Exercices – Méthodes chromatographiques

4. Chromatographie en phase gazeuse

EXERCICE 4.1. On souhaite séparer un mélange de n-heptane (téb 98°C) et de n-propanol (téb 97°C) par CPG. Pour
ce faire, on utilise deux colonnes chromatographiques différentes : la première est de type « Squalane » et l’autre
est une colonne « Carbowax ».
a) Quelle est la nature de ces deux phases
A. n-propanol B. n-propanol
stationnaires ? S’agit-il de phases stationnaires n-heptane n-heptane
polaire ou apolaire ?
b) Attribuez les chromatogrammes A et B à la
colonne correcte. Justifiez votre réponse en vous
aidant de la structure des composés.

a) Squalane terminaison comme « alcane » (hydrocarbure) phase stationnaire apolaire

Carbowax = phase de type polyéthylène glycol phase stationnaire polaire
b) n-heptane = alcane à 7 atomes de carbone (« n » signifie chaîne « normale » linéaire)
n-propanol = chaîne à 3 atomes de carbone qui porte une fonction alcool OH
Alcane = composé apolaire >< alcool = composé polaire (possibilité de faire des ponts H, existence d’un
moment dipolaire permanent au sein de la molécule)
OH

n-heptane n-propanol
OR, lors séparation chromatographique, « qui se ressemble, s’assemble » composés polaires aiment les phases
stationnaires polaires ( restent plus longtemps dans la colonne polaire) et composés apolaires aiment les
phases stationnaires apolaires.

• Chromato A : composé polaire sort en 1er le moins retenu phase stationnaire

apolaire (squalane)
• Chromato B : composé apolaire sort en 1er phase stationnaire polaire (carbowax)

EXERCICE 4.2. Soit un mélange de 5 n-alcanes homologues (C10 – C14) que l’on injecte en CPG sur une colonne
SPB-35 (35% phényl 65% méthyl polysiloxane) en régime isotherme à 114°C.
a) De quel type de phase stationnaire s’agit-il ? polysiloxane apolaire
b) Comment varie la température d’ébullition avec la longueur de la chaîne carbonée ?
Température d’ébullition augmente avec le poids moléculaire augmente avec la longueur de la chaîne
carbonée (car il y a plus d’interactions intermoléculaires de type VDW à rompre pour passer à l’état
gazeux)
c) Donnez l’ordre d’élution des 5 alcanes et justifiez votre réponse.
Composés sortent de la colonne par ordre croissant de température d’ébullition : composé le plus volatil
sort en 1er

EXERCICE 4.3. On souhaite déterminer la composition centésimale (en volume) d’un mélange de différents
alcools. Le chromatogramme obtenu suite à l’injection de ce mélange inconnu en CPG est présenté ci-dessous
(chromato. A). Un mélange comprenant des proportions identiques de 4 alcools (méthanol, éthanol, propanol et
butanol) est injecté de la même manière (chromato. B).
Composition centésimale (en volume) = composition en % volumique

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a) Identifiez tous les pics sur les deux chromatogrammes.

4 alcools globalement la même polarité ils sortent sur base de leur température d’ébullition
• 1) méthanol ; 2) éthanol ; 3) propanol ; 4) butanol

méthanol éthanol propanol butanol

Dans chomato A., que 3 pics ! sur base des temps de rétention dans chromato B., on peut dire que les 3 pics
sont éthanol, propanol, butanol (temps de rétention = une constante pour un composé donné dans des conditions
identiques)

b) Quel est le % volumique de chaque alcool dans le mélange comprenant les 4 alcools ? 25%
c) Calculez les facteurs de réponse pour les 4 alcools étudiés.
b) Composé % vol Surface (cm2) Surface relative Facteur de réponse
(%) (FR)
Méthanol 25 5,4 . 0,1 = 54 54/266 = 20,3 25/20,3 = 1,23
Ethanol 25 5,7 . 0,1 = 57 57/266 = 21,4 25/21,4 = 1,17
Propanol 25 5,3 . 0,1 = 53 53/266 = 19,9 25/19,9 = 1,26
Butanol 25 5,1 . 0,2 = 102 102/266 = 38,4 25/38,4 = 0,651
S totale = 266 Srel. totale = 100 %

d) Déterminez le % volumique des alcools présents dans le mélange inconnu.

Composé Facteur de Surface (cm2) Surface relative (%) % vol % vol corrigé
réponse
(FR)
Méthanol 1,23 / / / /
Ethanol 1,17 9,4 . 0,2 = 188 188/345 = 54,5 1,17 . 54,5 = 63,8 63,8/103,1 = 62 %
Propanol 1,26 5,5 . 0,1 = 55 55/345 = 15,9 1,26 . 15,9 = 20,0 20,0/103,1 = 19%
Butanol 0,651 5,1 . 0,2 = 102 102/2345= 29,6 0,651 . 29,6 = 19,3 19,3/103,1 = 19%
S totale = 345 Srel. totale = 100 % % vol total = 103,1%

e) Comment s’appelle cette méthode de dosage ?

Normalisation interne

f) Pourquoi doit-on calculer des facteurs de réponse ?

Car le détecteur donne une réponse différente pour des quantités identiques de différents composés injectés

donne des tailles de pics différentes

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A. B.

Mélange Mélange 4 alcools

inconnu

EXERCICE 4.4. Le valproate de sodium ou Dépakine® est un médicament actif dans

diverses formes d'épilepsie. Après administration orale, il est présent sous sa forme
active : l'acide valproïque (Fig. 1). Les concentrations thérapeutiques optimales se
situent entre 40 et 100 µg/mL. Pour adapter la posologie, il est nécessaire de
déterminer le taux sanguin du composé. Ceci est réalisé par CPG.
Fig.1. Structure de l’acide
valproïque

Dans un premier temps, l’acide valproïque est extrait du sérum par un solvant organique, le chloroforme. Ensuite,
il est dérivé au moyen de triméthylchlorosilane avant d’être finalement dosé par CPG en présence d’un standard
interne (avec réalisation d’une droite d’étalonnage au préalable).

Voici les chromatogrammes de 4 injections : un blanc, un témoin acide valproïque, un témoin standard interne et
un mélange acide valproïque - standard interne.

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a) Donnez le temps de rétention de l’ac. valproïque: ……3,64 min …… et du standard interne : ………4,41 min ……..
b) Voici les valeurs de surface des pics obtenus pour 4 étalons en acide valproïque injectés dans les mêmes
conditions :

Concentration Tr Surface y=?

(µg/mL) (min)
100 3.64 33924 33924/53984 = 0,628
4.42 53984
75 3.64 25204 25204/51336 = 0,491
4.43 51336
50 3.63 15875 15875/46132 = 0,344
4.42 46132
25 3.64 10094 10094/45235 = 0,223
4.42 45235

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L’équation de la droite d’étalonnage obtenue sur base de ces injections est

y = 0.0054 x + 0.081.

Que représente y ? A partir des données du tableau (et non à partir de l’équation de la droite d’étalonnage !),
calculez y pour chaque étalon (complétez le tableau ci-dessus).

Méthode de l’étalonnage interne Y = Rapport des signaux ( rapport des surfaces)

c) Calculez la concentration en acide valproïque d’un échantillon de sérum pour lequel on a obtenu les résultats
suivants :
Tr (min) Surface
3.64 3744
4.42 7142
Y = 0,0054 X + 0,081 3744/7142 = 0,0054 X + 0,081 X = 82,1 µg/mL
d) Le chromatographe utilisé nécessite l’emploi de trois gaz différents : le dihydrogène, l’hélium et l’oxygène.
Quel type de détecteur comporte le chromatographe ? Expliquez le rôle de chacun des gaz.
Détecteur F.I.D
He = gaz vecteur ; H2 = combustible et O2 = comburant pour la flamme du détecteur
e) Quel est le rôle du triméthylchlorosilane ? Que se passerait-il si on omettait de l’ajouter ? Donnez-en une
explication.

Réactif de dérivation : permet de transformer l’acide valproïque, peu volatil en raison des ponts hydrogène qui
existent entre les molécules d’acide valproïque, en un composé plus volatil car les atomes de H impliqués dans
ces interactions sont remplacés par un groupement triméthylsilyl ( pont H devient impossible à réaliser)

Si on n’oublie d’ajouter le réactif de dérivation, le composé ne sera pas volatilisé analyse par CPG impossible

EXERCICE 4.5. Un producteur de beurre fermier décide de faire réaliser une analyse chromatographique de la
matière grasse du beurre qu’il produit pour déterminer la teneur en acide gras polyinsaturés et ainsi, juger de
l’opportunité de changer l’alimentation de son cheptel. En effet, la composition en acide gras du beurre change
selon l’alimentation de la vache et une ration complémentée en tourteaux de colza permettrait d’augmenter le
taux d’acides gras polyinsaturés, meilleurs pour la santé humaine.
a) Après avoir extrait les triglycérides du beurre, ceux-ci sont hydrolysés pour libérer leurs acides gras.
Quelle étape doit-on ensuite effectuer sur ces acides gras avant de pouvoir réaliser une injection dans le
chromatographe en phase gazeuse ? Expliquez. Dérivation car fonction acide carboxylique des acides gras
forment des ponts H température d’ébullition élevée ! CPG impossible
En faisant dérivation, on remplace H impliqués dans pont H par un groupement qui ne peut pas faire
de pont H température d’ébullition plus faible pour les composés dérivés analyse en CPG possible
b) Lors de la préparation des échantillons nécessaires à la réalisation de la droite d’étalonnage et de
l’échantillon de beurre, on ajoute une certaine quantité de standard interne. Pourquoi ? Expliquez.
Pour s’affranchir des erreurs expérimentales et en particulier, erreur sur le volume injecté (qui peut un
peu varier d’une injection à l’autre)
c) Certaines des conditions opératoires utilisées pour la chromatographie sont présentées dans le tableau
suivant :
Injection Split (1 : 50), 1.0 µL, 270°C
Colonne OV-1 (100% diméthylsiloxane, 0.25 µm), 0.25 mm * 30 m

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Détection FID, 300°C

Programme de température 100°C, 2 min ; 30°C/min jusque 160°C, 160°C, 2 min

Sur base de ce tableau, quels sont tous les renseignements que vous pouvez tirer ?

Injecteur split-splitless utilisé en mode split division de l’échantillon injecté après vaporisation : une part entre
dans la colonne, 50 parts sortent par la fuite.
Température injecteur = 270°C température d’ébullition des composés étudiés pas supérieure à 270°C
Volume injecté = 1,0 µL

Colonne apolaire, de 30 m de long ( colonne capillaire) et 0.25 µm de diamètre interne et épaisseur du film
interne = 0.25 µm

Détecteur FID ( emploi gaz O2 et H2 pour la flamme en plus de He pour gaz vecteur)

Programmation de température :
Temp. Initiale : 100°C pendant 2 min
Gradient de 30°C par min
Temp finale : 160°C pendant 2 min

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