Empreinte Dnase Gene Raporter

Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines et
acides nucléiques
Introduction
ARN
A
Polymérase
répresseur
Opérateur Séquence protéique

Promoteur
B
Inducteur
répresseur
ARN
Polymérase
Opérateur Séquence protéique
Promoteur
Introduction
Les régions régulatrices de l’activation des gènes: l’expression des

gènes est régulée par un ensemble de facteurs activateurs et inhibiteurs
de la transcription.
L’interaction de ces facteurs (protéines) avec l’ADN est site spécifique.
Objectif: Présentation de quelques techniques permettant l’étude des

interactions entre protéines et ADNs.
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Cette technique sert à l’identification des sites de liaison des protéines

régulatrices sur la molécule d’ADN génomique.
Permet de déterminer les positions exactes de liaison des protéines à

l’ADN génomique.
Etapes de la méthode Protéines liant l’ADN
ADN
1 Crosslink (1% paraformaldehyde)
xxx xxx xxx

xxx
2 Fragmentation de l’ADN par sonication
xxx xxx xxx

xxx
Fragments ~200 nucléotides
Etapes de la méthode
Fragments ~200 nucléotides
xxx xxx xxx
xxx
Précipitation de l’ADN liant la protéine

3
d’intérêt avec un anticorps spécifique
xxx xxx xxx

xxx
4 Reverse cross-link (incubation O.N. à 65°C)
xxx xxx
5 Purification des fragments d’ADN

xxx xxx
PCR, séquençage des fragments
La technique des gènes rapporteurs
Gènes rapporteurs:
C’est une technique qui permet la détection ou la mesure de l’intensité

de l’expression d’un gène.
Consiste à construire un vecteur rapporteur contenant un gène

rapporteur sous la dépendance d’un promoteur constitué d’une
séquence régulatrice.
Les gènes rapporteurs peuvent correspondre à des protéines

fluorescentes ou bien des enzymes capable de convertir des substrats
invisibles vers des produits luninescents ou bien colorés.
Principe:
Transfection de cellules
Promoteur Analyse de l’expression du

gène rapporteur
Vecteur rapporteur (fluorescence, luninescence…)
Le gène rapporteur:
Le gène rapporteur est un gène témoin codant pour une protéine
facilement détectable et quantifiable (émission de fluorescence ou de
luminescence). Il est largement utilisé pour étudier et déterminer les
activités des régions promotrices de divers gènes.
Exemple: Luc Luciférase, b-Gal: b Galactosidase, GFP…etc.

Le gène rapporteur code pour une protéine révélatrice de la présence

de l’interaction entre une protéine régulatrice avec une ou plusieurs
séquences promotrices étudiées.
Etudier le rôle des interactions protéines ADN dans la régulation

spatio-temporelle de l’expression génique:
Caractériser les séquences régulatrices qui contrôlent l’expression du

gène étudié.
Déterminer le compartiment cellulaire abritant l’expression et

l’activité du gène (noyau, cytosol, surface cellulaire…etc.).
Les étapes de la technique:
1- Amplification de la région promotrice à étudiée (région régulatrice).
2- Insertion de la séquence de la région promotrice dans un vecteur

rapporteur contenant le gène rapporteur.
3- Transfection des cellules eucaryotes/procaryotes et expression du

gène rapporteur après induction du promoteur.
4- Mesure et analyse de l’expression du gène rapporteur dépendante du

promoteur.
Exemples de gènes rapporteur: Exemple-1 : Le gène Luc codant pour la Luciférase qui
émet de la lumière jaune.
Stimulant
Activation
promoteur Gène de la Luciférase

Séquence étudiée Gène rapporteur
Luciférase
Luciférine + ATP + O2 Oxyluciférine + AMP + PPi + CO2 + Lumière

Mg2+
- Luc + Luc Luciole: firefly

Exemple2: Le gène b-Gal codant pour la Galactosidase qui transforme X gal en Galactose et
émission d’une couleur bleue
5-bromo-4-chloro-3-hydorxyindole
Hydrolyse par la b-
galactosidase
+H2O
X-gal
Oxydation et dimérisation
galactose
spontanées
5,5’ –dibromo-4, 4’-dichloro-indigo

(produit insoluble de couleur bleue)
Quelques exemples de gènes rapporteur:
Exemple3 : Le gène GFP codant pour la Green fluorescent protéine qui possède une
fluorescence verte.
Méduse
Clones bactériens exprimant la GFP
La création de protéines de fusion par fusion de la séquence du gène

d’intérêt à la séquence de la GFP (ou protéines dérivés) permet
l’étiquetage de la protéine d’intérêt afin d’accéder à sa localisation
instantanée dans les cellules vivantes.
Imagerie sur cellules vivantes
mCherry
GFP
Transport antérograde
t=0 s t=7 s t=15 s t=23 s

Méthodes d’analyse de l’interaction des facteurs de transcription avec
l’ADN par la technique : Empreinte à la Dnase I
Empreinte à la Dnase I
L’interaction des facteurs de transcription avec l’ADN est séquence

spécifique.
L’empreinte à la Dnase I est une technique simple, sert à la
détermination des sites de liaison d’une protéine (facteur de
transcription) sur l’ADN.
Permet de déterminer la taille approximative du site d’interaction, de
quantifier le nombre de sites d’interaction entre un fragment ADN avec
une protéine régulatrice.

Étapes de la méthode:
1- Amplification de la région régulatrice à étudier (100-300 pb).
2- Marquage radioactif p32 sur une extrémité d’un des deux brins ADN.
3- Interaction séquence promotrice et la protéine à analysé.
4- Digestion partielle à la DNase I de telle sorte à avoir 1 site de coupure

par brin.
5- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide.
6- Southern Blot et révélation par autoradiographie.

1 brin marqué au P32

Protéine
Contrôle
(FT)
Digestion Dnase I Digestion Dnase I
Fragments générés Fragments générés

marqués au P32 Gel d’électrophorèse
marqués au P32
Protéine (µg/ml) 0 2 6 8
Empreinte-1
empreinte
Empreinte-2
Cas de 2 sites de fixation:
Empreinte-1
Empreinte-2
Applications:
Détection de protéines fixant l’ADN.
Analyse des séquences d’ADN au niveau des promoteurs et régions régulatrices.
Détection de protéines liant l’ADN à partir des extraits cellulaire.

La technique: Retard sur gel
= Electro Mobility Shift Assay (EMSA)
C’est une technique in vitro qui permet de mettre en évidence la

formation d’un complexe entre une séquence ADN et une protéine.
Elle est basée sur l’électrophorèse de ce complexe sur un gel de poly-

acrylamide dans des conditions non-dénaturante.
La technique : Retard sur gel
Étapes de la méthode:
1- Marquage du fragment d’ADN double brin (appelé sonde). Le

marquage peut être radioactif ou fluorescent.
2- Incubation du fragment ADN avec un extrait de protéines nucléaires.

Pour le contrôle de l’expérience, un fragment d’ADN seul est incubé
dans le tampon.
3- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide avec conditions non-

dénaturantes.
4- Southern Blot et révélation par autoradiographie, ou bien lecture du

gel avec un lecteur de fluorescence.
Exemple de Résultat :
Extraits nucléaires des Extraits nucléaires des cellules

cellules non-activées - activées
+
Sonde + NF-B
Sonde seule
Extraits nucléaires des Extraits nucléaires des cellules

cellules non-activées activées (expression génique)
- +
Sonde + NF-B ?
Sonde seule
La liaison du facteur de transcription à la séquence ADN induit un retard dans la

migration de la bande d’ADN pendant l’électrophorèse.
La technique : super Retard sur gel
Extraits nucléaires Extraits nucléaires Extraits nucléaire des

des cellules non- des cellules activées cellules activées
activées + un anticorps anti-FT
- + +
Sonde + NF-B + anti NF-B
Sonde + NF-B
Sonde seule

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Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines et

Opérateur Séquence protéique

Les régions régulatrices de l’activation des gènes: l’expression des

Objectif: Présentation de quelques techniques permettant l’étude des

Cette technique sert à l’identification des sites de liaison des protéines

Permet de déterminer les positions exactes de liaison des protéines à

1 Crosslink (1% paraformaldehyde)

xxx xxx xxx

2 Fragmentation de l’ADN par sonication

xxx xxx xxx

Précipitation de l’ADN liant la protéine

xxx xxx xxx

4 Reverse cross-link (incubation O.N. à 65°C)

5 Purification des fragments d’ADN

C’est une technique qui permet la détection ou la mesure de l’intensité

Consiste à construire un vecteur rapporteur contenant un gène

Les gènes rapporteurs peuvent correspondre à des protéines

Promoteur Analyse de l’expression du

Le gène rapporteur est un gène témoin codant pour une protéine

facilement détectable et quantifiable (émission de fluorescence ou de

luminescence). Il est largement utilisé pour étudier et déterminer les

activités des régions promotrices de divers gènes.

Exemple: Luc Luciférase, b-Gal: b Galactosidase, GFP…etc.

Le gène rapporteur code pour une protéine révélatrice de la présence

Etudier le rôle des interactions protéines ADN dans la régulation

Caractériser les séquences régulatrices qui contrôlent l’expression du

Déterminer le compartiment cellulaire abritant l’expression et

Les étapes de la technique:

1- Amplification de la région promotrice à étudiée (région régulatrice).

2- Insertion de la séquence de la région promotrice dans un vecteur

3- Transfection des cellules eucaryotes/procaryotes et expression du

4- Mesure et analyse de l’expression du gène rapporteur dépendante du

promoteur Gène de la Luciférase

Luciférine + ATP + O2 Oxyluciférine + AMP + PPi + CO2 + Lumière

- Luc + Luc Luciole: firefly

5,5’ –dibromo-4, 4’-dichloro-indigo

Clones bactériens exprimant la GFP

La création de protéines de fusion par fusion de la séquence du gène

t=0 s t=7 s t=15 s t=23 s

L’interaction des facteurs de transcription avec l’ADN est séquence

L’empreinte à la Dnase I est une technique simple, sert à la

détermination des sites de liaison d’une protéine (facteur de

transcription) sur l’ADN.

Permet de déterminer la taille approximative du site d’interaction, de

quantifier le nombre de sites d’interaction entre un fragment ADN avec

une protéine régulatrice.

1- Amplification de la région régulatrice à étudier (100-300 pb).

3- Interaction séquence promotrice et la protéine à analysé.

4- Digestion partielle à la DNase I de telle sorte à avoir 1 site de coupure

5- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide.

6- Southern Blot et révélation par autoradiographie.

1 brin marqué au P32

Fragments générés Fragments générés

Détection de protéines fixant l’ADN.

Analyse des séquences d’ADN au niveau des promoteurs et régions régulatrices.

Détection de protéines liant l’ADN à partir des extraits cellulaire.

= Electro Mobility Shift Assay (EMSA)

C’est une technique in vitro qui permet de mettre en évidence la

Elle est basée sur l’électrophorèse de ce complexe sur un gel de poly-