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    sur 3

    PCR

    Les premiers protocoles pour les réactions de polymérisation en chaîne utilisaient le fragment
    Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli pour la réaction de synthèse d'ADN.

    Comme cette enzyme est inactivée aux températures utilisées pour dénaturer l'ADN, chaque cycle de
    synthèse nécessitait l'addition d'un aliquot frais d'enzyme. Le problème fut résolu à partir de 1987
    par l'utilisation d'une ADN polymérase thermostable (Taq I ADN polymérase) purifiée à partir de la
    bactérie Thermus aquaticus qui vit dans des sources chaudes à 70°C. Cette polymérase fonctionne de
    manière optimale à 72°C et résiste à une incubation prolongée à 95°C.

    Principe de la PCR

    - Synthèse d’un fragment d’ADN encadré par deux amorces. Ce fragment est synthétisé un
    grand nombre de fois pour obtenir une quantité importante d’ADN.
    - En contrôlant la température de la réaction on effectue une succession de cycles de trois
    étapes.

    La température d'hybridation choisie pour une PCR est généralement égale ou supérieure de 2 à 3°C
    à la température de fusion de l'oligonucléotide (en anglais, Tm ou melting temperature).

    Une première manière de calculer cette température est la suivante:

    Tm = 2°C x (nombre de bases A, T) + 4°C x (nombre de bases G, C)

    Cette formule est valable pour des oligonucléotides longs de 11 à 20 nucléotides et dans 1 M NaCl.

    ex. : oligo CTC.AGA.ACC.ACC.GAG.CCC

    Tm = 2°C x 6 A,T = 48 + 12+ 4°C x 12 G,C = 60°C

    Pour des oligonucléotides plus longs que 20 bases, on peut utiliser la formule suivante :

    Tm = 16,6 log10(M) + 0,41 (Pgc) + 81,5 - Pm -B/L -0,65 (Pf)

    n Pour effectuer plusieurs synthèses successives, il faut que la polymérase supporte l’étape de
    dénaturation (94°C).

    n Origine des polymérases thermostables

    n Dénaturation (94°C)

    n Les brins d’ADN se séparent

    n Hybridation des amorces (30-65°C)

    n Les amorces s’hybrident de façon spécifique sur l’ADN matrice

    n Synthèse (72°C à cause de l’origine des polymérase)

    n l’ADN est synthétisé à partir des amorces


    Le mélange réactionnel de la PCR contient :

    Un tampon salin

    L’ADN matrice

    Les amorces

    Les nucléotides (dNTP)

    Ions Mg 2+

    Des additifs

    A chaque cycle (dénaturation/hybridation/synthèse), on multiplie par deux le nombre de molécule


    d’ADN dans la réaction

    Après 35 cycles, à partir d’une seule molécule matrice, il y a théoriquement 2 34 molécules soit
    environ 17 000 000 000. Car les molécules produites servent de matrice au cycle suivant.
    Début 0 0 1

    Cycle 1 0 1 1

    Cycle 2 1 2 1

    Cycle 3 4 3 1

    Cycle 4 11 4 1

    Cycle 5 26 5 1

    Cycle 10 1010 10 1

    Cycle 11 2036 11 1

    Cycle 20 1048555 20 1

    Cycle 30 1073741793 30 1

    Le rendement d'une PCR est élevé.

    Pratiquement, en partant de 1 pg (10 -6 µg) d'ADN, on obtient 0,5 à 1 µg de produit après 30 cycles
    d'amplification.

    On évalue la taille du produit PCR obtenu par électrophorèse sur gel d'agarose, suivie d'une
    coloration au bromure d'éthidium. La taille du segment amplifié est généralement de 0,2 à 2 kb, mais
    peut aller jusqu'à 15 kb.

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