avec laquelle la chute d’activité cholinesterasique s’est
produite. L’indicateur biologique d’exposition en France est une activité AChE qui a chuté
jusqu’à 70 % de la valeur de référence individuelle (soit 30 % d’inhibition). C’est le niveau
d’alarme signifiant une exposition possible à un inhibiteur des ChE . Quand la chute de
l’activité des ChE est rapide et massive, le dosage préalable de l’activité moyenne de base
n’est pas indispensable pour le diagnostic de certitude d’une exposition. Il prend tout son
intérêt dans les expositions à de faibles doses induisant des inhibitions comprises dans la
variabilité des mesures.
En pratique, l’activité de la BChE plasmatique de base de chaque travailleur est déterminée
avant toute exposition. Ensuite, il faut attendre trois à six semaines sans contact avec le
toxique. Cette valeur est la moyenne d’au moins deux dosages. Un troisième dosage est
proposé si la variation de l’activité entre les deux premiers dosages est supérieure à 20 % ; ces
91
CHOLINESTÉRASIQUE
deux premiers prélèvements sont effectués séparés de trois à quatorze jours. La conduite à
tenir est résumée en (Figure 39).
Figure 39. Interprétation de la baisse de l’activité cholinesterasique dans le cadre du suivi des
expositions professionnelles. [28]
En l’absence de détermination antérieure de l’activité de la BChE de base, une faible activité

peut, soit signer une intoxication par les OP à faibles doses, soit révéler une variante
génétique de la BChE anormal. Le diagnostic différentiel peut être réalisé par le test à la
dibucaïne :
• Test à la dibucaïne
Il s’agit d’un anesthésique local à fonction ester hydrolysé par la BChE. Au moins six
variantes génétiques de la BChE ont été décrites (A, F, J, K, S, U). Le phénotype normal le
plus courant est la forme U (usual), qui est sensible à l’inhibition par la dibucaïne. Les formes
atypiques de la BChE, sont beaucoup plus rares (< 0,1 % des sérums). Elles ont une forte
résistance à l’inhibition par la dibucaïne. Le résultat s’exprime en nombre de dibucaïne défini
par le pourcentage d’inhibition de la dibucaïne. Il permet d’identifier trois génotypes : la
BChE des individus normaux (UU), inhibée de 80 % environ, celle des homozygotes (AA) de
20 % et celle des hétérozygotes de 60 %. Un individu homozygote AA a une BChE inferieure
à 50 % de la normale (généralement entre 10 et 30 %), et un individu hétérozygote UA a une
92
CHOLINESTÉRASIQUE
BChE à 75 % de la normale. Mais si les méthodes biochimiques différencient les phénotypes

UU, UA, et AA, elles n’autorisent malheureusement pas une discrimination de tous les
phénotypes. Pour de nombreuses variantes, seule l’analyse de l’ADN permet de déterminer le
génotype précis de la BChE d’un patient. C’est l’apport de la biologie moléculaire, avec étude
génétique de l’ADN du patient qui permet de dépister les mutations à l’origine des variantes
génétiques, et par conséquent les patients qui présentent un déficit génétique en BChE. Si des
formes atypiques de la BChE sont mises en évidence, silencieuses cliniquement, l’usage des
curares tels que la succinylcholine et le mivacurium sont contre-indiqués. [29]
Dans l’armée américaine on préconise un dosage périodique de l’activité AChE pour les
personnels potentiellement exposés aux NOP (ceux qui les manipulent sur le terrain ou les
scientifiques en laboratoire). Il est obligatoire en Californie pour la surveillance des
travailleurs exposés aux OPP. En pratique, la détermination de l’activité AChE individuelle
de base est nécessaire avant toute exposition. Elle est obtenue par la moyenne de deux
dosages réalisés à quelques jours d’écart (3 à 14 jours). La conduite à tenir est résumée par la
Figure 40. [38]
Figure 40. Surveillance des travailleurs exposés aux neurotoxiques de guerre (NOP) [28].
93
CHOLINESTÉRASIQUE
2.2. Pour les carbamates

Comme les insecticides organophosphorés, les carbamates inhibent l'activité des
cholinestérases dans le sang, le cerveau et la plupart des autres tissus, de sorte que
l'acétylcholine s'accumule au niveau des synapses du système autonome, de certaines
synapses du système nerveux central et des terminaisons nerveuses.
Inhibition des cholinestérases par les carbamates est réversible, c’est pourquoi l’intérêt
du dosage des cholinestérases dans le diagnostic et le suivi des intoxications aux carbamates
est discuté. Certains auteurs considèrent que ce dosage n’est pas utile et n’est pas contributif
en raison de l’évolution rapide et favorable de l’intoxication, d’autres lui confèrent un intérêt
diagnostique limité, car l’inhibition des cholinestérases n’est en général que transitoire et les
estérases inhibées sont décarbamylées et régénérées pendant l’opération de dosage (in vitro),
en particulier en cas de dilution de l’échantillon.
Par contre l'inhibition des cholinestérases plasmatiques s’est révélée, dans certains cas,
prolongée d’où l’intérêt du dosage de ces enzymes dans le suivi des intoxications aiguës. Il
faut garder à l’esprit que, bien que la vitesse de régénération de l’enzyme liée au carbamate
soit relativement rapide en comparaison à celle de l’enzyme phosphorylée (en cas
d’intoxication par les organophosphorés), elle serait plus lente avec certains carbamates
comme c’est le cas de l’aldicarbe.De plus les AChE sont inhibées plus lentement par les
carbamates méthylés ou diméthylés in vitro, et leur réactivation spontanée est également plus
lente. [36]
Malgré des défauts de spécificité, la mesure de l’BChE, plus facile à réaliser et plus
sensible que celle de l’AChE, est indiquée pour confirmer rapidement le diagnostic de
l’intoxication aiguë et pour le suivi évolutif de l’intoxication. En revanche, ce dosage doit être
interprété avec prudence dans ce type d’intoxication. Car la détection d'une baisse modérée
de l’activité implique la connaissance préalable du taux basal de l'individu.
La mesure des AChE est un meilleur indicateur de l'activité cholinesterasique au niveau
des synapses neuronales que celle des BChE. Ce test est plus fiable mais plus difficile à
réaliser. La plupart des laboratoires ne maîtrisent pas la technique spéciale permettant de
déterminer l'activité des cholinestérases globulaire en présence de carbamates car les
conditions de prélèvement et de transport de l’échantillon sont particulièrement critiques et
l'analyse doit être effectuée très rapidement après l'intoxication, le prélèvement analysé
immédiatement (ou congelé immédiatement à -20C).
94
CHOLINESTÉRASIQUE
Il en ressort enfin que la mesure de l’activité des cholinestérases confirme rapidement

l’intoxication aiguë aux carbamates d’abord évoquée par le tableau cholinergique, contribue à
garantir une prise en charge spécifique de l’intoxication par l’instauration d’un traitement
régénérateur afin de réactiver au plus vite les cholinestérases, et pourra permettre de juger de
l’efficacité de ce traitement et de la rémission progressive de l’intoxiqué. [36]
95
PARTIE II
PARTIE PRATIQUE
CHAPITRE I :
MATÉRIELS ET MÉTHODES
PARTIE PRATIQUE CHAPITRE I :
MATÉRIELS ET MÉTHODE
1. Type de l’étude
L’étude réalisée est une étude descriptive effectuée durant la période s’étalant du mois
de décembre 2018 au mois de mars 2019. L’étude consiste en le dosage de l’activité
cholinestérasique sur COBAS interga 400 plus .
L’étude s’est déroulée au CHU NEDIR MOHAMED de TIZI OUZOU, en tant que structure
sanitaire de référence de cette région et où se trouve plusieurs services cliniques et
biologiques parmi lesquels, le laboratoire de biochimie et celui de toxicologie où
l’environnement analytique offre un cadre de travail pour notre étude.
2. Population de l’étude
L’étude a été réalisée sur un groupe de 60 personnes en bonne santé provenant de la
région centre comprenant les wilayas : TIZI OUZOU, BOUMERDES et BOUIRA, reparties
en trois groupes de 20 personnes chacun.
- La premier groupe est composé d’hommes donneurs de sang au niveau du centre de
transfusion sanguin de Tizi Ouzou (CTS) ;
- Le deuxième groupe est composé de jeunes femmes : étudiantes, travaillant à l’hôpital
ou venant à l’hôpital en tant que visiteuses âgées de 16 à 39 ans ;
- Le troisième groupe est composé de femmes enceintes venant consulter à
l’établissement public de santé de proximité de Draa Ben Khedda Tizi-Ouzou et du personnel
de l’hôpital.
3. Echantillonnage
Une méthode d’échantillonnage direct (recommandée par le comité IFCC /CLSI) avec
une sélection a priori a été utilisée.
Une fiche de renseignement fixant les critères d’inclusion et de non inclusion a été établie et
remplie avant chaque prélèvement et sur la base de laquelle une sélection d’individus en
bonne santé a été effectuée (Annexes I et II)
95
Figure 41 : Schéma de la validation des valeurs de référence
3.1 Critères d’inclusion

Ø Des critères communs ont été fixés pour les trois classes, ont été inclus dans l’étude des
personnes :
• En bonne santé, ne présentant ni :
§ De maladies aigues ;
§ De maladies chroniques;
§ Problèmes hépatiques et rénaux ;
§ Anémies ;
§ Troubles neuromusculaires ;
§ N’ayant pas été hospitalisé dans le mois précédant ;
§ N’ayant pas subis de curarisation ;
§ N’ayant pas pris de médicament 10 jours avant.
Ø En plus des critères cités précédemment, des critères d’inclusion ont été également fixés
pour chaque classe :
• Pour la première classe, ont été inclus :
- Les hommes adultes (âgé de plus de 18 ans) ;
• Pour la deuxième classe ont été incluses :
96
- Les femmes âgées entre 16 et 39 ans ;
- Les femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux.
• Pour la troisième classe ont été incluses :
- Les femmes âgées entre 18 et 41 ans ;
- Les femmes enceintes de plus de 3 mois.
3.2. Critères de non inclusion

Des critères de non inclusion communs aux trois classes ont été fixés
- Exposition aux pesticides (organophosphorés ou carbamates)
C'est ainsi que les 60 personnes constituant nos trois classes ont été retenues.
4. Analyse statistique
- Les résultats sont classés dans un fichier Excel en trois classes.
- Le test de Dixon est appliqué pour l’élimination des valeurs aberrantes ;
- Pour les variables quantitatives on a calculé les moyennes ± leurs écarts-types, valeur
minimale, valeur maximale, la médiane, 1er et le 3ème quartile.
- Pour les variables qualitatives, on a calculé les pourcentages.
- Pour les calculs des moyennes, écarts-types, médiane, pourcentages, quartiles, on a
utilisé le logiciel Microsoft EXCEL 2007.
- Pour la présentation des graphes on a utilisé l’EXCEL et le logiciel DISPLAYR en
ligne.
- Étude de corrélation avec le logiciel : INSTAT3
5. Critères de jugement
5.1. Pour les intervalles de référence de l’activité cholinestérasique
Ø Les intervalles de références à vérifier sont acceptés si le nombre de résultats en dehors
des limites est inférieur ou égal à 2.
Ø Une nouvelle sélection de 20 échantillons biologiques est analysée si le nombre de
résultats en dehors des limites proposées est égal à 3 : le même protocole que précédemment
est appliqué. Dans ces conditions, les intervalles de référence à vérifier sont acceptés si le
nombre de résultats de la nouvelle sélection en dehors des limites est inférieur ou égal à 2.
Ø Dans le cas où 4 résultats ou plus sont en dehors des limites proposées, il est conseillé
de revoir la procédure analytique, d'envisager la présence de possibles différences biologiques
97
et/ou démographiques et de déterminer les intervalles de référence de la méthode utilisée
suivant le protocole originel
Ø Intervalles de référence
- Femmes à partir de 40 ans, enfants, hommes : 5320-12 920 U/L (89-215 ukat/l)
- Femmes (de 16 à 39 ans) ne présentant pas de grossesse et ne prenant pas de

contraceptifs oraux : 4260-11250 U/L (71-187 ukat/l)
- Femmes de (18 à 41 ans) enceintes ou sous contraceptifs oraux : 3650-9120 U/L (61-
152 ukat/l)
5 .2.Pour l’indice de masse corporelle (IMC)

Permet d’évaluer rapidement la corpulence simplement avec le poids et la taille, quel
que soit le sexe.
C’est le seul indice validé par l’Organisation mondiale de la santé pour évaluer la
corpulence d’un individu et donc les éventuels risques pour la santé. L’IMC permet de
déterminer si l’on est en situation de maigreur, de surpoids ou d’obésité par exemple. Il se
calcule simplement en divisant le poids (en kg) par le carré de la taille (m). Dans le tableau
qui suit les 4 grandes classes selon la valeur calculé obtenue :
Tableau 18 : L’interprétation de l’IMC selon l’OMS
L’indice de masse corporelle (IMC) Interprétation (d’après l’OMS)

Insuffisance pondérale ˂18,5
Corpulence normale [18,5-24,9]
Surpoids [25-29,9]
Obésité ≥30
6. Matériels
6.1. Matériels utilisés pour les prélèvements
- Tubes secs en plastique et héparinés (héparinate de lithium) de 4 ml ;
- Epicrâniennes de taille G20 ;
- Gants et garrots en plastique ;
- Alcool chirurgical à 90° et coton pour la désinfection ;
- Sparadrap ;
98
- Portoirs ;
- Une glacière
6.2. Matériels pour l’analyse
- Godets ;
- Un automate COBAS intégra 400plus de la marque « Roche » ;
Figure 42: Automate COBAS integra 400plus[61]
- Centrifugeuses (ROTOFIX 32 A, EBA 20)
Figure 43 : A : Centrifugeuse ROTOFIX 32A. B : Centrifugeuse EBA 20.
99
- Des micropipettes (PIPETMAN GILSON réglable 1000 ul)
Figure 44 : Micropipette PIPETMAN GILSON
- Embouts de pipettes ;
Figure 45 : Embouts de pipettes
- Un réactif chimique prêt à l’emploi : Cholinesterase Gen 2 (CHE2)

§ Composition : substrat butyrylthiocholine,
§ Conservation : conservé dans une chambre froide entre 2 et 8°C jusqu'à sa
date de péremption.
§ Préparation : prêt à l’emploi.
§ Référence : 04498577 190
§ Numéro de lot:33812201
§ Marque : Roche
100
Figure 46: Réactif Cholinestérase Gen 2 (CHE2)
- Deux contrôles : PreciControl ClinChem Multi 1 (PCC1)

PreciControl ClinChem Multi 2 (PCC2)
§ Composition : Lyophilisat à base de sérum humain
§ Conservation : Conservés dans une chambre froide entre 2 et 8°C jusqu’à
la date de péremption. Après reconstitution les constituants sont stables
pendant :
- 12h (15 à 25C°)

- 5 jours (2 à 8)
- 28 jours (-25 à -15)
§ Préparation : introduire 5 ml d’eau distillée ou désionisée et dissoudre le

contenu dans un délai de 30 mn.
101
Référence : 05117003190
Numéro de lot:19110208
Marque : Roche
Figure47: PreciControl ClinChem Multi 1 (PCC1)
Référence : 05117216190
Numéro de lot:19111101
Marque : Roche
Figure 48: PreciControl ClinChem Multi 2 (PCC2)
- Calibrateur :Calibrator For Automated Systems (C .f. a .s)

§ Composition : Lyophilisat à base de sérum humain
§ Conservation : Conservé dans une chambre froide entre 2 et 8°C jusqu’à
sa date de péremption
102
§ Préparation : liquide prêt à l’emploi
§ Référence : 10759350 190
§ Numéro de lot: 25013501
§ Marque : Roche
Figure 49: Calibrator For Automated Systems (C .f. a .s)
7. Protocole opératoire
7.1. Etape pré-analytique
Elle concerne la préparation du sujet pour le prélèvement, la collecte des échantillons, la
centrifugation et la récupération des plasmas avant l’analyse.
L’étape pré analytique est très importante et déterminante, elle a été effectuée de la même
manière pour tous les sujets et tous les échantillons afin de garantir la validité des résultats.
L’objectif étant d’uniformiser la procédure pour tous les prélèvements afin de minimiser les
variations des résultats.
7.1.1. Fiche de renseignements :

C’est un formulaire contenant des données relatives au sujet, présenté sous forme d’un
questionnaire qui doit être remplie soigneusement avant le prélèvement sanguin et elle
contient :
- Questions relatives aux critères d’inclusions et d’exclusions ;
- Identification de participant : Nom, prénom, âge, résidence ;
103
- Données anthropométriques : Taille, poids ;
- Date et l’heure du prélèvement.
7.1.2. Déroulement du prélèvement

- Les prélèvements se sont déroulés au niveau du CHU NEDIR MOHAMED de TIZI
OUZOU, au sein de trois services à savoir le service de microbiologie, service de
toxicologie et le centre de transfusion sanguin et au niveau de la clinique de la
nouvelle ville de Tizi Ouzou le matin entre 9 heures et 11 heures ;
- Après la préparation du matériel de prélèvement, une vérification de l'identité du
patient est effectuée et la fiche de renseignement est soigneusement remplie.
- Si la personne répond aux critères d’inclusion un prélèvement est réalisé par ponction
veineuse pli du coude ;
- Cette analyse nécessite un prélèvement sur un tube hépariné, ce dernier est mélangé
soigneusement après son remplissage ;
- L'étiquetage des tubes a été fait systématiquement après le prélèvement et l’heure du
prélèvement a été mentionnée sur la fiche de renseignement.
7.1.3. Centrifugation
- Une fois les prélèvements réalisés, une centrifugation des échantillons est effectué
dans l’immédiat pendant 2 à 5 mn à 3460 tours par min ;
o Pour les prélèvements effectués au niveau de CHU NEDIR de TIZI OUZOU
(service microbiologie) la centrifugation est effectuée au laboratoire de
biochimie ;
o Pour les prélèvements effectués au service de toxicologie ou au CTS, la
centrifugation est effectuée au laboratoire de toxicologie ;
o Pour les prélèvements effectués à l’établissement public de santé de proximité
de Draa Ben Khedda Tizi-Ouzou, la centrifugation est effectuée au laboratoire
de biochimie de cet établissement.
- Apres centrifugation le plasma est récupéré dans un tube sec.
- Les plasmas présentant une hémolyse à l’œil nu sont rejetés.
104
7.1.4. Transport
L’objectif principal est d’acheminer les échantillons à analyser au laboratoire sans
altération et dans les plus brefs délais. La durée de transport des tubes prélevés est la plus
faible possible :
- Pour les prélèvements effectués au niveau de CHU NEDIR de TIZI OUZOU (service
microbiologie), ils ont été acheminés au laboratoire de biochimie immédiatement.
- Pour les prélèvements effectués au service de toxicologie, CTS ou à l’EPSP DBK de
Tizi Ouzou, ils ont été transportés dans une glacière dans un délai de moins d’une
demi-heure, à l’abri de la lumière et en position verticale pour éviter toute altération
possible au laboratoire de biochimie.
7.2. Etape analytique

L’analyse des échantillons a été faite par COBAS intégra 400plusau niveau du laboratoire
de biochimie du CHU NEDIR MOHAMED de TIZI OUZOU.
7.2.1. Programmation
Une fois les prélèvements arrivés au laboratoire de biochimie, le contenu des tubes secs
plus
est transvasé dans des godets et mis dans les portoirs du COBAS INTEGRA 400 et les
échantillons sont programmés.
7.2.2. Présentation de l’appareil :

Cet instrument permet de doser des enzymes, des substrats, des protéines spécifiques,
des médicaments et des drogues. En fonction des paramètres, les dosages se réalisent sur du
sérum, du plasma ou de l’urine.
Le COBAS Intégra est un appareil de chimie liquide, les réactifs sont contenus dans des
cassettes à l’intérieur de l’automate dans un compartiment réfrigéré. Ce système possède de
nombreux avantages : il est rapide ce qui permet de travailler en urgence mais il convient
également très bien pour la routine. C’est un appareil autonome qui effectue lui-même la
plupart de ses maintenances et les dilutions des échantillons.
105
Tableau 19: Quelques spécifications de système COBAS INTEGRA 400 plus.
Principe de mesure Intégration de quatre principes de mesure : Photométrie
d’absorption, turbidimétrie, polarimétrie de fluorescence,
potentiométrie directe et indirecte.
Système Système d’analyse à accès aléatoire et sélection d’échantillons.
36 tests à bord.
Types d’échantillon Sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, hémolysat et
sang total (HbA1c).
Types de substance Enzymes, substrats, protéines spécifiques, drogues, médicaments
et électrolytes.
Volume d’échantillon Normalement 2 à 10 µl par test.
Dimensions Largeur : 135 cm, Profondeur : 66 cm et Hauteur : 75 cm.

Conditions Thermorégulation des calibrateurs, contrôles et échantillons dans
d’utilisation le système, Compartiment pour réactifs réfrigéré de 10 à 15 °C.
7.2.3. Principe de mesure de l’automate

plus
Les dosages effectués sur COBAS integra 400 reposent sur plusieurs principes de
mesure différents, il intègre quatre principes de mesure : Photométrie d’absorption,
turbidimétrie, polarimétrie de fluorescence, potentiométrie directe et indirecte, nous détaillons
la photométrie d’absorption utilisée pour la mesure des cholinestérases.
- Principe de la photométrie d’absorption :
La photométrie est une méthode d’analyse basée sur le fait que les substances colorées
absorbent une partie du spectre lumineux. Lorsqu’un rayon lumineux traverse une substance,
une partie de la lumière traverse la solution, une autre est absorbée par les particules en
solution et une petite partie est dispersée. La photométrie va s’intéresser à la partie du spectre
lumineux qui est absorbée par la substance. L’absorbance d’une solution est proportionnelle à
l’épaisseur de la solution et à sa concentration. Lorsque la lumière passe à travers une
substance colorée, l’intensité de la lumière est réduite et cette diminution se fait en fonction
de la substance et de l’épaisseur traversée. Cette relation est définie par la loi de Beer-
Lambert :
106
Tel que :
- A= Absorbance,
- C= Concentration en mol/l,
- d= Trajet optique en cm,
- ε= Coefficient d’absorbance molaire).
Cette équation prend en compte le coefficient d’absorbance molaire. C’est une constante
spécifique à chaque substance mesurée mais dépendant de la longueur d’onde utilisée. Si le
coefficient est connu, on peut appliquer directement la formule de Beer -Lambert pour
calculer la concentration d’une substance à partir de son absorbance. Sinon étant donné que la
loi de Beer -Lambert démontre la linéarité de la relation entre l’absorbance et la
concentration, on peut également calculer la concentration d’un échantillon en introduisant un
calibrateur de concentration connue dans la série.
A calibrateur /C calibrateur = A échantillon / C échantillon.
Les calculs de concentration avec ou sans étalon sont possibles uniquement dans la zone
de loi de Beer-Lambert, la zone où l’absorbance de la substance est proportionnelle à sa
concentration. C’est ce qu’on définit comme la limite de linéarité qui est déterminée en
effectuant une courbe de calibration.
Le photomètre est constitué de plusieurs éléments :

- Une source lumineuse : La stabilité est un élément primordial car l’énergie de la
source ne doit pas varier au cours d’une mesure. Il existe plusieurs sortes de lampe.
Sur l’Intégra, on retrouve une lampe halogène qui fournit un spectre dans le visible et
dans le proche UV.
- Une fente d’entrée : Cette ouverture permet de concentrer le faisceau lumineux et de
sélectionner sa largeur ou sa surface. Elle assure également le parallélisme du
faisceau, ce qui donne un meilleur fonctionnement des filtres et des réseaux.
- Un monochromateur : Il permet de séparer une radiation de longueur d’onde définie à
partir d’un mélange de radiations lumineuses, c'est-à-dire de décomposer la lumière.
- Une cuve : La qualité des cuves est un élément important. Les cuvettes sont classées
par taille, matériaux ou encore selon leur principe de fonctionnement. Pour l’Integra,
107
on utilise des cuves en plastique acrylique à usage unique et faible coût, leur principal
avantage est d’éviter la contamination entre les dosages.
- Le détecteur d’intensité lumineuse : Ce détecteur capte la lumière transmise et mesure
l’absorbance. Sur l’Integra, les détecteurs sont des barrettes de diodes. Une barrette de
diodes contient plusieurs centaines de diodes et chacune reçoit un rayonnement
contenu dans un petit domaine spectral.
Figure 49:Principe de la Photométrie d’absorption [61]
- Principe du dosage de l’activité cholinesterasique (BChE) sur COBAS intégra 400

plus :
La détermination de l'activité des cholinestérases sur le COBAS integra 400 PLUS repose
sur la réaction d'hydrolyse de la butyrylthiocholine puis quantification du produit de
décomposition.
La butyrylcholinestérase hydrolyse la butyrylthiocholine en thiocholine et en butyrate, la
thiocholine réduit instantanément l’hexacyanoferrate (III) de potassium de couleur jaune en
un hexacyanoferrate (II) incolore. La diminution de la coloration peut être mesurée à des
longueurs d’onde entre 405 et 415 nm.
108
Figure 50 : Principe de dosage de l’activité cholinesterasique (BChE) sur COBAS intégra

400 plus [Annexe 06]
7.2.4. Domaine de mesure
- Domaine de mesure : 200-14OOO U /L (3,34-234 ukat /L)
- Domaine de mesure plus étendu (calculé), facteur de post dilution : 2 recommandé

200-28000 U /L (3,34-468 ukat /L)
- Limite inferieure de détection : 200 U /L (3,34 ukat /L)
- La limite inferieure de détection correspond au plus faible taux d’analyse mesurable

pouvant être distingué de zéro .Elle est obtenue par calcul et correspond au triple de
l’écart-type du standards zéro (standard 0 +3s, précision intra – série : n=21)
7.2.6. Précision
Selon le fournisseur, la reproductibilité à été déterminée à l’aide d’échantillons humains
et de contrôles selon un protocole interne (précision intra-série n=21, inter-série n=21). Les
résultats suivants ont été obtenus :
Tableau 20: Précisions de COBAS INTERGRA 400PLUS[Annexe 06]

Précision intra-série Précision inter-série
Echantillon Moyenne CV Moyenne CV
U/L ukat /L % U/L ukat /L %
Sérum humain 6374 106 0,5 6675 111 1,4
Precinorm U 6263 105 0,6 6213 104 1,1
Precipath U 6015 100 0,6 5964 100 0,9
109
7.2.7. Calibration
La calibration est un procédé permettant d’établir une relation entre l’absorbance et la
concentration du calibreur correspondant. En général, l’appareil demande une calibration à
chaque nouveau lot de réactif mais ces exigences varient en fonction des paramètres.
Pour effectuer cette courbe, on passe sur l’appareil un standard de concentration connue.
L’appareil va effectuer plusieurs dilutions avec le calibreur. Chaque dilution est mesurée.
Puis, l’automate représente les résultats à l’aide d’un graphique où les concentrations se
trouvent sur l’axe des abscisses et les absorbances sur l’axe des ordonnées. Les points
correspondants à nos dilutions sont reliés et la zone linéaire sera représentée par cette droite.
La zone linéaire commence à la limite de détection et finit par la limite de linéarité. La limite
de linéarité est très importante car en dehors de ces limites, la concentration n’est plus
proportionnelle à l’absorbance et les résultats sont faux.
7.2.8. Contrôle
La validation d’un automate comprend une phase initiale avant son utilisation en
routine, une phase de vérification continue et de confirmation des performances pour
contrôler la qualité du processus analytique et donc des résultats lors du fonctionnement
quotidien.
Les bonnes pratiques de laboratoire exigent des contrôles normaux et pathologiques
pour chaque test au moins quotidiennement afin de surveiller le processus analytique. Si le
test est stable moins de 24 heures ou suite à une modification capable d’affecter
potentiellement la stabilité du test, des contrôles doivent être passés plus fréquemment.
Des contrôles ont été effectués avant chaque analyse de l’activité cholinestérasique. Et
l’analyse est effectuée uniquement si les valeurs retrouvées sont incluses dans l’intervalle
fourni par Roche pour COBAS :
• Pour le PCC 1 :
- Intervalle : 4710-6810 U/L
- Valeur cible : 5760U/L
• Pour le PCC2 :
- Intervalle : 7090-5450U/L
- Valeur cible : 8650U/L
110
8. Ethique
Avant tout recrutement d’individu, nous avons procédé à l’explication de l’objectif et
l’intérêt de notre étude afin d’obtenir de sa part un consentement.
Une fois que le sujet marque son accord, nous procédons au questionnaire pour le remplissage
de la fiche de renseignement et ensuite au prélèvement.
111
CHAPITRE II :
RÉSULTATS
PARTIE PRATIQUE CHAPITRE II : RÉSULTATS
1 Caractéristiques de la population
1.1. Distribution selon l’âge
1.1.1. Hommes
La moyenne d’âge chez les hommes est de 35.3±10 ans avec des extrêmes variantes de 21 à
52 ans.
75% des hommes de l’étude avaient un âge compris entre 21 et 42 ans. (Graphe 1)
Graphe 01: Répartition du groupe des hommes selon l’âge.
1.1 .2. Femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux

La moyenne d’âge chez les femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux est
de 27.8±5 ans avec des extrêmes variant de 21 à 40 ans.
75% des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux de l’étude avaient un
âge entre 21 et 30,5 ans.(Graphe 02)
111
Graphe 02: Répartition du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de
contraceptifs oraux selon l’âge.
1.1.3. Femmes enceintes

La moyenne d’âge chez les femmes enceintes est de 33.2±4 ans avec des extrêmes variant de
24 à 39 ans.
75% des femmes enceintes de l’étude avaient un âge entre 24 et 36 ans.(Graphe 03)
Graphe 03 : Répartition du groupe des femmes enceintes selon l’âge
112
1.2. Répartition géographique

Toutes les personnes de cette étude étaient originaires de TIZI OUZOU, BOUMERDES ou
de BOUIRA.
1.2.1 .Hommes
60% des hommes de l’étude habitaient en milieu rurale contre 40% qui habitaient en milieu
urbain. (Graphe 04)
Graphe 04 : Répartition géographique du groupe des hommes.
1.2 .2.Femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux

60% des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux de l’étude habitaient
en en milieu rurale contre 40% qui habitaient en milieu urbain.(Graphe 05)
113
Graphe 05:Répartition géographique du groupe des femmes non enceintes non sous
contraceptifs.
1.2.3 .Femmes enceintes

90% des femmes enceintes de l’étude habitaient en en milieu urbain.
Graphe 06:Répartition géographique du groupe des femmes enceintes.
114
1.3. Distribution selon l’indice de masse corporelle (IMC)

1.3.1. Hommes
La tranche « Surpoids » est la tranche dominante chez les hommes, 75 % du groupe sont en
surpoids ou obèse. (Graphe 07, Tableau 21)
Tableau 21 : Distribution du groupe des hommes selon l’IMC

L’interprétation (selon l’OMS) IMC (kg /m) Nombre d’effectif
Insuffisance pondérale ˂18,5 0
Corpulence normale [18,5-24,9] 5
Surpoids [25-29,9] 10
Obésité ≥30 5
12
10
8
Nombre l'effectif
0
<18,5 [18,5-24,9] [25-29,9] ≥30
IMC (kg/m)
Graphe 07 : Distribution du groupe des hommes selon l’IMC.
1.3.2. Femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux

La tranche « corpulence normale » est la tranche dominante chez les femmes non enceintes et
ne prenant pas de contraceptifs oraux, cette tranche représente 65% de l’effectif total.
115
Tableau 22: Distribution du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de
contraceptifs oraux des selon l’IMC
L’interprétation (selon l’OMS) IMC (kg /m) Nombre d’effectif

Insuffisance pondérale ˂18,5 2
Corpulence normale [18,5-24,9] 13
Surpoids [25-29,9] 3
Obésité ≥30 2
14
12
10
Nombre d'effectif
0
<18,5 [18,5-24,9] [25-29,9] ≥30
l'IMC (kg/m)
Graphe 08 : Distribution du groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de

contraceptifs oraux selon l’IMC
2 .Résultats
2.1. Résultats de l’activité cholinestérasique
2 .1.1. Hommes
La moyenne des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique chez les hommes est
de 9180,2 U /L± 1428,75 avec des extrêmes variantes de 6255 à 11820 U/L.(Tableau 23)
75% des hommes de l’étude ont une valeur comprise entre 6255 et 10347,5U /L.(Graphe 09)
Les valeurs de l’activité cholinestérasique retrouvées en annexe III.
116
Tableau 23 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinesterasique pour le

groupe des hommes
Nombre de prélèvement 20
Valeur minimale 6255
1er quartile 7968,5
Médiane 9135,5
3ème quartile 10347,5
Valeur maximale 11820
Moyenne 9180 ,2
Ecart type 1428,75
Coefficient de variation % 0,155%
Graphe 09 : Distribution des valeurs de l’activité cholinesterasique plasmatique pour le

groupe des hommes
117
2 .1.2. Femmes non enceintes ne prenant pas de contraceptifs oraux

La moyenne des valeurs de l’activité cholinestérasique chez les femmes non enceintes et ne
prenant pas de contraceptifs oraux est de 7349,75 U /L±1069,36 avec des extrêmes variantes
de 5118 à 9469U/L. (Tableau 24)
75% des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux de l’étude avaient une
valeur comprise entre 5118 et 7805U /L. (Graphe 11)
Les valeurs de l’activité cholinestérasique retrouvées en annexe IV.
Tableau 24 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinesterasique pour

groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux.
1er quartile 6566

Médiane 7451
3ème quartile 7805
Moyenne 7349,75
Ecart type 1069,36
Coefficient de variation% 0,14%
118

groupe des femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux.
2.1 .3. Pour les femmes enceintes

La moyenne des valeurs de l’activité cholinestérasique chez les femmes enceintes est de
6383,6 U /L±1139.408 avec des extrêmes variantes de 4404 à 8464U/L. (Tableau 25)
75% des femmes enceintes de l’étude ont une valeur comprise entre 4404 et 7178,5U /L
(Graphe 11)
Les valeurs de l’activité cholinestérasique retrouvées en annexe V.
Tableau 25: Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinesterasique de la

classe des femmes enceintes
1er quartile 5750
Médiane 6178,5
3ème quartile 7178,5
Moyenne 6383,6
Ecart type 1139,408
Coefficient de variation 0,178%
119

groupe des femmes enceintes.
2.1 .4. Pour les trois groupes

Les valeurs de l’activité cholinestérasique de l’étude chez les trois groupes se
distribuent d’une façon tel que : Celles retrouvées chez les hommes sont plus élevées (Min :
6255U/L, Max : 11820U/L) que celles retrouvées chez les femmes non enceintes et ne
prenant pas de contraceptifs oraux (Min : 5118U/L, Max : 9469U/L) et ces dernières sont plus
élevées que celles retrouvées chez les femmes enceintes (Min : 4404U/L, Max :
8464U/L).(graphe 12)
120
Graphe 12 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique pour les trois groupes
2.2. Étude de corrélation

2.2.1. Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge
a. Hommes
La corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge pour le groupe des hommes est non
significative (P=0.5039) (Graphe 13) (Voir résultats statistiques en annexe VII)
P= 0.5039
Graphe 1 3 : Étude de corrélation de l’âge avec l’activité cholinestérasique chez le groupe

des hommes
121
b. Femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux

La corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’âge pour le groupe des femmes non
enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux est non significative. (P=0.3096) (Graphe
14)(Voir résultats statistiques en annexe VIII)
P = 0,3076
Graphe 14 : Étude de corrélation de l’âge avec l’activité cholinestérasique chez le groupe des
femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux
2.2.2. Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC

a. Hommes
La corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC pour le groupe des hommes est non
significative. (P=0.2636) (Graphe 15) (Voir résultats statistiques en annexe IX)
P = 0,2636
Graphe 15 : Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC chez le groupe

des hommes
122
b. Femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux

La corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC pour le groupe des femmes non
enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux est non significative. (P=0.9430) (Graphe
16) (Voir résultats statistiques en annexe X)
P=0 ,9430
Graphe 16:Étude de corrélation de l’IMC avec l’activité cholinestérasique chez le groupe des
femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux
123
DISCUSSIONS
PARTIE PRATIQUE DISCUSSIONS
L’étude consiste en la validation de l’IR de l’activité cholinesterasique chez les hommes

adultes, les femmes enceintes ainsi que les femmes non enceintes ne prenant pas de
contraception orale sur COBAS intégra 400plus. Pour cela un procédé de sélection d’un
nombre de 20 personnes pour chaque groupe a été réalisé, ce dernier est le nombre qu’exige le
protocole de validation des intervalles de référence au laboratoire de biologie médicale selon
les recommandations internationales de l’IFCC LM et du CLSI.
1. Contraintes
- Le manque de sources pour la recherche bibliographique a empêché l’accès à des
articles qui aurait été d’une grande utilité.
- La sélection d’un groupe de référence constitue la tâche la plus difficile lors de
l’établissement et de la validation des intervalles de référence car la définition de l’état
de « bonne santé » est particulièrement complexe à établir et suppose qu’une multitude
de conditions soient réunies. Une sélection faite par l’anamnèse ne permet pas de
troncher sur l’état de bonne santé des individus sélectionnés vu que les examens
complémentaires n’ont pas été faits ;
- Il est difficile de sélectionner sur un nombre forcément restreint un groupe d’individus
représentatif, un déplacement vers plusieurs unités a été nécessaire pour pouvoir
faire une sélection des personnes exigées à savoir le centre de transfusion sanguin
(CTS), à l’établissement public de santé de proximité de Draa Ben Khedda Tizi-Ouzou
particulièrement pour les femmes enceintes ainsi que le laboratoire de microbiologie ;
- Il n’y pas de salle de prélèvement prévue pour les prélèvements au niveau de l’hôpital,
ce qui a vraiment ralenti le déroulement des prélèvements.
- Des pannes techniques rencontrées au cours de l’étape pré-analytique du dosage
(calibration) ont eu pour conséquence l’altération des prélèvements (délai de dosage
dépassé) de la première sélection de groupe des hommes. Une nouvelle sélection pour
ce groupe a été nécessaire ;
- L’étude de corrélation des résultats de l’activité cholinestérasique avec l’IMC et avec
l’âge chez la femme enceinte n’ont pas été fait car l’interprétation des corrélations
dans de ce cas est délicate vu que :
• La grossesse est un état physiologique particulier durant laquelle il y a
une augmentation physiologique du poids de la femme en fonction de l’âge de la grossesse ;
124
• Toutes les femmes de l’étude appartiennent à une seule classe d’âge

« en âge de procréer »
2. Validation des intervalles de référence.

Les intervalles de références à vérifier sont acceptés si le nombre de résultats en dehors
des limites de référence est inférieur ou égal à 2 comme décrit précédemment dans le chapitre
1.
Pour touts les groupes étudiés, toutes les valeurs (100 %) observées sont incluses dans
les intervalles de référence fournis par le fournisseur à savoir Roche sur le COBAS
INTEGRA 400PLUS ce qui permet d’accepter le transfert des intervalles de référence du
COBAS INTEGRA 400PLUSau laboratoire de toxicologie du CHU NEDIR MAHAMED de
Tizi Ouzou.
Tableau 26 : Résultats de la validation des intervalles de référence sur COBAS INTEGRA

400 PLUS fournis par ROCHE
Le groupe Les intervalles de référence Résultats

fournis par ROCHE
Hommes 5320 à 12 920 U/l validé
Femmes enceintes (18 à 41 ans) 3 650 à 9 120 U/l validé
Femmes non enceintes et ne prenant pas 4 260 à 11 250 U/l validé

de contraceptifs oraux (16à 39 ans)
3 .Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique

Les valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique de l’étude chez les trois groupes
se distribuent d’une façon tel que : Celles retrouvées chez les hommes sont plus élevées
(Min : 6255U/L, Max : 11820U/L) que celles retrouvées chez les femmes non enceintes et ne
prenant pas de contraceptifs oraux (Min : 5118U/L, Max : 9469U/L) et ces dernières sont plus
élevées que celles retrouvées chez les femmes enceintes (Min : 4404U/L, Max : 8464U/L).Et
ces résultats sont en concordance avec les résultats de :
125
Ø De Lepage L, Schiele F, Gueguen R , Siest G. dans leur étude intitulée « l’activité des
cholinestérase totale dans le plasma : Variation biologique et limites de référence »
réalisée sur une population de 3372 sujets en bonne santé au moins pour quatre
ans publié en 1985 ou ils ont rapporté que les valeurs de l’activité cholinesterasique
sont plus élevées chez les hommes que chez les femmes ;
Ø Et de R.T. EVANS et J.M. WROE dans une étude intitulée « Plasma cholinesterase
changes during pregnancy » réalisée sur 941 femmes enceintes publié en 1980ou ils
ont rapporté qu’il y a une baisse des valeurs de l’activité cholinestérasique chez les
femmes enceintes comparées à celles non enceintes.
4. Étude de corrélation
L’étude de corrélation réalisée sur le groupe des hommes et des femmes non enceintes
et ne prenant pas de contraceptifs oraux a montré que la corrélation de l’activité
cholinestérasique avec l’âge et l’IMC est non significative pour les deux groupes
contrairement à ce qui est rapporté dans les études de :
Ø M. Jalady dans son article «Intérêt du dosage des cholinestérases dans le cadre des
intoxications aux organophosphorés » publié en 2013 que l’activité cholinestérasique est
soumise à des variations avec l’âge et qu’elle augmente avec le poids et la taille des
individus.
Ø Et de Lepage L, Schiele F, Gueguen R , Siest G. intitulé « l’activité des cholinestérase
totale dans le plasma : Variation biologique et limites de référence »réalisée sur une
population de 3372 sujets en bonne santé au moins pour quatre ans publié en 1985 ou ils
ont rapporté que :
- L’activité cholinesterasique n’est pas significativement corrélée avec l’âge chez
les hommes, tandis qu’il y a une corrélation significative avec l’âge chez les
femmes ;
- Il y a une diminution significativement de l’activité cholinesterasique d'environ
14% de 10-15 et de 15-25 ans et atteignant une valeur minimale de 25 à 35 ans ;
- À l'âge adulte, entre 35 et 45 ans, il y a aucune variation substantielle des valeurs
plasmatiques de la cholinestérase, mais ces valeurs sont plus élevées chez les
hommes que chez les femmes d’environ 18% ; Ceci peut être du au statut
hormonal chez les femmes.
126
- Après 45 ans, les valeurs de la cholinestérase augmentent chez les hommes et plus
encore chez les femmes atteignant les valeurs observées chez les hommes. Cette
augmentation de l'activité de la cholinestérase peut être due à une diminution des
hormones sexuelles, ce qui pourrait entraîner une réduction de la synthèse
hépatique ou la libération d'enzymes.
- Les femmes prenant des contraceptifs oraux avaient des activités enzymatiques
significativement plus faibles. Cette variation est réversible lorsque ces
médicaments ne sont plus pris et peut être provoquée par une inhibition de la
synthèse hépatique.
- L’influence du poids corporel sur l’activité des cholinestérases a été étudiée dans
la même étude que précédemment en utilisant comme index le degré de surcharge
pondérale et le pli cutané sous-scapulaire. L'excès du poids a été calculé et
exprimée en pourcentage d’écart par rapport au poids idéal. Dans ces conditions,
l’indice de pondération et pli cutané sous-scapulaire sont en corrélation
significative avec l’activité des cholinestérases chez l’homme. En revanche, les
coefficients de corrélation n'étaient pas significatifs chez les femmes. Ceci est
peut être du au rôle suspecté biologique des cholinestérases dans le métabolisme
des lipides et des lipoprotéines.
Cette discordance entre nos résultats et ces études est probablement du à l’effectif réduit
qu’on a utilisé (20 personnes) et aux tranches d’âge précises qu’on était conditionné à
sélectionner en vu de la réalisation de l’objectif principale de l’étude qui est la validation des
intervalles de référence de l’activité cholinestérasique , étant donné que l’étude de corrélation
en est un objectif secondaire .
127
CONCLUSION
CONCLUSION
Cette étude a permis de valider les intervalles de références chez trois groupes : les
hommes, les femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs âgées de 18 à 39 ans et
les femmes enceintes âgés de 18 à 41 ans au niveau du laboratoire de toxicologie.
Quelle que soit l'origine des limites de référence qui figurent sur les comptes rendus des
résultats de biologie médicale, il importe que leur signification et les limites de celles-ci soient
bien comprises par l'utilisateur final, prescripteur clinicien ou patient :
- Les limites de référence sont descriptives d'une population donnée ;
- Les limites de référence ne seront pas confondues avec les limites de décision
induisant une décision clinique ;
- La source et l'origine des limites de référence doivent être documentées ;
- Les limites de référence et/ou les limites de décision seront en cohérence avec le
système analytique et le recrutement du laboratoire [5]
Dans le cas des cholinestérases l’interprétation par rapport aux intervalles de référence reste
limité vu l’étendu de ces intervalles et la grande la variabilité intra et interindividuelle. Il
serait plus approprié de définir la valeur de base de chaque individu et de déceler d’éventuelle
variation par rapport à cette valeur basale au lieu d’interpréter par rapport aux intervalles de
référence.
Dans les perspectives d’ :

Ø Etendre la validation à d’autres groupes : enfants, les femmes sous contraceptif ;
Ø Étude de la variabilité intra-individuelle sur un effectif plus grand.
128
RÉFÉRENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
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organophosphor%C3%A9s
ANNEXES
ANNEXES
Annexe I : Fiche de renseignements (hommes)

ANNEXES
Annexe II : Fiche de renseignements (femmes)

ANNEXES
Annexe III : Résultats de dosage de l’activité cholinesterasique chez les hommes
Hommes Age(ans) IMC Milieu géographique Activité cholinestérasique

(U/L)
P1 52 31,25 Rural 8017
P2 30 29,05 Urbain 10524
P3 32 28,73 Urbain 7575
P4 41 26,58 Urbain 6255
P5 23 27,74 Urbain 8304
P6 33 26,87 Rural 7544
P7 33 33,65 Rural 10171
P8 29 26,59 Rural 8846
P9 35 25,46 Urbain 10538
P10 34 32,14 Rural 9881
P11 21 19,15 Rural 11820
P12 29 27,77 Rural 10757
P13 21 22,22 Rural 7810
P14 47 27,44 Urbain 9302
P15 34 30,86 Rural 8969
P16 34 24,56 Rural 9346
P17 43 30,36 Rural 9352
P18 46 29,06 Urbain 11742
P19 51 23,14 Rural 7920
P20 28 22,89 Urbain 8931
ANNEXES
Annexe IV : Résultats de dosage de l’activité cholinesterasique chez les femmes enceintes
Femmes Age (ans) IMC Milieu géographique Activité cholinestérasique

(U/L)
P1 36 25,39 Urbain 5891
P2 24 23,18 Rural 8054
P3 32 24,22 Urbain 5259
P4 34 25,09 Urbain 5854
P5 29 22,20 Urbain 8464
P6 36 31,14 Urbain 6954
P7 28 24,24 Urbain 7136
P8 31 28,44 Urbain 4638
P9 37 39,41 Urbain 6085
P10 31 28,37 Urbain 6272
P11 32 30,48 Urbain 5844
P12 37 45,26 Urbain 7970
P13 39 30,07 Urbain 7221
P14 32 23,71 Rural 4779
P15 35 28,12 Urbain 6563
P16 39 22,03 Urbain 5920
P17 32 24,60 Urbain 7776
P18 35 33,98 Urbain 6932
P19 36 30,85 Urbain 4404
P20 29 30,86 Urbain 5656
ANNEXES
Annexe V: Résultats de dosage de l’activité cholinesterasique chez les femmes non enceintes
et ne prenant pas de contraceptifs oraux.
Femmes Age (ans) IMC Milieu géographique Activité cholinestérasique

(U/L)
P1 23 21,79 Rural 7470
P2 32 30,48 Rural 7443
P3 36 26,17 Rural 8802
P4 21 19,83 Rural 6654
P5 24 21,00 Rural 8361
P6 30 21,64 Urbain 9469
P7 28 21,23 Rural 6016
P8 24 20,95 Urbain 6063
P9 40 32,88 Urbain 7459
P10 24 20,42 Rural 9104
P11 23 21,77 Urbain 7490
P12 25 23,52 Urbain 7200
P13 39 22,85 Rural 7443
P14 24 19,71 Rural 5118
P15 30 28,22 Rural 7251
P16 24 18,02 Urbain 5960
P17 24 20,31 Rural 7856
P18 31 25,79 Rural 7754
P19 30 17,23 Rural 6478
P20 25 21,98 Rural 7604
ANNEXES
Annexe VI : La fiche technique du COBAS Integra 400 plus pour le dosage de l’activité
cholinestérasique. (1/3)
ANNEXES
cholinestérasique.2/3
ANNEXES
cholinestérasique.3/3
ANNEXES
Annexe VII : Résultats statistique de l’étude de corrélation de l’activité cholinestérasique

avec l’âge chez les hommes
ANNEXES
Annexe VIII : Résultats statistique de l’étude de corrélation de l’activité cholinestérasique

avec l’IMC chez les hommes
ANNEXES
Annexe IX : Résultats statistique de l’étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec

l’âge chez les femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux
ANNEXES
Annexe X : Résultats statistique de l’étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec

l’IMC chez les femmes non enceintes et ne prenant pas de contraceptifs oraux
ANNEXES
Annexe XI : Principales caractéristiques des organophosphorés (OP) employés en agriculture

en France en 2007
ANNEXES
Annexe XII : Principales caractéristiques des carbamates anticholinestérasiques à usage

phytosanitaire commercialisés en France en 2007.
ANNEXES
Annexe XIII : L’article publié par CLSI : Transference and validation of Reference Intervals
1/4
ANNEXES
2/4
ANNEXES
3/4
ANNEXES
4/4
Résumé
Les intervalles de référence décrivent les variations des paramètres biologiques en

fonction de la population de référence et de la méthode analytique, leur détermination au
laboratoire de biologie médicale reste un outil précieux pour guider l’interprétation des
examens biologiques et elle constitue une des composantes de la décision médicale.
Dans la pratique, les laboratoires de biologie médicale utilisent le transfert pour valider
la majorité des intervalles de référence qu'ils mettent en œuvre, et établissent rarement un
intervalle de référence à nouveau, compte tenu de la considérable complexité du processus
d'établissement d’intervalle de référence précis et fiable.
Notre étude est réalisée au niveau de laboratoire de toxicologie CHU de TIZI OUZOU
dans le but de vérifier la transférabilité des IR de l’activité cholinestérasique sur COBAS
plus
INTEGRA 400 de 3 groupes de 20 personnes chacun supposés en bonne santé venants de
la même région kabyle.
Mots clés : Intervalle de référence, transférabilité, activité cholinestérasique.
Summary
The reference ranges describe changes in biological parameters according to the

reference population and the analytical method, their determination in the laboratory of
medical biology remains a valuable tool to guide the interpretation of biological tests and it is
one of the components of the medical decision.
In practice, medical biology laboratories use the transfer to validate most of the
reference ranges they implement, and rarely establish a referral interval again, given the
considerable complexity of the accurate and reliable reference interval establishment process.
Our study is carried out at TIZI OUZOU toxicology laboratory level in order to verify
the transferability of IR of cholinesterase activity on COBAS INTEGRA 400 more than 3
groups of 20 people each supposed healthy coming from the same Kabyle region.
Key words: Reference interval, transferability, cholinesterase activity.

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‫الجم ورية الجزائ ية الديمق اطية الشع ية‬

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l’Enseignement ‫ار‬

Université de Mouloud Mammeri ‫جامعة مولود معم ي‬

PROJET DE FIN D’ETUDES

En vue de l’obtention du diplôme : Docteur en Pharmacie

Activité cholinestérasique : validation des intervalles

-Melle AYADI Sabrina -Melle BERRAH Sabrina -Melle CHAOUCHE Sabrina

 BELAZOUGUI .O MAHU Faculté de médecine UMMTO Présidente

ANNÉE UNIVERSITAIRE : 2018/2019

A ma chérie maman, ma confidente, ma

Je dédie ce modeste travail à mes chers parents

Je dédie ce travail à mes chers parents,

Je dédie aussi ce travail à :

Au Dr. BELAZOUGUI maitre-assistante en Toxicologie à l’UMMTO, nos sincères remerciements pour

PARTIE I : PARTIE THÉORIQUE

3. Protocole de détermination des intervalles de référence…………………………………..09

CHAPITRE II : L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE

1.2.3. Fonctions physiologiques………………………………………………….26

2. Principaux facteurs influençant l’activité des cholinestérases…………………………28

CHAPITRE III : ACTION DES ORGANOPHOSPHORÉS ET CARBAMATES SUR

CHAPITRE IV : DOSAGE DE L’ACTIVITÉ CHOLINESTÉRASIQUE

1. Dosage de l’activité cholinestérasique………………………………………………….. 64

2. Intérêt du dosage de l’activité cholinestérasique dans les intoxications aux

PARTIE II : PARTIE PRATIQUE

CHAPITRE I : MATÉRIELS ET MÉTHODES

7.1.3. Centrifugation …………………………………………………………... 103

2. Résultats …………………………………………………………………………………. 116

- PFC : Plasma Frais Congelé

Figure 02 : Les étapes de détermination des intervalles de référence……………………….10

Figure 09 : Séquençage de Sanger du gène BCHE ………………………………………….34

Figure 17:Structure du Chlorpropharm………………………………………………………59

Figure 20: Principe de la méthode potentiométrique……………………………………….. 68

Figure 30 : Dosage basé sur l’accumulation d’indigo en présence d'oxygène………………76

Figure 40 : Surveillance des travailleurs exposés aux neurotoxiques de guerre (NOP)……..93

Figure 46 : Reactif Cholinesterase Gen 2 (CHE2)…………………………………………101

Tableau 01 : Comparaison entre limites de référence et limites de décision médicale …….. 07

Tableau 04 : Influence de la ménopause sur l’activité cholinestérasique chez des femmes

Tableau 05 :Activité de la cholinestérase plasmatique selon les syndromes hépatiques…… 32

Tableau 12: Dénomination, structure et létalité des principaux neurotoxiques

Tableau 13 : Les effets de l’inhibition de l’acétylcholinestérase ………………………. …. 54

Tableau 15 : Prélèvements sanguins des cholinestérases……………………………………65

Tableau 23 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique du groupe

Tableau 24 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique du groupe

Tableau 25 : Paramètres de distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique du groupe

Tableau 26 : Résultats de la validation des intervalles de référence sur COBAS INTEGRA

Graphe 01: Répartition du groupe des hommes selon l’âge………………………………..111

Graphe 03 : Répartition du groupe des femmes enceintes selon l’âge……………………. 112

Graphe 06 : Répartition géographique du groupe des femmes enceintes………………….114

Graphe 09 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique pour le

Graphe 10 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique pour le

Graphe 11 : Distribution des valeurs de l’activité cholinestérasique plasmatique pour le

Graphe 15 : Étude de corrélationde l’activité cholinestérasique avec l’IMC chez le groupe

Graphe 16 : Étude de corrélation de l’activité cholinestérasique avec l’IMC chez le groupe

L’intoxication est un processus dynamique et parfois multifactoriel. Elle relève souvent

Les intervalles de référence ne peuvent être adaptés systématiquement d’un pays à un

Afin de garantir une interprétation meilleure et fiable des résultats obtenus au

L’objectif principale de l’étude est la validation des intervalles de référence de l’activité

L’objectif secondaire est d’étudier la corrélation de l’activité cholinestérasique avec

Le premier concept de la valeur de référence a été proposé par Grasbeck et Saris en