LES VECTEURS : PLASMIDES, PHAGES, COSMIDES, YAC, BAC

I - LES VECTEURS EN GÉNIE GÉNÉTIQUE : L'ADN PLASMIDIQUE

1. Les plasmides.
a : Définition : Les plasmides sont de petites molécules d'ADN bicaténaires, circulaires, extra-
chromosomiques, susceptibles de se répliquer de façon autonome. Ils sont présents dans le
cytoplasme de nombreuses espèces bactériennes. Néanmoins, le plasmide killer de la levure est
composé d’une molécule d’ARN. Leur ADN comprend au minimum les gènes intervenant dans la
réplication et la ségrégation de leur matériel génétique dans les cellules filles à chaque cycle de
division cellulaire de la cellule hôte.
La plupart des plasmides naturels contiennent des gènes qui confèrent à l'hôte des propriétés
supplémentaires comme la résistance aux antibiotiques. Une bactérie peut posséder en même temps
plusieurs plasmides différents sauf si leur cohabitation est incompatible avec la survie de la bactérie.
En génie génétique, les plasmides sont généralement utilisés comme vecteurs pour :
 Le clonage et l'amplification d'une séquence d'ADN exogène.
 L'étude des mécanismes de l'expression d'une séquence d'ADN exogène.
 L'introduction des gènes dans les cellules bactériennes (transformation) ou animales
(transfections) ou dans des organismes entiers (animaux transgéniques).
 la production des protéines codées par les gènes contenus dans l’ADN inséré
b : Caractéristiques des plasmides utilisés en génie génétique
La cellule hôte la plus utilisée est Escherichia coli. Les plasmides naturels dits de première
génération ont été utilisés dans le passé comme vecteur de clonage, mais les plasmides utilisés
actuellement sont modifiés et sont donc des chimères obtenues par des recombinaisons de différents
plasmides naturels et de DNA viral. Ils sont petits de taille pour permettre l'insertion d'une
importante quantité d'ADN exogène tout en maintenant une bonne efficacité de transformation. Ils
possèdent :
 Une origine de réplication de type relâché : la séquence ori.
 Un gène de résistance à un antibiotique auquel la souche hôte est sensible, ce qui
permet la sélection des cellules résistantes.
 Un second gène marqueur phénotypique (soit un deuxième gène de résistance à un
second antibiotique ou le gène Lac Z') qui permet de reconnaître parmi les colonies transformées
celles qui hébergent un plasmide recombinant.
 Un site de clonage ayant un ou plusieurs sites de restriction (polylinker) qui
permettent la linéarisation du plasmide préalable à l'insertion de l'ADN exogène.
c : Deux vecteurs plasmidiques : pBR 322 et pUC18
Le plasmide pBR322 est très simple dans sa structure. Il contient 2 gènes de résistance aux
antibiotiques, tetR et ampR. Chacun de ces gènes contient un site de restriction qui est utilisé pour le
clonage. L'ADN du donneur peut être inséré dans le gène tet R. Une insertion réussie se traduira par
l'inactivation de ce gène qui ne sera plus capable de conférer la résistance à la tétracycline à la cellule
hôte. C'est pourquoi le protocole de clonage consistera à mélanger l’ADN du plasmide et l’ADN du
donneur digérés par une même enzyme de restriction suivi d’une ligaturation.
Cette préparation est alors utilisée pour transformer les bactéries et sélectionner les colonies
résistantes à l'ampicilline. Ces dernières doivent avoir été transformées avec succès par une molécule
de plasmide recombinante.
Parmi les colonies AmpR, seules celles qui s'avèrent sensibles à la tétracycline contiennent
une insertion, en d'autres termes, seules les colonies ampRtetS contiennent de l'ADN recombinant
(ADN du plasmide et ADN inséré). L’insertion de l’ADN étranger dans pBR322 est détectée par
l’inactivation du gène de résistance (tetR), indiqué par le phénotype tetS (sensible).
Le plasmide pBR322

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Lorsque ces plasmides vont transformer des bactéries réceptrices sensibles à l'ampicilline et à la
tétracycline, on va obtenir 3 types de bactéries : celles qui n'ont pas été transformées de 50 à 90%)
qui sont restées sensibles à l'ampicilline ; celles qui ont reçu un plasmide natif qui sont devenues
résistantes à l'ampicilline et à la tétracycline et celles qui ont reçu un plasmide recombiné qui sont
devenues résistantes à l'ampicilline mais sont restées sensibles à la tétracycline. En deux étapes on va
pouvoir repérer ces dernières. Toutes les bactéries sont étalées sur un milieu contenant de
l'ampicilline. Celles qui poussent sont répliquées sur milieu additionné d'ampicilline et de
tétracycline. Celles qui poussent ont reçu un plasmide natif. Celles qui ont reçu un plasmide
recombiné sont récupérées sur la matrice

d : Les plasmides pUC

Les plasmides de la famille pUC sont des vecteurs plus élaborés dont la structure permet la
sélection visuelle directe des colonies contenant l’ADN inséré. L'élément clé est une petite portion
du gène de la β galactosidase d’E. coli. Un segment d'ADN synthétique appelé adaptateur (polylinker
ou cloning site) contient de nombreux sites de restriction utiles pour l'insertion des fragments de
l'ADN du donneur. Un plasmide pUC est un plasmide pBR dans lequel on a remplacé le gène de
résistance à la tétracycline par un gène bactérien lacZ qui code la β galactosidase. Un produit non
toxique pour la cellule bactérienne est également substrat de la β galactosidase : le Xgal.

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 L’origine de réplication ori des plasmides pUC diffère légèrement par mutations de celle de
pBR322, ce qui explique le très grand nombre de copies des plasmides pUC dans une cellule
bactérienne et par suite des vecteurs de troisième génération qui en dérivent.
L'insertion d’un vecteur dans pUC est détecté par l'inactivation de la fonction galactosidase
du gène Z', qui se traduit par l'incapacité de la cellule hôte à convertir le substrat artificiel X-
Galactoside en un colorant bleu (X= paranitrophénol).
 Les plasmides de première génération: ce sont les plasmides rencontrés dans la nature. Il
s'agit des plasmides ColE1, RSF2124, pSC101. Ces types de plasmides n'ont pas les propriétés
requises pour les manipulations génétiques.
 Les plasmides de seconde génération: ce sont les plasmides de la famille pBR obtenus par
construction. Le plus utilisé est le plasmide pBR322, constitué de 4 363 paires de bases. Il possède
deux gènes de résistance aux antibiotiques : l’un pour la tétracycline et l’autre pour l’ampicilline et
20 sites uniques pour les enzymes de restriction. Parmi les sites uniques, 11 sont localisés dans les
gènes de résistance aux antibiotiques.
L'insertion d'ADN étranger dans un quelconque de ces sites se traduit par la perte de la
résistance à l'antibiotique.
 Les plasmides de 3ème génération : Ces plasmides ont été construits pour faciliter le travail
de sous clonage et pour une sélection des clones recombinants.
 la famille pUC: Ce plasmide de 2 600 paires de bases environ dont pUC18 possèdent : un
promoteur et un opérateur efficace de transcription, le gène de résistance à l’ampicilline Amp R et une
partie du gène lacZ. Un polylinker est inséré dans le gène lacZ. La présence de ce polylinker
n’interfère pas avec le fonctionnement du gène de la B-galatosidase. Le gène LacZ permet la
sélection des recombinants par la couleur des colonies. Il faut donc pour cela utiliser les bactéries
lac-. Les différents plasmides de cette famille diffèrent les uns des autres par la taille de leur
polylinker. Leur petite taille permet l’insertion d’un ADN assez grand et une croissance rapide des
plasmides.
 La famille pSP. Ils sont plus petits que pBR322 (entre 2900 et 3000 bp). Ces plasmides
possèdent : un polylinker, le gène de résistance AmpR et le promoteur de la RNA polymérase du
phage SP6 qui provient de Salmonella typhimurium immédiatement adjacent au polylinker. Ces
types de plasmides offrent un avantage, car ils permettent de transcrire en ARN la séquence d’ADN
qui a été insérée dans le polylinker.
 Les plasmides Gemini (1 à 4) dérivent des précédents. Ils possèdent en plus sur le brin
complémentaire, de l’autre côté du polylinker, un promoteur de la RNA polymérase du phage T7.
L’avantage de ces plasmides est de pouvoir transcrire l’ADN inséré en une grande quantité d’ARN
sur les deux brins pour la traduction en protéines.
 Les plasmides Blue-Scriptâ. Ce sont les plasmides les plus complexes car ils combinent tous
les avantages des vecteurs précédents. Le plasmide Blue-Scriptâ est un petit plasmide de 2961 paires
de bases à haut nombre de copies, plus de 500 exemplaires par cellule. Il possède, outre le gène de
résistance à l’ampicilline, le gène lacZ’ (codant pour le peptide Į de la β-galactosidase et contenant
les séquences régulatrices de l’opéron lactose) qui permet la sélection des colonies. De plus, l’ADN
inséré est sous la dépendance du promoteur du gène lacZ’. Chaque fois que ce gène est exprimé,
l’ADN inséré est aussi exprimé d’ou la production de la protéine correspondante. La haute efficacité
de transformation, due à sa petite taille, constitue un intérêt avantageux pour ce vecteur en
biotechnologie.

II- L'ADN PHAGIQUE

Les bactériophages ou phages sont des particules virales qui infectent les bactéries. Leur
multiplication est rapide et le nombre de copies par cellule bactérienne est très important.
Lorsque l’ADN du phage pénètre dans une bactérie, deux types de réponses peuvent se
produire :
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  Une réponse lytique : l’ADN du phage intégré dans le chromosome bactérien prend
immédiatement en charge le système de transcription et de traduction de la cellule hôte qui
commence la synthèse des constituants protéiques du phage. Ces différents constituants s’assemblent
et forment de nouvelles particules phagiques dès que commence la réplication de l’ADN phagique.
La bactérie éclate et les nouvelles particules virales infestent les bactéries voisines. Il se forme alors
une plage de lyse sur une boite de Pétri.
 Réponse lysogénique : L’ADN du phage est intégré dans le chromosome bactérie et se
réplique en même temps que le chromosome bactérien mais reste intégré à ce chromosome. Il ne se
produit pas de nouveaux virions. Le métabolisme et la viabilité des bactéries ne sont pas modifiés
tant que la bactérie reste dans cet état. Les bactéries à prophage intégré sont appelées des bactéries
lysogènes. La lysogénie peut être supprimée par des agents inducteurs de la virulence des phages
(rayons X, agents mutagènes…)
Deux types de phages qui infectent Escherichia coli sont d'usage fréquent en génie génétique:
le phage l et le phage M13.
1- Le phage Lambda λ
Le phage λ est un bactériophage de 1ère génération. Il est constitué d'un ADN double brin
linéaire de 48.502 paires de bases. Les extrémités appelés COS sont constituées par de l'ADN sous
forme simple brin sur une longueur de 12 bases. Le bactériophage λ est un vecteur de clonage
efficace pour plusieurs raisons:
 Les extrémités cohésives permettent au phage de se concaténer et de se circulariser.
La circularisation est observée dans la bactérie immédiatement après l’infection.
 La tête du phage λ peut encapsider un ADN chromosomique d’environ 5 kb. Cette
propriété permet de sélectionner les particules du phage λ naturel des phages λ contenant des ADN
étrangers.
 La région centrale du génome du phage λ n'est pas nécessaire pour la réplication ou
l'encapsidation des molécules d’ADN de λ dans E. coli et peut donc être excisée par des enzymes de
restriction et écartée.
 Les "deux bras" restants sont ensuite ligaturés avec l'ADN du donneur digéré par les
mêmes enzymes de restriction.
 Les molécules d’ADN ainsi obtenues peuvent être introduites dans E. coli par la
transformation ou être encapsidées in vitro dans les têtes d’un bactériophage.

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 Le passage de la forme linéaire (dans la particule phagique libre) à la forme circulaire (dans
l'ADN après injection dans la cellule hôte) est dû à la présence aux extrémités de la molécule linéaire
de bouts collants de 12 nucléotides (les extrémités cos).

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Ces propriétés du bactériophage ont permis de concevoir un nouveau vecteur à partir de capable de
transporter plus d'ADN étranger que les plasmides pBR et pUC.

2: Dérivés du phage λ utilisés comme vecteur de clonage

Le bactériophage l sauvage ne peut pas être toujours utilisé pour le clonage car son ADN
comporte des sites multiples pour beaucoup d'endonucléases de restriction utilisées dans les
différents processus de clonage. De plus, ces sites sont souvent localisés dans les régions du génome
indispensables pour le cycle lytique du phage.
La longueur de l'ADN pouvant être encapsidé ne peut dépasser 5 kb, si bien que la taille de
l'ADN étranger qui pourrait être inséré est très limitée. A partir des phages sauvages, on a construit
des phages qui n'ont qu'un (pour vecteur d’insertion) ou deux (pour vecteurs de substitution) sites de
restrictions situées dans les parties non essentielles du génome de phage λ.
Le phage λgt 11 est utilisé l’insertion pour cloner les cDNA dont la longueur varie de 6 à 8
kb. Il sert de vecteur d’expression car la séquence insérée pourra être exprimée dans la bactérie sous
forme de protéine, permettant la recherche du recombinant désiré à l’aide d’un anticorps dirigé
contre la protéine synthétisée.
Le phage λ ZAP II est une forme améliorée du précédent qui permet de visualiser
l’expression de l’ADN inséré. La sélection des recombinants se fait en analysant la coloration bleue
ou blanche, lorsque la culture est réalisée sur un milieu contenant le substrat X-gal et l’IPTG.

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3. Les phages EMBL 3 et 4
Ces deux phages sont très proches du phage λ classique. Ils en diffèrent par la présence d’un
polylinker aux deux extrémités de la zone de DNA qui sera supprimée pour être remplacé par le
DNA à cloner. Les deux phages ne diffèrent que par l’orientation du polylinker. On peut y introduire
des fragments de 15 à 20 kb. Ils constituent des phages de choix pour la constitution des banques
génomiques.
4. Les phages GEMR 11 et 12
Ces deux phages sont destinés à la réalisation de banques génomiques et sont des versions
améliorées des phages EMBL. La taille de l’ADN à insérer varie de 9 à 23 kb. Ils en diffèrent par
deux types d’améliorations :
- Modification du polylinker. Le polylinker de ces phages comporte un plus grand nombre de sites de
coupures uniques pour deux enzymes de restriction : Sfi dans la version 11, Not dans version 12 car
les sites de coupure de ces enzymes sont très rare. L’addition d’un site Xho I simplifie la réalisation
des banques génomiques.
- Addition de promoteurs pour des RNA polymérases spécifiques : Un promoteur de la T7 RNA
polymérase est ajouté à l’extrémité du bras gauche avant le polylinker et le promoteur de la T3 RNA
polymérase à l’extrémité droit.

5. Le phage M13 et ses dérivés

Le bactériophage M13 qui infecte E. coli est un phage filamenteux dont la particularité et
l'intérêt résident dans son matériel génétique. Le matériel génétique de ce phage est constitué d’une
molécule d'ADN circulaire monocaténaire de 6407 paires de bases notée brin (+). Le phage M13 a
été modifié de manière a pouvoir introduire un ADN étranger dans la forme réplicative au niveau
d'un site unique de restriction. La forme réplicative recombinée peut ensuite être introduite dans une
cellule hôte par transformation comme un plasmide de manière à disposer sur le brin (+) d'une
séquence connue au voisinage de l'insertion. Sur cette séquence connue, on peut hybrider un

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oligonucléotide de synthèse qui servira alors d'amorce pour la DNA polymérase. Les modifications
pour en faire un vecteur sont :
- L’addition d’un polylinker pour faciliter l’insertion des séquences de DNA
- L’addition d’un gène lacZ pour permettre la sélection des recombinants.

III. COSMIDES, YAC ET BAC

Les cosmides
Les cosmides sont des vecteurs hybrides constitués d’un plasmide classique auquel ont été
ajoutées les séquences COS du phage l. Leur ADN peut se répliquer au niveau de la cellule hôte
comme celui d'un plasmide ou être encapsidé comme celui d'un phage pour faire une infection. Les
cosmides peuvent contenir des insertions d’ADN environ trois fois plus longs que ceux portés par les
phages l (45 kb). Ceci est dû au fait que la majeure partie de la structure du phage a été supprimée
tandis que les séquences signaux responsables de l'encapsidation subsistent (les sites COS).
Dans le cosmide et au niveau du site multiple de clonage, on a placé de part et d'autre du
site de clonage BamHI, des promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un gène de
l'ADN étranger, qu'il soit inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6kbp en
moyenne et devant atteindre de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de
l'ordre de 45 kbp.

Les cosmides, après assemblage in vitro sont capables de se fixer sur la paroi de la cellule hôte et
d'injecter leur ADN. Celui-ci grâce aux extrémités cos se circularise et se réplique comme un
plasmide mais aucune des fonctions phagiques ne peut être exprimée donc les cellules survivent et
forment des clones.

Chromosomes artificiels
Les chromosomes artificiels (ou minichromosomes) sont des structures qui copient les
chromosomes de la cellule hôte eucaryote et se répartissent régulièrement lors des divisions, comme
les chromosomes naturels. On y retrouve donc les éléments essentiels des chromosomes :
 une origine de réplication qui est en phase avec les origines chromosomiques naturelles.
 une région centromérique qui assure la migration correcte du minichromosome
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  un site unique de clonage
 un ou plusieurs marqueurs de sélection (un par élément constitutif).
Ces chromosomes artificiels ont une capacité très augmentée d'accepter de l'ADN étranger. On en a
construit pour les bactéries : Bacterial Artificial Chromosome (BAC), pour la levure, YAC et on est
en train d'en mettre au point pour les mammifères, MAC.
A titre d'exemple, nous avons le plasmide YAC. C'est un vecteur navette puisqu'il peut se
répliquer aussi bien dans une cellule de levure que dans une cellule bactérienne. A l'état natif c'est un
plasmide circulaire qui comporte de l'ADN de deux origines :
 pBR 322 où il a reçu l'origine bactérienne de réplication et le gène de résistance à
l'ampicilline.
 chromosomes de levure où il a reçu une origine de réplication chromosomique Autonomous
Replication Site (ARS), une région centromérique chromosomique. Il a aussi deux régions
télomériques d'origine chromosomique qui protégeront les extrémités du minichromosome
après recombinaison. Chaque partie du pYAC porte un marqueur de sélection utilisable dans
la levure : ce sont les formes fonctionnelles de gènes qui codent des enzymes nécessaires
dans la synthèse d'acides aminés ou de bases azotées.

Une double digestion de ce plasmide par BamHI et Sma libère trois fragments : l'un contient h+,
ARS et CEN ainsi qu'un télomère, le second contient u+ et un télomère et le troisième uniquement
h+. Ces fragments étant de taille différente on peut les séparer par électrophorèse sur gel d'agarose et
récupérer les deux premiers que l'on mélange avec des gros fragments à intégrer ayant des extrémités
cohésives compatibles. Après action de la ligase on a un minichromosome recombiné qui a perdu h+
mais qui possède encor t+ et u+. Par contre il a perdu a+ car ce gène est maintenant interrompu par
l'ADN étranger.

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Il faut choisir une souche de levure portant des mutations qui inactivent les gènes a, h, t et u. Elle
présentera 4 auxotrophies [ade-, ura-, his-,trp-]. Après avoir reçu un pYAC natif ou un
minichromosome, les cellules transformées seront devenues [trp+, ura+]. Si elles ont reçu un pYAC
natif elles seront également [his+, ade+] et si elles ont reçu un minichromosome recombiné elles
seront [his-, ade-,trp+,ura+]. La combinaison de ces 4 marqueurs permet de distinguer ce qu'a reçu
chaque clone cellulaire.
Un des problèmes que l'on rencontre souvent avec les YAC c'est que sur un même
minichromosome on trouve des gènes de l'ADN étranger qui ne sont pas voisins dans l'organisme
d'origine. C'est que 2 fragments non contigus ont été intégrés dans le minichromosome. On parle
alors de chimère car l'image que l'on a de l'ADN de la banque ne reflète pas celui de l'organisme de
départ.

pBAC
Les BAC sont des ADN circulaires, comme un chromosome bactérien, dont l'origine de
réplication est issue de l'épisome sexuel F de E. coli.

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 Exemple de chromosome artificiel bactérien
OriS est l'origine de réplication de l'épisome F. Les gènes parB et parA de l'épisome servent à la
répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène repE code l'enzyme de réplication
spécifique de l'épisome. CosN vient du bactériophage lambda. Ce site est reconnu et ouvert par la
terminase in vitro. CmR d'origine plasmidique code la résistance au chloramphénicol.

Les YAC: Yeast Artificial Chromosome

Les YAC permettent de cloner de 150 à 1 000 kb de fragments d’ADN. Le génome de la
levure Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16 chromosomes de taille comprise entre 250 et 2
000 kb. Chez la levure, trois régions chromosomiques sont importantes pour sa réplication. Les
séquences télomériques (Tel), centromériques (CEN), et une séquence ARS (Autonomous
Replicating Sequence).
On a donc construit des chromosomes artificiels contenant ces régions essentielles. La taille
du DNA cloné peut donc atteindre de 1 000 à 2 000 kb. Les YAC n'exigent que les cellules de
levures comme hôtes. On peut cependant introduire dans l’ADN cloné des séquences bactériennes
pour la sélection.
3. Les PAC : P1-derived artificial chromosomes ou Chromosomes artificiels dérivés du phage P1
C’est un vecteur dérivé du bactériophage P1. Le vecteur pCYPAC1 permet de cloner des fragments
qui ont une taille de 130 à 150 kb avec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et
celle des YACs.

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Les BAC : Bacterial Artificial Chromosome
Les BAC ont pour base le facteur sexuel F de 7 kb d’Escherichia coli. Ce facteur peut
contenir de grands fragments d'ADN d'E. coli sous la forme de dérivés F'. De manière similaire, les
BAC peuvent incorporer des inserts d'ADN étranger pouvant atteindre 300 kb. Le plasmide F porte
des gènes qui sont essentiels pour réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi le nombre de
copies du plasmide F. Le plasmide F a aussi la capacité de s'intégrer dans le chromosome bactérien et
de s'en exciser. Un plasmide qui a cette capacité est appelé un épisome.

Les gènes oriS et repE régissent la réplication unidirectionnelle du plasmide tandis que les
gènes parA et parB maintiennent le nombre de copies de celui-ci à 1 à 2 copies par cellule.
Le vecteur pBeloBAC11 porte ces gènes essentiels ainsi qu'un gène de résistance au
chloramphénicol et la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites de restriction HindIII et
BamHI qui permettent le clonage de fragments d'ADN étranger.

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