UNIVERSITE ABDE LMAEK ESSAADI

FACULTE DES SCIENCES DE TETOUAN

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

GENETIQUE HUMAINE
ET MOLECULAIRE
TD2: LES ANALYSES MOLÉCULAIRES

S5 Pr: Mme BENIOURI R.

2015-2016
 LE CONSEIL GENETIQUE
Le conseil génétique est une consultation spécialisée
de médecine préventive.
C’est un acte médical particulier qui consiste à évaluer la probabilité
pour qu’un enfant à naître soit atteint d’une affection qui est déjà
survenue dans la famille ou qui a un risque plus élevé
d’y survenir du fait d’une situation particulière.

LE CONSEIL GENETIQUE REPOSE SUR:

§- Le diagnostic précis de l’affection
L’identification formelle de la maladie est l’un des impératifs du conseil
génétique, surtout en
cas de recours à des investigations anténatales chez le fœtus.
§- L’enquête génétique
C’est une des plus importantes étapes du conseil génétique.
L’enquête familiale doit être minutieuse et aboutir à un arbre
généalogique le plus complet possible.
§- Des connaissances actualisées sur la maladie
 De la connaissance du gène au test utilisable en clinique
Le domaine de la génétique moléculaire,
l’étude des gènes responsables de maladies,
est en constante évolution.

La génétique moléculaire,
initialement tournée vers les maladies monogéniques graves de l’enfant
(telles la myopathie de Duchenne, la mucoviscidose),
avec un but essentiellement de diagnostic prénatal,
se tourne depuis quelques années vers les maladies monogéniques de
déclaration tardive, chez l’adulte (telle la chorée de Huntington),
ainsi que vers l’oncogénétique (les cancers du colon, du sein) et,
plus récemment, vers les maladies multigéniques ou multifactorielles,
comme l’hypertension artérielle ou le diabète.
Cela s’effectue dans un but de diagnostic,
de meilleure prise en charge de la maladie,
mais aussi dans un but de diagnostic présymptomatique :
c’est l’« ère » de la prédiction génétique.
 Les analyses génétiques prénatales.

(après la fécondation artificielle)

Il a un caractère non invasif

Les techniques invasives du diagnostic

l’analyse de l’ADN fœtal circulant dans le sang maternel

Il est désormais possible d’analyser des fragments d’ADN fœtal présents dans le sang
de la mère et récoltés à partir d’une simple prise de sang chez cette dernière.
Cette pratique constitue un progrès important car
elle évite des prélèvements invasifs et leurs risques.
Techniques d’étude d’anomalies du Génome entre
Microlésions et Macrolésions
 METHODES BIOLOGIQUES DE DIAGNOSTIC
-1: Analyse phénotypiques
(biochimiques et métaboliques rarement histologiques):
dosages enzymatiques dans certaines maladies métaboliques.
-2 : Le caryotype métaphasique
Il faudra au minimum une mutation de 5 Mb (mégabase) pour qu'elle soit
détectée (anomalie de nombres et anomalie de structure).
-3 : Hybridation in situ en fluorescence.
La FISH peut s'appliquer aux cellules fœtales au stade d'interphase.
Elle pourra confirmer, dès le prélèvement du liquide amniotique,
la présence d'un complément euploïde ou aneuploïde.
-4 : Analyses moléculaires:
- Recherche directe d'une mutation: lorsque cette dernière est spécifique de
la pathologie recherchée, ou lorsque la mutation à l'origine de la maladie dans
la famille étudiée a été déjà identifiée.
- Diagnostic indirect par utilisation de marqueurs génétiques après
étude familiale.
Lorsque le gène clairement impliqué dans la maladie est localisé mais non encore cloné
ou lorsque les mutations du gène responsable sont très hétérogènes.
 Le diagnostic
direct :
identification
DIAGNOSTIC DIRECT
de l'anomalie
causale :

identification de la mutation dans le gène implique

(dans le cas de la génétique moléculaire)

DIAGNOSTIC
INDIRECT

Coségrégation familiale phénotype/marqueur

Le diagnostic indirect : Approche secondaire si les analyses directs ne
permettent pas d’identifier l’anomalie génétique causale.
Consiste à suivre indirectement la transmission de la mutation
au sein de la famille grâce à des marqueurs génétiques.
 Diagnostic indirect
C’est l’étude de la transmission des différents allèles d’un locus dans
une famille.
Technique utilisée quand la mutation n’est pas encore identifiée
Liaison ou linkage
Deux loci localisé sur le même chromosome parental peuvent demeurer
ensemble ou être séparés au cours de leur transmission.
La recombinaison lors du crossing-over est responsable de
la ségrégation indépendante de deux loci situé sur le même chromosome.

Plus 2 loci sont proches,

moins grandes sont les chances
de recombinaisons.
La coségrégation de deux ou
plusieurs loci est nommée
liaison
et ne concernent que
les loci pas les allèles.
 TESTS GÉNÉTIQUES
De nombreux tests génétiques apportent des informations relatives
à la santé des individus ou à celle de leur famille.
Ces tests consistent à rechercher des anomalies sur la molécule d’ADN,
ou à dépister des anomalies concernant le nombre ou
la forme des chromosomes.
Ils peuvent être réalisés avant la naissance (test prénatal) ou
après, à n’importe quel âge (test postnatal).
Techniques de détection de remaniements géniques
La détection de tels remaniements (délétions, inversions,
duplications de fragments de gènes)
fait historiquement appel à la technique de « Southern blot »,
qui impose de travailler avec 10 à 20 fois plus d’ADN
que la technique de PCR,
ce qui constitue une difficulté pour le diagnostic prénatal par exemple,
et impose un délai de rendu de résultats de 7 à 10 jours.
elle est supplantée par la technique de PCR qui permet,
en quelques heures de faire le diagnostic
de délétion, de duplication ou …
 L’ADN est présent dans toutes
Réplication les cellules nucléées et sa séquence est
identique dans toutes les cellules
d’un même organisme.
Il y a 12 picogrammes d’ADN par cellule.
1 ml de sang contient environ 5 millions
d’ADN d’ARN de leucocytes soit 60 mg d’ADN.
cDNA Cette quantité est largement suffisante
pour le diagnostic moléculaire et parfois
pour des études de recherche.
L’analyse de l’ADN est Le matériel génétique constitutionnel
Ubiquitaire ou
un moyen de diagnostic spécifiques d’un tissu
est identique dans toutes les cellules
utilisé depuis d’un type cellulaire
du corps
plusieurs années. d’un état
Cette technologie évolue très vite
mais reste délicate et ses indications
doivent être posés lors d’une
consultation de génétique médicale.
Nous allons traiter deux techniques
largement utilisées en diagnostic
médical: la PCR et
le séquençage de l’ADN.
 LES ANALYSES MOLÉCULAIRES
Effectuée sur de l’ADN extrait de cellules nucléées :
sanguines, fibroblastes, des cheveux, buccale, tumoral, amniotique, chorioniques, …
Le choix de la technique dépend du gène à analyser ainsi que du type de prélèvement.
§- Techniques de Southern blot
Électrophorèse de l’ADN fragmenté par une enzyme de restriction,
transfert sur une membrane et hybridation avec une sonde
§- Réaction en chaîne par l’ADN polymérase : PCR
Amplification de l’ADN ou de l’ARN en quelques heures,
en plusieurs millions de copies.
Permet donc des analyses sur base d’un matériel très petit.
§- Analyse au moyen des sondes oligonucléotidiques allèle spécifiques
Une sonde oligonucléotidique est une séquence connue de nucléotides d’un gène
particulier avec un marqueur radioactif ou tout autre marqueur.
Hybridation de l’ADN avec sonde qui ne s’hybride qu’avec de l’ADN ayant une
séquence normale ne donne des infos que dans la recherche de mutations connues.
§- Séquençage d’un gène
Détermination de la séquence complète de nucléotides d’un gène.
§- Autres techniques
PTT, SSCP, DGGE, DHPLC, MLPA…
 RFLP : polymorphisme de longueur de fragment de restriction
Origines du polymorphisme de restriction (RFLP) :
- Perte ou gain d'un site de restriction
- Mutation de type insertion-délétion
Dans les deux cas les loci sont généralement bialléliques et
l'expression des allèles est codominante.
Polymorphisme du à la disparition Polymorphisme du aux
d’un site de restriction mutations de type
(mutations ponctuelles). « insertion – délétion ».
 Pour mettre en évidence les RFLP, on réalise un southern blot.

Les étapes : Le Southern blot :

1- Préparation de l'ADN à étudier

-· Digestion par une enzyme de restriction adéquate.
-· Séparation des fragments par électrophorèse.
-· Dénaturation de l'ADN par incubation du gel d'électrophorèse dans
une solution de soude.
· Transfert de l'ADN sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon
par un flux de liquide entraînant l'ADN :
- Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou encore en nylon) est placée sur le gel.
- Une pression est appliquée au gel en plaçant une pile de serviettes
de papier et un poids sur la membrane et le gel.
- Ceci va permettre une montée par capillarité du tampon imprégnant le gel.
Ce déplacement de liquide entraîne l'ADN qui va ainsi se fixer
à la membrane de nitrocellulose (ou de nylon).
-· Fixation covalente de l'ADN sur la membrane par cuisson
(nitrocellulose) ou exposition aux U.V courts (nylon).
 2- Hybridation
On ajoute la sonde dénaturée à la solution d'hybridation.
La sonde est marquée de sorte qu'elle puisse être détectée,
habituellement par incorporation de la radioactivité ou en "étiquetage«
de la molécule avec un fluorophore.
Dans certains cas, la sonde peut être faite à partir d'ARN,
plutôt que d'ADN.

3- Lavages
Le lavage élimine la sonde en excès.
4- Autoradiographie
Dans le cas d’une sonde radioactive, on met la membrane en présence
d'un film radiographique vierge dans une enceinte opaque pour que la
sonde radioactive fixée sur les fragments de l’ADN complémentaires
impressionne le film.
On révèle le film : les taches noires (sur le négatif) correspondent
aux emplacements où ont migré les fragments d'ADN complémentaires
de la sonde.
Préparation de l'ADN à étudier

Autoradiographie
Diagnostic de l'achondroplasie
par RFLP
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Une anomalie génétique que l'on cherche à identifier
Problème : étude au niveau moléculaire → faible quantité de matériel
à disposition or il est nécessaire d’avoir une grande quantité de matériel
pour réaliser les analyses.
Solution : soit on travaille sur de grandes quantités de prélèvement,
soit on utilise l’amplification de la région d’intérêt.
La PCR est une technique permettant d'amplifier en grande quantité
une région d'intérêt, basée sur l'utilisation :
- De courts fragments d'ADN synthétiques (les amorces)
complémentaires à la séquence d'intérêt (appariement).
- D'une enzyme ADN Polymérase (Taq qui est thermostable) qui permet
d'amplifier/copier de manière fidèle un ADN cible à partir de régions
doubles brin (zones d'appariements ADN cible-amorces).
 La séquence est
doublée à chaque
cycle.
Si l’on effectue
n cycles on obtient
2n copies.
La technique de la
PCR est répétée
environ 30 cycles
amplification
exponentielle de
la région d’intérêt.
(Plusieurs 100ènes
de millions
230copies)

L'objectif n'est pas que d'amplifier mais aussi

d'analyser la séquence de la région d'intérêt
 Analyse au moyen des sondes
oligonucléotidiques allèle spécifiques
Une sonde oligonucléotidique est une
séquence connue de nucléotides
d’un gène particulier avec un marqueur
radioactif ou tout autre marqueur.
Hybridation de l’ADN avec sonde qui
ne s’hybride qu’avec de l’ADN ayant
une séquence normale ne donne
des infos que dans la recherche
de mutations connues.
 Le séquençage de l’ADN :
détermination de la séquenced’un acide nucléique
 Séquençage : la méthode de Sanger.
Utilisation de ddNTP qui sont
des analogues structuraux des dNTP mais incapables
de réaliser une liaison phosphodiester.
Incorporation au hasard de ddNTP marqués
qui stoppent à chaque fois l’élongation
Recherche d'une mutation dans un gène chez un patient,
par la technique du séquençage direct
 Nouvelles technologies
Les puces à ADN, dont le principe repose sur l’hybridation
à un très grand nombre d’oligonucléotides immobilisés
sur un support miniaturisé,
permettent en particulier,
dans le cadre du diagnostic moléculaire,
de faire du séquençage d’ADN,
ou de détecter simultanément un très grand nombre
de mutations ponctuelles.
Cette technologie très puissante,
susceptible de révolutionner la pratique des laboratoires de génétique
moléculaire,
est encore dans une phase de recherche et de développement,
et reste pour l’instant hors de portée des moyens financiers des
laboratoires publics de diagnostic.
« Micropuces» (Microarrays) =
PUCE à ADN
Etude de l’expression des gènes
à grande échelle
(totalité des gènes)

Comparaison de 2 échantillons

Par exemple:
-2 tissus différents
-1 tissus à 2 stades
-1 tissus +/-traitement
-mutation
 Le Dot Blot
« Dot » signifie tache en anglais.
C’est une technique d’une grande simplicité, le dot blot est utilisé pour
l’étude de petits fragments d’ADN ou des ARN.
Un échantillon est déposé sur un filtre en nylon.
Contrairement au Southern blot,
il n’y a pas d’étape préalable de digestion par des enzymes de restriction
ni d’électrophorèse.
Comme pour la technique de Southern,
dénaturation, hybridation, lavage et autoradiogramme sont
ensuite effectués.
Dans le dot blot on utilise une sonde (oligonucléotide de séquence
connue marqué par exemple avec des radioisotopes).
Ainsi, cette technique permet de savoir si,
dans le mélange des acides nucléiques testés,
il existe une ou plusieurs séquences complémentaires
de celle de la sonde.