5-Quel Avenir Amelioration Plantes 2742000755 Content

PARTIE IV
Les haploïdes et
V amélioration des plantes
Quel avenir pour l'amélioration des plantes ?
Ed. AUPELF-UREF. John Libbey Eurotext. Paris © 1994, pp. 299-303.
31
Contrôle nucléaire et cytoplasmique

de la régénération haploïde
chez les blés tétraploïdes
A. SARRAFI, M. GHAEMI, N. AMRANI, G. ALIBERT
Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes (BAP), INP/ENSAT EA

DRED 832, 145, avenue de Muret, 31076 Toulouse, France.
Résumé
Le contrôle nucléaire et cytoplasmique de la régénération haploïde par V andrògenèse et

par le croisement « blé x maïs » a été déterminé chez 2 génotypes de blé tétraploïde d'ori-
gines très éloignées, leurs deux lignées alloplasmiques, et 2 lignées résistantes et sen-
sibles au froid. Le dispositif expérimental consiste en un essai en blocs randomisés avec
4 répétitions, chacune comprenant 2 pots de 3 plantes. Le milieu d'induction concernant
l'androgenèse est le milieu «potato-2 » additionné de 0,5 g/l de glutamine, et celui de
régénération le milieu « R8 ». Pour le croisement « blé x maïs », les embryons sont mis en
culture sur le milieu Difco Orchid Agar additionné de 4 gA de saccharose. Les résultats
concernant l'étude d'un minimum de 1 000 anthères par génotype pour l 'androgenèse, et
environ 420 fleurs émasculées et pollinisées par le màis (Seneca 60) par génotype mon-
trent des effets nucléaires et cytoplasmiques, ainsi qu'une interaction nucléo-cytoplas-
mique pour les deux haplométhodes utilisées. Le fait que certains génotypes répondent
seulement à une méthode, et certains autres aux deux permet de penser qu 'il existe un sys-
tème de contrôle génétique différent pour les deux haplométhodes utilisées.
Les haploïdes doublés (HD) ont une importance considérable en amélioration des
plantes. L'obtention d'une structure homozygote (HD) en une seule étape permet une
réduction de temps appréciable pour la sélection.
299
A. Sarrafi et al.
Les méthodes d'haploïdisation couramment utilisées chez le blé tendre sont : l'an-
drogenèse [18, 3] et le croisement « blé x maïs » [9].
L'amélioration de la culture in vitro des anthères a pour conséquence une augmen-
tation importante du nombre d'haploïdes produits [13, 2, 6, 20]. Cependant, pour le blé
tétraploïde, la situation est plus complexe. En effet, la régénération des embryons peut
soit être bloquée, soit donner des albinos ou très peu de plantules chlorophylliennes
[19, 4]. Les problèmes rencontrés rendent cette technique inapplicable à l'amélioration
de cette espèce.
L'obtention des haploïdes peut se faire également par le croisement « blé x maïs ».
Le maïs est insensible aux actions des gènes de blé « Krl » et « Kr2 » responsables de
l'incompatibilité de fécondation [17, 7]. En effet, après la fécondation, dès les pre-
mières divisions cellulaires, les chromosomes de maïs sont éliminés aboutissant à la
formation des embryons haploïdes [8]. Cette technique reste inefficace pour le blé
tétraploïde puisque les embryons obtenus ne régénèrent pas [12].
Au cours d'un ensemble de travaux de recherche, nous avons tenté de déterminer le
contrôle nucléaire et cytoplasmique de la régénération haploïde par l'androgenèse et le
croisement « blé x maïs » chez quelques génotypes de blé tétraploïde d'origines très
éloignées. Ces deux méthodes sont celles qui sont les plus utilisées pour la production
des plantes haploïdes chez le blé hexaploïde.
Matériels et méthodes
Les 6 génotypes de blé dur utilisés dans nos expérimentations sont les suivants :
- ENSAT-508 : une lignée d'origine éthiopienne à grains très riches en protéines
[16].
- Opale : une variété créée dans notre laboratoire avec le cytoplasme d'un blé hexa-
ploïde [15].
- « 508-Opale » et « Opale-508 » : deux lignées alloplasmiques provenant de back-
cross réciproques à partir de l'hybride FI « ENSAT-508 x Opale », créées dans notre
laboratoire.
- ENSAT 2 et ENSAT 3 : des lignées pures, respectivement résistantes et très sen-
sibles au froid.
Le maïs utilisé pour les croisements est l'hybride FI « Seneca 60 ». Après 6 se-
maines de vernalisation à 2 °C ± 1, les grains de blé sont semés en pot dans une serre
contrôlée (température 25 °C/15 °C jour/nuit, et 16 h de photopériode).
Le dispositif expérimental est un essai en blocs randomisés avec 4 répétitions, et
chaque répétition comprend 2 pots de 3 plantes. Dans les expérimentations concernant
l'androgenèse, un minimum de 1 000 anthères par génotype a été mis en culture sur le
milieu « potato-2 » additionné de 0,5 g/1 de glutamine puis incubé à la lumière à 26 °C.
Pour ce qui concerne les croisements « Blé x Mais », environ 420 fleurs ont été
émasculées et pollinisées pour chaque génotype par le pollen de maïs. Un traitement
par une solution de 2,4-D (10 mg/1) a été appliqué dans les fleurs 24 h après la pollini-
sation. Deux ou trois semaines après le traitement, les embryons sont mis en culture sur
le milieu Difco Orchid Agar additionné de 4 g/1 de saccharose puis incubés à l'obscuri-
té à 20 °C ± 1.
Les embryons provenant de l'androgenèse sont mis sur le milieu « R8 » [5]. Toutes
les cultures d'embryons ont été incubées à 25 °C ± 1 avec une photopériode de 16 h.
300
Contrôle de la régénération haploïde chez les blés tétraploïdes
Une analyse de variance est réalisée sur les données transformées en Arcsin V x. Le
test de Newman-Keuls est utilisé pour la comparaison des moyennes des paramètres
suivants :
- embryons formés pour 100 épis (E/100 EP),
- embryons formés pour 100 épis embryogènes (E/100 EPE),
- plantules vertes pour 100 épis (PV/100 EP),
- ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées (OD/100 FP),
- plantules vertes pour 100 embryons (PV/100 E).
Résultats et discussion
L'analyse de variance des données transformées en Arcsin V x concernant les deux

expérimentations révèle l'existence d'un effet génotype pour certains paramètres étu-
diés.
Le test de Newman-Keuls a permis une comparaison des moyennes pour les caractères
étudiés (Tableau I).
Dans le cas du croisement « blé x maïs », l'étude des lignées alloplasmiques révèle
l'existence d'une différence significative entre ENSAT-508 et Opale avec un supériori-
té de « Opale » sur « ENSAT-508 », quel que soit le caractère étudié (Tableau I). La
lignée « 508-Opale » avec le cytoplasme de « ENSAT-508 » et le noyau de « Opale »
dépasse les deux génotypes « ENSAT-508 » et « Opale » alors que « Opale-508 » a une
valeur intermédiaire entre ces mêmes génotypes.
Tableau I. Résultats obtenus dans le croisement « blé x maïs » et dans l'androgenèse pour
3 caractères étudiés.
Croisement « blé x maïs » Androgenèse

Génotypes OD/100 FP PV/100 EP PV/100 E E/100 EP E/100 EPE PV/100 EP
Opale 42,41 cde 4,34 6,66 8,152 def 20,25 cde 0
ENSAT-508 22,59 e 0 0 40,44 bc 51,84 abc 1
OP-508 38,12 de 0 0 45,17 b 60,22 abc 1
508-Op 46,96 bcde 7,69 50 23,72 bed 36,95 cde 0
ENSAT 2 68,76 abc 0 0 0 0 0
ENSAT 3 73,28 ab 10,34 12,50 40,28 be 79,07 abc 3
Les moyennes suivies des différentes lettres sont significativement différentes au seuil de p = 0,05.
OD/100 FP : ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées.
PV/100 EP : plantes vertes pour 100 épis.
P V / 100 E : plantules vertes pour 100 embryons.
E/100 EP : embryons formés pour 100 épis.
E/100 EPE : embryons formés pour 100 épis embryogènes.
On en déduit qu'il existe un effet favorable du noyau de « Opale » avec une interaction
favorable de ce noyau avec le cytoplasme de « ENSAT-508 » pour le nombre d'ovaires
développés pour 100 fleurs pollinisées et le nombre de plantules vertes obtenues pour
100 épis.
301
A. Sarrafi et al.
« ENSAT 3 » est le génotype le plus performant suivi de « ENSAT 2 » pour le

nombre d'ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées (OD/100 FP). Seuls « ENSAT
3 » et la lignée alloplasmique « 508-Opale » et « Opale » ont produit des plantules
vertes (10,34-7,69 et 4,34 pour cent épis ou 12,56-50 et 6,66 pour cent embryons for-
més respectivement).
Dans le cas de l'androgenèse, la comparaison des moyennes des lignées alloplas-
miques met en évidence la supériorité de « ENSAT-508 » par rapport à « Opale » pour
le nombre d'embryons formés pour 100 épis (E/100 EP) ainsi que le nombre d'em-
bryons formés pour 100 épis embryogènes (E/100 EPE). Pour les mêmes paramètres, la
lignée alloplasmique « Opale-508 » est plus performante et « 508-Opale » a une valeur
intermédiaire par rapport au parent. Ces résultats montrent l'existence d'un effet
nucléaire favorable de « ENSAT-508 » et une interaction positive entre le noyau de
« ENSAT-508 » et le cytoplasme de « Opale ». « ENSAT 3 » est le génotype le plus
performant alors qu'« ENSAT 2 » est récalcitrant à l'androgenèse. Des plantules vertes
en faible quantité ont été produites par « ENSAT 3 », la lignée alloplasmique « Opale-
508 » et « ENSAT-508 ».
L'ensemble de nos résultats montre l'existence des effets nucléaires et cytoplas-
miques ainsi qu'une interaction nucléo-cytoplasmique pour les deux haplométhodes uti-
lisées. Ces effets ont été démontrés également par Bercraft et Taylor [1] et Sagi et Bar-
nabas [14] chez les blés hexaploïdes.
Le fait que certains génotypes répondent à une méthode (ENSAT-508 à l'androge-
nèse et Opale au croisement « blé x maïs ») ou aux deux méthodes (ENSAT 3) prouve
qu'il existe un contrôle génétique d'obtention d'haploïdes différent pour les deux sys-
tèmes. Pour ce qui concerne la lignée « ENSAT 2 », on peut remarquer l'absence totale
d'aptitude à l'androgenèse.
Nous constatons également une variabilité génétique très importante en fonction des
deux haplométhodes chez les génotypes étudiés. La variabilité génétique des variétés
de blé hexaploïde pour les paramètres androgénétiques a déjà été démontrée par Lazar
et al. [11] et pour le croisement « blé x maïs » par Laurie et Reymondie [10].
Le taux de plantules vertes obtenu pour un génotype répondant aux 2 systèmes tel
que « ENSAT 3 » est nettement plus élevé par le croisement « blé x maïs ». Cependant,
d'autres génotypes (« ENSAT-508 » et « Opale-508 ») produisent des plantules vertes
mais en plus faible quantité que par androgenèse. Ces résultats rendent difficile la com-
paraison de ces 2 méthodes quant à leur efficacité en production des plantules vertes.
Nous remercions le Conseil Régional de Midi-Pyrénées (N/Réf. : RECH/9200924)

et la société Caussade Semences pour le financement de ce projet.
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302
Controle de la régénération haploïde chez les blés tétraploïdes
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303
32
Effet du milieu de culture d'anthères

sur l'androgenèse du blé tétraploïde
Triticum turgidum var.
M. GHAEMI, A. SARRAFI
Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes (BAP), INP/ENSAT, EA

DRED 832, 145, avenue de Muret, 31076 Toulouse, France.
Résumé
L'androgenèse chez le blé dur pose des difficultés majeures et le faible taux de régéné-
ration chlorophyllienne reste l'obstacle principal et rend cette technique inapplicable à
la sélection de cette espèce. Une expérimentation a été réalisée afin de tester l'effet de
2 substances : l'acide phényl acétique (APA) avec 3 doses différentes (2,5 et 10 mg/l),
et l'ancymidol avec 2 doses différentes (0,5 et 1 mg/l), sur l'aptitude à l'androgenèse
d'un génotype de blé dur : ENSAT-508 sélectionné par nos travaux précédents.
D'après les résultats obtenus, l'utilisation de l'APA à 2 mg/l a permis une augmenta-
tion du taux d'embryon par rapport au témoin. Aucune amélioration de régénération
verte n 'est observée. Les traitements par ancymidol aux doses employées se sont révé-
lés inefficaces.
La production des plantes haploïdes par culture d'anthères offre plusieurs avantages
aux améliorateurs de plantes. En effet, l'androgenèse est un moyen de production rapi-
de des lignées homozygotes, pour la création varietale [5, 7].
Le succès de cette technique a été déjà démontré pour le blé hexaploïde Triticum aes-
tivum L. [4, 11]. En ce qui concerne le blé tétraploïde Triticum turgidum var., l'étape de
la régénération des embryons reste l'obstacle majeur. Le développement des embryons
est soit bloqué [8], soit donne des plantes albinos [18] et enfin peut aboutir à la forma-
305
M. Ghaemi, A. Sarrafi
tion d'un faible taux de plantes chlorophylliennes [9, 10]. Plusieurs approches sont utili-
sées pour améliorer le rendement de l'androgenèse chez le blé tendre : optimisation des
conditions de cultures de plantes mères [15], de milieu de culture d'anthères [17] et enfin
sélection des génotypes élites par l'étude de la variabilité génétique [2].
Pour ce qui concerne le milieu de culture d'anthères, Ziaudin et al. [19] ont trouvé
un effet bénéfique de l'acide phényl acétique (APA) sur la régénération verte chez le
blé tendre. D'autre part, chez l'asperge, Feng et Wolyn [6] ont réussi à augmenter le
taux de régénération des embryons par utilisation de l'ancymidol (substance antigibbe-
rellique).
Chez le blé dur, le problème principal reste la régénération des embryons en plan-
tules vertes.
Le but de notre étude consiste à tester l'influence d'APA et de l'ancymidol sur l'an-
drogenèse d'une lignée de blé dur : ENSAT-508 sélectionnée par nos travaux précé-
dents [9].
Le matériel végétal utilisé dans notre expérimentation est la lignée ENSAT-508, un blé
tétraploïde d'origine éthiopienne ayant des grains avec une teneur très élevée en pro-
téines [16].
Les grains germes de cette lignée sont vernalises pendant six semaines à 2 °C ± 1
dans un réfrigérateur. Les grains germes ainsi obtenus sont semés dans des pots de
18 cm de diamètre contenant un mélange de terreau et du sable (3 : 1) et placés dans
une serre contrôlée (la photopériode : 16 h et la température : 25° C le jour et 15 °C la
nuit). L'essai comprend 4 répétitions disposées en blocs randomisés. Chaque répétition
est composée d'un pot de 3 plantes. Le premier et le deuxième épis de chaque plante
sont utilisés pour la culture d'anthères. Les épis sont prélevés au moment où la majori-
té des microspores sont au stade uninucléé. Les épis prélevés sont entourés de sopalin
humide et de papier aluminium, mis dans des bocaux contenant de l'eau, puis placés
dans un réfrigérateur à 4 °C ± 1, à l'obscurité pendant 7 jours. Avant la mise en culture
des anthères, les épis sont désinfectés par une solution d'hypochlorite de sodium 10 %
(v/v) pendant 7 mn. Le milieu de base utilisé est le milieu pomme de terre [3] modifié
par addition de 0,5 g/1 de glutamine [13] et solidifié par Gelrite (4g/l). Cinq traitements
différents ayant pour base le milieu pomme de terre sont testés. Les 3 premiers contien-
nent l'acide phenyl acétique (APA) à trois concentrations différentes : 2, 5 et 10 mg/1,
deux autres traitements ont l'ancymidol à deux concentrations de 0,5 et 1 mg/1 et enfin
le milieu témoin, sans addition d'aucune substance.
APA et ancymidol sont additionnés au milieu de base après autoclavage par filtra-
tion à travers des filtres de 22 um. Les boîtes de culture contenant environ 40 anthères
provenant d'un épi sont incubées à l'obscurité à 28 °C dans un incubateur.
Approximativement, 1 000 anthères par traitement ont été mises en culture. 30 à
40 jours après la mise en culture des anthères, les embryoïdes sont comptés et transfé-
rés sur le milieu de régénération « R8 » [12] puis exposés à la lumière (phqtopériode
de 16 h à 26 °C ± 1). Toutes les données ont été transformées en Arcsin V x afin de
normaliser leur distribution. Une analyse de variance a été effectuée afin de déterminer
l'effet des différents traitements. Le test de Newman-Keuls est utilisé pour la compa-
raison des moyennes des paramètres suivants :
306
Effet du milieu de culture d'anthères sur l'androgenèse du blé tétraploïde
- épis embryogènes représentant le nombre d'épis donnant au moins un embryoïde

pour cent épis (EE/100 E),
- nombre d'embryoïdes pour cent anthères (E/100 A),
- régénération totale (verte + albinos) pour cent anthères (RT/100 A).
L'analyse de variance révèle l'existence d'une différence significative entre les diffé-
rents traitements pour les paramètres étudiés tandis que l'effet de blocs n'est pas signifi-
catif (Tableau I). La comparaison des moyennes des différents traitements est représen-
tée dans le Tableau II. A partir de ce tableau, nous pouvons dégager les informations
suivantes :
- pour le nombre d'épis embryogènes pour 100 épis (EE/100 E), aucun traitement
ne s'est révélé efficace. En revanche, l'utilisation de 2 mg/1 d'acide phényl acétique
(APA) a permis une augmentation du nombre d'embryoïdes pour 100 anthères
(E/100 A) par rapport au témoin, alors qu'il n'entraîne aucune amélioration quant à la
régénération chlorophyllienne. L'indépendance des 2 phases de l'androgenèse, embryo-
genèse et régénération haploïde, confirme les résultats de Agache et al, [1]. L'effet
bénéfique de cet auxine a été démontré par Ziaudin et al. [19] sur la régénération verte
du blé et de l'orge. La dose de 10 mg/1 semble être un seuil toxique pour l'embryoge-
nèse de l'ENSAT-508 ; en effet 10 mg/1 de l'APA provoque une diminution du taux
d'épis embryogènes entraînant une chute du nombre d'embryoïdes.
L'utilisation d'ancymidol à 0,5 mg/1 ne s'est pas révélée efficace pour l'embryoge-
nèse et une dose de 1 mg/1 diminue la totalité des paramètres d'androgenèse étudiés par
rapport au témoin. Chez l'asperge, en augmentant la fréquence des embryons bipo-
laires, l'ancymidol améliore le rendement des plantes haploïdes [6]. Le taux de la régé-
nération total (verte et albinos) n'est amélioré par aucun traitement.
L'ensemble de nos résultats nous permet de conclure que l'acide phényl acétique
(APA) utilisé à faible concentration (2 mg/1) a un effet favorable sur l'embryogenèse
de l'ENSAT-508. D'autres investigations sont nécessaires afin d'améliorer la régénéra-
tion des embryons haploïdes chez le blé dur. L'utilisation de l'APA sur d'autres géno-
types de blé dur est à envisager.
Tableau I. Carré moyen (te l'analyse de variance des paramètres androgénétiques (données
transformées en Arc sin V x) de la lignée ENSAT-508.
Sources de variation ddl EE/100 E E/100 A RT/100 A

Traitements 5 622.44*** 108.77*** 22.01***
Blocs 3 38.16 NS 1.41 NS 1.37 NS
Résiduelle 15 73.06 2.85 1.12
*** : significant au seuil de 0.001.
NS : non significatif.
307
M. Ghaemi, A. Sarrafì
Tableau II. Effet de divers traitements sur les paramètres de l'androgenèse chez la lignée
ENSAT-508.
Traitement EE/100 E E/100 A RT/100 A PV/100 A PA/100 A

Témoin 58.33 a 2.01b 0.47 a 0.18 0.27
APA 2 mg/1 54.16 a 10.53 a 0.38 b 0.19 0.19
APA 5 mg/1 54.16 a 2.69 b 0.61 a 0.11 0.5
APA 10 mg/1 20.82 b 1.29 c 0.5 b 0 0.5
Ancymidol 0,5 mg/1 62.49 a 2.31 b 0c 0 0
Ancymidol 1 mg/1 16.66 b 0.73 d Oc 0 0
EE/100E : Épis embryogènes pour 100 épis.
E/100A • Embryoides pour 100 anthères.
RT/100 : Régénération totale pour 100 anthères.
PV/100A : Plantules vertes pour 100 anthères.
PA/100A : Plantules albinos pour 100 anthères.
APA : Acide phényl acétique.
Les moyennes (correspondant aux valeurs réelles) ayant la même lettre ne présentent pas une différence
significative (test de Newman et Keuls).
Nous remercions le Conseil Régional de Midi-Pyrénées (N/Réf. : RECH/9200924)

et la société Caussade Semences pour le financement de ce projet.
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309
33
Sélection in vitro
de plantes androgénétiques de blé tendre
résistantes à la salinité
K.PIRI, C. ANCEAU, S. EL JAAFARI, P. LEPOIVRE, J. SEMAL
Laboratoire de Pathologie végétale, Faculté des Sciences agronomiques,

5030 Gembloux, Belgique.
Résumé
La faisabilité de la sélection in vitro de plantules androgénétiques de blé tendre, pour
leur tolérance au NaCl, a été étudiée en utilisant l'irradiation gamma et la régénéra-
tion gamétoclonale comme sources de variation. Les anthères ont été prélevées sur des
épis de la variété Sabine, irradiés ou non aux rayons gamma. Les cals et les
embryoïdes formés à partir des anthères ont été mis en culture sur milieu de régénéra-
tion, supplémenté ou non avec 0,75 % ou 0,9 % de NaCl. Les cals survivants, ainsi que
les plantules vertes régénérées, ont été ensuite transférés sur milieu de régénération,
sans NaCl. Onze dihaploïdes R0 ont été obtenus par traitement à la colchicine. Après
autofécondation, les descendants R1 ont été évalués pour leur tolérance au NaCl. Six
lignées Rr sur les 7 étudiées, ont montré une tolérance à la salinité supérieure à celle
du témoin Sabine, sur base de la réduction du chlorure de tétrazolium en formazan par
les cellules de rondelles foliaires ayant flotté préalablement pendant 24 h sur 1,6 % de
NaCl. Les mécanismes de tolérance développés par les lignées androgénétiques ont été
analysés au niveau de la génération R2 et apparaissent associés à la vigueur des
plantes, à leur capacité à limiter l'accumulation du NaCl dans les tissus photosynthé-
tiques et à une efficacité accrue dans l'utilisation de K+.
Les stress environnementaux, dont la salinité, constituent une limitation sérieuse du

rendement des cultures en zones arides et semi-arides.
Il existe cependant des indications chez les végétaux d'un potentiel génétique pour
311
K. Piri et al.
la tolérance aux stress environnementaux, établies sur la base de critères agronomiques

tels que le rendement [24]. En particulier, la variabilité manifestée par les espèces
apparentées et les variétés, pour la résistance à la salinité, permet d'envisager la sélec-
tion de génotypes de blé adaptés au stress salin.
Un programme d'amélioration nécessite l'exploitation d'une variabilité génétique
associée à la mise en œuvre de tests permettant un tri à grande échelle des phénotypes
recherchés, lesquels seront soumis à des essais de rendement au champ.
Nous analyserons différents mécanismes de résistance à la salinité, ainsi que les
méthodes développées pour les sélectionner, en détaillant plus particulièrement la pro-
blématique de la sélection in vitro et l'analyse des phénotypes obtenus présentant une
résistance améliorée à la salinité.
Mécanismes de résistance à la salinité chez les végétaux

La résistance d'une plante à la salinité s'exprime par sa capacité à survivre et à produi-
re dans des conditions de stress salin. Il existe, en la matière, une large gamme de
mécanismes qui ne sont pas exclusifs l'un de l'autre, mais qui peuvent se compléter.
Diverses classifications des mécanismes de tolérance au sel ont été élaborées [28].
Les plantes peuvent être groupées à cet égard en 2 catégories principales, sur la base de
leur comportement vis-à-vis des stress salins : (1) les halophytes qui tolèrent des
concentrations relativement élevées en sel et (2) les glycophytes qui ne tolèrent que des
concentrations peu élevées en NaCl.
Mécanismes de tolérance aux sels chez les halophytes

Chez les halophytes, les types les plus tolérants au sel ont une croissance réduite dans
des conditions de faible salinité. Cette adaptation leur permet d'absorber de grandes
quantités d'ions tout en maintenant la turgescence cellulaire, et en évitant leur toxicité
grâce à une compartimentage cellulaire et l'accumulation dans les vacuoles, l'équilibra-
ge osmotique du cytoplasme étant assuré par une synthèse active de composés orga-
niques solubles [8].
Mécanismes de tolérance aux sels chez les glycophytes

• Sensibilité à Na+
Les glycophytes les plus sensibles au sel restreignent le transport de Na+ dans les par-
ties aériennes et maintiennent de la sorte des niveaux de sel relativement bas dans les
tissus photosynthétiques. D'autres glycophytes tolérants au sel, comme le cotonnier ou
l'orge, transportent et accumulent de grandes quantités de Na+ dans leurs feuilles.
Cette contradiction apparente provient de l'existence de deux comportements dis-
tincts concernant la distribution de Na+ dans les plantes. Les espèces les plus sensibles
à la salinité sont incapables de compartimenter Na+ dans leurs feuilles, de façon à limi-
ter la concentration cytoplasmique de cet ion. Chez ces espèces, la restriction du trans-
port de sel dans les organes aériens correspond à une protection contre NaCl.
Au contraire, les espèces glycophytes relativement tolérantes se caractérisent par un
transport de grandes quantités de NaCl dans les feuilles, rendu possible grâce à un bon
compartimentage cellulaire du Na+. Ces deux comportements s'observent notamment
chez le blé et les espèces sauvages apparentées.
Certaines espèces de graminées tolérantes au NaCl, comme Agropyron scirpeum et
312
Sélection in vitro de plantes andrògénétiques de blé tendre résistantes à la salinité
Aegilops searsii, montrent une concentration élevée en sel dans les tissus foliaires,
associée à un compartimentage efficace.
Au niveau varietal, une corrélation entre la tolérance au sel et l'aptitude à limiter le
transport de Na+ dans les feuilles existe chez le blé et les triticales : les variétés les plus
résistantes sont habituellement celles qui transportent le moins de Na+ dans leurs
feuilles [1].
• Sélectivité ionique : efficacité d'utilisation de K+
A l'interface racine/sol, l'excès de Na+ peut limiter l'approvisionnement de la plante en
macroéléments essentiels, tels que K+.
Une composante de la tolérance à la salinité sera donc l'efficacité avec laquelle K+
est absorbé et utilisé pour les besoins métaboliques. Une grande variabilité se manifeste
à cet égard au sein des espèces et des variétés, ce qui permet d'envisager une sélection
pour l'efficacité nutritionnelle en présence de Na+.
Chez le blé et l'orge, une corrélation existe entre la croissance en milieu salin, la
vitesse d'absorption de K+ et son efficacité d'utilisation [7, 24].
Amélioration des plantes pour la résistance à la salinité
Monneveux [17] a proposé une classification des différentes approches utilisées dans la
sélection des blés résistants à la sécheresse ; les grandes lignes de cette classification peu-
vent être transposées à la problématique de la sélection de plantes tolérantes à la salinité.
Approche empirique descriptive

Une première approche, qui peut être appelée « approche empirique », a été largement
utilisée par les améliorateurs avec des résultats appréciables ; elle implique la mise en
place d'essais multilocaux comme principaux outils de la recherche. Il s'agit d'une
approche descriptive, dans la mesure où l'on s'intéresse essentiellement aux rende-
ments obtenus, la plante étant considérée comme une « boîte noire » dont le fonction-
nement n'est pas pris en compte, car il est difficile de caractériser biochimiquement un
génotype au travers de l'observation d'un caractère phénotypique complexe et de faible
héritabilité, comme le rendement.
Approche analytique et explicative

Cette approche consiste à isoler et à étudier individuellement un mécanisme de résistan-
ce donné, en précisant les processus biochimiques et biophysiques qui le déterminent et
en mettant au point des méthodes simples d'études de ces mécanismes, en vue de
rechercher des tests, si possible précoces, applicables en sélection. Ces critères peuvent
être utilisés à différents niveaux d'organisation, de la cellule à la plante (Tableau I).
Une catégorie de mécanismes s'adresse à la plante entière : aptitude à la germina-
tion ou à la croissance [4, 6], transport ionique et efficacité d'utilisation du K+ en pré-
sence d'excès de NaCl [1, 7], fluorescence de la chlorophylle [5].
Une autre approche repose sur la corrélation entre des paramètres biophysiques ou
biochimiques tels que viabilité des cellules, accumulation d'osmorégulateurs [16, 21,
22], induction de protéines spécifiques [21].
La culture in vitro, en permettant de contrôler de manière précise les conditions du
milieu et de cribler rapidement un grand nombre de cellules dans un espace réduit,
313
K. Pìri et al.
Tableau I. Tests de sélection pour la résistance des plantes à la salinité.
Test relatifs aux caractères de tolérance cellulaire

- résistance protoplasmique
- perméabilité cellulaire
- marqueurs moléculaires
• synthèse de protéines
• accumulation de proline
• accumulation de sucres
Tests s'appliquant à la plante entière
- germination et émergence
- croissance et survie
- transport ionique
• sensibilité à Na+
• recirculation du Na+ dans le phloème
• sélectivité ionique
- fluorescence de la chlorophylle
représente une approche privilégiée pour la mise en œuvre de tests de sélection appli-
cables au niveau cellulaire. Ces critères peuvent cependant conduire à une vue partielle
et réductionniste du comportement de la plante, en dissociant les mécanismes biochi-
miques élémentaires des fonctions globales.
La sélection de génotypes résistant à la salinité

par culture in vitro
Les grandes étapes suivantes doivent être satisfaites lors de la sélection in vitro en vue
d'obtenir de nouveaux génotypes de végétaux tolérants vis-à-vis d'un agent de stress :
1) création de la variabilité génétique (à cet égard, la variation somaclonale ou gaméto-
clonale générée par culture in vitro peut être combinée avec l'application d'agents
mutagènes) ; (2) mise au point d'un protocole de sélection ; (3) suivi de la descendance
des plantes sélectionnées, afin de s'assurer de la stabilité du caractère retenu et de l'ab-
sence de variations épigénétiques, non transmissibles par voie sexuée.
L'emploi des techniques de culture in vitro s'est avéré efficace pour isoler des
lignées cellulaires tolérantes à la salinité. Des plantes entières ont été régénérées à par-
tir de ces cellules et la transmission à leur descendance du caractère de tolérance a été
confirmée [3, 12, 26]. Cette démarche s'est cependant avérée inadéquate dans certains
cas, car la culture de tissus végétaux en présence de NaCl ne reflète pas toujours la
complexité des problèmes liés à la salinité et il n'existe pas de corrélation automatique
entre le comportement in vitro et celui de la plante entière [2].
Chez le blé, des plantes ont été régénérées à partir de lignées cellulaires diploïdes
initiées à partir d'embryons matures ou immatures, et sélectionnées pour leur tolérance
à NaCl ou à l'eau de mer. La descendance Rt des plantes régénérées à partir de cals
sélectionnés a été cultivée pendant 4 semaines dans une solution hydroponique conte-
nant 0,5 % NaCl ; les plantes obtenues ont montré un taux de survie supérieur à celui
du témoin non sélectionné [13].
314
Sélection in vitro de plantes androgénétiques de blé tendre résistantes à la salinité
Création de la variabilité et sélection des génotypes résistants

Nous avons appliqué une pression de sélection en présence de NaCl à des cals issus
d'anthères de la variété de blé Sabine, sensible à la salinité.
Notre étude de la variation gamétoclonale induite par la culture d'anthères a porté
sur l'analyse de 2 modalités de régénération privilégiant soit l'organogenèse après une
phase de callogenèse [27], soit l'embryogenèse selon la technique de Piri et al. [19].
La variabilité induite par la culture d'anthères a été évaluée sur base du rapport
entre le nombre de cals ou embryoïdes survivants sur milieux de régénération supplé-
mentés en NaCl (0,75 % et 0,9 % globalisés) et le nombre de cals ou embryoïdes mis
en culture sur ces milieux sélectifs (Tableau II).
Tableau IL Fréquence des cals et embryoïdes sélectionnés et des plantules vertes régéné-
rées.
Nombre de cals % de cals Nombre de

Protocole ou embryoïdes ou embryoïdes plantules
de Traitements Nombre placés sur survivants sur vertes
régéné- des d'anthères le milieu de le milieu régénérées
ration anthères cultivées sélection contenant de sélection (b)
0,75 % 0,9 % 0,75 % 0,9 % 0,75 % 0,9 %
(a) NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl
irradiées 492 24 22 8 4 1 0
non irradiées 680 53 20 14 3 1 0
irradiées 550 25 25 4 0 0 0
non irradiées 586 30 27 3 1 0 0
(a ) : Protocole de régénération :
A : cals induits sur le milieu d'induction initiés à partir d'anthères irradiées ou non (rayons gamma à 0,43 krad).
après avoir été prélevées sur des épis de plantes cultivées en serre (var. Sabine).
B : embryoïdes induits à partir d'anthères irradiées ou non (rayons gamma à 0,43 krad), prélevées sur des épis de
plantes cultivées en serre (var. Sabine).
(b) : nombre de plantes régénérées après transfert des cals ou embryoïdes survivant sur un milieu de régénération
ne contenant pas de NaCl.
Nos résultats indiquent que la proportion de cals survivant après sélection sur les
milieux de régénération Supplementes en NaCl (0,75 % et 0,9 %), ainsi que le nombre
de plantules obtenues, sont plus élevés avec le protocole A (régénération privilégiant
l'organogenèse) qu'avec le protocole B (favorisant l'embryogenèse).
Les variations génétiques induites par la culture in vitro peuvent être amplifiées par
l'application d'agents mutagènes (dont les rayons gamma) sur les tissus haploïdes ou
diploïdes. L'application de rayons gamma sur les anthères de riz, avant leur mise en
culture, augmente la fréquence des variations affectant des caractères comme la préco-
cité ou la résistance à certaines maladies chez les plantes régénérées [14].
Dans cette perspective, nous avons associé l'application des rayons gamma à la cul-
ture in vitro, par irradiation des épis de blé avant le prélèvement des anthères.
Il est reconnu que l'irradiation gamma affecte le comportement des tissus cultivés
in vitro. Chez le blé, des travaux [25] ont montré qu'une irradiation à 0,1 krad, appli-
quée sur les épis avant la mise en culture des anthères, augmente la fréquence de la
première division des microspores ainsi que la formation de structures multicellulaires,
sans toutefois modifier le taux de régénération des plantules. Les mêmes auteurs ont
315
K. Piri et al.
indiqué que, chez le riz, l'irradiation gamma des épis avec une dose de 0,1 krad aug-
mente de 30 % la fréquence de la callogenèse et de la régénération de plantules vertes,
par rapport au matériel non irradié. Les doses plus élevées diminuent la division des
microspores, la fréquence d'initiation des cals, et le nombre de plantules vertes régéné-
rées. Des effets analogues ont été observés chez le maïs [18] où le traitement des
embryons immatures avec 0,5 krad de rayons gamma, avant la mise en culture in vitro,
augmente la fréquence des cals embryogènes et la régénération des plantules, tandis
que le traitement à 1 krad diminue les valeurs de ces deux paramètres.
Dans nos essais, l'irradiation gamma des épis avec 0,107 ou 0,210 krad a augmenté
de 40 % la fréquence de callogenèse (ou d'embryogenèse) des anthères cultivées sur
les milieux d'induction. Les doses plus élevées d'irradiation gamma des épis diminuent
progressivement la fréquence de callogenèse ou d'embryogenèse. Afin de provoquer
une quantité importante de mutations, nous avons choisi d'utiliser un traitement gamma
de 0,43 krad, qui réduit la callogenèse à partir des anthères, de 40 % à 60 % selon le
milieu d'induction utilisé.
Sur la base de la proportion des cals survivants sur le milieu de régénération sup-
plémenté en NaCl (0,75 % et 0,9 % additionnés), l'irradiation des épis de blé induit
une variabilité génétique supérieure à celle du matériel non irradié. Cependant, eu
égard à l'effet dépressif de l'irradiation des épis sur l'androgenèse, le nombre de plan-
tules vertes régénérées in fine à partir des cals sur le milieu de régénération contenant
NaCl, n'est pas significativement amélioré par l'irradiation des épis (Tableau III).
En conclusion de nos essais, 12 plantes vertes androgénétiques R0 spontanément
diploïdes et fertiles ont été régénérées à partir de cals sur des milieux de régénération
contenant 0,75 % ou 0,9 % de NaCl ; 2 proviennent du milieu supplemento avec 0,9 %
et 9 ont été régénérées en présence de 0,75 % de NaCl.
Tableau III. Effet de l'irradiation gamma des épis sur le nombre de plantes sélectionnées pour
leur tolérance à la salinité.
Nombre Nombre de cals Nombre de
Protocole d'anthères androgénétiques Nombre de plantes plantes/
de déposées déposés sur milieu régénérées anthères
sélection sur d'anthères de sélection à partir des cals régénérées
le milieu callogènes sur milieu
(a) d'induction NaCl NaCl de sélection
0 % 0,75 % 0,9% 0% 0,75 % 0,9 % (b)
A 5 600 6,8 120 132 130 8 3 1 4
B 6 000 15,6 280 340 320 66 5 1 6
(a) : protocole de sélection.
A : épis irradiés (0,43 krad) après avoir été prélevés sur des plantes (var. Sabine) cultivées au champ.
B : épis non irradiés prélevés sur des plantes (var. Sabine) cultivées au champ.
(b) : nombre total de plantes vertes régénérées à partir des cals survivant sur les milieux de sélection contenant
0,75 % ou 0,9 % de NaCl.
Évaluation de la descendance des lignées androgénétiques sélectionnées

Un caractère sélectionné in vitro ne s'exprimant pas nécessairement au niveau des
plantes régénérées ou de leur descendance, nous avons évalué la tolérance à la salinité
des Rj obtenus à partir des dihaploïdes. Six lignées R{ sur 7 ont montré une tolérance à
la salinité supérieure à la variété Sabine d'origine, sur la base de la réduction du chlo-
316
Sélection in vitro de plantes andrò génétique s de blé tendre résistantes à la salinité
rure de tétrazolium en formazan [11] par les cellules de rondelles foliaires ayant préala-
blement flotté pendant 24 h sur 1,6 % NaCl.
Après autofécondation des individus R,, les descendants (R,) de 5 lignées (1 à 5)
ont été cultivés dans des bacs d'hydroponiques contenant la solution de Hoagland addi-
tionnée ou non de NaCl (0,9 %). Ces plantes ont été comparées à la variété Sabine
d'origine et à une lignée T3 descendant d'une plante androgénétique provenant de la
variété Sabine non soumise à la sélection in vitro. La mesure du poids sec des parties
aériennes a été effectuée après 16 jours de culture (Figure 1).
Il apparaît qu'en l'absence de NaCl dans le milieu, les lignées sélectionnées 3, 4 et
5, ainsi que la lignée T3, présentent une croissance plus marquée que la variété Sabine.
En milieu salin, les lignées sélectionnées (à l'exception des lignées 1 et 2) ainsi que
la lignée T3, montrent une plus grande production de matière sèche que Sabine.
La réduction de la croissance en milieu salin, par rapport au témoin sans sel, varie
entre 37 % et 45 % pour toutes les lignées étudiées et pour le témoin Sabine. On peut,
dès lors, penser que la plus grande tolérance à la salinité développée chez les variants
est liée à leur vigueur accrue, ce qui rejoint les résultats obtenus sur pomme de terre
(Gutierrez, résultats non publiés).
Afin d'identifier les mécanismes de tolérance développés au cours des protocoles de
sélection in vitro, nous nous sommes intéressés à l'accumulation des ions Na+ et K+,
mesurée par spectrophotométrie d'émission de flamme [23]. Les lignées qui maintien-
nent des niveaux de Na+ relativement bas sont celles qui, globalement, présentent la
meilleure croissance en milieu salin (Figure 2). Ce comportement est propre aux glyco-
phytes et a été observé chez les variétés de blé sélectionnées par hybridation classique.
La deuxième composante nutritionnelle susceptible d'intervenir est l'efficacité avec
laquelle le K+ absorbé est utilisé pour les besoins de la plante. L'efficacité d'utilisation
du potassium constitue un paramètre pour lequel on observe une variabilité importante,
notamment chez l'orge [9,10], L'efficacité d'utilisation de K+ a été définie comme la
quantité de biomasse produite par unité de K+ absorbé [15].
L'application de ce critère montre que la plupart des lignées de blé que nous avons
sélectionnées ont une efficacité d'utilisation du potassium significativement plus élevée
que Sabine, y compris le variant 1, dont la croissance n'est pas améliorée (Figure 3).
o
c
o>
0 100 200 300 400 500
Poids sec (mg)

Figure 1. Poids sec de plantes androgénétiques de blé en conditions de stress salin.
317
K. Pin et al.
180
• SSa
160
140 -
• SS3
• T3
120
• S1S18
i 100
• SS4 •SAB
80 h
* SSb
I I
60.
30 35 40 45 50 55 60
Indice d'accumulation de NaCI dans les feuilles
Figure 2. Relation entre le poids sec des feuilles en milieu sain et l'indice d'accumulation de
NaCI dans les feuilles.
Indice d'accumulation = rapports des concentrations en NaCI présents dans les feuilles de plan-
tules se développant en milieu salin ou non salin.
S,S|8, SSa, SS3 SS4, SSb = lignées androgénétiques provenant de plantes regénérées à partir de
cals sélectionnés en présence de NaCI.
T3 = lignée androgénétique provenant d'une plante régénérée à partir d'un cal non sélectionné
sur NaCI.
SAB = variété Sabine.
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Efficacité d'utilisation de K
Figure 3. Efficacité d'utilisation du potassium chez les lignées androgénétiques du blé sous
stress salin.
Efficacité d'utilisation de K+ (quantité de biomasse produite par unité de K+ absorbé) des lignées
androgénétiques sélectionnées, comparées à la variété Sabine (SAB).
318
Sélection in vitro de plantes androgénétiques de blé tendre résistantes à la salinité
Conclusion
Par sélection in vitro de plantilles dihaploïdes issues de culture d'anthères (irradiées ou

non aux rayons gamma), en présence de 0,75 % ou 0,9 % de NaCl, nous avons obtenu
des lignées plus résistantes au sel que la variété de départ Sabine ayant fourni les épis-
mères. Chez la plupart des lignées, ce caractère a été transmis de façon homogène par
autofécondation à la Rl et à la R r
La tolérance à la salinité, développée chez nos variants gamétoclonaux après sélec-
tion in vitro en présence de NaCl, est liée à une plus grande vigueur des plantes (y
compris en l'absence de sel), à une limitation des transferts du sodium vers les tissus
photosynthétiques, et à une meilleure efficacité d'utilisation du potassium.
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320
34
Isolement de protoplastes
à partir de mésophylle, de cals de feuilles
et de cals de racines de Prunus cerasus L.,
var. « Montmorency »
RAOUDHA KAMOUN-MEHRI12, PHILIPPE LEPOIVRE1,

PHILIPPE BOXUS2
1. Laboratoire de Phytopathologie, Faculté des Sciences Agronomiques,

2. Station de Recherches des Cultures Fruitières et Maraîchères,
Bien que la technologie des protoplastes fournisse, pour l'amélioration des espèces
fruitières, une alternative aux méthodes d'hybridations conventionnelles par la création
de nouveaux génotypes : production de variants somaclonaux [8] et d'hybrides soma-
tiques [10], elle reste tributaire de la capacité de ces cellules végétales à régénérer une
plante entière. Des systèmes protoplastes-plantes ont été développés pour un grand
nombre d'espèces herbacées, alors que pour les ligneux tempérés, les résultats sont
limités et récents, les premiers datant de 1986 [7].
L'isolement des protoplastes constitue la première étape de ce protocole et condi-
tionne la réussite de leur culture ultérieure et par conséquent du processus de régénéra-
tion [1, 2] mais aucune technique d'isolement appliquée à un génotype donné n'est
entièrement extrapolable à d'autres espèces ou variétés.
Plusieurs paramètres interviennent dans le processus d'isolement et influencent le
rendement et la viabilité des protoplastes dont :
- l'origine et les conditions de prétraitement des tissus utilisés comme source de
protoplastes incluant les conditions de leur culture, leur âge, leur état physiologique et
le protocole de préparation de ces tissus ;
321
R. Kamoun-Mehri, P. Lepoivre, P. Boxus
- la composition des solutions enzymatiques utilisées pour la digestion des tissus et

les conditions d'incubation (température, lumière) pendant cette opération.
Chez Prunus cerasus L. l'établissement de techniques d'isolement de protoplastes
efficaces et reproductibles n'a concerné que 3 porte-greffes clonaux, CAB4D, CAB5H
et CAB11E [9] [11]. Le présent travail présente un protocole d'isolement des proto-
plastes de Prunus cerasus L.,var. « Montmorency » à partir de 3 types de tissus : le
mésophylle foliaire, des cals de feuilles ou des cals de racines. Les effets du stade phy-
siologique de l'expiant, du traitement plasmolysant et du traitement enzymatique sur le
rendement, la viabilité et la taille des protoplastes sont étudiés.
Matériel et méthodes
Matériel végétal
Des vitroplants issus de méristèmes de cerisier acide Prunus cerasus. L., var. « Mont-
morency » et micropropagés à la Station de Recherches des Cultures fruitières et
maraîchères (Centre de Recherches Agronomiques de Gembloux) ont été utilisés
comme source de matériel foliaire et comme explants, pour la production de cals.
Pour un meilleur développement des feuilles, les vitroplants ont été transférés sur le
milieu MS4 constitué de macro-éléments, micro-éléments et vitamines MS [6] addition-
né de NAA (0,3 mM), BAP (3 mM) et GA3 (0,13 mM), solidifié avec 0,5 % d'Agar
Difco (pH = 5,6). Les cultures ont été maintenues sous une photopériode de 16 heures,
à température de 25 ± I o C. L'énergie lumineuse est de 35 (imol nr 2 sec 1 .
Les cals de feuilles ont été initiés à partir de feuilles bien développées, non vitri-
fiées, blessées au niveau de la nervure centrale et déposées face supérieure au contact
du milieu de callogenèse (MS3). Ce milieu à base de macro-éléments, micro-éléments
et vitamines MS [6] contient NAA (10 mM) et BAP (1 mM) (pH = 5,6).
Les cals de racines ont été initiés, à partir de fragments de racines de 1 à 2 cm de
long, sur le même milieu de callogenèse MS3. Le milieu d'enracinement est constitué
de macro-éléments (dilués de moitié) et micro-éléments MS [5] auxquels on ajoute
2 mgfl IBA (pH = 5,3).
Les cals de feuilles ou de racines ainsi obtenus ont été séparés de l'expiant et main-
tenus par repiquages réguliers sur le même milieu MS3. Les conditions de culture sont
les suivantes : photopériode de 16 heures, température de 25 ± 1 °C, et énergie lumi-
neuse de 22 (imol nr 2 sec 1 fournie par des tubes fluorescents cool white.
Préparation des protoplastes
Les protoplastes de mésophylle foliaire ont été isolés à partir de feuilles prélevées à
différents niveaux des vitroplants (feuilles apicales, médianes et básales) après 10, 30
et 45 jours de culture sur MS4. Pour les cals de feuilles ou de racines, les protoplastes
ont été isolés après 10, 15, 20 et 30 jours de culture sur le milieu MS4.
Pour tester l'effet de la plasmolyse sur l'isolement de protoplastes, de jeunes
feuilles et des cals de feuilles ou de racines ont été finement lacérés et placés à 25° C
et à l'obscurité dans la solution plasmolysante CPW [12] additionnée d'un tampon
MES 5 mM (acide 2-N morpholino-éthane sulfonique) (pH = 5,6), de 13 % de manni-
tol et 0,1 M glycine (antioxydant). Cette solution a été préalablement stérilisée par fil-
tration (0,2 [im). L'osmolalité de la solution est de 800 mosmol/kg H2O.
Les protoplastes isolés ont été dénombrés, leur viabilité déterminée et leur taille
322
mesurée après 0, 30, 60 et 90 minutes d'incubation des tissus dans le milieu plasmoly-
sant.
Les fragments de limbe foliaire et de cals ont été ensuite transférés dans une solu-
tion enzymatique à raison de lg de poids frais par 10 ml de solution stérilisée par fil-
tration (0,2 |j.m). Les enzymes (cellulases, hémicellulases et pectinases) utilisées à dif-
férentes concentrations ont été dissoutes dans la solution plasmolysante (pH = 5,8)
[12]. Les tissus ont été incubés à l'obscurité et à 25 ± 1° C, et soumis à une agitation
lente de 40 tours/mn.
Une étude de la cinétique de la libération des protoplastes de mésophylle foliaire,
de cals de feuilles et de cals de racines a été réalisée en enregistrant à intervalle de
temps régulier le nombre, la viabilité (% de protoplastes fluorescents en présence de
diacétate de fluoresceine, FDA) [15] et le diamètre des protoplastes isolés.
A la fin de la phase de digestion, la suspension de protoplastes est filtrée successi-
vement à travers 2 tamis dont les mailles sont respectivement de 100 et 64 (im pour les
protoplastes issus de cals de feuilles ou de racines, et à travers un tamis dont les
mailles sont de 53 |0.m pour les protoplastes du mésophylle foliaire. La suspension est
lavée avec la solution CPW 13 % de mannitol, puis centrifugée à 120 xg pendant
10 minutes pour les feuilles et à 100 xg pendant 8 minutes pour les cals, afin d'élimi-
ner la solution enzymatique. Deux centrifugations successives sont ensuite effectuées
pour la purification des protoplastes [13].
Après l'étape de purification, on procède au comptage et aux mesures de viabilité et
de taille des protoplastes [12]. Le nombre de protoplastes par ml de suspension est
déterminé sur la lame de Burker et rapporté au poids frais de tissus digérés.
Le diamètre moyen des protoplastes est estimé par la mesure du diamètre de
200 protoplastes à l'aide d'un micromètre oculaire.
Résultats
Les meilleurs résultats en terme de nombre et de viabilité ont été obtenus à partir de
mésophylle des feuilles médianes prélevées sur des vitroplants cultivés depuis 10 jours
(Tableaux I et II). Le maximum de protoplastes viables a été obtenu à partir de cals, 10
à 15 jours après leur mise en culture (Tableau III).
Tableau I. Effet du niveau d'insertion des feuilles sur le nombre et la viabilité des proto-
plastes isolés de mésophylle de Prunus cerasus L.,var. « Montmorency ».
Niveau d'insertion Nombre moyen % de Diamètre moyen

des feuilles de protoplastes protoplastes des protoplastes
à partir de l'apex par g de poids frais vivants (Mm)
Feuilles apicales 3,3 x 106 (0,7) 50 (4,9) 12 (0,9)
Feuilles médianes 15,2 x 106 (2,3) 77 (4,5) 15 (1,4)

6
Feuilles básales 3,8 x 10 (0,7) 29(4) 10 (0.5)
Feuilles de plantules repiquées depuis 10 jours, plasmolysées pendant 1 heure dans CPW et incubées pendant
8 heures dans une solution enzymatique contenant 1 % de cellulase RS, 1 % de hémicellulase et 0.1 % de
pectolyase Y-23.
Les valeurs représentent la moyenne de 3 répétitions suivies de l'erreur standard.
323
Tableau II. Effet de F age des plantilles sur le nombre et la viabilité des protoplastes isolés
de mésophylle foliaire de Prunus cerasus L., var. « Montmorency ».
Nombre moyen % de Diamètre moyen
Nombre de jours
de protoplastes protoplastes des protoplastes
après repiquage
par g de poids frais vivants (um)
10 jours 15,2 x 10 " (2,3) 77 (4,5) 15 (1,4)
30 jours 1,5 x 10 6 (0,3) 27 (5,8) 11 (0,8)
45 jours 0,2 x 10 6 (0,1) 27 (4,5) 10 (0,9)
Feuilles médianes plasmolysées 1 heure dans CPW 13 % de mannitol et incubées pendant 8 heures dans la
solution enzymatique contenant 1 % de cellulase RS, 1 % de hémicellulase et 0,1 % dectolyase Y-23.
Tableau III. Effet de l'âge des cals de feuilles et de racines sur le rendement et la viabilité
des protoplastes isolés de Prunus cerasus L.,var. « Montmorency ».
Types Nombre moyen % de Diamètre moyen
Nombre de jours
de de protoplastes protoplastes des protoplastes
après repiquage (um)
cals par g de poids frais vivants
10 jours Cf 3,5 x 106 (2,7) 86 (3,2) 19(0,1)

Cr 6,8 x 106 (3,8) 90 (2,6) 28 (0,03)
15 jours Cf 2,8 x 106 (1,1) 52 (3,7) 19 (0,52)
Cr 7,9 x 106 (0.9) 91 (5,4) 28 (0,3)
20 jours Cf 0,7 x 106 (0,2) 49 (0,9) 17 (0,1)

Cr 4,9 x 106 (2,1) 79 (3,6) 25 (0,2)
30 jours Cf 0,7 x 106 (0,5) 20 (0,7) 18(1,1)

Cr 2,1 x 10 6 (0.9) 51 (1,8) 25 (0,8)
Cals issus de feuilles (Cf) et cals issus de racines (Cr) incubés pendant 16 heures et à l'obscurité dans la
solution enzymatique contenant 2 % de cellulase R-10, 2 % de rhozyme HP-150 et 0,03 % de macérozyme
R-10(pH = 5,8).
La plasmolyse est une étape améliorant l'isolement des protoplastes de mésophylle

foliaire tant en terme de rendement qu'en terme de viabilité (Figure 1) contrairement aux
cals chez lesquels ce traitement diminue aussi bien le nombre que la viabilité des proto-
plastes (Tableau IV). La durée optimale de plasmolyse du mésophylle foliaire est de
1 heure En fin de cette période, les cellules végétales deviennent arrondies et plus volu-
mineuses. Le contenu cellulaire est détaché de la paroi pectocellulosique facilitant ainsi la
digestion enzymatique de cette dernière sans altérer le métabolisme de la cellule.
324
100 -i nombre xlO 5

viabilité en %
Taille en microns.
80 -
60 -
40-
20-
0 30 60 90
Durée de la plasmolyse (minutes).
Figure 1. Effet de la durée de la plasmolyse sur le nombre, la viabilité et la taille des protoplastes
de mésophylle foliaire de Prunus cerasus L., var. « Montmorency ». Les fragments de feuilles ont
été plasmolysés dans CPW puis incubés pendant 8 heures dans la solution enzymatique contenant
1 % de cellulase Onozuka RS, 1 % de hémicellulase et 0,1 % de pectolyase Y-23.
Tableau IV. Effet de la plasmolyse sur l'isolement des protoplastes de cals de feuilles et de
cals de racines de Prunus cerasus L., var. « Montmorency ».
% cellules Nombre Diamètre

Traitement % de
vivantes moyen/g moyen des
Source de
des cals de matériel protoplastes protoplastes
plasmolyse avant l'isolement végétal vivants (um)
Cals Avec 1,5 x IO6 46 21

de 70% (0.3) (1,6) (0.1)
feuilles Sans 3,5 x IO6 86 19
(MS3) (3.4) (5,1) (0,4)
Cals Avec 6.4 x IO6 79 27

de (7,3) (2,8) (0,01)
80 %
racines Sans 7,9 x IO6 91 28
(MS3) (1,9) (3,8) (0,2)
Plasmolyse des cals 1 heure dans CPW et incubation de 16 heures dans la solution enzymatique contenant
2 % de cellulase Onozuka R-10, 2 % de rhozyme HP-150 et 0,03 % de macérozyme R-10.
La solution enzymatique composée de 1 % de cellulase Onozuka RS, 1 % de hémi-

cellulase et 0,1 % de pectolyase Y-23 a permis l'obtention de 15 x 10 6protoplastes/g de
feuilles avec une viabilité de 78 %. En remplaçant 1 % de cellulase RS par la même
concentration de cellulase R-10, le rendement n'est plus que de 5,5 x 10 6 de proto-
plastes avec 59 % de viabilité (Tableau V). L'utilisation de la macérozyme à 1 %
comme pectinase a permis l'obtention d'un rendement de 2,3 x 10 6 de protoplastes
325
avec une viabilité de 49 %. Le rendement maximum de 3,5 x 10 6 et 8 x 10 6 de proto-

plastes par g de cals de feuilles et de cals de racines avec des pourcentages de viabilité
respectifs de 86 et 91 % ont été obtenus avec la solution enzymatique composée de 2 %
de cellulase Onozuka R-10, 2 % de rhozyme HP-150 et 0,03 % de macérozyme R-10.
Tableau V. Effet des différentes solutions enzymatiques sur l'isolement des protoplastes
isolés de mésophylle foliaire de Prunus cerasus L.var. « Montmorency ».
Nombre % de
Solution Cellulase Hemi- Pectolyase de. proto- proto- Diamètre
enzymatique Onozuka cellulase Y-23 plastes/ plastes moyen
RIO (Sigma) gMF vivants (um)
(x 10«)
A 0,5% 1 % 0,1 % 1,2 (0,1) 15(4) 12 (0,9)

B 1 % 1 % 0,1 % 5,5 (0,7) 59 (3,5) 13 (0,2)
C 2% 1 % 0,1 % 3,1 (2,8) 10 (4,3) 12 (1,6)
D 1% 1 % 0,05 % 0,4 (0,1) 25 (6,4) 10 (0,5)
E 1% 1 % 0,2% 6,7 (1,4) 33 (3,2) 13 (1,6)
F 1% 1 % 0,3% 2,0 (0,8) 0 12 (0,9)
Cellulase
G Onoz. RS
1% 1 % 0,1 % 14 (1,7) 78 (2,05) 15 (1,4)
Feuilles de vitroplants cultivées depuis 10 jours sur MS4 et plasmolysées dans CPW 13 % de mannitol pen-
dant une heure.
La durée optimum d'incubation enzymatique en terme de rendement et de viabilité

des protoplastes a été de 8 heures pour le mésophylle foliaire et de 16 heures pour les
cals racinaires et foliaires (Figures 2, 3 et 4).
A la fin de la digestion, la taille moyenne des protoplastes diffère selon l'origine de
l'expiant. Les protoplastes issus de mésophylle foliaire sont petits (15 microns), riches
en chloroplastes et présentent un cytoplasme dense alors que ceux de cals de racines
sont plus volumineux (28 microns) et vacuolisés. Les protoplastes issus de cals de
feuilles ont un diamètre intermédiaire de 19 microns.
Discussion et conclusions
Les meilleurs résultats en termes de nombre et de viabilité des protoplastes ont été
obtenus avec des feuilles de vitroplants, pré-plasmolysées pendant une heure dans la
solution saline CPW 13 % de mannitol et incubées pendant 8 heures, à l'obscurité,
dans une solution enzymatique composée de 1 % de cellulase RS, 1 % de hemicellulase
et 0,1 % de pectolyase Y-23.
Pour les cals de feuilles ou de racines, le maximum de protoplastes viables est enre-
gistré après une incubation de 16 heures, sans plasmolyse préalable, dans une solution
enzymatique contenant 2 % de cellulase Onozuka R-10, 2 % de rhozyme HP-150, et
0,03 % de macérozyme R-10.
326
Nbre proto. F.
Nbre proto. Cr
S 15-
Ù Nbre proto. Cf
|
S" 10 -
a
V
•a
5-
25 28
Durée d'incubation (heures)
100-1
Viab.proto. F.
viab.proto. Cr
Viab. proto.Cf
„ 80-
V
I 60-
I
o 40-
I
s 20-
0
10 15 20 25 30
Durée d'incubation (heures)
30 -,
Taille proto. F.
taille proto. Cr
Taille proto.Cf
20-
10
12 17 22 27 32
Durée d'incubation ( heures)
Figures 2, 3, 4. Évolution du nombre, de la viabilité et de la taille des protoplastes issus de méso-

phylle foliaire, de cals de feuilles ou de cals de racines en fonction de la durée d'incubation enzy-
matique. Pour le mésophylle foliaire, la solution enzymatique est composée de 1 % de cellulase
RS, 1 % de hémicellulase et 0,1 % de pectolyase. Pour les cals de feuilles ou de racines, la solu-
tion est de 2 % de cellulase R-10, 2 % de rhozyme HP-150 et de 0,03 % de macérozyme R-10.
327
La digestion des tissus foliaires de la variété « Montmorency » nécessite l'utilisa-

tion de préparations enzymatiques présentant des activités spécifiques élevées (cellulase
RS et pectolyase Y-23) alors que les protoplastes de cals peuvent être isolés avec cellu-
lase Onozuka R-10 et la macérozyme R-10.
D'autre part, l'utilisation de la cellulase Onozuka RS et de la pectolyase Y-23
(comme pectinase) a augmenté significativement le nombre et la viabilité des proto-
plastes de mésophylle foliaire par rapport à la cellulase Onozuka R-10 et à la macéro-
zyme R-10. Cela est confirmé par les travaux de James et al. [3] qui ont souligné l'ef-
fet de la cellulase RS sur le rendement de protoplastes du Ceriser « Colt »
{Prunus avium x pseudocerasus). Selon Johnson et al. [4], Grézes et al. [3], ces
enzymes présentent des activités spécifiques élevées par rapport respectivement à la
cellulase Onozuka R-10 et la macérozyme R-10. En effet, la cellulase Onozuka RS
contient une activité xylanase 3 fois plus grande que la cellulase R-10, qui, elle, possè-
de plutôt des activités amylase, hémicellulase et protease. La pectolyase Y-23 est une
macérase hautement purifiée à'Aspergillus japonicus contenant 2 types de pectinases :
une endopolygalacturonase et une endopectine lyase. La macérozyme R-10 dérivée du
champignon Rhizopus spp est la seule enzyme commerciale contenant à la fois pectina-
se, cellulase et hémicellulase.
Les taux de viabilité des protoplastes observés (78 % à 91 %) peuvent être considé-
rés comme satisfaisants puisque, chez les ligneux, un bon système d'isolement doit per-
mettre d'enregistrer un taux supérieur à 50-60 % de viabilité [10].
Par ailleurs, les protoplastes issus de mésophylle foliaire de la variété « Montmoren-
cy » apparaissent plus petits (15 microns de diamètre en moyenne) que la plupart des
rosacées (25 microns en moyenne) [10]. L'importance de ce facteur « taille des proto-
plastes » a été soulignée aussi bien pour la culture que pour la fusion des protoplastes et
la caractérisation des hétérokaryons [12]. Une corrélation a été observée entre la taille
des protoplastes et leur capacité à subir des pulsations électriques [14] et entre la taille
et la nature des milieux de culture [10]. Plus les protoplastes sont gros, plus ils sont sen-
sibles au voltage et à la durée des pulsations électriques. De plus, les protoplastes de
petite taille préfèrent des milieux de culture semi-solides ou solides à ceux liquides.
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329
35
Rôle du génome « D »
dans la régénération haploïde
du croisement « blé x maïs »
A. MOIENI, A. SARRAFI
Institut National Polytechnique, École Nationale Supérieure Agronomique (INP-

ENSAT), Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes (BAP), EA DRED
832, 145, avenue de Muret, 31076 Toulouse, France.
Résumé
L'aptitude à la régénération haploïde dans le croisement intergénique (blé X maïs) de

deux variétés de blé tendre (Cheyenne et Wichita) et de leurs 14 lignées substituées
pour le génome « D » a fait l'objet de cette étude. L'expérimentation, réalisée dans une
serre contrôlée, consiste en un essai en blocs randomisés avec 4 répétitions, chacune
comprenant un pot de 3 plantes. Les épis de chaque génotype ont été castrés et pollini-
sés par les grains de pollen d'un hybride FI de maïs (Seneca 60). 24 heures après la
pollinisation, 0,3 à 0,5 ml d'une solution de 2,4-D (10 mg/l) a été injectée dans la
cavité de l'entre-nœud, et une goutte dans chaque fleur. Des embryons et des plantules
haploïdes vertes ont été obtenus chez l'ensemble des génotypes. L'étude de plusieurs
paramètres de la régénération haploïde montre que :
- le chromosome « 3D » de Cheyenne chez Wichita diminue significativement le
nombre d'embryons formés pour 100 fleurs pollinisées, ainsi que le nombre d'em-
bryons formés pour 100 ovaires développés,
- le chromosome « 5D » de Wichita chez Cheyenne diminue significativement les
valeurs des deux paramètres : nombre d'ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées
et nombre d'embryons germes pour 100 embryons formés.
331
A. Moieni, A. Sarrafi
Une des méthodes actuellement utilisée pour l'amélioration des blés est l'haplodiploïdi-
sation. Cette méthode suscite un très vif intérêt parmi les sélectionneurs, car elle per-
met de raccourcir la période de sélection aboutissant à la production de lignées pures
par comparaison aux méthodes classiques de sélection [3, 4, 12].
Le maïs, Zea mays L., peut fertiliser le blé tendre Triticum aestivum L., [7, 17]. Le
zygote issu de croisements entre le blé et le maïs contient une combinaison de 21 chro-
mosomes de blé et 10 chromosomes de maïs, et l'albumen est soit absent, soit forte-
ment anormal [7, 9]. Les 10 chromosomes de maïs montrent des centromeres qui pré-
sentent une faible affinité pour le fuseau achromatique, ce qui entraîne leur élimination
rapide au cours des trois premières divisions cellulaires et la formation d'un embryon
haploïde avec des chromosomes en provenance du parent blé [7, 9, 10].
Les deux gènes du blé, Krl et Kr2, empêchant le croisement avec le seigle, Secale
cereale [5, 6], et avec Hordeum bulbosum [14, 15] n'ont pas un effet significatif sur le
croisement « blé x maïs » [8]. Les gènes Kr inhibent la croissance du tube pollinique
étranger au niveau du style et sa pénétration à l'intérieur de l'ovaire.
Par l'étude des lignées de substitution chromosomiques, on peut identifier des chro-
mosomes porteurs de gènes correspondant à un caractère de façon plus fiable que par
la voie des aneuploïdies [13].
Le but de ce travail a été d'étudier l'intervention du génome D et de ses chro-
mosomes dans la régénération haploïde du croisement « blé hexaploïde x mais ».
Deux lots de lignées de substitution chromosomiques développées par Morris à l'uni-

versité de Lincoln (Nebraska, USA) entre deux cultivare de blé tendre de force Wichita
(WI) et Cheyenne (CNN) ont été utilisés dans cette étude. L'obtention de ces lignées a
été décrite par Zemetra et al. [16].
Les grains de chaque génotype ont été vernalises dans des boîtes de Pétri, dans un
réfrigérateur, durant 6 semaines à 2 °C± 1 à l'obscurité. Par la suite, les grains germes
ont été semés dans un mélange de terreau et de sable (3-1). La variété de maïs « Sene-
ca 60 » est cultivée en plusieurs semis échelonnés à l'intervalle d'une semaine. La flo-
raison de cette variété de maïs demande 9 à 10 semaines. La culture est conduite sous
serre dans les conditions contrôlées suivantes :
- une photopériode de 16 heures avec une intensité lumineuse de 130-300 (lE.m^s1,
- une température de 25 °C le jour et de 15 °C la nuit,
- une humidité relative de 75 % à 80 %.
Le dispositif expérimental est un essai en blocs randomisés avec 4 répétitions,
chaque répétition étant constituée d'un pot de trois plantes. Les plantes ont été irriguées
régulièrement et, une fois par semaine, l'irrigation a été effectuée avec une solution
nutritive complète et les plantes ont été traitées par des insecticides et fongicides afin
d'assurer une bonne alimentation minérale et un bon état sanitaire.
Pour les 16 génotypes de blé, l'épi est emasculé 1 à 4 jours avant l'anthèse. Les
épis castrés sont recouverts d'un sachet en cellophane pour éviter des croisements acci-
dentels. Un à quatre jours après la castration, lorsque les stigmates deviennent plu-
meux, les fleurs sont pollinisées avec le pollen du maïs. Celui-ci est récolté sur du
papier aluminium en agitant l'inflorescence mâle, puis transféré sur les stigmates de blé
332
Rôle du génome « D » dans la régénération haploïde du croisement « blé x maïs ;
à l'aide d'une petite brosse dans les 10 minutes qui suivent la récolte (la durée de vie
du pollen de maïs étant très courte).
Vingt-quatre heures après la pollinisation avec le maïs, 0,3 à 0,5 ml d'une solution
de 2,4-D (acide 2,4 dichlorophenoxyacétique) à 10 mg/1 sont injectés dans la cavité de
l'entre-nœud supérieur à l'aide d'une seringue fine. La même solution de 2,4-D est
ensuite appliquée directement sur les fleurons à raison d'une goutte dans chaque fleur.
Les épis sont couverts d'un sachet.
Quatorze jours après le traitement au 2,4-D, on repère les épis ayant des grains
assez développés pour être prélevés. Les autres épis sont laissés sur la plante mère pour
une semaine supplémentaire.
Les grains sont stérilisés sous une hotte à flux laminaire par l'éthanol dénaturé
(95°) pendant 1 à 2 minutes, puis dans une solution de Domestos (désinfectant ména-
ger) à une concentration de 25 ml/1 pendant 3 à 5 minutes. Les grains sont ensuite rin-
cés à l'eau distillée stérile, et séchés sur papier filtre stérile.
Les grains sont disséqués sous la loupe binoculaire, à l'aide d'une pince très fine et
d'une pointe à dissection. L'embryon est prélevé avec précaution et placé sur le milieu de
culture.
Le milieu gélose utilisé pour la culture des embryons est composé de :
- 7,5 g/1 de Difco Orchid Agar et 4 g/1 de saccharose.
Le pH du milieu s'ajuste à 5,7. Les boîtes de Pétri sont placées à l'obscurité à
25 °C. Après la germination, les boîtes de Pétri sont placées sous la lumière avec une
photopériode de 16 heures par jour et une intensité lumineuse de 1,5 (jE.nrV1. Les
plantules formées sont alors transférées dans des tubes contenant le même milieu, et
sont placées sous la lumière.
Lorsque les jeunes pousses ont formé suffisamment de racines, elles sont transfé-
rées dans des pots remplis de tourbes et conservées en mini-serres (humidité de 100 %)
placées dans une chambre de culture à une température de 25 °C et une photopériode
de 16 h/j.
Au stade de trois feuilles, les plantules haploïdes sont extraites du sol. Elles sont
ensuite placées dans une solution contenant :
- 0,05 % de colchicine, 1,5 % de DMSO et une goutte de Tween 80 pour 200 ml
de solution.
Les caractéristiques suivantes ont été déterminées pour chaque génotype et chaque
répétition chez tous les épis du maître-brin et du premier brin secondaire :
- nombre d'ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées (ODF),
- nombre d'embryons formés pour 100 fleurs pollinisées (EFF),
- nombre d'embryons formés pour 100 ovaires développés (EFO),
- nombre d'embryons germes pour 100 embryons formés (EGE),
- nombre des plantules vertes pour 100 embryons germes (PVE).
Toutes les données ont été transformées par la fonction Arcsin Vx pour normaliser
la fréquence de distribution.
Les résultats d'analyse de la variance (Tableau I) montrent une différence significative
entre génotypes pour tous les caractères étudiés sauf pour la régénération des plantules
vertes.
D'après les résultats qui sont reportés dans le Tableau II, la différence entre les deux
génotypes parentaux (Wichita et Cheyenne) n'est pas significative pour les caractères étudiés.
333
A. Moieni, A. Sarrafl
Tableau I. Analyse de la variance des paramètres de l'aptitude à la régénération haploïde

chez les lignées substituées.
Paramètres ODF EFF EFO EGE PVE
variation d.d.l CM F CM F CM F CM F CM F
Total 63 52,86 34,84 52,62 1,14 464,89

Génotypes 15 91,98 2,26** 65,92 2,64** 88,15 2,12* 1,15 2,51** 589,37 1,38ns
Blocs 3 39,54 27,68 40,70 1,16 419,94
Résiduelle 45 40,71 24,96 41,56 1,17 426,39
ODF : Ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées

EFF : Embryons formés pour 100 fleurs pollinisées
EFO : Embryons formés pour 100 ovaires développés
EGE : Embryons germes pour 100 embryons formés
PVE : Plantules vertes pour 100 embryons germes
CM : Carré moyen
*: Significatif au seuil de 0,05
** : Significatif au seuil de 0,01
ns : Non significatif
Tableau II. Différences entre les moyennes de chaque lignée de substitution et son parent
receveur pour les paramètres étudiés.
Paramètres ODF EFF EFO EGE PVE

Fond
génétique WI CNN WI CNN WI CNN WI CNN WI CNN
Chromosome
substitué
ID 2,46 -6,11 - 4,74 - 4,47 - 5,34 - 4,71 -6,68 +20,67 - 7,2 - 12,14
2D + 3,14 -6,02 - 2,33 - 4,97 - 3,81 - 6,26 - 12,06 - 7,42 - 13,72 - 12,14
3D 3,45 + 4,72 - 8,98* - 0,08 - 12,65* - 1,81 - 6,06 - 6,05 + 31,00 -8,26
4D + 5,21 -8,84 - 5,23 - 6,26 - 7,75 - 6,42 - 20,32 - 14,25 + 4,75 - 12,14
5D + 5,62 - 13,18* -3,51 -6,91 - 6,01 - 7,01 -9,95 -32,72* -0,95 - 12,14
6D + 0,64 -3,33 - 1,79 - 0,32 - 2,38 - 1,97 -21,64 +8,1 - 13,72 - 12,14
7D 2,97 -2,27 - 3,82 - 0,2 - 3,94 + 0,06 - 7,76 - 23,24 - 0,01 + 10,22
Moyennes des
parents :
WICHITA (WI) 53,36 21,95 27,72 59,55 14,29
CHEYENNE
(CNN) 55,17 15,30 19,49 33,29 12,71
WI-CNN 1,81 (ns) 6,65 (ns) 8.23 (ns) 26,26 (ns) 1,58 (ns)
PPDS (5 %) 9,05 7,08 9,14 30,75 29,28
ODF : Ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées

EFF : Embryons formés pour 100 fleurs pollinisées
EFO : Embryons formés pour 100 ovaires développés
EGE : Embryons germes pour 100 embryons formés
PVE : Plantules vertes pour 100 embryons germes
*: Significatif au seuil de 0,05
ns : Non significatif.
334
Rôle du génome « D » dans la régénération haploïde du croisement « blé x maïs »
Les différences entre les lignées de substitutions et le parent correspondant à leur

fond génétique ne sont significatives que dans les cas suivants :
- Cheyenne (CNN) et CNN (W15D) pour le nombre des ovaires développés ainsi
que pour le nombre des embryons germes,
- Wichita (WI) et WI (CNN3D) concernant le nombre des embryons formés pour
100 fleurs pollinisées et le nombre d'embryons formés pour 100 ovaires développés.
D'après l'ensemble de nos résultats, nous constatons que la formation des ovaires
développés ainsi que l'obtention d'embryons et de plantilles haploïdes dépendent du
génotype de blé utilisé dans les croisements intergénériques « blé x maïs ».
Ces résultats confirment ceux de Laurie et Reymondie [11] chez les blés hexa-
ploïdes et Amrani et al. [2] chez les blés tétraploïdes qui ont montré également une
variabilité génétique très importante pour ces caractères. D'après Al-Qaudhy et al. [1],
la différence entre une lignée de substitution chromosomique et son parent receveur
peut être liée aux situations suivantes :
- effet génétique du chromosome substitué par rapport à l'homologue qu'il remplace,
- interaction entre les gènes du chromosome substitué et ceux du fond génétique
(gènes modificateurs),
- adéquation du nombre de générations dans le programme de rétrocroisement qui
élimine les gènes du cultivar donneur sur les autres chromosomes.
Dans notre étude, les valeurs des paramètres EFF, EFO, EGE et PVE de la variété
Wichita sont supérieures à celles de Cheyenne, mais les différences entre eux ne sont
pas significatives. Bien qu'il n'existe pas de différence significative entre les deux
parents, Wichita et Cheyenne, pour les caractères étudiés, nous avons trouvé des effets
significatifs de deux chromosomes, qui sont les suivants :
- l'effet de chromosome 3D sur la formation d'embryons pour 100 ovaires dévelop-
pés (EFO) ainsi que pour 100 fleurs pollinisées (EFF),
- l'effet du chromosome 5D sur le nombre d'ovaires développés pour 100 fleurs
pollinisées (ODF) et le taux d'embryons germes pour 100 embryons formés (EGE).
Ces résultats indiquent que les chromosomes 3D et 5D seraient porteurs d'un ou de
plusieurs gènes intervenant dans le déterminisme génétique des caractères correspon-
dants. Le chromosome 3D de Cheyenne diminue significativement le nombre d'em-
bryons formés, par rapport aux fleurs pollinisées ainsi que le nombre d'embryons for-
més pour 100 ovaires développés. Le chromosome 5D de Wichita diminue
significativement le nombre d'ovaires développés pour 100 fleurs pollinisées (ODF)
ainsi que le taux des embryons germes pour 100 embryons formés tandis que le chro-
mosome 5D de Cheyenne augmente le taux de ces mêmes caractères.
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336
36
Gynogenèse chez des génotypes

marocains d'orge (Hordeum vulgäre)
M.L. SIBI, M. FAKIRI
Amélioration génétique et Biotechnologies, ENSAIA, 2, avenue de la Forêt-de-Haye,

54505 Vandœuvre, France.
Résumé
L'obtention de plantes haploïdes par gynogenèse est présentée ici chez Bérénice, orge
de printemps de type européen, ainsi que chez les génotypes marocains, Asni, Tamelalt,
et 905. Ces derniers cultivars ont la particularité d'avoir un cycle de croissance extrê-
mement bref, et de ne produire qu 'un nombre restreint de talles, permettant sans doute
à la plante de donner rapidement une descendance, quoique de modeste importance.
Les tests de gynogenèse qui ont porté sur plus de 7 000 ovaires non fécondés ont
amené, pour le génotype Asni, l'obtention de près de 9 % de plantes haploïdes, toutes
étant chlorophylliennes, certains des ovaires ayant donné jusqu'à huit plantes.
La conduite en parallèle de deux lignes expérimentales, l'une en conditions lumi-
neuses, l'autre sans éclairement, montre l'impact positif de l'obscurité sur le dévelop-
pement de plantes haploïdes. Le processus le plus efficace consiste à prélever les épis
quand le pollen est au stade mononucléé tardif, ou binucléé ; un prétraitement de
14 jours à la température de 4 °C précède la mise en culture in vitro des ovaires sur
milieu de Hunter, sans thiamine ni ANA, mais avec addition de 2 mg/l de 2-4 D ; les
boîtes sont entreposées à l'obscurité avec une alternance de température de 22/18 °C
(16/8 heures). Les plantes haploïdes se développent entre la 7e et la 10e semaine d'obs-
curité, elles verdissent dès qu 'elles sont exposées à la lumière.
La production d'haploïdes par culture in vitro présente les intérêts que l'on connaît,
que la technique soit celle de l'androgenèse ou de la gynogenèse. Ici, point plus délicat
337
M.L. Sibi, M. Fakiri
chez les céréales, c'est la régénération de plantes entières qui est visée, afin de produi-
re, en conditions de stress adéquats, des vitrovariants [9-11] résistants à la sécheresse et
à la salinité [12, 13]. Notre but consiste donc à obtenir sur l'ensemble des génotypes
concernés le processus de régénération.
Le génotype européen Bérénice, pour lequel des haplodiploïdes ont déjà été
obtenus [1, 5, 6, 8], servira ici de témoin de référence vis-à-vis des types marocains,
Asni, Tamelat et « 905 » qui seront traités par la culture d'ovaires non fécondés, c'est-
à-dire par gynogenèse.
Les prétraitements [1, 3, 5, 8] et milieux de base qui seront testés sont ceux qui ont
déjà donné des résultats intéressants lors de l'androgenèse de divers génotypes, et réfé-
rés dans les données bibliographiques [1, 2, 4, 5, 6, 8].
Par ailleurs, les cultures in vitro seront menées en parallèle dans deux conditions
d'éclairement différentes (lumière/obscurité), permettant la comparaison de ces proces-
sus expérimentaux.
Matériel végétal et culture en sol
• Description du matériel végétal
Les 4 génotypes utilisés comprennent un type européen, Bérénice (B), et 3 cultivars
marocains, Asni (A), Tamelalt (T), et « 905 » qui proviennent de sélection locale. La
particularité de ces derniers est d'avoir une très grande réactivité vis-à-vis de la chaleur
et de la sécheresse. Dès que l'un de ces deux paramètres est en jeu (même de façon
extrêmement brève), le tallage cesse et l'épiaison a lieu. Cela aboutissant fréquemment
à l'obtention d'un unique épi, de petite taille (15 à 20 cm maximum pour Tamelalt), et
comportant un nombre restreint de grains (9 à 12 grains pour « 905 »). Il convient
donc, pour optimaliser la qualité physiologique du matériel, que l'on sait essentielle
pour tous travaux d'androgenèse ou de gynogenèse, d'entretenir les plantes avec grand
soin, de façon à obtenir un tallage abondant avant l'épiaison.
• Entretien des plantes

Les plantes entières se développent dans du terreau en fértil pots disposés dans un phy-
totron. La photopériode est de 16 heures avec un éclairement de 3 000 lux, les tempé-
ratures diurnes et nocturnes sont de 15 °C et 12 °C (± 2 °C) respectivement, et l'hygro-
métrie est de 75 %.
Prélèvement des épis et culture in vitro

• Prélèvement des épis
Pour que les cellules contenues dans l'ovaire non fécondé évoluent favorablement, il
faut prélever les épis lorsque les anthères contiennent une majorité de grains de pollen
au stade uninucléé avancé, ou binucléé [5, 8]. Cette phase est en cours lorsque les
barbes de ces orges commencent à émerger de la gaine [1,6].
• Prétraitement au froid
Les épis prélevés sont conservés dans un vase au frigo à 4 °C, pendant 14 jours.
338
Gynogenèse chez des génotypes marocains d'orge
• Milieux de culture
Les 5 milieux utilisés sont ceux établis dans le cadre de l'androgenèse, quelquefois
après modifications, et numérotés comme suit :
- 1. Foroughi-Wehr et al. [2], modifié par Devaux (comm. pers., 1987) ;
- 2. Hunter [4] ;
- 3. Hunter, geirrte [4] ;
- 4. Hunter [4]
r sans thiamine-HCl
I 2-4 D (2mg/l) remplace ANA (lmg/1) ;
- 5. San Nœum [8], modifié, (sans efficacité dans nos conditions).
• Mise en culture in vitro
Les épis sont excisés, et les barbes éliminées aux ciseaux, avant stérilisation.
Après 5 mn de trempage dans une solution aqueuse d'hypochlorite de calcium à
70 % et à raison de 25 g/1, les épis sont rincés 3 fois à l'eau stérile. Les ovaires sont
alors prélevés en conditions d'asepsie et déposés dans des boîtes de Pétri (0 = 5 cm)
contenant les milieux nutritifs, avec 20 à 25 unités par boîte. Un total de plus de
7 000 ovaires a été ainsi traité.
Les effectifs des divers génotypes répartis sur les différents milieux sont alors com-
pris entre des valeurs s'approchant de 200 jusqu'à plus de 300 ovaires par processus
expérimental.
• Conditions dans la pièce de culture in vitro
Un éclairement d'environ 2 000 à 3 000 lux pendant 16 heures est fourni par des tubes
fluorescents. La simple protection des boîtes de Pétri par claustration dans des caches
entraîne l'obscurité. Les « températures diurnes et nocturnes sont de 22 °C et 18 °C
(± 2 °C), respectivement, et l'humidité de 75 % à 80 % environ.
Processus expérimentaux et traitement des données
• Entretien des cultures et observations

Deux processus expérimentaux sont suivis en parallèle, en séparant les boîtes contenant
les ovaires en 2 lots d'effectifs équivalents :
- l'alternance jour/nuit (lumière : L),
- l'obscurité (obscurité : O).
Ils permettent de comparer l'évolution des ovaires, puis après 10 semaines de cultu-
re in vitro, le nombre de plantes obtenues, selon les différents milieux et pour les diffé-
rents génotypes (Tableaux I à IV).
• Traitement des données^
Les faibles effectifs des réussites (plantes entières) amènent à utiliser le test y}
comme critère d'analyse des données, et quelquefois à regrouper ces dernières en un
cumul des divers états d'un même facteur.
Ainsi, on comparera s'il y a identité de réponse pour les différents génotypes (* g), pla-
1. Seuls sont présentés les résultats relatifs aux travaux ayant donné au moins une réponse positive.
Ainsi, bien qu'étant intervenus lors des expérimentations, ni les résultats négatifs concernant l'utilisation du
milieu n° 5, ni ceux ayant trait aux 850 ovules du cultivar « 905 » n'apparaîtront dans les tableaux.
339
ces indépendamment sur chaque milieu \i (u) : %2 {^ g/|i}, ou encore pour tous milieux
confondus (X mil.) : %2 {^ g/E mil.}, et ainsi de suite pour chaque facteur analysé.
Résultats et discussions
Efficacité des différents milieux selon le génotype
» A la lumière L (Tableau I) : Les nombres de plantes générées à la lumière se répar-

tissent entre 0 %-A et B- sur milieu 3, jusqu'à 4,44 %-A- sur milieu 4, en passant par
3 %-A- sur milieu 1.
Deux milieux présentent les valeurs les plus élevées ; il s'agit des n° 1 et 4 ; ce dernier
donne même des valeurs non significativement différentes pour les trois génotypes :
(X2 {* g/4} = 4,00 NS), et maximales (1,48 %-T-, 2,08 %-B-, et 4,44 %-A-).
Tableau I. Évolution, en conditions lumineuses (L), des ovaires de chaque génotype déposés sur
les différents milieux.
Milieu
Cultivar Nbov Nbpl % pl/ov
Bérénice 257 0,40

1 Asni 297 3,00
Z 2 =8,87* Tamelalt 313 0,64
Bérénice 268 1,12
2 Asni 285
X-= 1,50 Tamelalt 232 1,29
Bérénice 328 0,00
Asni 286 0,00
X 2 =6,44* Tamelalt 194 1,03
Bérénice 240 5 2,08
4 Asni 225 10 4,44
X 2 =4,00 Tamelalt 202 3 1,48
Codages : nb ov : nombre d'ovaires mis en culture ; nb pi : nombre de plantes obtenues ; % pl/ov : nombre de
plantes pour cent ovaires.
Présentation des %2 (L) sur les effectifs de plantes obtenues :
X2 relatif aux 3 génotypes (^ g) sur le milieu (j, %2 (^ g/u.), Significatif à :
avec a0()5 = 5,99 (d.d.l. = 2) : * = 5%
** = 1 %
X2{* g/1) = 8,87*
*** = \%o
XM* g/3) =6,44*
Les autres x1 '• N.S. = non significatif
tous génotypes confondus, avec a005 = 7,81 (d.d.l. = 3):
X2 (*mil./Ig.) = 18^99***
tous milieux confondus, avec a005 = 5,99 (d.d.l. = 2) :
X2 {*g/Zmil.) =4,81 N.S.
340
• A l'obscurité O (Tableau II) : A l'obscurité, seul le milieu 3 entraîne pour les trois
génotypes des résultats non signifïcativement différents (%2 {^ g/2} = 0,95 NS) et
médiocres (0 %-A-, 0,51 %-T-, 0,71 %-B-).
Les autres milieux amènent des résultats hétérogènes (%2 {;* g/1} = 12,16**, %2 {^ g/2}
= 9,30**, x2 {* g/4} = 11,64**), mais toujours supérieurs à 1,60 % -B/1-. Cependant,
si pour B, ces milieux donnent des résultats diversifiés (1,60 %/l, 3,07 %/2, 3,33 %/4),
ce fait disparaît pour T (3,90 %/l, 3,91 %/2, 3,96 %/4) et pour A (8,00 %/l, 8,77 %/2,
8,88 %/4). Les deux génotypes marocains semblent alors ne plus réagir de façon spéci-
fique vis-à-vis de ces trois milieux.
En fait, tout comme à la lumière, le milieu 4 donne à l'obscurité les résultats les
plus élevés pour chacun des génotypes (3,33 %-B-, 3,96 %-T-) et particulièrement pour
A, avec la valeur de 8,88 %.
Tableau IL Évolution, à l'obscurité (O), des ovaires de chaque génotype déposés sur les diffé-
rents milieux.
Milieu u
Cultivar Nbov Nbpl % pl/ov
Bérénice 250 1,60

1 Asni 300 24 8,00
X2 = 12,16** Tamelalt 205 3,90
Bérénice 260 3,07
2 Asni 285 25 8,77

X2 = 9,30** Tamelalt 230 3,91
3 Asni 286 0 0,00
X2 = 0,95 Tamelalt 194 1 0,51
4 Asni 225 20 8,88
X 2 = 11,64** Tamelalt 202 8 3,96
Codages : nb ov : nombre d'ovaires mis en culture ; nb pi : nombre de plantes obtenues ; % pl/ov : nombre de
plantes pour cent ovaires :
Présentation des X2 (O) sur les effectifs de plantes obtenues :
X2 relatif aux 3 génotypes (# g) sur le milieu u, x2 {* g/M-), Significatif à :
avec a005 = 5,99 (d.d.l. = 2) : * = 5%
y} (*g/l) = 12,16** ** = 1 %
X2 {* g/2) = 9,30** *** = l%o
f} (îtg/4) = 11,64** N.S. = non significatif
Les autres x2 :
tous génotypes confondus, avec oc °'05 = 7,81 (d.d.l.= 3) :
X2 {*mu/Ig.) =30,88***
tous milieux confondus, avec ct005 = 5,99 (d.d.l. = 2) :
X2 {*g/Zmil.} =28,85***
341
M.L. Sìbì, M. Fakìrì
Impact des conditions d'éclairement, tous milieux confondus

Le regroupement des valeurs en un cumul permet de baser les interprétations sur des
effectifs plus importants, et donc de tirer des conclusions plus fiables quant à la diffé-
rence de comportement des ovaires mis en culture, selon les conditions d'éclairement.
Ainsi, tous milieux confondus, les taux de plantes obtenues pour 100 ovaires culti-
vés à la lumière (L Tableau III) sont de 0,95 %-T-, 1 %-B-, et 1,92 %-A-, tandis qu'à
l'obscurité (O Tableau IV), les performances de 3,12 %-T-, 2,03 %-B-, et de 6,69 %-
A-, sont plus élevées que les précédentes.
La comparaison de l'impact des deux processus L/O, pour les différents génotypes,
montre un %2 très hautement significatif pour les deux génotypes marocains A et T (%2
A {* L,O/X mil.} = 29,55***, X2T {* L,O/X mil.} = 10,60***), mais pas pour B (%2 B
{^ L.O/Z mil.} = 3,65N.S.) qui paraît moins sensible à cet effet.
Tableau III. Nombre de plantes à 10 semaines, tous milieux confondus, en conditions lumi-
neuses (L).
Nb total Nb d'ov produisant un nb de pi = Nb pi
Cultivars % pl/ov
d'ov 1 2 3 6 8 total
Bérénice 1093 1,00
Asm 1093 21 1,92
Tamelalt 941 0,95
Tableau IV. Nombre de plantes à 10 semaines, tous milieux confondus, à l'obscurité (O).
Nb total Nb d'ov produisant un nb de pi = Nbpl

Cultivars % pl/ov
d'ov 1 2 3 6 8 total
Bérénice 1030 4 4 3 0 0 21 2,03
Asni 1030 27 5 6 1 1 69 6,69
Tamelalt 831 11 3 3 0 0 26 3,12
Codages pour les tableaux III et IV : nb total ov : nombre d'ovaires mis en culture tous milieux confondus ; nb
d'ov ... de pi : nombre d'ovaires ayant généré un score défini ; nb pi total : nombre de plantes totales obtenues ; %
pl/ov : nombre de plantes pour cent ovaires mis en culture.
Présentation des x1 issus des Tableaux III (L) et IV (O)
X2 issu des 2 conditions L/O, tous milieux confondus, %z [* L,O/E mil.), Significatif à :
avec a005 = 3,84 (d.d.l. = 1) : * = 5%
** = 1 %
Bérénice : x2 {* L.Offi mil.) = 3,65 N.S.
*** = \%o
Asni : x2 {* L,O/Z mil.) = 29,55***
Tamelalt : x2 {* L.O/Z mil.) = 10,60*** N.S. = non significatif
342
Conclusion
Le point essentiel que l'on peut retirer de cet ensemble, c'est l'impact marquant de
l'obscurité sur la régénération de plantes à partir des ovaires des génotypes considérés.
Cela est déjà apparent au niveau des données individuelles :
- à la lumière, les trois génotypes ont un comportement diversifié selon les milieux
utilisés ; cependant, tous les génotypes donnent leur performance maximale sur milieu
4 (1,48 %-T-, 2,08 %-B-, et 4,44 %-A-) ;
- à l'obscurité, l'ensemble des valeurs est augmenté sur les milieux 1, 2, 4 ; pour
Bérénice les valeurs sont hétérogènes (1,60 %/l, 3,07 %/2, 3,33 %/4), alors que pour
Tamelalt (3,90 %/l, 3,91 %/2, 3,96 %/4), comme pour Asni (8,00 %/l, 8,77 %/2,
8,88 %/4), peu de différences sont enregistrées sur ces trois milieux.
Cependant, aussi bien à la lumière qu'à l'obscurité, le milieu 4 tend à donner des
chiffres supérieurs aux autres pour chacun des génotypes. Ainsi, le milieu de Hun-
ter [4] sans thiamine ni ANA, mais additionné de 2 mg/1 de 2-4 D, est favorable à la
régénération de plantes haploïdes pour les trois cultivars présentés, tandis que le milieu
3 donne des performances faibles (-T-, -B-) ou nulles (-B-, -A-), comme si l'agent géli-
fiant (gelrite) constituait, dans nos conditions, un facteur limitant.
En fait, les valeurs obtenues tous milieux confondus, confirment l'impact positif de
l'obscurité, malgré le cumul avec les données moins favorables du milieu 3.
Ainsi, pour les génotypes utilisés, la réponse la plus efficace quant à la culture
in vitro d'ovaires non fécondés pour l'obtention de plantes haploïdes est obtenue en
suivant la procédure qui suit.
Après avoir cultivé les plantes-mères en conditions optimales, les épis sont prélevés
dès que les barbes pointent hors de la gaine (stade uninucléé tardif ou binucléé des
grains de pollen) ; ils sont conservés au frigo à 4° C pendant 14 jours ; les barbes sont
alors éliminées et, après stérilisation, les ovaires sont prélevés en asepsie, et déposés
sur le milieu 4 ; les boîtes sont entreposées à l'obscurité, avec une alternance de tempé-
rature 22 °C/18 °C pendant des périodes de 16/8 heures, respectivement ; les premières
plantes haploïdes apparaissent à partir de la T semaine, et jusqu'à 10 semaines après la
mise en culture, et toutes verdissent dès leur exposition à la lumière.
Ces expérimentations ont permis de définir des conditions efficaces de gynogenèse
chez l'orge. Elles ont également eu comme résultat l'identification d'un cultivar maro-
cain, que l'on sait adapté à la sécheresse et à la salinité, particulièrement réactif vis-à-
vis de la gynogenèse ( A » T > B). Bien que chez l'orge d'autres voies de production
de plantes haploïdes (culture de microspores isolées [7], hybridations interspécifiques)
donnent des rendements plus élevés, la gynogenèse, par la particularité de ses
résultats [5, 9, 12, 13], garde ici tout son intérêt.
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l'amélioration des plantes ? Paris : AUPELF-UREF, John Libbey Eurotext : 345-353.
344
37
Vitrovariation chez des orges

(Hordeum vulgäre)
issues d'haplodiploïdisation.
Analyse des ß amylases
chez les croisements diallèles
M.L. SIBI, M. FAKIRI
Amélioration génétique et Biotechnologies, ENSAIA, 2, avenue de la Forêt-de-Haye,

54505 Vandœuvre, France.
Résumé
L'analyse des descendants d'haploïdes doublés issus de l'orge de printemps Bérénice a

été effectuée par comparaison d'électrophorégrammes des ß amylases contenues dans
le grain. On vérifie ainsi, au niveau moléculaire (nombre, disposition et intensité des
bandes), le comportement variant qui avait déjà été mis en évidence sur des plans bio-
métriques et biochimiques.
Les électrophorégrammes des ß amylases provenant des grains d'autofécondation
montrent certaines évolutions que l'on ne peut relier directement ni avec l'âge des
grains, ni avec le nombre de méioses, ni avec l'origine biologique du matériel. Des
comparaisons cohérentes impliquent donc d'utiliser un matériel clairement défini :
même nombre de méioses à partir d'une référence commune, même degré de vieillisse-
ment, mêmes conditions d'analyses expérimentales.
L'analyse des grains, produits du croisement diallèle de l'ensemble des individus
précédents, montre que l'hérédité, explorée au moyen des spectres électrophorétiques,
345
ne répond pas à des lois simples. Entre autres, les dissymétries chez les croisements
réciproques amènent à confirmer le rôle d'effets épigéniques sur Vexpression du géno-
me de ces descendants vitrovariants issus d'haplodiploïdes.
Ce travail s'intègre dans le cadre plus général de l'analyse de la vitrovariation [7-15]

et, plus particulièrement ici, de celle issue d'haplodiploïdisation.
Ainsi qu'il a été présenté dans des étapes précédentes [2, 15], l'orge de printemps
Bérénice a servi de matériel expérimental dans la succession des analyses soit biomé-
triques, soit biochimiques.
Des grains de la première génération <£>1 d'autofécondation d'haploïdes doublés d'or-
ge vitrovariants Al, A2, A3, issus d'androgenèse, et GÌ, G2, issus de gynogenèse, ainsi
que le témoin T, fixé (Bérénice), nous ont été fournis en 1984 par San-Noeum [5, 6].
Les analyses biométriques effectuées lors des autofécondations successives de ce
matériel, et, entre autres, la 4e O 4, ont montré [15] un maintien des modifications por-
tant sur la cinétique d'apparition des talles, les longueurs de feuilles, etc. Cette variabi-
lité apparaît ici plus marquée chez les descendances issues d'androgenèse comparées à
celles de gynogenèse.
Les observations biochimiques [15] ont alors porté sur des paramètres comme les
taux de protéines, ou les activités des a et des ß amylases.
Soulignons que l'analyse du grain ou de l'embryon qu'il contient porte en fait sur
la génération engendrée par la plante, donc la suivante.
Ces données amènent à constater, contrairement aux observations précédentes faites
lors des analyses biométriques, une variabilité souvent plus marquée chez les gynogé-
nétiques que chez les androgénétiques, avec pour les premiers un réel éclatement des
potentialités comportementales [15].
Un premier croisement diallèle entre vitrovariants et avec le témoin, tous de généra-
tion O 4, avait été réalisé. Les données issues des produits de croisements ont été ana-
lysées selon le modèle de Griffing. Ainsi on a pu constater [15] des dissymétries de
comportement chez les croisements réciproques, des hérédités soit de type paternel, soit
de type maternel, et par ailleurs, selon le critère considéré, des effets dits de transgres-
sions, associés quelquefois aux dissymétries d'expression présentées antérieurement.
Notons que l'autofécondation d'une partie des produits de croisement a montré un
maintien des transgressions pour les paramètres biométriques.
Une approche biochimique avait alors été envisagée, et les activités des a et des
ß amylases, ainsi que l'observation des électrophorégrammes des ß amylases, avaient
déjà été abordées [4]. Cependant, les analyses n'avaient pu être poursuivies au niveau
des grains des croisements réciproques, par manque de matériel.
Rappelons que, contrairement aux a amylases, les ß amylases s'expriment directe-
ment au niveau du grain mûr, sans qu'il soit besoin de traitement complémentaire parti-
culier.
C'est donc ce type d'analyse qui sera ici proposé sur des grains issus, d'une part
des autofécondations successives, d'autre part des produits de croisement diallèle. On
pourra ainsi tester l'effet « génération » (ou nombre de méioses), le vieillissement du
grain, et le comportement des grains issus des croisements réciproques.
346
Vitrovariation chez des orges issues d'haplodiploïdisation
Électrophorégrammes des ß amylases
Cette analyse s'effectue donc sur le grain mûr. La technique utilisée est celle mise au
point en 1983 chez le blé par Joudrier [3], après l'adaptation dans le cadre de notre
laboratoire au cas de l'orge [1, 2, 4].
• Gel : la migration se fait en gel de polyacrylamide (acrylamide 7,5 % additionné
de bis-acrylamide 0,2 % dans de l'eau distillée). Pour 2 gels (50 ml chacun), 110 ml
sont nécessaires auxquels auront été ajoutés 0,352 ml de diméthylaminopropionitrile
puis, juste avant de couler l'ensemble entre les deux plaques en verre de chacun des
systèmes, 0,11 g de persulfate d'ammonium qui précipite la polymérisation. Le peigne
adapté à l'ensemble ménage des puits dans lesquels seront placés les dépôts. La poly-
mérisation a lieu en 1 à 2 heures à température ambiante.
• Tampon : pour la migration, de même que pour le bain de révélation, on utilise
un tampon lactate d'aluminium dont le pH est ajusté à 3,2 au moyen d'acide lactique
(0,7 M).
• Extraction et migration : après fixation des plaques dans la cuve (BIO-RAD pro-
tean II xi), et inversion des électrodes au niveau des extrémités, la saturation ionique
s'effectue dans la pièce froide à 4 °C, pendant toute une nuit à raison de 8V/cm.
L'extraction des protéines enzymatiques se fait indépendamment pour chaque grain
(environ 40 mg), par broyage manuel dans un mortier contenant 0,650 ml d'un mélan-
ge de mercaptoéthanol (0,5 M) et de chlorure de sodium (0,2 M). L'ensemble est
ensuite transféré dans un tube à centrifugation, et la macération a lieu pendant 2 heures
à température ambiante. Une centrifugation, même à faible vitesse, permet de faire
décanter les parties solides. Une addition de bleu de bromophénol permet ultérieure-
ment de suivre le dépôt sur le gel.
Après que 3 \û de chaque extrait ont été placés dans chacun des puits, la migration
a lieu, toujours à 4 °C, avec les électrodes inversées, d'abord pendant 1 heure sous une
tension de 16V/cm, puis pendant 2 heures à raison de 25 V/cm.
• Révélation : la révélation est effectuée en préparant d'une part une solution
d'amidon soluble (1 g) dans 500 ml de tampon lactate d'aluminium - l'ensemble est
agité et chauffé jusqu'à devenir limpide ; d'autre part, une solution fraîche d'iode
constituée de 0,62 g d'iode pure en paillettes et de 0,6 g d'iodure de potassium dilués,
par chauffage et agitation, dans 100 ml d'eau distillée.
Le gel est alors isolé, placé dans un bac contenant la solution d'amidon et transféré
dans une étuve à 37 °C pendant 25 mn pour être imprégné. Il est ensuite rincé 3 fois à
l'eau du robinet.
On verse alors la solution d'iode, qui teinte en bleu l'ensemble, et laisse non colo-
rés les emplacements où l'amidon a été hydrolyse par la ß amylase. On peut ainsi
observer les fronts de migration de l'enzyme.
Matériel végétal analysé

• Dénomination : un sigle unique désignera les produits d'autofécondation ou les
parents, par exemple : Al. Chaque individu issu de croisement est désigné par les
sigles de ses parents, maternel d'abord, puis paternel. Ainsi, A1G2 provient de la
réception par le parent Al (castré) du pollen de G2.
347
• Grains issus d'autofécondation : les grains d'autofécondation récoltés au cours

des années 1988 sur des plantes O 4 (produits 4> 5), puis 1989 (produits O 6), et 1992
(produits O 7) ont été analysés en parallèle pendant l'été 1993.
Par ailleurs, une partie des grains récoltés en 1989 (produits O 6) avait déjà été tes-
tée en 1991 [4].
• Grains issus du croisement diallèle : les grains <£> 6 (prélevés sur les individus
de génération O 5) des séries du Al, A2, A3, GÌ, G2, et le témoin T constituent les
parents d'entrée du tableau diallèle.
Le renouvellement de cet ensemble de croisements en 1992, permet de disposer
d'une quantité suffisante de grains pour les analyses électrophorétiques.
Notons qu'il n'a pas été possible, ici, d'obtenir des grains du croisement A3A1.
Organisation expérimentale de l'analyse

Pour chaque catégorie, 5 grains d'orge (produits <E> 7, issus du croisement entre les
parents O 6) ont été utilisés. Chaque grain a constitué un extrait unique amenant à la
réalisation de 4 dépôts placés dans les puits, choisis de façon aléatoire, sur chacun des
2 couples de plaques de chaque expérimentation. Les conclusions proviennent donc de
5 x 4 observations. Notons qu'aucune variation de comportement n'est enregistrée pour
ces différentes analyses portant sur la même famille.
Grains issus d'autofécondation (Figure 1)

Les grains analysés en 1993 ont soit un an (récolte 1992, produit O 7), soit deux ans
ou quatre ans (récolte 1989, respectivement/a et/b, produit í> 6), soit cinq ans (récolte
1988, produit 4> 5).
Tous les électrophorégrammes présentent une bande principale (pr), d'intensité plus
ou moins marquée, sauf semble-t-il pour les grains de A2 âgés d'un an (récolte 92) et
analysés en 1993, ce dernier cas de figure paraît pour le moins surprenant.
De une à trois bandes complémentaires (cp) apparaissent par ailleurs selon les cas.
Les analyses des grains de 1988 (de quatre ans) présentent une diversité de bandes
plus importante que les grains de 1992 (un an). Le vieillissement des grains entraîne-
rait-il une augmentation du nombre de bandes ?
En fait, les analyses (89a) pratiquées en 1991 sur des grains de deux ans (récolte
1989) ont amené, chez le témoin et les gynogénétiques, à l'observation d'un nombre
élevé de bandes cp, tandis que le même matériel analysé en 1993 (89b), et qui a donc
quatre ans, voit une partie de ces bandes disparaître. Ainsi le témoin T subit une dispa-
rition de certaines bandes, de même que Gl et G2, tandis que pour A2 une bande com-
plémentaire apparaît, et que Al et A3 restent identiques à eux-mêmes.
L'effet du vieillissement n'est donc pas clair et l'on peut se demander si le nombre
d'autofécondations peut être impliqué dans la modification des électrophorégrammes.
Si le nombre d'autofécondations était cause d'une évolution régulière des bandes,
les produits successifs O 5, O 6, O 7 devraient présenter des spectres progressifs, avec
augmentation, ou diminution cohérente. Ainsi, dans cette dernière éventualité, la récolte
1989 (produit <I> 6) devrait amener à un nombre plus restreint de bandes que celle de
348
•1988 (produit <ï> 5), ce qui n'est pas le cas, alors que pour les grains récoltés en 1992
(produit <E> 7) on constate cette diminution.
Il ressort de l'ambiguïté de ces évolutions que toute analyse comparative se doit
d'utiliser des grains de même vieillissement, prélevés sur des plantes issues d'un même
nombre de méioses, et qui se sont développées dans les mêmes conditions. De plus, ces
analyses doivent être effectuées à la même époque.
Grains provenant du croisement diallèle (Figure 2)

Le diallèle est effectué à partir d'individus <E> 6, les grains analysés ici sont donc les
produits directs issus du croisement. Nous considérerons les autofécondations <ï> 7
comme les équivalents comportementaux des parents ayant engendré les croisements.
Ces autofécondations sont disposées selon la diagonale du tableau.
Lors de ces analyses de 1993, le témoin T (Bérénice) ne présente qu'une intense
bande pr ; chez A3 l'intensité de cette bande est déjà plus faible, de même que chez
Gl et G2. Quant à Al, il présente, en plus de cette bande, une cp d'intensité moyenne,
et A2 voit pr devenir evanescente au profit d'une cp très marquée.
Le point essentiel est maintenant de comparer les croisements réciproques pour les-
quels, rappelons-le, les génomes sont identiques puisque issus du même couple de
parents. Dans le tableau diallèle, ils sont placés de façon symétrique par rapport à la
diagonale des autofécondations.
Si l'on se réfère tant à l'intensité des bandes qu'à leur diversité, seuls les couples
réciproques G1A2-A2G1, G2T-TG2, G2A2-A2G2, et G2A3-A3G2 paraissent ne pré-
senter ici aucune différence.
Remarquons que, outre les fréquentes dissymétries d'expression observables selon
le sens de croisement, des bandes cp apparaissent quelquefois à partir de parents qui ne
présentent que pr. Ainsi en est-il de TG1 (+1 cp intense) et de GIT (+ 2 cp dont une
intense, et l'autre faible) ou encore de G2T et TG2 qui présentent de façon identique
2 cp (l'une intense, l'autre faible) qui n'existent pas chez les géniteurs.
De même, A2 qui, seul, présente une très faible bande pr, peut en croisement
engendrer des individus tel A2T, qui mis à part la bande pr de T et la cp de A2, expri-
me une autre cp de faible intensité, et TA2 qui diffère de son réciproque, et présente
pr et une cp très evanescente. Ce cas se reproduit encore pour G1G2, avec 2 cp très
faibles.
Ajoutons que A3 et Gl, qui ne présentent qu'une pr, aboutissent à la création de
A3G1 pour lequel la pr disparaît presque au profit d'une cp intense, cette expression
diffère d'ailleurs de celle du réciproque G1A3 qui n'a qu'une pr intense.
Chez les grains issus de croissement, ces expressions qui se distinguent de celles de
chacun des deux parents ne pourraient-elles se classer parmi les effets de transgression,
de façon semblable aux cas déjà observés lors des analyses biométriques (10, 11, 12, 15).
349
1988 1989 a 1989 b 1992
O6 <D6 O7
sene 5 ans 2 ans 4 ans 1 an
A1
A2
A3
G1 i ••---•--•• i
G2
bande principale
bande complémentaire
intensité décroissante des bandes
Figure 1. Électrophorégrammes des ß amylases du grain pour les autofécondations des vitro-
variants et du témoin. Comparaison des grains issus des récoltes : 1988 (produits «55, grains de
5 ans), 1989 (produits d> 6), 1989/a : analysé en 1991 (grains de 2 ans), 1989/b : analysé en 1993
(grains de 4 ans), 1992 (produits © 7, grains de 1 an). Dans la majorité des cas, il apparaît une
bande principale pr, il peut aussi y avoir des bandes complémentaires cp.
A1 A2 A3 G1 G2
A1
A2
A3
G1
G2
IZZI pr bande principale
cp bande complémentaire
intensité décroissante des bandes
Figure 2. Électrophorégrammes des ß amylases du grain pour les croisements diallèles et les
autofécondations. Le nom des parents est inscrit en entrée du tableau. La diagonale contient les
observations effectuées sur les autofécondations. Les croisements réciproques se trouvent dans
les couples de cases symétriques par rapport à la diagonale. De nombreuses dissymétries de com-
portement peuvent être observées comme par exemple pour le couple issu du croisement réci-
proque de Gl avec A3, ou avec G2, ou avec T, ou bien avec G2 avec Al, ou encore de A2 avec
T, etc.
351
Conclusions
Sans aller plus avant dans le descriptif des résultats de ce tableau, il ressort principale-
ment de cet ensemble que les familles issues des vitrovariants diffèrent du témoin de
façon plus ou moins marquante, avec l'apparition quelquefois d'une bande complémen-
taire, ou la disparition presque totale de la bande principale, ou encore une intensité
plus ou moins marquée de cette bande.
Par ailleurs, malgré la constitution identique du noyau des produits réciproques, des
réponses distinctes peuvent être très fréquemment observées entre ces croisements.
Des bandes complémentaires peuvent apparaître à partir de parents qui n'en possè-
dent pas (croisement de T avec Gl), ou encore disparaître à partir de parents qui en
possédaient (croisement de Al avec A2).
De même, la bande principale peut pratiquement s'effacer comme pour A3G1, sans
que cela concerne le réciproque G1A3.
Ajoutons que les grains de chaque catégorie donnent des résultats équivalents lors
des diverses répétitions, ce qui n'est guère étonnant puisque les autofécondations n'ont
jamais donné de ségrégation, et que les croisements sont les produits directs de ces
parents.
Ainsi, une succession d'analyses [15] avait déjà conduit à l'hypothèse de l'expres-
sion, après culture in vitro, de modifications héréditaires impliquant l'intervention de
systèmes dits épigéniques [11].
Ici, les dissymétries de comportement, exprimées au travers des électrophoré-
grammes des ß amylases, montrent qu'un même génome peut avoir des expressions
diversifiées par l'intermédiaire de systèmes que l'on ne peut exclusivement associer au
cytoplasme maternel, ou paternel. Cela s'accorde avec l'hypothèse de la modification de
systèmes épigéniques lors de la culture in vitro. Ceux-ci agiraient sur le comportement
de ces vitrovariants issus d'haplodiploïdisation. La confirmation de cette hypothèse sera
apportée par l'analyse des descendances d'autofécondation des produits de croisement.
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353
38
L'haplodiploïdisation :
un outil multi-usage pour la génétique
et l'amélioration des céréales
EMMANUEL PICARD, ELISABETH CRAMBES,

AATIKA MIHAMOU-ZIYYAT
Université Paris-Sud, Centre Universitaire, Bât. 332, Service de Biologie Végétale,

91405 Orsay Cedex, France.
Résumé
Les méthodes de production d'haploïdes doublés et plus particulièrement celles faisant

appel à l'haplodiploïdisation in vitro, biotechnologie dont on fête le trentième anniver-
saire cette année, ont déjà eu un impact sur la génétique et l'amélioration des plantes.
Cet impact a toutes les chances de s'amplifier dans les années à venir. En effet, cette
biotechnologie offre non seulement la possibilité d'obtenir plus rapidement des lignées
totalement homozygotes - la sélection de ces lignées en est simplifiée par la suite en
raison de l'absence de biais dû à l'hétérozygotie, et la réponse à la sélection est
accrue - mais elle permet également de simplifier certaines analyses en génétique
quantitative et se révèle être un outil remarquable en marquage moléculaire. C'est dire
son importance stratégique, tant dans le domaine de l'application que dans celui de la
recherche plus fondamentale. Nous nous intéresserons, dans cet article, à trois aspects.
Tout d'abord, nous essaierons de dresser un bilan succint des progrès de cette techno-
logie sous l'angle de son insertion dans les programmes de sélection et par consé-
quent, au niveau de la création varietale, en rappelant les principales raisons pour les-
quelles les haploïdes doublés sont un matériel de choix. Dans une seconde partie, nous
donnerons un aperçu des progrès récents obtenus dans le domaine des méthodes de
culture in vitro et notamment des cultures de microspores isolées. Ces dernières per-
355
E. Picard, E. Crambes, A. Mihamou-Ziyyat
mettent en effet d'envisager de mettre au point des systèmes haploïdes monocellulaires

élégants, ouvrant la voie non seulement à des productions en masse d'haploïdes dou-
blés, mais aussi à des expériences de sélection in vitro ou de manipulations génétiques
avec des chances de réussite accrues par rapport aux autres méthodes existantes.
Enfin, nous ferons une revue des principaux thèmes de recherche chez lesquels l'ha-
ploïdie joue un rôle significatif ou bien tout simplement des questions posées à la
recherche par ce système de reproduction particulier.
Impact de l'haplodiploïdisation sur la sélection
Rappel des avantages et des limites de cette méthode de sélection

Quand on double le nombre chromosomique des plantes haploïdes, cela pouvant se
faire d'ailleurs spontanément ou bien artificiellement, on duplique du même coup toute
l'information génétique de chacun de leurs chromosomes et l'on obtient ainsi, en une
étape, l'équivalent de plus de dix années d'autofécondation, c'est-à-dire des lignées
complètement homozygotes (lignées pures). L'haplodiploïdisation permet donc au
sélectionneur d'obtenir plus rapidement ces lignées pures dont il a besoin dans ses pro-
grammes, de juger leur valeur agronomique avec une meilleure précision, et, en fin de
compte, d'obtenir plus aisément soit de nouvelles variétés « lignées pures » s'il tra-
vaille sur une plante autogame, soit de nouveaux parents d'hybrides s'il sélectionne
une plante allogarne, soit encore de nouveaux clones. Il n'y a pas d'effet de biais dû à
l'hétérosis, comme c'est le cas en F2 ou en F3. Les gènes, qu'ils soient récessifs ou
dominants, s'expriment tous ; aucun n'est masqué.
Dans une population d'haploïdes doublés issus d'un croisement, la variance additive
est deux fois plus importante que celle de la population de plantes F2 issues de l'autofé-
condation du même croisement, permettant aussi une maximisation de la part de l'addi-
tivité et de l'épistasie eis, une expression de tous les gènes (alíeles) et en particulier des
gènes récessifs masqués, ce qui permet une valorisation et une optimisation de ces effets
additifs ou d'épistasie [10, 11, 28, 30]. L'haplodiploïdisation est une méthode que l'on
peut appliquer à n'importe quelle génération au cours d'un programme de sélection
classique. Cependant, son niveau d'application dépendra toujours de l'héritabilité des
caractères que l'on cherche à améliorer, et de la structure du croisement de départ.
Le passage par l'état haploïde permet également une simplification de l'analyse
génétique : par exemple, dans le cas d'une mutation, la lecture directe de la mutation
est possible à l'état haploïde. Il permet aussi une étude plus facile de l'effet de dosage
des gènes, de la disjonction des caractères et de la localisation des gènes chez les
lignées monosomiques. De plus, il facilite, aussi bien chez les espèces autogames que
chez les espèces allogames, l'analyse de la « valeur en lignées » des croisements, c'est-
à-dire de la moyenne des lignées dérivables d'un croisement, et c'est aussi un outil de
base très intéressant pour la sélection récurrente.
Dans le cas des plantes allogames, comme le maïs et le tournesol, outre le fait que
l'haplodiploïdisation accélère la phase de fixation du matériel génétique et donc l'ob-
tention des lignées inbred (dans ce cas complètement homozygotes) dont il faudra tes-
ter les aptitudes à la combinaison, elle offre aussi l'énorme avantage de ne plus avoir à
faire de tri intradescendance comme dans la sélection généalogique classique, du fait
même de leur homozygotie. Toute la variabilité génétique additive, composante princi-
pale de l'aptitude générale à la combinaison, se trouve ainsi éclatée entre familles. Par
356
L'haplodiploïdisation
ailleurs, on a pu montrer que l'obtention de quelques dizaines d'HDs à partir de popu-

lations-sources permettrait de juger la valeur en combinaison de ces populations en tes-
tant ces HDs en croisement avec un testeur. Chez le tournesol, on peut ajouter que
l'haplodiploïdisation par androgenèse in ovulo permettrait la conversion rapide sur
cytoplasmes mâles stériles des lignées. Par ailleurs, l'haplodiploïdisation permettrait un
accès plus facile à la variabilité du genre Helianthus, car elle accélérerait l'introgres-
sion de résistances aux maladies, du fait de la simplification des effets génétiques.
Limites de l'haplodiploïdisation
Chez certaines espèces, le taux de plantes haploïdes doublées obtenues est souvent trop
faible pour que ces plantes puissent être utilisées dans un programme de sélection clas-
sique. Il y a en effet dans ce cas un risque élevé de perte d'alíeles. L'haplodiploïdisa-
tion fixe immédiatement les produits d'une méiose et n'autorise donc plus d'autres
recombinaisons. En revanche, la sélection généalogique et la bulk peuvent, chacune à
leur façon, utiliser le reliquat de zones hétérozygotes qui subsiste au cours des généra-
tions précoces (F3, F4) sur les bras chromosomiques et dans lesquelles des crossing-
over efficaces peuvent avoir lieu.
Bilan de la création varietale par haplodiploïdisation

Chez des familles aussi importantes que les crucifères, les céréales, les liliacées et les
solanacées, l'haplodiploïdisation est couramment utilisée et de plus en plus largement
dans les programmes de sélection publics ou privés. Il existe deux points de vue chez
les sélectionneurs quant au meilleur stade d'insertion de l'haploïdie dans leurs schémas
de sélection. Il y a ceux qui préfèrent haploïdiser tout de suite, dès la FI, puis rejeter par
la suite dans les populations d'HDs obtenues plus de génotypes. La sélection dans ce
cas suit strictement la fixation. Cette méthode est très certainement la plus efficace pour
tous les caractères fortement soumis au milieu où la sélection en F2 n'est pas efficace
(cas de faible héritabilité, caractères polygéniques). Cette méthode a abouti, notamment,
à la création de la première variété HD inscrite au catalogue des variétés en France par
les établissements Desprez, la variété « Florin » [5] et toujours second blé cultivé en
Belgique. Puis il y a ceux qui préfèrent haploïdiser après une ou deux années de sélec-
tion généalogique au champ en F2, voire en F3. Cette méthode hybride est très certaine-
ment efficace pour les caractères héritables, elle permet ainsi au sélectionneur d'écarter
rapidement des génotypes indésirables. Dans tous les cas, les produits sont des lignées
homozygotes, donc plus aisément jugeables [22-24]. Pour l'orge, par exemple, il y a
une différence impressionnante entre la complexité des parcelles de lignées F3 ou F4 où
il est toujours difficile de faire un choix à cause de la structure des plantes, et une série
de lignées HD provenant du même croisement. Les lignées HD sont plus facilement
typables. De nombreuses études ont par ailleurs démontré que l'haplodiploïdisation
in vitro, même si elle provoque, comme nous l'évoquons par ailleurs, des vitrovariations
ou des phénomènes de sélection in vitro, conduisant à des distorsions par rapport aux
disjonctions observées en autofécodation (F2, F3, etc.), a abouti largement à des pro-
duits utilisables en sélection. Cette nouvelle méthode semble bien avoir les mêmes
chances de produire de bonnes lignées que les méthodes plus traditionnelles. De plus,
de nombreuses études ont montré que, même avec de faibles effectifs, l'HDion a un
potentiel identique aux autres méthodes. Le Tableau I rassemble, pour quelques
céréales, les principaux exemples de variétés HDs connues à travers le monde.
357
Tableau I. Bilan des variétés de céréales obtenues par haplodiploïdisation.
Céréales
Orge Nombreuses variétés : en Europe (Danemark, Allemagne, France),
au Canada, aux États-Unis, en Nouvelle Zelande.
Ex: Rodeo, Mingo, Craig, TBR 579.5, TBC 555.1, Gwilan. Michka
Blé tendre Nombreuses variétés en Chine (Jinghua. 1. Huapei),
quelques résultats en Europe. En France Florin tjrs cultivé en Belgique ;
deux variétés. GKI : Delibab, Ambitus : « BR 43 »
Riz Nombreuses variétés en Chine, au Japon, en Inde, en Afrique (IRRAT)
Triticale Premières lignées en France (INRA)
On peut estimer peut-être à 250 000 environ le nombre d'haploïdes doublés créés
annuellement dans l'ensemble des laboratoires privés et publics chez les seules espèces
colza, blé tendre et orge. Le tableau ne reflète cependant pas toute la vérité, car une
partie des sélectionneurs qui utilisent couramment cette méthode, et parfois sur une
large échelle, ne mentionnent pas chaque fois à partir de quelles méthodes ont été obte-
nues leurs variétés ; et cela volontairement, comme certains l'ont dit à l'auteur de ces
lignes. La raison qu'ils invoquent est qu'ils ne veulent pas effrayer leur clientèle (les
débats publics sur la transgénèse ont des retentissements partout) ou bien que la réputa-
tion qu'ont les cultures in vitro de provoquer des vitrovariattions pourrait nuire à l'ima-
ge commerciale de leurs produits.
L'application de ce mode rapide de reproduction en consanguinité pour la sélection
de lignées pures ou de lignées parentales pour la création d'hybrides a connu un réel
succès. Si l'on prend l'exemple du colza dans nos régions (cas de la variété
« Goéland » par exemple) ou du canola canadien, plusieurs variétés haploïdes doublées
existent sur le marché et sont utilisées par les agriculteurs. Récemment, la création de
cultivars modernes, hybrides de choux de Milan, de Bruxelles ou de broccolis, a com-
mencé à s'appuyer sur Fhaploïdie et notamment la culture de microspores isolées [26],
méthode qui apparaît comme une alternative extrêmement valable pour la sélection
rapide des lignées parentales. Toujours en ce qui concerne les plantes légumières, le
rôle joué par l'haploïdie apparaît de plus en plus grandissant [25]. On peut donc dire
que l'haploïdie a véritablement déjà joué son rôle biotechnologique, au sens où ces
plantes ont servi l'industrie des semences et, plus généralement, ont apporté un progrès
génétique. Mais, il nous semble qu'il convient de rester modeste, car le nombre de
variétés issues de l'haplodiploïdisation est, somme toute, relativement faible encore, ne
représentant qu'un tout petit pourcentage de la totalité des variétés mises sur le marché.
Progrès récents obtenus dans le domaine de l'haplodiploïdisation :

les cultures de microspores isolées
L'haplodiploïdisation a connu sur le plan méthodologique une évolution assez rapide

au cours des 7 dernières années [54]. Récemment, après des progrès sans précédent
dans le domaine des cultures en milieux liquides ou semi-liquides, ce sont surtout les
méthodes de cultures de microspores isolées, initialement mises au point chez le
358
tabac [34, 50] et le colza [12], qui ont fait l'objet des recherches les plus actives. Ces
méthodes conduisent à l'établissement de cultures de microspores obtenues après
diverses techniques de broyage des anthères, suivi de filtrations et de centrifugations.
Les principaux avantages des microspores isolées peuvent être résumés comme suit. Ce
sont des systèmes de cultures monocellulaires, haploïdes et à faible polymorphisme.
Les microspores ne sont plus soumises aux contraintes des parois des anthères et, de ce
fait, sont soustraites à une partie des effets dus à la plante mère. En général, cette
méthode donne de meilleurs résultats que la culture d'anthères. Sur le plan pratique, la
culture de microspores isolées réduit donc les coûts de production des HDs par un allé-
gement substantiel de la phase de mise en culture. Aujourd'hui, cette méthode est lar-
gement appliquée chez le colza et l'orge par les sélectionneurs privés.
D'autre part, en ce qui concerne la recherche, les techniques de microspores isolées
permettent de placer celles-ci dans des conditions de nutrition par rapport au milieu
beaucoup plus uniformes que dans l'anthère où il était fréquent d'observer des effets
« position ». En conséquence, le modèle « microspores isolées » est celui qui rendra
possible des expériences de sélection in vitro sans ambiguità pour des caractères expri-
més précocement in vitro au stade gamétophytique. Un autre avantage, en recherche,
est que les microspores isolées ouvrent la voie à des études cellulaires, cytologiques et
moléculaires des processus de réorientation des microspores et d'induction androgéné-
tique. Enfin, le modèle « microspores isolées », très analogue aux modèles « cellules
isolées » ou « protoplastes », devrait faciliter les expériences de transformation géné-
tique des plantes au niveau haploïde, par la voie balistique, par électroporation ou par
incorporation, tout en évitant une phase trop longue de conversion des embryons en
plantes entières, génératrice de vitrovariations.
Un nombre important de paramètres entrent en jeu pour la réussite de la culture de
microspores isolées, comme par exemple les conditions de croissance des plantes
mères, le stade de développement des microspores au moment de leur extraction, ou les
conditions de culture (densité des microspores, milieu, hormones). Le stade des micro-
spores est souvent le même que celui observé pour les cultures d'anthères comme, par
exemple, chez les céréales [16, 38, ou 39]. On a démontré aussi qu'il existait une sensi-
bilité des microspores au cours des 24 premières heures de culture, vis-à-vis d'éléments
toxiques sécrétés par elles-mêmes dans le milieu de culture.
Pour certaines espèces, comme le tabac, l'orge, le blé et le riz, l'obtention des
embryons et des plantes par ces méthodes de pollen isolé ont tout d'abord requis une
préculture des anthères [50]. Chez le riz [16], la culture en shed pollen, c'est-à-dire en
pollen répandu hors des anthères dans le milieu, montre que les variétés de type
« Japónica » répondent beaucoup mieux que les variétés de type « Indica », en ce qui
concerne la production d'embryons et l'obtention de plantes vertes fertiles. Kasha et
al [38, 39], sur la variété d'orge « Igri », obtiennent des microspores isolées en faisant
macérer, pendant 3 à 4 jours, les anthères dans une solution de mannitol à 120 g.l1.
L'inconvénient de cette technique est qu'une partie des microspores restent prison-
nières dans les anthères [74]. Depuis les premières recherches, cette phase de précultu-
re a été supprimée chez le colza puis chez l'orge.
Le Tableau II [15] résume les principaux travaux publiés ayant abouti à un succès
dans le domaine des cultures de microspores isolées, en donnant des éléments sur les
stades des microspores qui ont été employés, les types de culture, les génotypes". Dans
tous les cas, les chercheurs ont essayé de développer leur modèle sur 1 ou 2 génotypes.
Cependant, il faut savoir que cette méthode est appliquée au colza et à l'orge pour la
création l'obtention d'HDs sur de larges éventails de croisement.
359
Tableau II. Principales références sur les méthodes de culture de microspores isolées.
Stades Types cultures Espèces Génotypes Auteurs

UM-UT PC puis MI Orge Ziauddin et al. [74]
UM-UT PC puis MI Orge Igri Hoekstra et al. [35]
UM-BJ PC puis MI Orge Igri and Gimpel Mordhorst and Lörz [46]
BJ-BM MI Orge Sabarlis Wei et al. [69]
UT-BJ PC puis MI Riz Type Indica Cho and Zapata [9]

UJ-UM SP Riz Types Indica Dattaeía/. (1990) [16]
and Japónica
UT MI Maïs Seneca 60 Coumans et al. [13]

UT-BI MI Maïs DH5 x DH7 Gaillard et al. [27]
UT MI Tomate Gardener Deberg and Nitsch [19]
U IM Datura Nitsch et Norreel [49]
M MI Tabac Red Flower, Nitsch [50]

Coulo, Sylvestris
M MI Tabac Atropurpúrea Wernicke and Kohlenbach [71]
M-BJ PC puis MI Tabac White burley Sunderland and Roberts [80]
BJ PC puis MI Tabac Badischer Burley Heberle-Bors and Reinert [34]
BM PC puis MI Tabac Samsun Kyo and Harada [41]
UT-PM MI Colza TntonandG231 Kott et al. [40]

UT-BJ MI Colza Topaz Pechan and Keller [53]
BM-T MI Chou blanc Cao et al. [6]
UM : uninucléé médian BJ : bicellulaire jeune PC : préculture

UT : uninucléé tardif BM : bicellulaire moyen MI : microspores isolées
PM : prémitose T : tricellulaire SP : « shed pollen »
M: mitose
Les comparaisons entre cultures d'anthères et cultures de microspores ne sont pos-

sibles que lorsqu'on a traduit le nombre d'anthères mises en culture par un nombre cor-
respondant de microspores contenues dans celles-ci. Hoekstra et al [35] ont montré
ainsi, au cours d'une étude comparative entre les 2 méthodes, culture d'anthères (CA)
et culture de microspores isolées (MI), menées chez le cultivar Igri
(Hordeum vulgäre L.), qu'il était possible d'obtenir 6,5 fois plus d'embryons et une
amélioration de 40 % à 50 % du taux de régénérations chlorophylliennes avec la
méthode des microspores isolées. Chez l'orge, Ziauddin et al. [74], Kasha et al. [38,
39], obtiennent 0,12 % à 0,4 % d'efficacité des MI en plantes en supposant que les
anthères contiennent 2 500 microspores, ce qui est 4 à 5 fois supérieur à la CA. Chez
le maïs, les pourcentages en CA ou MI sont sensiblement les mêmes : 0,02 % à
0,036 % des microspores sont induites [27, 54], et 10 % des embryons régénèrent une
plante. Coumans et al [13] obtiendraient, chez le maïs, une efficacité en plantes de
0,1 %. Actuellement, en MI, seul le colza donne de très bons résultats : l'efficacité en
embryons atteint 7,8 % [57]. Siebel et Pauls [65] ont effectué une comparaison appro-
fondie des 2 techniques, CA/MI. Il en ressort que les MI sont 10 fois plus productives
360
L'hapiodiploïdisation
que la CA mais que les plantes issues des 2 techniques ne diffèrent pas dans leur com-
portement physiologique (dates de floraison, d'épiaison et de maturation). Chez le riz,
l'efficacité en embryons, exprimée en pourcentage d'embryons par microspore, peut
être estimée à 3,5 % [9] ; exprimée en pourcentage de plantes par microspore, elle
chute à 0,004 %, voire 0,001 % suivant les variétés Indica et Japónica [16]. Le tourne-
sol n'a pas connu encore de succès dans le domaine des microspores isolées malgré de
nombreux essais.
Chez le blé aussi, les recherches sur les méthodes de cultures de microspores isolées
ont progressé. Ainsi, il y a quelques années, Datta et Wenzel [16] avaient montré qu'un
choc thermique de 6 à 8 jours au froid stimulait les divisions nucléaires des microspores
isolées, obtenues par expulsion passive à l'extérieur des anthères (shed pollen), et que
c'était la combinaison d'une forte concentration de 2,4 D à 5 mg4 et de ficoll 10 %,
dans un milieu contenant de l'hydrolysat de caséine et de la proline, qui permettait l'ini-
tiation de l'embryogenèse. Cependant, ces auteurs n'avaient pas obtenu de plantes et les
microspores n'étaient isolées que mécaniquement. Plus récemment, des travaux ont
montré qu'il était possible d'obtenir des plantes haploïdes à partir de microspores iso-
lées des anthères dès le début de la culture, soit en les cultivant avec des ovaires [44],
soit en cultivant les microspores seules [67]. Nous avons nous-mêmes [15] obtenu éga-
lement des résultats très intéressants en microspores isolées de blé tendre et les avons
comparés avec ceux obtenus en même temps en culture d'anthère pour 6 génotypes : les
MI donnent en général 9 à 10 fois plus d'embryons que les CA, alors que le taux de
régénération dépend beaucoup plus du génotype, avec cependant parfois une supériorité
encore de la CA. Cependant, avec la lignée HD 112, nous avons obtenu 1 055 plantes
androgénétiques vertes pour 16 épis, après un broyage direct des épillets au Warring
Blendor, double filtration, deux centrifugations et mise en culture des microspores iso-
lées, à la concentration de 105 microspores ml-1, en milieu Chu liquide, modifié, addi-
tionné de glucose 0,26 M et en les cocultivant avec des ovaires de la même variété.
Nous avons donc confirmé les résultats de Mejza et al [44], mais le milieu que nous uti-
lisons résulte de plusieurs années de recherche. Nous pensons que nous pouvons propo-
ser HD 112 comme génotype modèle pour la culture de microspores isolées chez le blé,
comme Igri ou Topaz le sont chez l'orge et le colza réciproquement. En effet,
2 à 3 microspores sur mille donnent un embryon et la fréquence des microspores don-
nant une plante haploïde chlorophyllienne chez ce génotype est égale à 103, soit 10 fois
moins que celle observée chez Topaz ou Igri. Le modèle est donc sans doute perfec-
tible, si l'on se rappelle que les travaux sur le colza ont débuté en 1985.
Principales voies de recherche liées à l'haplodiploïdisation
Nous l'avons déjà vu ci-dessus avec les microspores isolées, la manipulation de la

phase haploïde avec les développements récents des techniques ouvre la voie sans
aucun doute à de nombreuses recherches. Cette dernière partie est donc consacrée à un
aperçu de ces sujets qui sont liés à l'haploïdie.
Le cas des espèces récalcitrantes

Malgré les résultats parfois spectaculaires de l'androgenèse ou des microspores isolées
chez certaines espèces, il en existe qui restent récalcitrantes à l'androgenèse in vitro ou
361
dont la réussite est partielle ou faible, voire nulle. Chez le maïs, il est connu qu'à part
quelques génotypes sélectionnés, comme par exemple des HDs à haute fréquence d'in-
duction [2], le matériel qui intéresse les sélectionneurs répond très faiblement. C'est
aussi le cas du blé dur. Chez cette espèce, la phase d'induction des embryons androgé-
nétiques se passe comme chez les espèces non récalcitrantes, telles que le blé tendre ou
l'orge, mais les problèmes apparaissent pendant la phase de régénération où les
embryons, pour la majorité des génotypes, ne régénèrent que des plantes albinos ou des
racines. Ainsi, seules quelques plantes chlorophylliennes avaient été obtenues par les
différentes équipes. Plus récemment, Mihamou-Ziyyat [45] a mené une étude assez
extensive sur une collection de 174 lignées de blé dur et a pu ainsi montrer qu'il existe
néanmoins chez cette espèce un petit nombre (environ 10 % des lignées testées) de
lignées aptes à donner en androgenèse in vitro des plantes chlorophylliennes. Leurs
performances sont alors tout à fait comparables à celles des génotypes de blé tendre
embryogènes. Au total, plus d'une cinquantaine de plantes haploïdes chlorophylliennes
ont ainsi été produites. Un programme de croisement a été lancé pour étudier le mode
de transmission de leur aptitude à l'androgenèse. Avant que les méthodes d'androgenè-
se in vitro soient mises au point sur le blé dur, ce sont les méthodes faisant appel aux
croisements intergénériques, notamment avec le maïs, qui permettent d'obtenir des
plantes haploïdes chlorophylliennes, et par suite des haploïdes doublés chez cette
espèce [1, 14, 59].
Marquage de l'aptitude à l'haploïdie

Devant la variabilité génétique et spécifique de l'aptitude à répondre in vitro, il est
logique que des travaux commencent à paraître sur les possibilités de repérage, à l'aide
de marqueurs cytologiques ou moléculaires, de cette aptitude. Ainsi Sangwan et Sang-
wan-Norreel [62] ont montré que le caractère récalcitrant ou favorable à l'androgenèse
des espèces peut être marqué par la différenciation plus ou moins précoce des pro-
plastes en amyloplastes au cours de la gamétogenèse mâle. Les espèces connues
comme étant favorables à l'haploïdie in vitro n'accumulent de l'amidon dans leur pol-
len qu'au stade bi-cellulaire alors que cela se passe très précocement chez les espèces
récalcitrantes, les amyloplastes étant observables pendant toute la gamétogenèse. Ces
organites cytoplasmiques sont connus pour ne pas pouvoir se dédifférencier in vitro.
Un autre exemple : chez le maïs, la corrélation entre la synthèse d'une protéine de
32 kd et l'aptitude à répondre en androgenèse a été mise en évidence [68]. Elle est
induite par le prétraitement au froid des panicules avant leur mise en culture. Égale-
ment, chez une variété de blé tendre connue pour ses bonnes performances androgéné-
tiques et cultivée in vitro dans deux conditions, l'une favorable et l'autre défavorable à
l'haploïdie, Reynolds et Kitto [58] ont pu mettre en évidence, grâce aux techniques de
screening différentiel de banques d'ADNc, des clones spécifiques des toutes premières
étapes de l'androgenèse. La nature et le rôle de ces gènes exprimés ainsi spécifique-
ment sont encore inconnus.
L'albinisme
Le problème de l'albinisme est un problème majeur en androgenèse in vitro et spéci-
fique de cette méthode de production d'haploïdes. On peut dire qu'il est particulière-
ment aigu chez les céréales comme le blé dur, l'orge, le seigle. Il a été démontré chez
le blé tendre et l'orge que les plantes albinos issues de l'androgenèse présentent des
362
deletions très importantes dans leur génome chloroplastique [17, 18]. Dans le cas où
les plantes sont chlorophylliennes, leurs génomes chloroplastiques ne sont pas affectés
par le processus in vitro comme cela a été démontré par Rode et al [60] chez le blé ou
par Charmet et al [8] chez le Triticale. Tuvesson et al [66] avaient montré, par ailleurs,
chez le blé tendre, que cet albinisme est sous le contrôle de deux groupes de gènes
nucléaires. Le premier est composé de gènes à effets principalement additifs contrôlant
le pourcentage de régénérations chlorophylliennes à cause de leur effet sur l'aptitude
globale du matériel à régénérer. Le deuxième groupe, composé de quelques gènes
dominants ou à effets épistatiques, affecterait la fréquence à l'origine des structures
chlorophylliennes. Aujourd'hui, cependant, aucune explication n'a été donnée, ni des
mécanismes qui sont à l'origine de ces deletions massives, ni sur leur localisation spa-
tio-temporelle. On ne sait pas, en particulier, si les deletions préexistent dans les micro-
spores avant leur mise en culture ou bien ont lieu pendant la phase de culture. Une
étude comparée, menée par Mourilzen et Holm [47] chez l'orge, sur les variétés Igri et
Alexis, très différentes en ce qui concerne leurs aptitudes à donner des plantes albina,
montrent que les erreurs de replication de l'ADN chloroplastique ne débuteraient qu'au
cours de la phase de régénération, c'est-à-dire tardivement.
Les embryons d'origine androgénétique comme source de souches cellulaires

pour obtenir des protoplastes pour la transformation génétique.
Il a été démontré récemment chez l'orge [36] que le meilleur matériel de départ pour
établir des suspensions cellulaires aptes à la régénération et pouvant servir de cibles
pour des plasmides se trouve être les embryons androgénétiques eux-mêmes. En effet
ils permettent d'établir en quelques semaines (de 8 à 10) des suspensions cellulaires à
partir desquelles on peut isoler des protoplastes aptes à l'organogenèse, et donc consti-
tuant un matériel de choix pour la transformation. Cependant, l'établissement de telles
souches embryogènes entraîne parfois l'apparition de stérilités mâles chez les plantes
régénérées.
D'autres recherches menées par exemple chez le colza ou l'orge démontrent que les
embryons haploïdes d'origine androgénétique sont eux-mêmes un matériel excellent
quand ils sont utilisés comme explants primaires pour la transformation génétique, soit
par la voie Agrobacterium, soit par la voie balistique à condition cependant de disposer
d'un système efficace de régénération d'embryons secondaires à partir des explants
transformés [43, 48].
Les microspores isolées comme modèle idéal pour la transformation génétique

des espèces récalcitrantes à Agrobacterium
Le système des microspores isolées apparaît bien comme étant une des meilleures solu-
tions pour le génie génétique des espèces peu ou pas réceptives aux techniques de trans-
formation par Agrobacterium. C'est le cas des céréales. En effet, il permet non seule-
ment une conversion rapide des embryons en plantes, mais également les événements de
transformation pourront être fixés plus immédiatement à l'état homozygote après dou-
blement chromosomique, simplifiant ainsi l'analyse génétique par la suite. Des résultats
positifs de transformation utilisant des cultures de microspores isolées chez le colza,
l'orge et le tabac ont été obtenus récemment, avec soit le canon à particules, soit la
transformation par absorption directe [37, 72].
363
Les vitrovariations au cours des processus in vitro

Des vitrovariations (ou variations gamétoclonales) sont en effet couramment observées
à la suite d'un ou de plusieurs cycles d'androgenèse chez les céréales [77, 31, 55] aussi
bien que chez le tabac ou Nicotiana sylvestris [51, 52]. L'analyse de ces variations
chez les haploïdes doublés a été faite également au niveau des ADN nucléaires et cyto-
plasmiques par Rode et al [60, 61] ou par Charmet et al [8]. Des variations dans cer-
taines régions de l'ADN nucléaire, telles que l'espaceur non transcrit de l'ADN riboso-
mal, ont été mises en évidence. Les caractères affectés par l'androgenèse in vitro sont
nombreux : hauteur, précocité, rendement, caractéristiques biochimiques, résistance aux
maladies, etc. Les travaux de Sibi et Kandil [63] et Sibi et Fakiri [64] sur l'orge ont
montré que l'on peut obtenir des variations aussi bien en androgenèse qu'en gynoge-
nèse in vitro et ce, pour des caractères biométriques et biochimiques, notamment les
alpha-amylases.
Bjornstad et al. [3, 4], dans le cadre de comparaison de méthodes de production
d'haploïdes doublés et de lignées homozygotes chez l'orge et le blé, ont fait une syn-
thèse des résultats obtenus récemment en ce qui concerne les variations provoquées par
le passage par l'haploïdie, et surtout montré qu'il existe une interaction génotype x,
méthode très significative. Cependant, pour reprendre Demarly et Sibi [21], les lignées
issues des méthodes de sélection « classiques », utilisant l'autofécondation, telles que la
sélection généalogique inventée par les Vilmorin, seront génétiquement différentes des
lignées issues d'haplodiploïdisation, au niveau notamment du découpage de l'informa-
tion génétique le long des bras chromosomiques. En effet, l'HD va fixer les recombi-
naisons ayant eu lieu dans le génome de la FI ; de grands secteurs issus de chaque
parent se retrouveront donc chez les lignées HD, et les interactions entre alíeles auront
donc beaucoup d'importance. Le marquage dense du génome par les marqueurs molé-
culaires permettrait sans nul doute de résoudre cette question très intéressante. Dans le
Tableau II, nous donnons une liste de quelques travaux qui ont été consacrés à l'analy-
se des différences entre méthodes. L'androgenèse in vitro, qui avait été soupçonnée
d'être génératrice de vitrovariations systématiquement défavorables, n'apparaît plus
ainsi à la suite de tels travaux.
La sélection in vitro pour la tolérance aux stress

Puisque ces modifications se produisent somme toute assez fréquemment, elles sont
actuellement étudiées dans le cadre d'expériences de sélection in vitro, au cours des-
quelles on soumet les microspores ou les cellules des sacs embryonnaires à des pres-
sions de sélection dirigées : forte salinité, températures élevées [45, 63]. L'objectif de
telles recherches, proposées par exemple par Lashermes [42], qui reposent non seule-
ment sur la possibilité d'obtenir des vitrovariations, mais également sur la perspective
de sélectionner au niveau gamétique et d'obtenir, à l'aide de ces processus d'haplodi-
ploïdisation in vitro, réalisés dans des conditions stressantes, de nouvelles lignées tolé-
rantes aux stress environementaux (sécheresse, salinité, hautes températures, froids,
etc.). Très peu de résultats ont été obtenus jusqu'à aujourd'hui dans ce domaine. Citons
cependant les travaux de Ye et al [73] qui ont montré pour la première fois qu'une
sélection in vitro était possible chez l'orge pour la résistance à la salinité.
364
Les haploïdes doublés comme matériel idéal pour le marquage moléculaire

Si l'on fait le bilan de tous les grands programmes internationnaux de marquage molé-
culaire chez les céréales, on peut observer qu'ils sont en grande partie basés sur des
populations d'haploïdes doublés. C'est le cas notamment pour le programme nord-amé-
ricain de marquage de l'orge, dont le matériel est constitué de quelques populations de
150 à 200 haploïdes doublés obtenues à partir des croisements de référence : Steptoe x
Morex ou Harrington x TR-306 [33]. Il en est de même pour le programme allemand
de marquage du génome de l'orge. De même, au CIMMYT, une partie du programme
du génome du blé s'appuie sur une population d'HDs de blé (Lacaze P., com. pers.).
Les raisons d'un tel intérêt pour des populations d'HDs sont les suivantes : a) l'ha-
plodiploïdisation donne des lignées définitivement fixées à partir d'un croisement ; on
parle de lignées « éternelles » ; b) le nombre d'individus génétiquement identiques chez
un HD étant quasiment illimité, cela permet une meilleure appréciation des interactions
génotypes x milieux de ces lignées par le fait que l'on peut multiplier les répétitions ;
c) contrairement aux analyses sur F2 ou back-cross, les HDs permettent une utilisation
de tout le polymorphisme, les gènes dominants et co-dominants pouvant être pris en
compte et enfin d) les corrélations QTL x marqueurs pourront être estimées avec une
meilleure précision en cas de faible héritabilité. Carbonell et al [7] ont démontré, grâce
à un modèle statistique, qu'avec une population de 250 HDs on peut détecter dans
90 % des cas des QTLs individuels présentant une héritabilité très faible de 0.05 par
exemple.
Les microspores isolées, un modèle pour l'analyse cytologique fine

des processus de réorientations embryogènes
Enfin, les microspores isolées sont un matériel très accessible pour des études de cyto-
logie concernant les premières phases de l'embryogenèse haploïde. En effet, dans ce
cas on est débarrassé des parois des anthères et les techniques d'immunofluorescence
ou de fluorescence sont plus facilement utilisables. De plus, il n'est pas sans intérêt de
comparer différents processus d'embryogenèse haploïde : cultures d'anthères, cultures
en shed pollen, microspores isolées. Déjà, des résultats ont été publiés chez le colza qui
montrent que la première division embryonnaire qui intervient chez les microspores
isolées de cette espèce est en général symétrique, ce qui est contraire à ce qui se passe
habituellement au cours de la permière division zygotique [32].
Conclusion
Nous avons essayé de montrer non seulement que l'haplodiploïdisation est un outil
utile en création varietale, mais qu'il doit également faire partie intégrante de tout pro-
gramme de recherche en génétique de plantes comme les céréales [70]. Son rôle tant
dans le domaine du marquage moléculaire que dans celui de la transformation géné-
tique apparaît de plus en plus évident. Il ne fait aucun doute que, dans l'avenir, ce rôle
ira en se renforçant.
365
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369

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PARTIE IV

Contrôle nucléaire et cytoplasmique

A. SARRAFI, M. GHAEMI, N. AMRANI, G. ALIBERT

Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes (BAP), INP/ENSAT EA

Le contrôle nucléaire et cytoplasmique de la régénération haploïde par V andrògenèse et

L'analyse de variance des données transformées en Arcsin V x concernant les deux

Croisement « blé x maïs » Androgenèse

« ENSAT 3 » est le génotype le plus performant suivi de « ENSAT 2 » pour le

Nous remercions le Conseil Régional de Midi-Pyrénées (N/Réf. : RECH/9200924)

4. Foroughi-Wehr B, Zeller FJ (1990). In vitro microspore reaction of different german wheat

Effet du milieu de culture d'anthères

Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes (BAP), INP/ENSAT, EA

- épis embryogènes représentant le nombre d'épis donnant au moins un embryoïde

Sources de variation ddl EE/100 E E/100 A RT/100 A

Traitement EE/100 E E/100 A RT/100 A PV/100 A PA/100 A

Nous remercions le Conseil Régional de Midi-Pyrénées (N/Réf. : RECH/9200924)

K.PIRI, C. ANCEAU, S. EL JAAFARI, P. LEPOIVRE, J. SEMAL

Laboratoire de Pathologie végétale, Faculté des Sciences agronomiques,

Les stress environnementaux, dont la salinité, constituent une limitation sérieuse du

la tolérance aux stress environnementaux, établies sur la base de critères agronomiques

Mécanismes de résistance à la salinité chez les végétaux

Mécanismes de tolérance aux sels chez les halophytes

Mécanismes de tolérance aux sels chez les glycophytes

Amélioration des plantes pour la résistance à la salinité

Approche empirique descriptive

Approche analytique et explicative

Tableau I. Tests de sélection pour la résistance des plantes à la salinité.

Test relatifs aux caractères de tolérance cellulaire

La sélection de génotypes résistant à la salinité

Création de la variabilité et sélection des génotypes résistants

Nombre de cals % de cals Nombre de

Évaluation de la descendance des lignées androgénétiques sélectionnées

0 100 200 300 400 500

Poids sec (mg)

Indice d'accumulation de NaCI dans les feuilles

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Par sélection in vitro de plantilles dihaploïdes issues de culture d'anthères (irradiées ou

RAOUDHA KAMOUN-MEHRI12, PHILIPPE LEPOIVRE1,

1. Laboratoire de Phytopathologie, Faculté des Sciences Agronomiques,

- la composition des solutions enzymatiques utilisées pour la digestion des tissus et

Niveau d'insertion Nombre moyen % de Diamètre moyen

Feuilles apicales 3,3 x 106 (0,7) 50 (4,9) 12 (0,9)

Feuilles médianes 15,2 x 106 (2,3) 77 (4,5) 15 (1,4)

30 jours 1,5 x 10 6 (0,3) 27 (5,8) 11 (0,8)

45 jours 0,2 x 10 6 (0,1) 27 (4,5) 10 (0,9)

10 jours Cf 3,5 x 106 (2,7) 86 (3,2) 19(0,1)

20 jours Cf 0,7 x 106 (0,2) 49 (0,9) 17 (0,1)

30 jours Cf 0,7 x 106 (0,5) 20 (0,7) 18(1,1)

La plasmolyse est une étape améliorant l'isolement des protoplastes de mésophylle

100 -i nombre xlO 5

% cellules Nombre Diamètre

Cals Avec 1,5 x IO6 46 21

Cals Avec 6.4 x IO6 79 27

La solution enzymatique composée de 1 % de cellulase Onozuka RS, 1 % de hémi-

avec une viabilité de 49 %. Le rendement maximum de 3,5 x 10 6 et 8 x 10 6 de proto-

A 0,5% 1 % 0,1 % 1,2 (0,1) 15(4) 12 (0,9)

La durée optimum d'incubation enzymatique en terme de rendement et de viabilité

Figures 2, 3, 4. Évolution du nombre, de la viabilité et de la taille des protoplastes issus de méso-

La digestion des tissus foliaires de la variété « Montmorency » nécessite l'utilisa-