FACULTÉ DES SCIENCES

DOMAINE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES

MENTION PHYSIOLOGIE ANIMALE,
PHARMACOLOGIE, COSMÉTOLOGIE

Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie

LPGPC

MÉMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MASTER

OPTION PHARMACOLOGIE

ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04

SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE COCHON D’INDE

Présenté par
AYADE Mohamed Houmadi
le 18 Août 2017
Devant le JURY composé de :

Président : M. RANDIMBIVOLOLONA Fanantenanirainy Pr Titulaire

Rapporteur : Mme RANDRIANAVONY Patricia Pr
Examinateur : M. RAFATRO Herintsoa Pr Titulaire
Nom : AYADE

Prénoms : Mohamed Houmadi

Adresse : lot III K 3 A Ankaditoho

E-mail : [email protected]

Téléphone : 032 62 755 60

ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04

SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE COCHON D’INDE

Promotion : 2016-2017

Rapporteur : Professeur RANDRIANAVONY Patricia

Laboratoire : Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de

Cosmétologie.

B.P : 8357

E-mail : [email protected]

Faculté des Sciences

Université d’Antananarivo
 REMERCIEMENTS

Au terme de la réalisation de ce mémoire, je tiens à exprimer ma profonde gratitude :

 A Monsieur le Professeur Titulaire RANDIMBIVOLOLONA Fanantenanirainy.

Permettez-nous de vous remercier cher maître de la confiance que vous avez faite en
nous acceptant à vos côtés. C’est un honneur pour nous d’être cité parmi vos élèves.
Veuillez accepter le témoignage de notre sincère et profonde gratitude.

 A Madame le Professeur RANDRIANAVONY Patricia.

Nous avons beaucoup admiré vos immenses qualités humaines et scientifiques tout au
long de ce travail. Vous avez cultivé en nous, le sens du travail bien fait. Trouvez ici,
cher maître, l’expression de notre profonde gratitude et de notre indéfectible
disponibilité.

 A Monsieur RAFATRO Herintsoa.

Professeur Titulaire d’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique.
Cher Maître, c’est un grand plaisir que vous nous faites en acceptant de siéger à ce jury
malgré vos multiples occupations. Permettez-nous de vous exprimer notre profonde
gratitude et notre grand respect.

 A Monsieur QUANSAH Nathaniel.

Pour son précieux aide, conseils et générosité tout au long de ce travail. Je tiens à vous
exprimer mes très vifs remerciements.

 A tout le corps enseignant de la Mention Physiologie Animale, Pharmacologie et

Cosmétologie de la Faculté des Sciences d’Antananarivo.
Pour avoir déployé leurs efforts pour notre formation. C’est l’occasion de vous
remercier pour la qualité de vos encadrements, de vos conseils, pour votre générosité et
la disponibilité dont vous avez toujours fait preuve. Recevez ici nos sincères
remerciements.

 A ma famille, j’aurais aimé que vous soyez là en ce moment mémorable qui voit
l’aboutissement et la réalisation de tous les travaux consentis. Ce travail est le fruit de
votre patience, vos sacrifices et vos bénédictions. Je vous remercie à tous aujourd’hui
pour vos conseils, encouragements et aides depuis le début de mes études.
 TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................... i

LISTE DES FIGURES ............................................................................................................... ii

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ............................................................................ iii

I. INTRODUCTION .............................................................................................................. 1

II. MATÉRIELS ET MÉTHODES ......................................................................................... 6

A. PARTIE CHIMIE ........................................................................................................ 6

1. Préparation de l’extrait ............................................................................................. 6

2. Criblage phytochimique ........................................................................................... 8

B. PARTIE PHARMACOLOGIE.................................................................................. 10

1. Animaux d’expérimentation .................................................................................. 10

2. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale ..................................... 10

3. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale ....................................... 11

4. Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine ...................................... 12

C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS ............................................... 13

III. RÉSULTATS ................................................................................................................ 14

A. PARTIE CHIMIE ...................................................................................................... 14

B. PARTIE PHARMACOLOGIE.................................................................................. 15

1. Effet de l’extrait MOHA-04 sur la sécrétion intestinale ........................................ 15

2. Effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale........................................................ 15

3. Effet de MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine .................................................... 16

IV. DISCUSSION ............................................................................................................... 18

V. CONCLUSION ................................................................................................................ 21

RÉFÉRENCES ......................................................................................................................... 22
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I. Les tests utilisés pour détecter les différentes familles chimiques présentes dans
l’extrait MOHA-04 ................................................................................................................... 9

Tableau II. Composition de la solution de Tyrode dans 1 litre d’eau distillée ...................... 11

Tableau III. Familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04..........14

i
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Différentes étapes de l’extraction de MOHA-04 ..................................................... 7

Figure 2. Variation du volume de fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium

administré par voie orale chez les témoins et les cochons d’Inde traités avec l’extrait MOHA-
04, administré par voie orale, aux doses 300 et 600 mg/kg .................................................... 15

Figure 3. Relâchement du duodénum, précontracté avec de l’acétylcholine, en présence de

l’extrait MOHA-04 injecté dans le bain d’une manière cumulative ........................................16

Figure 4. Variation de la contraction du duodénum isolé de cochon d’Inde provoquée par

l’acétylcholine administrée dans le bain de manière cumulative, en absence et présence de
l’extrait MOHA-04 aux concentrations de 0,125 et 0,250 mg/ml dans le bain ....................... 17

ii
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS

AMPc : Adénosine MonoPhosphate Cyclique.

°C : degré Celsius

CE50 : concentration donnant 50 % d’effet.

cm : centimètre

coll. : collaborateurs.

g : gramme.

e.s.m : écart type réduit.

kg : kilogramme.

LPGPC : Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie.

MgSO4 : Sulfate de Magnésium.

min : minutes.

ml : millilitre.

mM : millimole.

M : mole.

mg/kg : milligramme par kilogramme.

ml/kg : millilitre par kilogramme.

n : nombre d’animaux.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

P : probabilité.

PNLMD : Programme National de Lutte contre les Maladies Diarrhéiques.

% : pourcentage.

VIP : Peptide Vasoactif Intestinal.

𝑥̅ : moyenne.

iii
INTRODUCTION
I. INTRODUCTION

La diarrhée présente une situation alarmante qui a conduit l’OMS à mettre en place en 1980, le
Programme National de Lutte contre les Maladies Diarrhéiques (PNLMD), dont le but est de
réduire la morbidité et la mortalité infantile. En effet, chaque année, on compte 1,7 milliards
de cas de diarrhée dans le monde (OMS, 2017). C’est la troisième cause de décès provoqué par
des maladies infectieuses, tout âge confondu, à l’échelle mondiale (OMS, 2011 ; ASSOGBA
A.L et coll., 2012), et la 5ème cause de décès prématuré, tuant des jeunes enfants à un âge très
précoce (OMS, 2014). Par ailleurs, c’est la deuxième cause de mortalité chez l’enfant de moins
de cinq ans, avec 525 000 de décès par an (OMS, 2017). Madagascar n’est pas épargné par ce
fléau, avec une prévalence particulièrement importante chez les bébés de 6 à 11 mois, qui
représente 15 % en moyenne (ANDRIANJAKA J.C. et RAKOTONDRABE F.P., 2010). Cette
prévalence très élevée est liée à l’insalubrité, à l’absence de système d’assainissement de l’eau
et au manque d’hygiène qui sont à l’origine de 88 % des maladies diarrhéiques (PRÜSS-
USTÜN A. et coll., 2008). Selon le Ministère de l’eau et de l’Assainissement, seuls 42,63 % de
la population ont accès à de l’eau potable à Madagascar, jusqu’en 2010 (MINISTERE de
l’EAU, 2011).

La diarrhée est caractérisée par des selles molles, voire liquides, dont la quantité et/ou la
fréquence est anormalement élevée (BRYCE J. et coll., 2005). C’est le résultat d'une
perturbation des mouvements d'eau et d’électrolytes au niveau de l’intestin (GUANDALINI S.
et VAZIRI H., 2010). En effet, l’intestin joue un rôle majeur dans le maintien de l’équilibre
hydro-électrolytique de l’organisme, en gardant l’équilibre entre la réabsorption et la sécrétion
hydro électrolytique (MIN/SA, 1994). Il existe un flux bidirectionnel constant d’eau et d’ions
à travers la muqueuse intestinale : l’absorption et la sécrétion, et la diarrhée est due à la baisse
de la réabsorption par rapport à la sécrétion, ou à l’augmentation de la sécrétion. L’absorption
a lieu au niveau des cellules des villosités, et la sécrétion, au niveau des cellules de crypte en
grande partie (BINDER H.J. et REUBEN A., 2009). L’absorption de sodium est assurée par les
entérocytes par une pompe Na+-K+/ATPase située au niveau des membranes basolatérales des
cellules de cryptes et des villosités intestinales. L’absorption de Na+ entraine celle de l’eau ;
par ailleurs, la sécrétion active de Cl- contribue à la sécrétion d’eau (BINDER H.J., 2009).

Dans les conditions physiologiques normales, environ 8 litres d’eau arrivent au niveau de
l'intestin grêle supérieur ; 2 litres proviennent des aliments ingérés, et les 6 litres restants sont
issus des sécrétions salivaires, gastriques, biliaires et pancréatiques. La grande partie de ce

1
liquide est réabsorbée avant d’atteindre la partie distale de l’intestin grêle, de telle sorte que
seulement environ 1 litre de liquide atteint le côlon (DEVROEDE G.J. et PHILLIPS S.F., 1969).
Ensuite, le côlon réabsorbe la presque totalité du reste, de telle sorte que l’eau contenue dans
les matières fécales soit inférieure à 200 ml (DEBONGNIE J.C. et PHILLIPS S.F., 1978). La
diarrhée résulte, soit de l’augmentation de la sécrétion, soit de la baisse de la réabsorption
(FIELD M., 2003).

Selon son origine, la diarrhée peut être sécrétoire, osmotique, motrice ou médicamenteuse
(GUANDALINI S. et VAZIRI H., 2010). Les diarrhées sécrétoires sont causées par la sécrétion
excessive de l’hormone Peptide Vasoactif Intestinal (VIP), qui stimule la sécrétion excessive
d’eau et d’électrolytes au niveau de la muqueuse intestinale (PHILLIPS S.F., 1972).
Généralement, ce genre de diarrhée est causé par des agents pathogènes qui affectent l’intestin
grêle. Ils adhèrent à la muqueuse et détruisent celle-ci, perturbant le processus d’absorption et
de sécrétion au niveau de la membrane de l’entérocyte, à l’origine d’une sécrétion active
(FIELD M., 2003). Quant aux toxines produites par divers agents pathogènes tels que
Staphylococcus, Escherichia coli, et Vibrio cholorae ; elles altèrent la structure de la paroi
intestinale, provoquant une perturbation des échanges osmotiques au niveau de la lumière
intestinale.

Quant à la diarrhée osmotique, elle est due à la présence de solutés non absorbables ou peu
absorbables dans l’intestin, tels que l’alcool, le mannitol ou le sorbitol, le magnésium, les
sulfates et les phosphates. Ces solutés exercent une force osmotique, et attirent l’eau vers la
lumière intestinale, et secondairement d’autres ions. Par exemple, la malabsorption de glucides
peut provoquer une diarrhée osmotique. Ceci se produit lorsqu’il existe une carence ou une
défaillance des enzymes responsables de la coupure des polysaccharides en glucose, fructose et
galactose, des sucres absorbables au niveau de la muqueuse intestinale. Non hydrolysés, les
entérocytes sont incapables d’absorber ces glucides qui stagnent dans la lumière intestinale et
retiennent de l’eau (FIELD M., 2003 ; HAMMER H.F. et coll., 1989).

Par ailleurs, les mouvements d’eau et de solutés dans l’intestin dépendent de la motilité
intestinale, qui assure la progression du contenu intestinal. Une motilité accrue accélère
l’évacuation du contenu intestinal, augmentant la fréquence d’émission de selles ; en plus elle
diminue le temps de contact entre le contenu luminal et l’épithélium, ce qui diminue sa capacité
d’absorption, et il en résulte une diarrhée motrice (FELDMAN M. et coll., 2010). Cette
motricité intestinale est régulée par des neurotransmetteurs comme l’acétylcholine et la

2
sérotonine, et leur effet exagéré peut être à l’origine d’une diarrhée motrice. Les troubles du
contrôle nerveux (du cerveau aux nerfs viscéraux) et l’intestin sous forme de nocivité viscérale
et de motilité anormale causée par ces neurotransmetteurs, peuvent être à l’origine de la diarrhée
motrice (GRUNDY D., 2002 ; CAMILLERI M., 2002).

Enfin, la diarrhée peut être l’effet secondaire de médicaments ; les médicaments chimio-
thérapeutiques diminuent la prolifération de l’entérocyte et par conséquent, la réabsorption
intestinale. Quant aux antibiotiques, ils peuvent altérer la flore bactérienne dans le côlon,
diminuant ainsi la réabsorption de glucose à l’origine d’une diarrhée de mal absorption, de type
osmotique. Certains médicaments comme le lactulose, ne sont pas réabsorbés au niveau de
l’intestin, et provoquent également de la diarrhée osmotique. D’autres médicaments comme la
théophylline, augmentent l’AMPc intracellulaire au niveau de la paroi intestinale, et provoquent
ainsi une hypermotilité intestinale aboutissant à une diarrhée motrice (FELDMAN M. et coll.,
2010).

Ces perturbations entrainent une perte en eau et en électrolytes, et nécessitent un traitement

selon le type de diarrhée en question. Les Solutions de Réhydratations Orales sont indiquées et
recommandées par l’OMS pour rétablir l’équilibre hydrominéral (SOCIÉTE CANADIENNE
DE PÉDIATRIE, 2003 ; TURCK D., 2007). Par ailleurs, différents traitements sont disponibles
pour limiter cette perte en eau et en électrolytes, comme les anti-sécrétoires, les ralentisseurs
du transit intestinal, les astringents et les adsorbants, les probiotiques et les antibiotiques.

Les anti-sécrétoires intestinaux sont destinés à diminuer la sécrétion excessive d’eau et

d’électrolytes dans la lumière intestinale. Par exemple, le Racécadotril (TIORFAN©) qui inhibe
l’enképhalinase ; une enzyme responsable de la dégradation des enképhalines (des peptides
opioïdes endogènes). Ces enképhalines stimulent les récepteurs opioïdes δ de l’intestin et
diminuent l’AMPc intra cellulaire qui régule l’ouverture des canaux à chlorure, réduisant la
sécrétion de cet ion (SCHWARTZ J.C., 2000).

Tandis que les ralentisseurs du transit intestinal comme le Lopéramide (IMODIUM©), qui est
en même temps un antisécrétoire, inhibe la sécrétion d’eau et d’électrolytes au niveau de
l’entérocyte et diminue le péristaltisme. La fixation du Lopéramide sur les récepteurs opioïdes
δ de l’entérocyte diminue la production de l’AMPc, responsable de l’ouverture des canaux à
chlorure. L’inhibition de l’ouverture de ces canaux réduit l’hypersécrétion de l’ion Cl- et par
conséquent la sécrétion d’eau. Quant au péristaltisme, le Lopéramide se fixe aux récepteurs
opioïdes µ de l’entérocyte, diminuant l’activité du plexus myentérique, système nerveux

3
contrôlant le péristaltisme, innervé lui-même par l’acétylcholine. Ceci diminue ainsi la motilité
intestinale et augmente le temps de contact entre le bol alimentaire et la muqueuse intestinale,
augmentant la réabsorption d’eau (HUIJGHEBAERT S. et coll., 2003).

Les adsorbants, tels que la siméticone©, l’attapulgite© (smectite dioctaédrique), le kaolin

(silicate d’aluminium naturel) et la pectine ont toujours été utilisés pour traiter la diarrhée. Ils
adsorbent les toxines dans la lumière intestinale, les bactéries et les métabolites produits par
celles-ci, des substances pouvant altérer la muqueuse intestinale. La neutralisation de ces agents
permet de garder l’intégrité de la paroi intestinale afin d’éviter une perte de liquide. Par ailleurs,
les astringents comme les tanins resserrent la paroi intestinale. Ils dénaturent les protéines de la
paroi intestinale, la rendant plus résistante et l’empêchant d’activer la sécrétion de liquide via
des récepteurs entérocytaires, diminuant ainsi la sécrétion d’eau et d’électrolytes. Les
adsorbants et les astringents ont également une activité antidiarrhéique en neutralisant les
agresseurs microbiologiques ou chimiques (LEEMANS L., 2013 ; RATEAU J.G. et coll.,
1982).

Quant aux probiotiques, ce sont des préparations à base de micro-organismes qui modifient la
microflore de l’intestin en abaissant le pH du côlon par la production d’acides gras à chaînes
courtes. Ces substances génèrent des composants antimicrobiens et des antitoxines contre
d’autres bactéries, améliorant ainsi la fonction barrière de la muqueuse intestinale, à l’origine
de la diminution de l’hypersécrétion d’eau (GOLDENBERG J.Z. et coll., 2009 ; VALERIE M.
et SOCIÉTE CANADIENNE DE PÉDIATRIE, 2012).

Malgré la panoplie de molécules antidiarrhéiques existant sur le marché, beaucoup de gens

utilisent les plantes médicinales pour soigner la diarrhée (JEAN-PIERRE N., 2013). Au Maroc,
les gens mangent les fruits, frais ou secs de Rhus pentaphylla (ANACARDIACEAE) pour lutter
contre la diarrhée (BELLAKHDAR J., 1997). En Côte-d’Ivoire, le décocté de l’écorce et du
tronc d’Adansonia digitata (BOMBACACEAE) est également utilisé contre la diarrhée (KONE
M.W. et coll., 2002), alors qu’au Brésil, ils utilisent le décoté de la racine de Faramea
guianensis (RUBIACEA) (DOLIVO A., 2013). A Madagascar, ils utilisent le décocté de la
racine de l’Adansonia suarezensis (MALVACEAE) ou des feuilles de Psidium guajava
(MYRTACEAE), ou le décocté de la plante entière de Euphorbia hirta (EUPHORBIACEAE)
(JEAN-PIERRE N., 2013).

D’après les enquêtes ethnopharmacologiques que nous avions effectuées dans la Région
d’Analamanga, les gens utilisent le décocté des feuilles de la plante à partir desquelles a été

4
extrait MOHA-04 comme antidiarrhéique. Ce décocté est pris en cas de ballonnements, de
nausées, de douleurs et de crampes abdominales suivies d’une diarrhée, des symptômes pouvant
être provoqués par une perte d’eau et d’électrolytes. En analysant ces informations, cette plante
pourrait réduire l’hypersécrétion d’eau dans la lumière intestinale, dont son origine impliquerait
une hypermotilité. Pour étudier cette activité, une extraction hydroalcoolique a été effectuée à
partir des feuilles de la plante, puis des tests in vivo ont été effectués avec cet extrait chez le
cochon d’Inde ; ensuite des tests in vitro ont été réalisés pour élucider le mécanisme d’action
probable de l’extrait.

5
MATÉRIELS ET MÉTHODES
II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
A. PARTIE CHIMIE
1. Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante utilisées dans ce mémoire ont été récoltées dans la région Analamanga
au mois de décembre 2016. Elles ont été séchées à l’ombre dans un endroit aéré et sec et à la
température ambiante, pendant 50 jours. Elles ont ensuite été broyées à l’aide d’un broyeur à
marteau électrique BROOK CROMPTON© série 2000 au Laboratoire de Pharmacologie
Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie (LPGPC) à la Faculté des Sciences
d’Antananarivo. Deux cent grammes de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange
éthanol : eau (60 : 40), à la température ambiante, pendant 72 heures. Le macérât obtenu a été
filtré sur du coton hydrophile, puis l’alcool a été évaporé à la température de 80 °C avec un
distillateur, puis l’eau a été évaporée dans un bain marie à la température de 100 °C (Figure 1).

L’extrait hydroalcoolique ainsi obtenu a été codé MOHA-04, puis pesé pour calculer le
rendement selon la formule :

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙′𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 = × 100
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑜𝑢𝑑𝑟𝑒

6
 Feuilles fraiches de la plante
200 g

Séchage à l’ombre
Feuilles sèches de la plante

Broyage

Poudre de la plante

Macération éthanol-eau (60 : 40)

Macérât

Filtration

Filtrat Marc

Evaporation à 80 °C et bain marie 100 °C

Extrait MOHA-04

Figure 1. Différentes étapes de l’extraction de MOHA-04.

7
 2. Criblage phytochimique

Un criblage phytochimique a été effectué pour détecter les familles chimiques présentes dans
l’extrait MOHA-04. Cette méthode est basée sur la formation de complexes insolubles ou de
complexes colorés, en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique (Tableau
I) (FONG H.H.S. et coll., 1977).

Avec :

++ présence en teneur moyenne

+ présence en faible teneur

± présence en très faible teneur

8
Tableau I. Les tests utilisés pour détecter les différentes familles chimiques présentes dans
l’extrait MOHA-04 (FONG H.H.S. et coll., 1977).

Familles chimiques Tests Réactifs Observations

ALCALOÏDES DRAGENDORFF, Précipitation
MAYER, WAGNER
TANINS Gélatine + NaCl Précipitation verte
Gélatine + FeCl3 Précipitation
Méthanol Bleue
COMPOSÉS Gélatine 1 % Précipitation
PHÉNOLIQUES
STÉROÏDES ET LIERMAN Anhydride acétique + Coloration violette
TRITERPÈNES BURCHARD H2SO4
BADGET Acide picrique Coloration rouge
KEDDE
SALKOWSKI H2SO4 Anneau de
séparation rouge
FLAVONOÏDES WIL-STATER Ruban de Mg + HCl Coloration rouge
concentré
LEUCOANTHOCYANES HCl concentré+bain Coloration rouge
BATH-SMITH marie violacée
ANTHOCYANES HCl à froid Coloration rouge
POLYSACCHARIDES + 3 Volumes d’éthanol Trouble
SUCRES RÉDUCTEURS Liqueur de Fehling+ Précipitation rouge
Bain-marie brique
COUMARINES NaOH 10 % Fluorescence à
l’UV
SAPONINES MOUSSE HCl + Agitation Persistance d’une
mousse (3 cm
d’épaisseur) après
30 min

9
B. PARTIE PHARMACOLOGIE

L’activité de l’extrait MOHA-04 a été étudiée chez les cochons d’Inde. Des tests in vivo ont été
effectués pour étudier son effet sur la sécrétion intestinale et des tests in vitro, pour étudier son
effet sur la motilité intestinale.

1. Animaux d’expérimentation

Des cochons d’Inde mâles et femelles, âgés de 3 à 5 mois et pesant entre 200 et 250 grammes
ont été utilisés. Ces animaux ont été élevés à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie
Générale, de Pharmacologie Cinétique et de Cosmétologie (LPGPC). Ils ont été nourris avec
des feuilles de graminées et ont eu accès libre à de l’eau.

2. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale

L’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo sur une diarrhée
expérimentale provoquée par le sulfate de magnésium (FINE K.D. et coll., 1991).

L’extrait MOHA-04 et le sulfate de magnésium ont été dissouts dans de l’eau distillée. Puis les
cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations. Ils ont ensuite été repartis
en 3 lots: un lot témoin et deux lots traités avec l’extrait MOHA-04. Le lot témoin a reçu 10
ml/kg d’eau distillée, tandis que les deux autres lots ont reçu l’extrait MOHA-04 par voie orale
aux doses respectives de 300 et 600 mg/kg dans 10 ml/kg d’eau distillée (MITHUM S. et coll.,
2011).

Quarante-cinq minutes après, tous les animaux ont reçu 2 g/kg de sulfate de magnésium, par
voie orale, dans un volume de 10 ml/kg. Trente minutes après l’administration du sulfate de
magnésium, les cochons d’Inde ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital,
administré par voie intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011). Ensuite, ils
ont étés mis en position décubitus dorsale et une laparotomie a été effectuée. Les animaux avec
une longueur d’intestin grêle semblable ont été sélectionnés et une ligature a été faite au niveau
du pylore et une autre au niveau du caecum. Le segment de l’intestin entre les deux ligatures a
été prélevé dans sa totalité et son contenu a été versé dans un récipient gradué afin de mesurer
le volume du fluide intestinal (GALVEZ J. et coll., 1993).

L’effet anti-sécrétoire de l’extrait a été calculé et exprimé en % avec la formule ci-dessous :

𝑉0 − 𝑉𝑇
E= × 100
𝑉𝑇

10
Avec:

E : effet de l’extrait sur la variation du volume de liquide intestinal

V0: volume de liquide intestinal du lot témoin

VT : volume de liquide intestinal du lot traité

3. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale

L’activité de l’extrait MOHA-04 sur la motilité intestinale a été étudiée in vitro sur le duodénum
isolé de cochon d’Inde, en utilisant de l’acétylcholine comme agent contracturant
(RAJAMANICKAM V. et coll., 2010).

Les cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations avec un accès libre à
de l’eau. Ensuite, ils ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital, injecté par voie
intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011), puis ils ont été mis en position
décubitus dorsale, et une laparotomie a été effectuée afin de prélever le duodénum.

L’organe ainsi prélevé a été tout de suite plongé dans une boîte de Pétri contenant une solution
de Tyrode (Tableau II) (TYRODE M., 1910), maintenue à la température de 37 °C, et aérée
avec de l’air à l’aide d’un aérateur électrique.

Tableau II. Composition de la solution de Tyrode dans 1 litre d’eau distillée (TYRODE M.,
1910)

Ingrédients NaCl KCl CaCl2 NaHCO3 MgCl2 NaHPO4 Glucose

Concentration (mM) 136 3,4 3,4 17 1,7 0,8 17

L’organe a ensuite été nettoyé en débarrassant les mésentères puis découpé en morceaux de 2
cm de long. Puis l’organe a été monté dans une cuve à organe isolé à l’aide de 2 nœuds en fil
de coton inextensible placés à ses 2 extrémités. Le premier nœud a été fixé à un crochet se
trouvant au fond de la cuve, et le deuxième a été relié à un capteur isométrique Gould - Statham©
sous une tension de 1,5 g (KAMGANG R. et coll., 2015). La cuve contenait 20 ml de solution
de Tyrode maintenue à la température de 37 °C et aérée à l’aide d’un aérateur électrique. Les
contractions du duodénum ont été enregistrées avec le logiciel SignalMonitor© (IOGA).

11
L’organe a été laissé se stabiliser dans la cuve pendant 45 minutes. Pendant cette période, il a
été rincé toutes les 15 minutes. Après cette période de stabilisation, le duodénum a été
sensibilisé avec de l’acétylcholine, à la concentration de 10-5 M dans le bain. La préparation a
ensuite été rincée puis laissée de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes en changeant trois
fois le bain, et en réajustant la tension (BORGES E.L. et coll., 2003).

Après la deuxième période de stabilisation, l’acétylcholine a été injectée dans le bain, de

manière cumulative, afin de réaliser des concentrations finales croissantes à partir de 10-9 M
jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Après l’obtention de cette contraction
maximale, l’extrait MOHA-04 a été injecté dans le bain, de manière cumulative afin d’apprécier
le relâchement de l’organe. L’amplitude des contractions a été mesurée, puis rapportée sur un
papier semi logarithmique, et la CE50 de l’extrait a été déterminée graphiquement.

4. Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine

Afin d’étudier le mécanisme mis en jeu lors du relâchement de l’organe provoqué par l’extrait,
le duodénum isolé de cochon d’Inde a été pré-incubé dans un bain contenant l’extrait à
différentes concentrations avant de le contracter avec de l’acétylcholine (HAMMAD H.M. et
ABDALLAH S.S., 1997).

Après la période de stabilisation et de sensibilisation, l’extrait a été injecté dans le bain

contenant l’organe pour réaliser une concentration finale de 0,125 mg/ml. L’organe a été laissé
en contact avec l’extrait pendant 10 minutes. Après ce temps d’incubation, l’acétylcholine a été
injectée de manière cumulative dans le bain, afin de réaliser une concentration à partir de 10-9
M jusqu’à la contraction maximale. Ensuite la préparation a été rincée, puis laissée se stabiliser
pendant 45 minutes en la rinçant toutes les 15 minutes, et la même manipulation a été refaite
mais en pré-incubant l’organe dans le bain contenant 0,25 mg/ml de l’extrait.

L’amplitude des contractions provoquées par l’acétylcholine, en absence et en présence de

l’extrait a été mesurée, puis exprimée en fonction de la contraction maximale provoquée par
l’acétylcholine seule, considérée comme 100 %. Ensuite, rapportée sur un papier semi-
logarythmique en fonction de la concentration de l’acétylcholine et celle de l’extrait. La valeur
de CE50 de l’acétylcholine a été déterminée graphiquement.

12
C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS

Les résultats obtenus ont été exprimés sous forme de moyenne avec écart type réduit (𝑥̅ ±
e.s.m), puis les moyennes ont été comparées entre elles en utilisant le test « t » de Student, et la
valeur de P<0,05 a été considérée comme significative.

13
RÉSULTATS
III. RÉSULTATS
A. PARTIE CHIMIE

L’évaporation à sec du filtrat hydroalcoolique obtenu avec 200 g de poudre de feuilles, donne
32 g d’extrait, soit un rendement de 16 %.

Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait hydroalcoolique MOHA-04 révèle la présence

de tanins, de leucoanthocyanes, d’anthocyanes, de stéroïdes et de triterpènes en teneur
moyenne. Tandis que les composés phénoliques, les flavonoïdes, les saponines et les alcaloïdes
sont présents en faible teneur, enfin, les sucres réducteurs sont présents en très faible teneur
(Tableau III).

Tableau III. Familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04.

FAMILLES CHIMIQUES TENEUR

Tanins ++

Leucoanthocyanes ++

Anthocyanes ++

Stéroïdes et Triterpènes ++

Composés phénoliques +

Flavonoïdes +

Saponines +

Alcaloïdes +

Sucres réducteurs ±

14
 B. PARTIE PHARMACOLOGIE
1. Effet de l’extrait MOHA-04 sur la sécrétion intestinale

L’administration du sulfate de magnésium chez le cochon d’Inde provoque une accumulation

de fluide dans la lumière intestinale des animaux. Le volume du fluide intestinal des animaux
traités avec l’extrait est inférieur à celui des animaux témoins. Chez les animaux du lot témoin,
le volume du fluide intestinal est égal à 1,8 ± 0,2 ml, contre 0,9 ± 0,06 et 0,6 ± 0,1 ml chez les
cochon d’Inde traités avec l’extrait aux doses respectives de 300 et de 600 mg/kg (P<0,05)
(Figure 2). Ce qui correspond à une diminution respective de 51,85 % et de 66,67 % du volume
du fluide intestinal par rapport au lot témoin.

2
Volume du fluide intestinal (ml)

1,5

0,5

0
Témoin Traité 300 mg/kg Traité 600 mg/kg

Doses (mg/kg)

Figure 2. Variation du volume du fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium

administré par voie orale chez les témoins et les cochons d’Inde traités avec l’extrait MOHA-
04, administré par voie orale, aux doses 300 et 600 mg/kg (𝑥̅ ± e.s.m ; n=3 ; P<0,05).

2. Effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale

L’injection de l’acétylcholine dans le bain contenant le duodénum isolé contracte ce dernier.

Injectée d’une manière cumulative dans le bain, l’acétylcholine augmente l’amplitude de la
contraction de l’organe. L’amplitude maximale est obtenue à la concentration de 10-3 M, avec
une CE50 égale à 1,7.10-6 M. En injectant l’extrait d’une manière cumulative dans le bain
contenant l’organe précontracté avec de l’acétylcholine, il se relâche, et l’amplitude diminue en
fonction de la concentration de l’extrait dans le bain. L’extrait provoque un relâchement de
26,19 ± 3 %, et 66,68 ± 2,06 % respectivement aux concentrations de 0,125 et de 0,5 mg/ml
(P<0,05) (Figure 3).

15
 80

Relâchement du duodénum (%)

70

60

50

40

30

20

10

0
0,125 mg/ml 0,250 mg/ml 0,500 mg/ml
Concentrations MOHA-04 administrées (mg/ml)

Figure 3. Relâchement du duodénum, précontracté avec de l’acétylcholine, en présence de

l’extrait MOHA-04 injecté dans le bain d’une manière cumulative (𝑥̅ ± e.s.m ; n=3 ; P<0,05).

3. Effet de MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine

Le mécanisme d’action de l’extrait MOHA-04 a été étudié en utilisant l’acétylcholine comme

agent contracturant. En pré-incubant l’organe dans un bain contenant l’extrait avant de le
contracter, l’amplitude maximale de la contraction provoquée par l’acétylcholine diminue, et
sa CE50 augmente en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain.

En absence de l’extrait, l’amplitude maximale de la contraction provoquée par l’acétylcholine

est de 64,28 ± 6,18 %, et sa CE50 est égale à 1,7.10-6 M. En présence de l’extrait aux
concentrations de 0,125 et de 0,25 mg/ml dans le bain, l’amplitude maximale est de 30,95 ±
2,06 % et 16,67 ± 2,06 % respectivement, et la CE50 est égale à 4,5.10-6 M et 6.10-6 M
respectivement (P<0,05) (Figure 4).

16
 100

80
Contraction (%)
60

40

20

0
-10 -8 -6 -4 -2 0
log concentrations de l'acétylcholine (M)

Figure 4. Variation de la contraction du duodénum isolé de cochon d’Inde provoquée par

l’acétylcholine administrée dans le bain de manière cumulative, en absence et présence de
l’extrait MOHA-04 aux concentrations de 0,125 et 0,250 mg/ml dans le bain (𝑥̅ ± e.s.m ;
n=3 ; P<0,05).

17
DISCUSSION
IV. DISCUSSION

Cette étude a eu pour objectif d’étudier l’activité de l’extrait hydroalcoolique MOHA-04 sur la
diarrhée chez le cochon d’Inde. Son effet sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo sur
l’accumulation de fluide intestinal provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie
orale ; tandis que son effet sur le péristaltisme intestinal a été étudié in vitro sur le duodénum
isolé de cochon d’Inde contracté avec de l’acétylcholine.

Les résultats du test in vivo chez les animaux témoins, montrent que le sulfate de magnésium
augmente le volume du liquide dans la lumière intestinale. Toutefois, celui des animaux traités
avec l’extrait est inférieur à celui de ces témoins, et ce volume diminue en augmentant la dose
de l’extrait administrée. Ceci nous permet de dire que l’extrait a diminué l’accumulation de
fluide intestinale provoquée par le sulfate de magnésium administré par voie orale.

Administré par voie orale, le sulfate de magnésium se dissocie en Mg2+ et SO42-, deux ions peu
absorbables par la paroi intestinale. Leur présence dans la lumière intestinale attire de l’eau par
un phénomène d’osmose, entrainant une accumulation du liquide intraluminal, conduisant à
une diarrhée osmotique (EWE K., 1988 ; FINE K.D et coll., 1991). La diminution du volume
de liquide intestinal, suite à l’administration de l’extrait par voie orale s’explique par le fait que
l’extrait empêcherait la sortie d’eau vers la lumière intestinale, ou favoriserait la réabsorption
d’eau. Dans le premier cas, il est probable que l’extrait resserre les pores au niveau de la paroi
de la muqueuse intestinale, la rendant imperméable à la sécrétion d’eau. En outre, la sécrétion
active de l’ion chlorure entraine une sécrétion d’eau lors de la diarrhée sécrétoire (FIELD M.,
2003), et le blocage du canal aux ions chlorures, inhiberait la sortie d’eau (ILLEK B. et coll.,
2000).

D’une part, les tanins, par leur caractère astringent, resserrent les pores et dénaturent les
protéines qui forment les canaux au niveau de la paroi intestinale, empêchant une sécrétion
d’électrolytes et d’eau (BRUNETON J., 1999). Des études réalisées sur un extrait de Juglans
regia (JUGLANDAEA) contenant des tanins hydrosolubles ont montré que cet extrait inhibe
la sécrétion de chlorure, ce qui entraine la diminution de la sécrétion d’eau dans la lumière
intestinale (WONGSAMITKUL N. et coll., 2010). Les flavonoïdes inhibent aussi les canaux
chlorures dans la lumière intestinale, réduisant ainsi la sécrétion d’eau intestinale. En outre, des
études effectuées sur l’extrait de l’écorce de Croton lechleri (EUPHORBIACAEA) ont montré
que les flavonoïdes contenus dans cet extrait inhibent les canaux chlorures, diminuant ainsi la
sécrétion de cet ion et de l’eau (FISCHER H. et coll., 2004 ; GABRIEL S.E. et coll., 1999).

18
Dans le deuxième cas, le MgSO4 provoque la libération de cholécystokinine au niveau du
duodénum, une hormone qui inhibe la réabsorption de chlorure de sodium et de l’eau
(MALAGELADA J.R. et coll., 1978). Il se pourrait que la présence de l’extrait dans la lumière
intestinale favorise l’absorption de sodium au niveau de l’intestin grêle ; et l’ion chlorure et
l’eau suivent les mouvements du sodium, ce qui expliquerait la diminution du volume de fluide
intestinal en présence de l’extrait (BINDER H.J., 2009). Il est probable que MOHA-04
inhiberait la cholécystokinine, expliquant en partie la diminution de l’accumulation du liquide
dans l’intestin. Il y a une probabilité que l’inhibition de la cholécystokinine soit liée à la
présence de tanins dans l’extrait. En effet, une étude effectuée sur une alimentation à base de
tanins a montré que ces derniers inhibaient la cholécystokinine (AHMED A.E. et coll., 1990).

Par ailleurs, lors des tests in vitro, l’extrait relâche le duodénum pré-contracté avec de
l’acétylcholine, et ce relâchement augmente en fonction de la concentration de l’extrait dans le
bain. Ceci nous permet de dire que l’extrait MOHA-04 est capable de diminuer la contraction
du duodénum provoquée par de l’acétylcholine. Et en pré-incubant l’organe dans un bain
contenant de l’extrait, l’effet maximal de l’acétylcholine n’est plus atteint, et sa CE50 augmente.
Ceci suppose que le principe actif de l’extrait est un antagoniste non compétitif de
l’acétylcholine. En se fixant sur son récepteur, l’extrait pourrait relâcher le duodénum ou
empêcherait l’acétylcholine de se fixer sur son récepteur, à l’origine du relâchement de l’organe
(LANDRY Y. et GIES J.P., 2014). Comme l’extrait de Dodonaea viscosa (SAPINDACEAE),
utilisée contre la diarrhée, qui agit sur les récepteurs β-adrénergiques (RAJAMANICKAM V.
et coll., 2010).

Etant donné qu’une motilité intestinale accrue diminue le temps de contact entre le contenu
luminal et l’épithélium pour l’absorption, cela provoque une diarrhée (FELDMAN M. et coll.,
2010). En relâchant l’intestin contracté par l’acétylcholine, l’extrait MOHA-04 diminue le
péristaltisme intestinal, ce qui augmente le temps de contact du contenu intestinal avec la paroi.
Ceci expliquerait en partie la diminution du volume du fluide intestinal lors des tests in vivo.

D’une part, en dénaturant les protéines recouvrant la muqueuse intestinale, les tanins
neutralisent l’irritabilité de celle-ci, diminuant ainsi sa sensibilité à la contraction et ainsi la
motilité (SHARMA P. et coll., 2010). Ce fut le cas de l’étude sur Lithocarpus dealbata
(FAGACEAE) qui a révélé le rôle antipéristaltique des tanins présents dans cette plante
(YADAV A.K. et TANGPU V., 2007). D’autre part, les flavonoïdes diminueraient le
péristaltisme intestinal en inhibant le système nerveux entérique qui est régulé lui-même par

19
l’acétylcholine (BERN M.J. et coll., 1989), un neuromédiateur responsable de la contraction du
muscle intestinal. D’ailleurs, une étude réalisée sur Egletes viscosa (ASTERACEAE) a montré
l’effet de relâchement des muscles lisses de l’intestin par les flavonoïdes contenus dans cette
plante (RAO V.S., 1997).

Des études approfondies seraient nécessaires pour identifier les molécules responsables de ces
effets ainsi que leurs mécanismes d’action.

20
CONCLUSION
V. CONCLUSION

Les résultats des tests effectués chez le cochon d’Inde montrent que l’extrait MOHA-04
diminue l’accumulation de fluide dans la lumière intestinale ainsi que la contraction du muscle
lisse duodénal. Ces deux activités expliqueraient l’activité de la plante utilisée en médecine
traditionnelle comme antidiarrhéique. Cette activité pourrait être associée aux tanins ou aux
flavonoïdes présents dans l’extrait hydroalcoolique MOHA-04.

21
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 « ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ DE L’EXTRAIT MOHA-04 SUR LA DIARRHÉE CHEZ LE
COCHON-D’INDE »

Auteur : AYADE Mohamed Houmadi Rapporteur : RANDRIANAVONY Patricia

Année : 2016-2017 Email : [email protected]
Adresse : Lot III K 3 A Ankaditoho BP : 8357
Numéro de téléphone : 032 62 755 60 Laboratoire : Laboratoire de Pharmacologie
Email : [email protected] Générale, de Pharmacocinétique et de
Cosmétologie - Faculté des Sciences
Université d’Antananarivo

RÉSUMÉ

Cette étude avait pour objectif d’évaluer l’activité de l’extrait MOHA-04 sur la diarrhée chez le cochon
d’Inde. Son activité anti-sécrétoire a été étudiée in vivo sur la diarrhée osmotique provoquée par sulfate
de magnésium administré par voie orale, et son effet sur la motilité intestinale a été étudié in vitro sur le
duodénum isolé de cochon d’Inde contracté avec de l’acétylcholine.
L’administration de l’extrait par voie orale réduit l’accumulation de fluide intestinal de 50 ± 3,33 % et de
66,67 ± 5,56 % avec les doses de 300 et de 600 mg/kg respectivement par rapport au témoin (P<0,05).
L’extrait injecté dans le bain à organe isolé d’une manière cumulative diminue la contraction du
duodénum de 26,19 ± 3 %, et de 66,68 ± 2,06 % aux concentrations respectives de 0,125 et 0,5 mg/ml par
rapport au témoin (P<0,05). L’incubation de l’organe dans un bain contenant de l’extrait aux
concentrations respectives de 0,125 et de 0,25 mg/ml diminue l’amplitude maximale de la contraction
provoquée par l’acétylcholine à 30,95 ± 2,06 %, et 16,67 ± 2,06 %, et augmente la CE50 de l’acétylcholine
de 1,7.10-6 M à 4,5.10-6 et 6.10-6 respectivement (P<0,05). Ces effets sont à l’origine de l’activité anti-
diarrhéique de cet extrait. Cette dernière pourrait être due à la présence des tanins ou des flavonoïdes dans
l’extrait MOHA-04.

Mots clés : anti-diarrhéique, anti-motilité, anti-sécrétoire, cochon d’Inde.

ABSTRACT

The objective of this study was to investigate the activity of the extract MOHA-04 on diarrhea in guinea
pig. The extract’s anti-secretory activity was studied in vivo on osmotic diarrhea induced by oral
administration of MgSO4 while its effect on intestinal motility was studied in vitro on acetylcholine-
induced contracted isolated duodenum.

Oral administration of the extract at doses 300 and 600 mg/kg reduces intestinal fluid accumulation by
50 ± 3.33 % and 66.67 ± 5.56 % respectively (P <0.05). Injecting the extract cumulatively into an organ
bath at concentrations 0.125 and 0.5 mg/ml decreases the duodenal contraction by 26.19 ± 3 % and
66.68 ± 2.06 % respectively (P <0.05). Incubation of the organ in a bath containing the extract MOHA-
04 at concentrations of 0.125 and 0.25 mg/ml decreases the maximal amplitude of contraction caused by
acetylcholine from 100 % to 30.95 ± 2.06 % and 16.67 ± 2.06 % respectively and increases the EC50 of
acetylcholine 1.7.10-6 M to 4.5.10-6 and 6.10-6 respectively (P <0.05). These results indicate that extract
MOHA-04 possesses anti-diarrheal activity. The presence of tannins and flavonoids in the extract
MOHA-04 could be responsible for this activity.

Keywords: antidiarrheal, anti-motility, anti-secretory, guinea pig.