COURS DE COLLEGE DES MALADIES INFECTIEUSES

MICROBIOLOGIE – PARASITOLOGIE

Diagnostic biologique du paludisme

01 Mars 2012 Faculté de Médecine de Sousse

Principes des techniques utilisées
dans le diagnostic biologique du
paludisme

Pr.Ag Fathallah Akila

Faculté de Médecine de Sousse

CHU F. Hached de Sousse

01 Mars 2012 Faculté de Médecine de Sousse

 SIGNES D'ORIENTATION

► Orientation clinique:

♣Paludisme: urgence diagnostique et thérapeutique

♣ Toute suspicion clinique de paludisme doit faire

pratiquer en urgence une recherche de Plasmodium avec
un délai de résultat inférieur à 2 heures.

♣ Toute fièvre au retour d’une zone d’endémie est un

paludisme jusqu’ à preuve du contraire
 ► Orientation biologique:

♣ Anémie hémolytique
♣ Hyper leucocytose initiale suivie d’une leuco-
neutropénie au cours des accès répétés
♣ Thrombopénie, parfois majeure
( 10 000 plaquettes/mm3.)
♣ Perturbations biochimiques (cytolyse modérée,
hypoalbuminémie, hypocholestérolémie, hypocalcémie,
hypertriglycéridémie)
Le diagnostic de certitude =
Dg parasitologique direct
L’observation de Plasmodium dans les GR sur un
prélèvement de sang

Le résultat doit être obtenu dans un délai maximal de

2 heures

Le sang prélevé au moment d’un pic fébrile et avant

tout traitement .
 Diagnostic parasitologique direct

But
♣ Mise en évidence du parasite

♣ Identification de l’espèce

♣ Numération (Appréciation de la densité

parasitaire )

♣ Suivi du traitement
Techniques classiques:
Le frottis mince = examen rapide
La goutte épaisse =examen de concentration différé.

Ne nécessite qu'un microscope optique

et des colorants d'un coût modéré
Mais
La qualité du résultat dépend beaucoup de
l'expérience de la personne réalisant cet examen.
 Frottis et goutte épaisse
Se font:

♣ Soit par prélèvement capillaire au bout du doigt,

lobe de l’oreille ou talon (enfant) avec confection
immédiate du frottis et de la goutte épaisse

♣ Soit par ponction veineuse avec prélèvement dans

un tube contenant un anticoagulant ( EDTA ,
l’héparine est à proscrire: déformation des GR )

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Frottis mince (FS)
Avantages
♣ Lecture aisée
♣ Technique rapide  diagnostic d’urgence
♣ Diagnostic d’espèce
Inconvénients
-Peu sensible  problème pour les
parasitémies faibles Seuil = 160 parasites/µl
 Goutte épaisse (GE)
Avantages:
Sensible GE  une concentration parasitaire d’environ
20 fois celle d’un frottis et peut détecter des parasites au
taux extrêmement faible 5 parasites/µl ,
soit une parasitémie de 0.0001%

Inconvénients:
Diagnostic d’espèce difficile
Lente
Technique du frottis mince:

♣ Le frottis doit être fait immédiatement, sinon il

faut conserver le prvt à 4°c (maximum pendant une
nuit car le parasite peut évoluer et même donner
des formes atypiques)

♣ Le frottis doit être mince de manière à ne

comporter qu'une couche cellulaire.

♣ Le frottis, après coloration au Giemsa, sera lu avec

la plus grande attention, à l'immersion, pendant 30
minutes environ, avant de rendre un résultat négatif.
Technique du frottis mince
1- La goutte de sang doit être plus petite la
moitié que celle utilisée pour la goutte épaisse.

2-Appliquer le tranchant d'une autre lame de

verre sur la goutte de sang à un angle de 45°
laisser le sang s'étaler par capillarité tout au long
du tranchant de la lame.

3- pousser la lame en avant tout en la gardant au

même angle.

4-Il est essentiel de pousser la lame d'un seul

coup et sans s'arrêter ni se reprendre; le sang
doit suivre la lame et ne doit pas être poussé par
elle.
5-Un frottis bien fait devrait consister d'une
couche de sang mince et uniforme, sans que la
pointe du frottis ne touche le bord de la lame.
Sécher le frottis immédiatement en agitant la
lame ou en la plaçant devant un ventilateur.
http://en.impact-malaria.com/iml/cx/fr/layout.jsp?cnt=FEB78125-7164-42FC-BB1A-2884CE64DE9
 Technique de la goutte épaisse
1- Dépôt du sang: déposer une grosse
goutte de sang (2 fois le volume utilisé
pour un frottis).

2- Défibrination : pour empêcher la

coagulation, avec le coin d'une autre lame ,
étaler régulièrement le sang sur une surface
de 1 cm de diamètre, en tournant
régulièrement pendant 2 minutes.

3- Sécher 24h à temp ambiante ou 2h à

37°c .

Ne jamais fixer à la chaleur ou à l'alcool

responsable d’une fixation des hématies.
Coloration du frottis
♣Doit être fixé 3 à 5mn dans le méthanol ou le May Grunwald

♣ La coloration se fait par une solution de Giemsa 1/10 à 1/20

(Giemsa : 1 ml, eau tamponnée qsp : 10 ml) pendant 20 mn pour le

Giemsa lent, 10 mn pour le Giemsa rapide.

♣ Rincer à l'eau (neutre) ou tamponnée.

♣ Le pH du colorant doit être légèrement alcalin/ (7.2- 7.4)

Une coloration acide pourrait empêcher la mise en évidence des

parasites.
Coloration de la goutte épaisse
♣ Lyse des GR et libération de l’Hb :recouvrir abondamment la
goutte épaisse du mélange Giemsa : (3 gouttes, 2 ml eau neutre)
(ou tremper la GE dans de l’eau distillée )
Laisser agir pendant 5 à 10 minutes jusqu'à décoloration
complète les parasites, restent intacts sur la lame.

♣ Fixer ensuite à l'alcool méthylique.

♣ Coloration : Giemsa : 1 ml, eau neutre qsp : 10 ml. Laisser agir

20 minutes

♣ Laver à l'eau du robinet

♣ Sécher à l'air.
 Erreurs fréquentes dans la préparation de frottis :

1- Trop de sang: la marge du frottis est perdue et le frottis est trop épais
2- sang coagulé au moment de faire le frottis
3- Contact irrégulier entre la lame d'étalement et le frottis .
4- Lame mal dégraissée
5- Bon frottis
6- Frottis et goutte épaisse sur la même lame

Crédits : illustration tirée d"Essential Malariology" de L. Bruce-Chwatt, 1980

 NUMERATION
Nbr total de GR parasités dans 100 champs
(FS)Parasitémie (%) = x 100
Nbr moyen de GR /champ x 100 champs
GE: nombre de parasites dans 20 µl de sang
Intérêts
♣ apprécier la gravité de la maladie

♣ permet d’apprécier l’efficacité thérapeutique

♣ permet de détecter une éventuelle résistance

 DECLARATION

le paludisme est une maladie à

déclaration obligatoire
 En cas de diagnostic positif :
déclaration au ministère de la santé
(direction régionale de la santé)
 Le diagnostic d’espèce repose :
Sur la morphologie du parasite.

Sur la morphologie du GR qui le porte.

GR de tout âge, taille normale
P.f. + tâches de Maurer.
P.v. et P.o. GR jeunes, taille agrandie
+ granulations de Schüffner
P.o. ovalisation, extrémité frangée

P.m. Vieux GR, taille normale ou

granulations= 0
Plasmodium falciparum

Critères de diagnostic
 Plasmodium falciparum :critères de diagnostic
6- Schizonte et rosace absents
1- Parasite le GR de tout âge ,
ds sang périphérique
taille normale
(16 à 24Nx).
Frottis monotone
2- Trophozoïtes (formes en anneau)
7-Les gamétocytes formes en
bague à chaton (1/4 à 1/5 de
croissant ou faux. ♂
l’hématie) fins et fragiles
gamétocyte mâle: cytoplasme
lilas, extrêmités arrondies
3- Polyparasitisme fréquent.
gamétocyte femelle:
cytoplasme bleu, extrêmités
pointues (corps en croissant) ♀
4- Certains trophozoïtes peuvent
avoir deux grains de chromatine.
8- Des tâches de Maurer
peuvent être présentes.
5- formes marginales ou
appliquées.
http://diagnosticparasitology.weebly.com/malaria.html
Plasmodium falciparum :trophozoïtes en anneau . Frottis
monotone
Plasmodium falciparum : polyparasitisme et formes marginales
Plasmodium falciparum :trophozoïtes en anneau et des tâches de Maurer
Plasmodium falciparum :trophozoïtes en
anneau et des tâches de Maurer
Plasmodium falciparum : polyparasitisme
Plasmodium falciparum : Gamétocyte
Plasmodium falciparum : Gamétocyte mâle
 Plasmodium falciparum : Schizonte absent du sang périphérique :
16 à 24 noyaux
Plasmodium falciparum : goutte épaisse
Plasmodium falciparum : goutte épaisse
Plasmodium vivax
Critères de diagnostic
 Plasmodium vivax :critères de diagnostic
1-Hématies parasitées jeunes augmentées de volume
2-Présence de granulations de Schüffner tardif
3- Frottis panaché avec tous les stades évolutifs

4- Trophozoïte jeune bague à chaton (1/3 à1/4 de l’hématie)

pas de granulations de Schüffner = 0

5- Trophozoïte âgé et g Schüffner +

larges et grossiers
Corps amiboïde

6- Schizonte âgé (rosace)à 16-24 noyaux Schüffner +

7- Gamétocyte arrondis ou ovalaires remplit le cytoplasme ♂

Schüffner rose g mâles
cytoplasme
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bleus g femelles ♀
 Tâches de Maurer Granulations de Schüffner

les granulations
Les tâches de de Schüffner
Maurer sont des représentent des
expansions du cavéoles à la
systeme surface du
membranaire réticulocyte
parasitophore qui
prennent le
colorant
P. vivax : Corps amiboïde granulations de Schüffner
Corps en rosace de P. vivax
 P.vivax: gamétocyte mâle
P.vivax: gamétocyte femelle
Hématie plus grande que la normale
Cytoplasme bleu
Cytoplasme lilas
Pigments malariques
Plasmodium ovale
Critères de diagnostic
 Plasmodium ovale : critères de diagnostic
1- Hématies parasitées jeunes
augmentées de volume parfois frangées

2-Frottis panaché avec tous les stades

évolutifs
3- Granulations de Schüffner d’apparition
précoce dès le stade de trophozoïte jeune
4-Trophozoïte à cytoplasme large et
grossiers 1/3 de l’hématie
5- Schizonte mûr ou rosace à 8-10 noyaux
pigment malarique central
6- Gamétocytes ressemblent à ceux de
P.vivax mais plus petits

♂ ♀
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Plasmodium malariae

Critères de diagnostic
 Plasmodium malariae critères de diagnostic
1- Hématies parasitées âgées de taille normale ou
2- Frottis panaché avec tous les stades évolutifs

3- Pigment malarique +++ dès le stade de trophozoïte

jeune

4-Les formes en bande caractérisent cette espèce dite

en plaque équatoriale Pigment intracytoplasmique
noir en grains volumineux

5-Les schizontes matures peuvent avoir des formes

typiques corps en marguerite à 8 noyaux (max 10)

6- Gamétocytes Sphériques ou ovoïdes

- Pigment grossier et abondant
-Cytoplasme grisâtre ou verdâtre G mâles
bleu intense pour les G femelles
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Plasmodium knowlesi
♣Plasmodium knowlesi Asie du Sud Est (primates)
5ème espèce responsable du paludisme humain

♣ Les throphozoïte jeunes de P. knowlesi

ressemblent à ceux de P.falciparum

♣ Confondu avec P. Malariae :

throphozoïtes âgés svt en plaque équatoriale
abondance du pigment malarique

♣ Mais sa rosace peut comporter jusqu’à 16 noyaux

P.knowlesi throphozoïtes jeunes Idem P. falciparum

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 P.knowlesi throphozoïtes âgés Idem P. malariae

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P.knowlesi Sckizonte Idem P.malariae mais max 16 Nx

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 Artéfacts identifiés comme Eléments infectieux
parasites Dg ≠

Crédits : Wendi Bailey

Crédits : Wendi Bailey, LSTM Crédits : Wendi Bailey, LSTM

Groupe de GR infectés avec des

Plaquette plaquettes pouvant piroplasmes (Babesia)
superposée sur un être pris pour un peuvent être pris pour
globule rouge schizonte des plasmodies
QBC Malaria Test
Quantitative Buffy Coat QBC Malaria®
Recherche de plasmodies par fluorescence directe
Des tubes QBC* en verre (tubes capillaires )sont tapissés d'acridine
orange = fluorochrome qui a une affinité pour le matériel nucléique
Le sang est prélevé dans un tube QBC*
Après centrifugation:
-la sédimentation se fait en plusieurs couches:
*Les plaquettes, * les GB , * les GR parasités * ensuite et enfin les GR
non parasités
-la couche intermédiaire est observée au microscope en UV et les
GR colorés à l’acridine orange sont facilement repérés
 Plaquettes

Lymphocytes et
Monocytes

Granulocytes

Hématies

Tube de Quantitative Buffy Coat (QBC-Test) après centrifugation

 Fluorescence des GB Fluorescence des parasites

Crédits : Courtoisie de Beckton-Dickinson

Avantages:
♣ Technique rapide (6mn entre le prélèvement et la
lecture)
♣ Seuil de détection 10 parasites /µl
Inconvénients :
♣ Diagnostic d’espèce difficile
♣ Nécessite un appareillage et des réactifs coûteux:
◘Tubes QBC* ,
◘ Microcentrifugeuse ,
◘ Microscope optique standard recevant latéralement
une fibre optique alimenté par un UV parlens®
◘ Porte-tube adaptateur sur j'objectif

♣ Demande une certaine expérience.

 Autres techniques de diagnostic
♣ La recherche d’antigènes spécifiques = technique des
bandelettes

♣ La PCR

♣ La sérologie
Détection d’antigènes =
Tests de diagnostic rapide (TDR)

08/10/2012 68
 Détection d’antigènes
Tests de diagnostic rapide par chromatographie sur membrane de
nitrotrocellulose
♣Les Ag detectés :

- l'Histidine Rich Protein 2 (HRP-2), glycoproteïne spécifique de

P. falciparum (Parasight F® et ICT Malaria Pf® )

- pLDH (Plasmodium lactate déshydrogénase) enzyme glycolytique produite

par les 4 espèces (OptiMal ®).

- L’Aldolase ICT Malaria Pf/Pv®

♣Des anticorps monoclonaux dirigés contre ces enzymes sont fixés sur la mbr

♣Après la mise en contact avec le sang, la présence de l'antigène est visualisée

par action d'un deuxième anticorps révélateur.

♣Réponse rapide (- de 15 mn), visuelle sous forme d'un trait sur la bandelette
et ne nécessite donc pas de compétence particulière.
TDR
Très rapide mais sa sensibilité et sa spécificité sont moins
bonnes que la technique de référence
faux (-) quand parasite est en quantité insuffisante
faux (+) test reste (+) jusqu'à 3 à 4 semaines après un accès
de paludisme correctement traité

Il ne faut donc jamais se fier au résultat de cette technique

utilisée seule, sans frottis sanguin – goutte épaisse associé.
Parasight F® et ICT Malaria Pf® ne mettent en
évidence que P. falciparum (sensibilité: 93%;
spécificité:99%)
les 4 espèces peuvent être retrouvées avec le test
OptiMal ®. Ce dernier présente l'intérêt d'une
possibilité de suivi (l'enzyme n'étant présente que chez
le parasite vivant).

OptiMal assay Result

Méthodes moléculaires
►Les techniques d’amplification génomique pour la détection
des plasmodiums sont nombreuses :
♣PCR classique ,
♣ Nested-PCR,
♣ PCR avec marquag à la digoxigénine (PCR-DIG) ,
♣ PCR multiplex,
♣ PCR en temps réel (Real Time PCR) , etc….

►Les cibles d’amplification sont variables les plus utilisées

♣ le gène de la grande sous-unité de l’ARN ribosomal est
conservé chez toutes les espèces plasmodiales
♣ le gène répété codant pour la petite sous-unité 18s
de l'acide ribonucléique (ARN) ribosomal
♣ le gène du circumsporozoïte
Apport de la PCR dans le diagnostic du paludisme

♣ LA PCR est plus précoce et plus sensible / tech conventionnelles Gain de

6 % de sensibilité

♣ La PCR indiqué si contexte clinique évocateur et examens mic négatifs

♣ Quand l’identification d’ espèce a été difficile sur le frottis sanguin

♣ Elle est plus performante pour mettre en évidence des associations d'espéces
possible par PCR quantitative ou PCR multiplex

♣ les premières études laissent espérer que la détermination de la charge

parasitaire par PCR quantitative puisse devenir un critère d'évaluation
de la gravité du paludisme et de l'efficacité du traitement

Fabre et al. Parasitology 2004 15-21 , Lee et al., 2002, P. Minodier J.Ped .puériculture 2005 386- 388
Morassin et al Am. J.Trop.Med.Hyg.2002 503-8 , Sophie Cassaing et al Revue Française des Laboratoires, mars 2003, No 351 63-5
SEROLOGIE
 SEROLOGIE
♣ Elle n'a pas d'intérêt pour un diagnostic d'urgence.

♣La sérologie a un intérêt surtout épidémiologique (évaluer

l’endémicité d’une région donnée)

♣ Paludisme viscéral évolutif, au cours duquel le taux

d'anticorps est très élevé.
♣ Suivi de l’efficacité d’un programme de lutte anti-palustre

♣ Dépistage des donneurs de sang et prévenir un paludisme

transfusionnel
♣ l'IFI en utilisant comme support des hématies
parasitées seuil > à 1/20

♣ ou ELISA.

ELISA

IFI
 CONCLUSION

♣La méthode de référence pour le diagnostic du

paludisme demeure encore l'examen
microscopique d'un frottis-goutte épaisse coloré
par le Giemsa.
♣Les TDR peuvent aider dans le dépistage
♣ La PCR est très performante mais n’est pas
accessibles à tous