Enzymologie

Partie 1- Les Enzymes : 3

I- Structure : 3
1.1) Catalyseur : 3

1.2) Les Enzymes : 3

Les principales caractéristiques des enzymes : 5

Deux grandes catégories d’enzymes : 6

II- Coenzyme : 7
Précurseurs des co-enzymes : 8

Propriétés générales : 8

Les différents types de co-enzymes: 8

III- Les isoenzymes : 9

Enzyme d’amidation : La PAM (environ 950 AA) : 11

IV) Cinétique Enzymatique : 16

V) Vitesse de réaction : 17

VI) Les facteurs modifiant la vitesse de réaction enzymatique : 19

Influence de la température : 20

L’effet du pH : 22

VI) Inactivation thermique des enzymes : 23

Partie 2 - Mode d’action des enzymes : 24

I) Cinétique enzymatique : 24

II) Le site actif : 25

1) Structure du site actif : 25

2) Spécificité du site actif : 26

3) Liaison du substrat : 27

4) Modification du Substrat : 27
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III- L’influence des inhibiteurs des enzymes : 29
A- Inhibiteurs irréversibles : 29

B- Les inhibiteurs réversibles : 31

a) Les inhibiteurs compétitifs : 31

b) Les inhibiteurs non compétitifs : 33

IV) Cancers : 36
1) CBNPC: cancer bronchique non à petites cellules : 36

L’EGFR un coeur de la carcinogenèse à l’origine d’une cascade de

mécanismes tumoraux : 36

EGF: facteur de croissance épidermique 38

Altération génomique à la base d’une augmentation de l’activité kinase 41

Le spectre des mutations de l’EGFR : 42

Version 2.0 - 23/10/2017

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 Partie 1- Les Enzymes :
I- Structure :
1.1) Catalyseur :


• C’est une substance qui interagit avec un réactant en modifiant la distribution

d’énergie entre ses liaisons chimiques avec finalement diminution du niveau d’énergie
requis pour transformer le réactant en produit.


• L’énergie d’activation étant moindre en présence d’un catalyseur, la réaction est plus
rapide.

• La composition chimique du catalyseur n’est pas modifiée par la réaction et donc une
molécule unique de catalyseur peut être utilisée à de multiples reprises pour catalyser
la conversion de nombreuses molécules de réactant en produit (en biologie, réactant = substrat).

• Un catalyseur ne modifie pas le contenu énergétique des réactants et des produits.

1.2) Les Enzymes :


• La plupart des réactions chimiques survenant dans l’organisme se feraient à des

vitesses très lentes si elles étaient effectuées dans un tube à essais en mélangeant
simplement les réactants car leurs énergies d’activation sont très élevées.

• Pour obtenir les grandes vitesses de réactions observées dans les organismes vivants,
il faut que les catalyseurs abaissent les énergies d’activation.

• Ces catalyseurs particuliers sont appelés enzymes. Celles-ci sont des protéines donc
une enzyme est un catalyseur protéique.

• Certaines molécules d’ARN possèdent une activité enzymatique: ce sont des ribozymes.
(pas de QCM sur ça )

• Pour assurer ses fonctions, une enzyme doit rentrer au contact des réactants appelés
substrats dans le cas des réactions enzymatiques. Le substrat se fixe sur l’enzyme
formant un complexe enzyme-substrat et se désagrège pour libérer les produits (P) et
l’enzyme.

- La réaction Enzyme/Substrat ES est décrite de la manière suivante:

S (substrat) + E (enzyme) ⇄ E-S → P + E

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- À la fin de la réaction, l’enzyme peut rentrer dans une
nouvelle réaction avec d’autres molécules de substrat.
L’effet global est l'accélération de la conversion du
substrat en produit, l’enzyme agissant comme un
catalyseur.

• Une enzyme comme toute protéine est synthétisée à

partir des informations codées dans l’ADN ou dans
l’ARN dans le cas de certains virus. 



ADN → ARN primaire (après transcription) → ARNm
(après maturation) → pré-pro-protéine de haut poids
moléculaire. RE puis passage par le Golgi puis grains
de sécrétion.

Si l’enzyme doit être sécrétée : elle sera soluble dans le

système endomembranaire et on pourra la trouver dans
la circulation sanguine.


New :


L’enzyme est synthétisée sous forme de

préproprotéine de haut PM (c’est le précurseur). 



Elle va subir des modifications post traductionnelles durant son voyage à travers le
système endomembranaire, sans ces modifications elle ne peut pas être active. Elle
acquiert ses fonctions dans les sacs de Golgi.

Le substrat va être dans le même sac que l’enzyme.

Puis elle se dirige vers la membrane. Suite à un stimulus : adhésion à la membrane

(fusion membrane plasmique et grains de sécrétion) et libération dans le système sanguin
par exemple.

L’insuline : L’ARNm est traduit dans le RE, passage dans le Golgi, grains de sécrétion qui
seront sécrétés quand le corps en aura besoin. La préproprotéine en présence de la
chaine a et b ainsi que le peptide de connexion, on peut doser l’insuline ou le peptide c
pour nous donner une idée du taux de synthèse chez un patient.
Si l’enzyme doit être sécrétée : elle sera soluble dans le système endomembranaire et on
pourra la trouver dans la circulation sanguine.

Elle sera sous forme de pro-pré-enzyme. Elle n’est pas active dès sa synthèse, c’est
pourquoi elle nécessite des modifications post-traductionnelles.
En revanche elle pourra potentiellement être active à chaque niveau du « voyage » (dans
Golgi, dans les granules de sécrétion).

Dans les granules de sécrétion on trouve les enzymes.

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Exemple : L’ACTH :

L’ACTH est synthétisée dans l’hypophyse (hormone de la peur) et la POMC est sa

préproprotéine. À partir de ce précurseur, on peut avoir une multitude d’hormones
différentes et cela grâce à des enzymes (PC1= proconvertase 1 et PC2 = proconvertase
2) qui vont cliver la protéine de haut poids moléculaire en différents fragments, peptides,
protéines… Synthèse de différentes molécules qui proviennent du même précurseur.

La préproprotéine subit aussi le voyage RE, Golgi etc.

Si elle est à destination de la membrane: elle sera membranaire dans le système

endomembranaire.

On peut avoir des enzymes à partir d’ADN (adénovirus) ou ARN (rétrovirus, ex: HIV du
SIDA)

Elle subit des modifications protéolytiques ou non protéolytiques durant son "voyage" dans
le système endomembranaire et une maturation de la proenzyme en enzyme.

Les principales caractéristiques des enzymes :


- Une enzyme ne subit aucun changement chimique au cours de la réaction qu’elle

catalyse.

- La fixation d’un substrat sur le site actif d’une enzyme a toutes les caractéristiques de
la fixation d’un ligand sur une protéine.

- Une enzyme augmente la vitesse d’une réaction chimique mais n’induit pas une
réaction qui n’aurait pas lieu en son absence, elle est « seulement là pour aider ».

- Une enzyme abaisse l’énergie d’activation d’une réaction mais ne modifie pas la
quantité nette d’énergie qui est apportée au système ou qui est libérée par le substrat au
cours de la réaction.

- Les enzymes sont des protéines qui font rapidement évoluer la réaction vers son point
d’équilibre sans toutefois modifier la position de ce dernier. Les enzymes sont des
catalyseurs biologiques.

- Les enzymes diffèrent des catalyseurs chimiques par la structure chimique : les
catalyseurs sont des composés minéraux alors que les enzymes sont des composés
organiques.

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Deux grandes catégories d’enzymes :

- Les enzymes purement protéiques, qui ne sont constituées que d’acides aminés, 

exemple : la ribonucléase pancréatique → Elle n’a besoin ni de cofacteur ni
d’apoenzyme !! (cf concours l’année dernière) Elle n’a besoin de rien pour fonctionner,
après sa synthèse elle devient direct biologiquement active. Synthétisée sous la forme
de préproprotéine du RE jusqu’au grain de sécrétion.

- Les enzymes qui sont en 2 parties : une partie protéique (apoenzyme), et une partie
non protéique (organique ou minérale) (cofacteur)

Le cofacteur est un métal présent à l’état de trace (magnésium, fer, manganèse,

cuivre..). L’activité enzymatique est portée par la partie protéique : apoenzyme

La fixation de l’un de ses métaux sur l’enzyme modifie la conformation de l’enzyme lui
permettant d’interagir avec le substrat.

Le cofacteur peut aussi être une molécule organique le plus souvent de faible PM qui
participe directement à la réaction comme un des substrats → coenzyme.
à la fin de la réaction le coenzyme va retrouver sa nature initiale.

Le complexe apoenzyme + cofacteur ou apoenzyme + coenzyme est appelé

holoenzyme

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Une enzyme complètement active sur le plan catalytique avec son co-enzyme ou un
cofacteur est appelée holoenzyme. 


L’activité catalytique spécifique appartient à l’apoenzyme (structure protéique) donc à la

composante protéique.

E1 E2
R − 2H + coenzyme! R + coenzyme − 2H ! P − 2H + coenzyme

II- Coenzyme :


Définition: composé organique de nature non protéique qui, associé à la partie

protéique de l’enzyme, lui confère ses propriétés enzymatiques.
→ Sans le coenzyme, la catalyse de la réaction ne peut avoir lieu.

Exemple: l’aminoacétyl transférase, enzyme fixant l’acide aminé sur l’ARNt lors de la
traduction a besoin de l’ATP (joue le rôle de coenzyme) pour fixer l’acide aminé sur l’ARNt.
Aminoacyl transférase + AA + ATP → ARNt
Sans l’ATP, l’acide aminé ne peut pas être fixé sur l’ARNt

Les enzymes qui nécessitent des coenzymes catalysent des réactions dans lesquelles
quelques atomes (tels que : hydrogène, groupements acétyl ou méthyl par exemple) sont
soit extraits, soit ajoutés au substrat. Ils passent par le coenzyme. 


L’enzyme catalyse 2 réactions : new




R − 2H + coenzyme ⎯enzyme
⎯⎯→ R1 + coenzyme − 2H = S + coenzyme


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Précurseurs des co-enzymes :


Les vitamines sont souvent des précurseurs de co-enzymes. Ce sont des petites
biomolécules nécessaires en petite quantité dans le régime des animaux supérieurs.

Les vitamines hydrosolubles sont :


• La vitamine C (ascorbate = anti-oxydant) L’ascorbate est nécessaire à l’hydroxylation

des résidus Proline du collagène, protéine clé du tissu conjonctif. 


• Les vitamines B composant des co-enzymes.

Les vitamines liposolubles sont : 


• La vitamine A (précurseur du rétinal)

• La vitamine D (régulateur du métabolisme de Ca++ et phosphore),
• La vitamine E (anti-oxydant des membranes) ,
• La vitamine K (acteur de la carboxylation du glutamate)


Propriétés générales :

Les coenzymes et co-facteurs sont stables à la chaleur, ils sont de faible masse
moléculaire et ne sont pas responsables de la spécificité des enzymes. Ils sont là pour
aider les enzymes à avoir la réaction catalytique.

À l’inverse des substrats qui sont transformés en produits durant la réaction enzymatique,
ces coenzymes finissent toujours par retrouver leur état initial.

Un même coenzyme tel que l’ATP peut être utilisé par des enzymes de spécificités
différentes mais exerçant le plus souvent un même type d’effet sur S. La
reconnaissance est liée à la structure de l'apoenzyme


Exemple: enzyme Acétyl-CoA carboxylase, pyruvate carboxylase.

Les différents types de co-enzymes:

Les réactions auxquelles participent les co-enzymes sont des réactions de transfert
d’électron, de proton, de groupement phosphate et servent d’accepteurs
temporaires.

• On distingue les co-enzymes activateurs ou groupements prosthétiques qui sont

fortement liés à l’apoenzyme par des liaisons covalentes. Ils ne se détachent pas de
l’apoenzyme au cours de la réaction (exemple : FAD = Flavine Adenine Dinucléotide).

• Les co-enzymes transporteurs ou co-substrats se dissocient facilement de

l’apoenzyme.

Le co-enzyme ne retrouve son état initial que lors d’une 2de réaction faisant intervenir une
2ème Enzyme (comme par exemple l’ATP). Quand l’enzyme est inactive, le coenzyme
n’est pas fixé à l’enzyme.

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III- Les isoenzymes :

De nombreuses enzymes apparaissent sous plus d’une forme moléculaire dans la

même espèce, dans le même tissu, ou la même cellule.

Dans chaque cas, les formes différentes de l’enzyme catalysent la même réaction mais
puisqu’elles ont des propriétés cinétiques différentes et une séquence en AA
nettement différente, elles peuvent être distinguées et séparées par des procédés
appropriés.


→ Ces formes multiples d’enzymes sont des isoenzymes ou isozymes.


Une des 1er enzymes à posséder des formes multiples est la lactate déshydrogénase 

(ou lactico déshydrogénase, LDH) qui est un tétramère qui catalyse la réaction
réversible d’oxydo-réduction dans laquelle le lactate perd 2 atomes d’hydrogène pour
donner du pyruvate.

lactate + NAD + ⎯LDH

⎯⎯ → pyruvate + NADH + H +

La lactate déshydrogénase apparait dans les tissus animaux sous 5 isoenzymes 


(ou isozymes) différents séparables par électrophorèse : cette enzyme catalyse le stade
final de la glycolyse anaérobie dans toutes les cellules.

Méthode : 



On se sert d’anticorps pour repérer les enzymes. On purifie la protéine, puis on développe
un anticorps MAP (monoclonal), à l’aide d’un lapin par exemple.


Une fois que l’on a ça, on fait une électrophorèse avec PAGE (on laisse migrer de + 

vers -) puis on laisse migrer sur le gel de polyacrylamide. Quand la référence arrive à son
niveau final on pose sur une membrane de nitrocellulose, puis on fait chauffer, il y a fusion
des protéines avec le sucre, ce qui fait que cela ne bouge plus.


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 On fait une révélation avec des grains d’argent.
Après on fait un séquençage des protéines, on trouve des monomères et des
hétérodimères.

Il possède une structure formée de 4 sous unités (tétramère), 2 types de sous-unités

différentes sont observés :


- Les chaines M prédominantes dans les isoenzymes des muscles (Muscles)

- Les chaine H prédominantes dans les cellules cardiaques (Heart)
Cathode (-)

Origine

LDH1
Séparation électrophorétique LDH2
des isoenzymes de la lactate
déshydrogénase (LDH) LDH3
LDH4
LDH5

Anode (+)
La composition en AA de ces 2 types de chaînes indique des différences: ces chaines
peuvent s’assembler pour former 5 isoenzymes différentes :

M4 , M 3 H 1 , M 2 H 2 , M 1 H 3 , H 4 


- Leur distribution selon le tissu dépend ainsi de la proportion relative des chaines H et M.

Un seul gène est capable de donner plusieurs protéines : la maturation des différents
ARNm et leurs différentes localisations subcellulaires donnent des protéines différentes;
c’est le principe de l’épissage alternatif. Différents ARNm qui vont coder plusieurs
protéines qui auront la même activité enzymatique. Ce sont des isoenzymes.


À la base les ARN ont la même activité enzymatique

Dans 1 grain de riz il y a 30 000 gènes.

Différentes chaines synthétisées à partir de ses propres gènes.

2 types de facteurs (protéines / peptides actifs) finissent par : (en C-term ) 


1- Un groupe COOH / COO- (30%)

2- CO-NH2, porte une groupe amide. (70%)

Si on retire le groupe amide en C-terminal : perte de l’activité biologique.

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Enzyme d’amidation : La PAM (environ 950 AA) :

Au cours de leur biosynthèse, les peptides biologiquement actifs (neuropeptides et

neurohormones) subissent plusieurs modifications post-traductionnelles.

Un grand nombre de ces peptides sont amidés en position C-terminale (COOH). Cette
fonction amide est essentielle à leur activité biologique.

1) Facteurs: NH2-AA———————AA—COOH —> 30% des protéines

2) Facteurs: NH2-AA———————AA—CONH2 —> 70% des protéines

New :


Il y a une seule enzyme codée par un seul gène responsable de l’amidation (c’est à dire
placer un groupement NH2 en C-term) : c’est la PAM.

La glycine, acide aminé le plus simple, est utilisée par la PAM. En présence de cuivre (co-
facteur) et d’ascorbate (à pH = 7 et température 37°C), et va provoquer l’hydroxylation
du carbone alpha (activité PHM).



Dans les granules de sécrétion de la cellule, à pH acide, le complexe alors hydroxylé
devient stable. On va alors avoir la 2ème activité lyase de l’enzyme qui va créer une
coupure entre NH2 et Cα

PAM = PHM + PAL (ces deux activités peuvent être actives ensembles comme séparées)

La PAM possède donc deux activités :

N-term : hydroxylation du Carbone alpha de la glycine —> PHM

Lyase : rupture NH2 - Cα —> PAL



PAM = PHM + PAL
Ces deux activités fonctionnent ensemble (réunies dans un même peptide) 

comme séparées.

On se retrouve alors avec un peptide amidé + du Glyoxalate.

Tout ce qui est soluble va se déverser et ce qui est membranaire va rester ancré à la
membrane : de la PAM circule dans notre sang

Expérience :

On prend un substrat : D-Tyr-Val-Gly (signal de l’enzyme d’amidation), que l’on marque

radioactivement (pour pouvoir le suivre)

On prend 60 microlitres de plasma + cuivre + ascorbate + air ambiant (O2). On incube le

tout pendant 2h a 37°C.

En présence de la PAM, il devient D-Tyr-Val-CO-NH3+ + Glyoxalate (produit secondaire)

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On prend un gel SPSephadex qui change de pH en fonction du tampon. On travaille à
pH=7 il va être chargé négativement. Tout ce qui est substrat chargé négatif va partir. Les
charges positives vont êtres retenues.

Le produit est chargé positivement et le gel est chargé négativement = réaction entre les
deux, puis lavage (décroche du substrat) et élution.

Tampon chargé beaucoup plus négativement pour détacher le reste.


On analyse le contenu récupéré : Rendement de l’activité d’amidation : 52%

Conclusion il y a de l’activité enzymatique (PAM) qui circule dans mon sang.

Comme la PAM est la seule enzyme d’amidation, elle peut servir de marqueur notamment
dans les tumeurs, qui vont suggérer certaines activités enzymatiques spécifiques et
orienter les traitements. On utilise pas la PAM comme cible thérapeutique

La peptidyl-glycine α-amidating monooxygenase (= PAM;EC 1.14.17.3) catalyse la

réaction d’alpha amidation (c’est le carbone alpha de la glycine qui est hydroxylé) (la PAM
est la seule et unique enzyme responsable des amidations) de ces peptides. 



Il s’agit d’une réaction en 2 étapes dont chacune est
catalysée par un domaine différent de l’enzyme dite alors
« bifonctionnelle » (PHM et PAL). 



Un seul gène complexe code pour la PAM mais des
phénomènes d’épissages alternatifs soumis à une
régulation au cours du développement présentant une
spécificité cellulaire engendrent plusieurs fores d’ARNm
codant pour les différentes formes protéiques de
l’enzyme. 

Environ 250 acides aminés sont utiles à l’activité 

PAL/PHM.



Certains ARNm possèdent des domaines
transmembranaires et d’autres non, ce qui explique la
variation de présence dans les cellules. 


Certaines enzymes seront solubles les autres seront

trans-membranaires dans les grains de sécrétion du
Golgi puis potentiellement à la membrane. 


Tous ce qui est soluble finira dans la circulation. Cette différence entre les enzymes est
due à l’épissage alternatif.

Un seul gène complexe code pour la PAM (28 exons), mais le phénomène d’épissage
alternatif, soumis à une régulation au cours du développement, et présentant une
spécificité cellulaire, engendre plusieurs formes d’ARN messagers codant pour les
différentes formes protéiques de l’enzyme.

FIN DU COURS 16/10/17

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Dans l’hypothalamus il y a la synthèse d’un peptide TRH (Thyrotropin Releasing Hormone)
pour venir vers l’hypophyse.
La structure primaire pGlu—His—Pro—NH2 → peptide fini (c’est la TRH), biologiquement
actif qui va venir s’insérer sur TSH.

Si on prend le cas du TRH, on aura Glu-His-Pro-Gly, la glycine est quelque chose de

commun entre tous les précurseurs juste après l’AA qui va être aminé.


Le TRH est synthétisé à partir du préproTRH (précurseur du TRH). Il contient 5 copies de

la TRH (carrés rouges). Au cours de la maturation, le précurseur va générer 5 molécules
actives de TRH. Le but des modifications est de libérer le tétrapeptide pour que l’enzyme
d'amidation puisse agir afin de donner le produit amidé.
Ce tétrapeptide (Glu-His-Pro-Gly) sera entouré d’un doublet d’AA.


Sur le coté N-term et en C-term idem on va trouver des acides aminés basiques :
Lys-Arg , Lys-Lys ou Arg-Arg.


Des endopeptidases sont spécifiques au doublet d’acides aminés basiques. Il va couper

la liaison peptidique entre Lys-Arg, Lys-Lys ou Arg-Arg.
« Endo » et pas « Exo » car elle va couper entre deux acides aminés.


Après l’action de l’endoprotéase il n’y aura qu’un AA basique de part et d’autre de la

séquence.

Exopeptidases : en N-term l’exopeptidase prend le nom d’amino-exopeptidase et en C-

term c’est une carboxy-exopeptidase.
On se retrouve avec le pGlu—His—Pro—Gly Schéma HC

Pour se protéger, on aura une enzyme qui

va cycliser Glu avec His. (Le « p » signifie
qu’il est cyclisé. Cette cyclisation sert de
protection pendant la circulation
sanguine).

La PAM possède 2 activités : PHM

(monooxygénase) et PAL (lyase). On se
retrouve dans des conditions acides (Golgi
ou grains de sécrétion, pH entre 3,5 et 5,5)

Les cofacteurs sont le cuivre, l’ascorbate,

l’oxygène de l’air et une incubation à 37°C.

L’activité monooxygénase de la PHM

hydroxyle le carbone α de la glycine, c’est
pour ça qu’on parle de réaction d’alpha-
amidation. Le groupe hydroxyle est stable
à pH acide, mais biologiquement inactif.

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La lyase fonctionne à pH acide nécessaire pour catalyser la rupture entre N et Cα. Si il n’y
a pas d’activité lyase, le peptide restera un produit intermédiaire inactif sur le plan
biologique.
À la fin on a du pGlu—His—Pro—NH2 + glyoxalate

On peut doser la pGlu-His-Pro-NH2 avec un anticorps anti TRH ou anti glyoxalate.

L’anticorps reconnait seulement la forme amidée et pas la forme avec la glycine. La
spécificité est orientée vers la région aminée, incapable donc de reconnaitre si il y a
encore la glycine.

Si il n’y avait pas de modification, on aurait 100% des protéines avec un groupement
COOH (chargé + a pH = 7) mais dans la nature 70% des peptides présentent un groupe
amide CO-NH2 (chargé - à pH = 7) au lieu du groupe COOH.

Toute protéine qui porte en C-terminal une fonction amide a subi l’action de la PAM.

Dans le précurseur : (C’est la même chose mais version 2016)




Deux acides aminés basiques encadrent de chaque côté (à gauche 

Lys-Arg , Arg-Lys ou Lys-Lys et à droite Arg-Arg, ou Arg-Lys ou Lys-Lys) le peptide de la
protéine mature. Avant l’acide amine qui sera amidé, on trouve également une glycine. 



On applique ensuite du coté C et N terminal une endopeptidase pour couper un Arg. Enfin,
on applique du coté C terminal une carboxypeptidase pour couper le dernier AA basique
au précurseur et une amino peptidase coté N terminal pour couper le dernier AA du
précurseur.
Le résidu Glycine est absolument nécessaire à l'activité de la PAM (signal pour la PAM).



Dans un premier temps, on a une première famille d'endopeptidase qui coupe les liaisons
entre les AA basiques. On a une Arginine en N-term et une en C-term.


Ensuite c'est une deuxième famille de peptidases qui sont des exopeptidases qui vont
couper l'Arginine en N-term et celle en C-term. Donc en N-term on a rien de spécial et en
C-term on a la glycine, donc notre peptide est biologiquement non actif.

Ce résidu va être hydroxylé en hydroxyGlycine par l'activité PHM de PAM puis clivé à son
premier tiers par la PAL de PAM. Le produit est stable à pH acide.

PAL va rompre la liaison NH-Cα à l'intérieur de l'hydroxyglycine. On aura donc un peptide

ne terminant plus par Tyr-Gly C-terminal mais par Tyr-NH2 (on rajoute un Tyr car on peut
tout faire avec).

La deuxième activité se fait seule à pH basique. Mais dans le corps, PAM est en milieu
acide (pH=5), à ce pH, elle fonctionne très bien mais, elle ne peut pas fonctionner sans
son activité lyase (car le peptide après hydroxylation par PAM est stable à ce pH). 



En revanche, si on place la PAM à pH basique (son pH optimum), à ce pH l’hydroxylation
du peptide par PHM rend la liaison entre Cα et NH2 très fragile, elle se coupe donc toute
seule, et il n y a alors pas besoin de l’activité lyase de la PAM (mais PAL n’est pas inactive
pour autant). Donc la 2ème activité lyase de PAM se fait bien à pH acide, mais la coupure
se fait toute seule à pH basique.



Page 14 sur 56
L’enzyme d’amidation possède 2 activités : la 1ère est l’hydroxylation au niveau du Cα
créant une liaison OH (nuage électronique vers H).


La 2ème activité est dans l’hypophyse, il existe un peptide CRM qui a un rôle important
dans l’axe hypothalamo-hypophysaire, elle permet son amidification. Une déficience de
la PAM empêchant cette amidification ne serait alors pas viable.

Exemple : CRF sans amidation = effet divisé par 1000-2000 par rapport à la forme amidée

La PAM a comme cofacteur le cuivre, ascorbate, oxygene

Un lien intéressant (HC) qui semble être en relation avec les expériences et en plus rédigé
par le dit professeur.. —> Cliquer ici

La concentration en glyoxalate permet de mesurer l’activité de la PAM

Diapo du prof

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 Leonor Michaelis
IV) Cinétique Enzymatique :
La capacité catalytique des enzymes est très diverse, l’activité
catalytique d’une enzyme est mise en évidence par l’étude de sa
cinétique c’est à dire par la vitesse à laquelle elle catalyse une
réaction dans différentes conditions expérimentales.

En 1913, Leonor Michaelis et Maud Menten ont décrit la relation

mathématique entre la concentration du substrat et la rapidité de
la réaction enzymatique mesurée par la quantité de produits
formés (ou de S consommés) en un temps donné.

On a déterminé la vitesse initiale pour une série de mélanges

contenant la même quantité d’enzymes pour des concentrations
croissantes de substrat.

Chaque enzyme possède sa propre constante de Michaelis

On voit bien que la vitesse initiale de la réaction varie beaucoup avec

la concentration du substrat. Cet effet repose sur la capacité de
chaque enzyme.
Maud Menten
Lorsque la concentration du S est faible, les molécules d’enzymes sont soumises à un
nombre relativement limité de collisions avec le substrat pendant un temps donné.
Les molécules de S sont le facteur qui limite la vitesse.

À l’opposé, aux concentrations élevées de S, les enzymes entrent en collision avec les
molécules de S plus rapidement que celles-ci ne peuvent être transformées en produits. 


Lorsque le substrat est très concentré, les molécules enzymatiques individuelles

travaillent donc à leur capacité maximale. Donc la vitesse est limitée par les molécules
d’enzyme. 


Lorsque la concentration du substrat augmente progressivement, l’enzyme se rapproche

d’un état de saturation: la vitesse à ce point théorique de saturation est la vitesse
maximale appelée Vmax.

La constante de Michaelis KM est égale à la concentration de S au moment où la

V
vitesse de réaction atteint la moitié de Vmax. K M = max
2

À forte concentration :



La vitesse est limitée par les molécules d’enzyme


À basse concentration :


Les molécules de substrat limitent la vitesse

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Comme son nom l’indique, la constante KM (en mM) est une constante pour une enzyme
donnée, elle est indépendante du S et de la concentration de l’enzyme.

La meilleure estimation de la relation entre Vmax et KM est donnée par l’équation de

Michaelis-Menten que l’on peut utiliser pour tracer le graphique (plus Km est petit, plus
l’affinité est grande entre enzyme et substrat et inversement).

V = V max
[ S ] si [ S ] = Km
[ S ] + Km
V max
alors V=
2

V) Vitesse de réaction :


Les enzymes augmentent considérablement la vitesse des réactions chimiques
spécifiques qui ne pourraient se produire que très lentement.
Ils augmentent la vitesse des réactions en abaissant leur énergie d’activation.

Une réaction chimique telle que A+B → AB s’effectue car une certaine fraction des
molécules A et B arrivées à un moment donné possède plus d’énergie interne que le
reste de la population, énergie suffisante pour les amener au sommet de la colline
énergétique à une forme réactive appelée état de transition.

Les substrats A et B en conditions normales, requièrent une quantité d’énergie

considérable E1 pour atteindre l’état de transition AB à la suite duquel le produit de la
réaction AB peut se former.


L’enzyme crée un micro environnement dans lequel A et B peuvent atteindre un état de

transition (AEB) plus facilement, réduisant par conséquent la quantité d’énergie
requise (E2).



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 Comme il est plus facile d’atteindre un niveau d’énergie inférieur, la réaction peut 

avoir lieu plus fréquemment ce qui se traduit par une vitesse de réaction accrue.

Énergie libre d’activation

ΔG** de la réaction en ΔG Liaison
Variation d’énergie l’absence d’enzyme
libre lors d’une Énergie libre G
réaction Énergie libre d’activation
enzymatique : 
 ΔG** de la réaction en

 présence d’enzyme
Les enzymes
diminuent l’énergie Variation d’énergie libre
d’activation. ΔG de la réaction

Étapes de la réaction

Substrat État de transition Produit

L’énergie d’activation d’une réaction est la quantité d’énergie en calories nécessaire

pour amener toutes les molécules d’une mole de substance à une température donnée à
l’état de transition au sommet de la barrière énergétique.

La vitesse d’une réaction chimique est proportionnelle à la concentration des espèces

en état de transition.

La vitesse d’une réaction chimique sera très élevée si une grande fraction des molécules
A et B se trouve dans un état de transition riche en énergie.

Et elle sera très faible si seulement une petite fraction des molécules A et B se trouve
dans cet état de transition.

Il existe 2 méthodes pour augmenter la vitesse d’une réaction chimique:

- L’une est l’augmentation de la Température qui augmente la fraction ayant une

énergie interne suffisante pour entrer dans l’état de transition.

La vitesse d’une réaction chimique est approximativement doublée par une augmentation
de 10°C de la Température.

- L’autre méthode consiste à ajouter un catalyseur ou une enzyme.

L’enzyme se combine transitoirement au substrat A et B pour produire un nouveau
complexe dont l’état de transition possède une énergie d’activation beaucoup plus
basse que l’état de transition de A et B dans la réaction non catalysée. 


Les catalyseurs et les enzymes abaissent donc l’énergie d’activation des réactions
chimiques. Exemple d’une réaction avec et sans enzyme:

H2O2 → H2O + 1/2 O2

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Énergie d’activation (Ea):

a. Ea = 18 kcal/mol sans catalyseur

b. Ea : 12 kcal/mol avec un platine colloïdal (catalyseur chimique)
c. Ea = 6 kcal/mol en présence de la catalase (enzyme). Km = 25 μM

VI) Les facteurs modifiant la vitesse de réaction enzymatique :


- Les concentrations en enzymes et en substrats (l’enzyme en présence d’une forte

concentration en substrat est saturée).

Quand l’enzyme est saturée, la vitesse initiale est égale à la vitesse maximale (Vmax).

- Les concentrations en ions métalliques.


- Les caractéristiques physico-chimique du milieu des réactions (Température/pH)


- La présence d’inhibiteur de la réaction enzymatique.

La PAM a besoin d’une concentration précise de cuivre (son cofacteur). La même enzyme
ne travaille pas à la même concentration selon l’endroit où elle se trouve.


Au niveau de l’hypophyse on a le maximum de rendement de synthèse pour une

concentration de cuivre de 3μM. Si on augmente trop la concentration on va perturber
l’enzyme qui va finir par perdre son activité.

On fait la même chose pour l’ascorbate : courbe pour voir à quelle concentration il y a le
meilleur rendement.

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Influence de la température :

La Température a une influence sur la vitesse des réactions enzymatiques 


comme pour n’importe quelle réaction chimique.

Par exemple, varie avec la T°: (reformulé)


À 100°C on dénature la protéine → pas de retour possible

On observera un précipité dans le tube, c’est la protéine dénaturée.

Si on traite la protéine à maximum 60°C on pourra avoir un retour en arrière et retrouver

l’activité de la protéine.

- La structure de l’enzyme (la température peut modifier sa conformation, par exemple; si

une enzyme enchâssée dans la MP et qu’elle fonctionne, l’augmentation de la
température va perturber la bicouche ce qui va avoir des répercussions sur la structure
3D de la protéine donc sur l’activité de l’enzyme).

- Au delà de 60-70°C, par exemple à 100°C pendant 10 minutes, on ne pourra plus revenir
vers une conformation active de la protéine, on a perdu la conformation globulaire, on a
une conformation complètement linéaire.


Après le passage à 100°C, on le centrifuge (passage dans la glace), on le fait tourner et

au retrouvera au fond un précipité qui est la protéine dénaturée sous forme linéaire. 

Elle a changé de densité, devenue précipitable, à une grande vitesse de rotation.

- La stabilité du complexe ES.

- L’ionisation de certains sites.
- L’environnement de l’enzyme (la concentration en substrat, solubilité de l’oxygène
(substrat des oxydases).

Par exemple  : 



Enzyme ancrée dans la membrane cellulaire, comme l’isozyme transmembranaire de la
PAM. En augmentant la température on perturbe la membrane (changement de fluidité/
viscosité du milieu, de la structure lipidique), ce qui affecte la structure 3D de l’enzyme,
perturbée par son environnement et par la température. On peut provoquer une
dénaturation réversible ou non, par modification du site actif),

- La fluidité de la phase lipidique des membranes

- La concentration d’un substrat

→ En résumé : La concentration d'un substrat (par exemple l’oxygène qui est un substrat
pour les oxydases) diminue par élévation de température.

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 La réaction enzymatique ralentit et s’arrête rapidement au delà d’une certaine zone de
température à cause de la dénaturation de la protéine.


Les enzymes possèdent une Température optimale en conditions optimales qui doit
approcher les 37-38°C et peut augmenter jusqu’à 60° pour conservation de cette activité
optimale (mais au delà de 60° l’activité ne sera plus que partielle).


Il existe cependant des enzymes thermostables telles que l’ADN polymérase utilisant la
PCR autour de 68°/72°C (réaction en chaine). 



Exemple : Fossile: on extrait l’ADN et on veut l’amplifier. On fait une PCR à l’aide de la Taq
polymérase.


→La Taq polymérase fonctionne à 68°C - 72°C, on l’utilise avec le MgCl2- (cofacteur). On
a des primers (amorces) sens et anti-sens. La Taq polymérase a donc besoin de
magnésium pour fonctionner.

3 étapes de la PCR: (Polymerase Chain Reaction) (new)


1) À 96° séparation des constituants en 30 secondes. C’est une étape de dénaturation.


2) Puis 50-60° (température d’hybridation) pendant deux minutes pour hybrider les
amorces dégénérées entre elles. On vient de former le complexe AA-primer. 

La séquence double brin peut alors être utilisée par la Taq polymérase pour débuter la
synthèse.


3) On met la Taq polymérase à 68/72°C pendant 2 minutes.


On fait 45 cycles comme ça (cela dure 1h30-2h). 




Après ça, 72°C pendant 10 minutes, pour que la Taq polymérase puisse finir les synthèses
qu’elle a commencé. On récupère le type contrôle. On prépare un gel d'agarose pour faire
migrer les produits.



Après le séquençage on aura la séquence complète des 500 paires de bases.

On est passé de 10 ans à une semaine pour séquencer le génome humain.


L’utilisation de la PCR est quotidienne dans les laboratoires pour aller chercher un gène
spécifique afin de trouver une interaction moléculaire et pouvoir prescrire un médicament.

Schéma HC : pour la
compréhension

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L’effet du pH :

Selon les activités de l’enzyme le pH change.

Les inhibiteurs sont spécifiques des enzymes. On peut déterminer la concentration

d’inhibiteur nécessaire à l’inhibition de l’enzyme

Pour définir la zone de fonctionnement du système enzymatique, la réaction enzymatique

est dosée à diverses valeurs de pH en utilisant chaque fois un tampon convenable.

Le pH du milieu intervient sur l’état d’ionisation de nombreux sites internes à la molécule

d’enzyme, ces effets sont donc multiples sur :


- La structure de l’enzyme
- L’association entre l’enzyme et le substrat
- Le mécanisme réactionnel.

Les enzymes possèdent un pH optimal selon les réactions, le complexe enzyme substrat
devra se faire à pH neutre comme pour l’hydrolyse de l’amidon, à pH acide environ 3 pour
la pepsine, 8 pour la trypsine.

Courbes d’activité en fonction du

pH de 2 enzymes.

(a) Le pepsine et (b) la glucose 


6-phosphatase

Effet de pH sur l’activité

d’amidation


L’état de protonation soit du site actif soit du site de liaison peut en effet être critique dans
l’activité de l’enzyme. 


L’activité catalytique des enzymes dans les cellules peut être régulée en partie par des
modifications du pH des milieux environnants (on passe direct à « mode d’action des enzymes)

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 VI) Inactivation thermique des enzymes :
La dénaturation thermique des enzymes entraine leur inactivation en général de façon
irréversible. La dénaturation provoque des changements de formes de la protéine qui
peut passer d’une forme globulaire à une forme allongée et devenir insoluble. C’est le
cas de la dénaturation suivie de centrifugation et du précipité au fond du tube cf exemple
précédent.

Réponses aux questions : 2016

Dosage: On met une glycine en C terminal, pour servir de signal d’amidation par la PAM
La D tyrosine permet d’éviter d’être dégradée, protéger de déégradation par endo/
exoprotéases, marquée à l’iode 125 (radioactif), il était facile à marquer car il y a un cycle

PAM D-Tyr Val

D-Tyr Val Gly Ascorbate + O2
3h à 37°C
Iode 125 Iode 125

+ Glyoxalate

C’est ce dosage qui a permis de purifier la PAM, en vérifiant que l’échantillon contenait la
PAM, en purifiant environ 500 fois. On peut ensuite développer un Ac pour isoler cette
protéine. On peut la séquencer, etc…

Dans les témoins de l’expérience on substituait la glycine par d’autres acides aminés pour
vérifier que c’est la glycine qui est nécessaire à la réaction. L’hypothèse a été vérifiée

Si on fait un KO de la PAM les organes ne fonctionnent pas ou pas normalement: chez la

souris, les foetus meurent en 1 ou 2 jours. On ne peut pas utiliser la PAM contre un cancer
car cela provoquerait le décès du patient

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 Partie 2 - Mode d’action des enzymes :

I) Cinétique enzymatique :
La formation d’un complexe ES est la 1ère étape de la catalyse enzymatique. Une grande
partie du pouvoir catalytique des enzymes vient du fait qu’ils se mettent en présence du S
dans des orientations favorables au sein de complexes ES. Les S sont liés à une
région spécifique de l’enzyme appelée site actif. 


La plupart des enzymes sont très sélectives dans leur liaison avec les substrats.

L’existence des complexe ES a été mise en évidence de différentes façons :

À une concentration constante d’enzyme, la vitesse de réaction augmente avec
l’augmentation de la concentration de S jusqu’à ce qu’une vitesse maximale soit
atteinte.


Les complexes ES ont été visualisés directement par ME comme dans le cas de l’ADN
polymérase 1 lié à la matrice de l’ADN.

Les caractéristiques spectroscopiques de nombreux enzymes ou substrats changent

lors de la formation d’un complexe ES. Ces changements sont particulièrement
frappants lorsque l’enzyme contient un groupement prosthétique coloré.


La tryptophane synthétase, enzyme bactérienne liée de façon covalente au groupement

prosthétique pyridoxal phosphate (PLP) (molécule fluorescente) composant de la vitamine
B6.
Cette enzyme catalyse la synthèse des L-Tryptophane à partir de la L-Sérine et d’un
dérivé indole.


L’addition de L-Sérine à l’enzyme produit une augmentation très marquée de la

fluorescence du groupe PLP.
L’addition d’indole, second substrat réduit cette fluorescence à un niveau plus bas que
celui de l’enzyme seule.

L-Sérine + Indole ⎯PLP

⎯⎯⎯⎯⎯
+ Trp synthétase
→ L-Tryptophane

La spectroscopie de fluorescence révèle l’existence d’un complexe enzyme-sérine et

un complexe enzyme-sérine-indole.

Changements des caractéristiques

spectroscopiques lors de la formation du
complexe enzyme-substrat.

L’intensité de la fluorescence du groupe

pyridoxal phosphate du site actif de la
tryptophane synthétase varie avec l’addition
des substrats, la sérine et l’indole

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II) Le site actif :
Le site actif d’une enzyme est la région qui lie les Substrats et contient les résidus qui
participent directement à la formation ou au clivage des liaisons.
Ces résidus sont appelés groupes catalytiques (nécessaires à l’activité enzymatique)

Bien que les enzymes diffèrent largement dans leur structure, leur spécificité et leur rôle
de catalyse, un certain nombre de caractères généraux concernant leur site actif peut
être établi.

Pour obtenir la forme linéaire on traite la forme tridimensionnelle à haute température puis
on la fait migrer sur un gel (marche mieux quand c’est un gel dénaturant) : on aura la
forme linéaire, la protéine sera dénaturée.

1) Structure du site actif :

Le site actif occupe une part relativement réduite du volume total de l’enzyme. 

La plupart des résidus aminoacides d’une enzyme ne sont pas en contact avec le
Substrat.
La structure du site actif dépend du repliement correct de la chaine polypeptidique.

Le site actif est une entité tridimensionnelle constituée de groupes venant de

différentes régions de la séquence linéaire des aminoacides. 



Les résidus éloignés dans la séquence linéaire peuvent interagir plus fortement que les
résidus adjacents dans la séquence des AA.

Dans tous les enzymes de structures connus, les molécules de substrat sont liées au site
actif.

Exemple dans le lysozyme: Les groupes importants du site actif sont constitués par
des résidus qui portent les numéros 35, 52, 62, 63,101 et 108 dans la séquence linéaire
des 129 AA.


→ S’il y a une mutation des AA aux niveau de ces numéros là, cela veut dire que le
lysosyme va perdre son activité enzymatique. Le site actif perd son activité catalytique. Il
peut y avoir une mutation qui entraine une augmentation de l’effet de EGFR, cela fait une
boucle sans fin

Les sites actifs peuvent inclure des résidus très distants dans la structure primaire.

Les sites actifs sont des fissures ou des crevasses : dans toutes les enzymes de
structures connues, les molécules de S sont liées à une fissure ou à une crevasse.

Les sites actifs peuvent

inclure des résidus très
distants dans la structure
primaire
Page 25 sur 56
2) Spécificité du site actif :

La spécificité de liaison dépend de la disposition définie des atomes dans un site actif.
Un substrat doit avoir une forme complémentaire à celle du site pour s’adapter à lui.

Les études sur la spécificité du substrat d’une enzyme ont conduit aux concepts d’une
complémentarité du type clé-serrure entre la molécule de substrat et le site actif.

Formation du complexe 

enzyme-substrat selon le modèle
clé-serrure

Certaines enzymes ont des formes complémentaires de celles du substrat seulement

après que celui ci se soit lié.


Ce processus de reconnaissance dynamique est appelé adaptation induite.

Metalloprotéase : enzyme dont le site actif a besoin d’interagir avec des métaux.

Sites actifs de 3
classes de
protéases

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 3) Liaison du substrat :


Les substrats sont liés aux enzymes par de multiples attractions

faibles. 


Les interactions réversibles entre deux molécules sont médiées par : 


- Les liaisons électrostatiques
- Les liaisons hydrogène
- Les interactions hydrophobes
- Les liaisons de Van der Waals.

Kinase : processus de phosphorylation avec l’ATP. Le phosphate

gamma de l’ATP va être clivé pour être greffé sur le substrat en
question.

Le glucose va glisser à l’intérieur du site actif de l’hexokinase, il va y avoir un changement

de conformation pour refermer la fissure par laquelle le glucose est rentré. Il va y avoir
phosphorylation. L’hexokinase va donc phosphoryler le glucose.

4) Modification du Substrat :

Elle fait intervenir des modifications de l’enzyme avec des transferts d’électrons ou
d’atomes entre l’enzyme et le substrat.
L’énergie de liaison entre l’enzyme et le substrat atteint un maximum au moment de la
catalyse, c’est-à-dire quand celui-ci est sous la forme d’état de transition. (AEB)

Le modèle clé-serrure proposé par Fisher en 1890 rend compte de la liaison du

substrat mais pas de celle des états de transition. E + S ↔ ES ↔ ES* → P + E

Changement de
conformation après
formation du complexe
enzyme-substrat

En thérapeutique, il faut essayer d’élaborer des médicaments inhibiteurs le plus proche de

l’état de transition et non pas de l’état initial.

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Le bon modèle est celui du Bâton :

Bâton → 1/2 bâton

« batonase »

On imagine une enzyme: la batonase définie pour catalyser la cassure d’un bâton de
métal.

a) Pour se casser le bâton doit d’abord être plié: c’est l’état de transition
Dans la bâtonase, des interactions magnétiques remplacent les liaisons de faibles
énergies entre l’enzyme et le substrat.

b) Une enzyme avec une poche doublée d’aimants complémentaire de la structure du

bâton va le stabiliser (qui remplaceraient les liaisons hydrogènes, les liaisons
électrostatiques etc.). Il ne pourra plus être plié à cause des attractions magnétiques
échangées avec l’enzyme.


c) Une enzyme complémentaire de l’état de transition permettra de déstabiliser le

bâton et donc de catalyser la réaction. 

Les interactions magnétiques fournissent l’énergie nécessaire pour plier le bâton.

Pour catalyser une réaction, l’enzyme doit être complémentaire de l’état de transition de
la réaction.

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III- L’influence des inhibiteurs des enzymes :

L’activité de nombreuses enzymes peut être inhibée par les liaisons de molécules
spécifiques. La plupart des enzymes peuvent être rendues inefficaces par certains
réactifs chimiques.

L’étude des inhibiteurs enzymatiques a fourni des informations sur la spécificité de

substrat des enzymes, la nature des groupements fonctionnels du site actif et le
mécanisme de l’activité catalytique.

L’inhibition enzymatique peut être soit réversible, soit irréversible. Il existe 2 types
d’inhibiteurs enzymatiques, les inhibiteurs irréversibles et les réversibles.

A- Inhibiteurs irréversibles :

Ce sont ceux qui se combinent avec ou qui détruisent un groupement fonctionnel de

l’enzyme (nécessaire à l’enzyme, souvent un groupement catalytique : AA nécessaires à la
catalyse) qui est nécessaire à son activité catalytique.

Les inhibiteurs irréversibles entrainent une perte des propriétés catalytiques de l’E soit
par modification de sa conformation, soit par blocage du site actif de l’enzyme. 

Exemple : métaux lourds et agents alkylants.

Les inhibiteurs irréversibles peuvent être répartis en 3 catégories :


- Les réactifs spécifiques de groupe

- Les analogues du substrat
- Les inhibiteurs suicides

Exemple : Aspirine et pénicilline

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Quelques exemples d’inhibiteurs irréversibles :

L’aspirine est un inhibiteur de la cyclooxygénase.

L’aspirine (acide acétylsalicylique) agit par modification covalente de l’enzyme 


cyclo-oxygénase (c’est l’enzyme qui nous a fait mal jusqu’à ce qu’on prenne un cachet) ce qui réduit la
synthèse des prostaglandines et des thromboxanes à la base de signaux
d’inflammations. 


Il se comporte comme un inhibiteur irréversible des sites actifs des cyclo-oxygénases en

acétylant une Sérine du site actif. Liaison covalente avec groupement OH de la Sérine.
Le site actif de la cyclooxygénase est uniquement formé de la Sérine.

Exemple 2: La Pénicilline = antibiotique 




C’est un analogue du substrat naturel de la glycopeptide transpeptidase bactérienne
(enzyme responsable de la synthèse de la paroi bactérienne) qui se comporte comme un
substrat suicide.


Le groupement C=O du cycle de Lactame de la pénicilline réagit par formation d’une
liaison covalente entre l’hydroxyle d’une Serine du site actif de l’enzyme, aboutissant à
son inhibition irréversible.
→ Le résultat sera l'arrêt de la synthèse de la paroi des cellules bactériennes et donc la
mort des bactéries (nécessite 24 à 48h pour commencer à faire sentir une différence à
l’hôte). 


Le traitement antibiotique doit absolument être suivi durant la durée annoncée par le
médecin (exemple : 5-7 jours) pour faire disparaitre définitivement la souche bactérienne
et éviter que la bactérie ne s’habitue pas à l’antibiotique.

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L’iodoacétamide :

L’iodoacétamide: qui peut agir avec des groupes sulfidryles (thiol SH)
du résidu de la cystéine, avec l’imidazole du résidu histidine.


À l’aide de ces inhibiteurs l’hydroxyle de la Sérine, le thiol de la

Cystéine et l’imidazole de l’histidine ont été identifiés comme
participants à l‘activité catalytique de différentes catégories
d’enzymes.


On purifie une protéine (solution homogène de protéine) et on cherche à la séquencer. 


On développe des anticorps contre cette protéine en l’injectant au lapin. 

On va la séquencer et l’enregistrer dans une banque de données. À ce stade on ne
connait pas encore les sites catalytiques. 



On fait un test avec l’iodoacétamide :


Si on n’inhibe pas l’activité avec ce test (si on a un produit) ça signifie qu’il n’y a pas de
cystéine, pas de sérine et pas d’histidine. Cette démarche est toujours utilisée, on utilise
des inhibiteurs des groupements catalytiques (qui agissent de façon covalente avec les
AA). Pour cette expérience, on a éliminé 3 AA (sérine, cystéine, histidine) sur 20, il nous
en reste donc 17 à tester.
On connait aujourd’hui tous les groupements catalytiques grâce à cette expérience.

Si on a plus de synthèse de produit en présence d’iodoacétamide, on sait que dans le site

catalytique, il y a soit la sérine, soit la cystéine, soit l’histidine soit les trois. On fera alors
une expérience pour désigner les sites catalytiques spécifiques de cette enzyme.

B- Les inhibiteurs réversibles :

L’inhibition réversible contrairement à l’inhibition irréversible est caractérisée par une

dissociation rapide du complexe enzyme-inhibiteur. On distingue selon leurs
mécanismes d’action 2 types principaux: les inhibiteurs compétitifs et les inhibiteurs
non compétitifs. ⎯⎯
E+I← ⎯
→ EI
⎯

a) Les inhibiteurs compétitifs :

Les inhibiteurs compétitifs: dans une inhibition compétitive, l’enzyme peut se lier au
substrat pour former un complexe ES ou se lier à l’inhibiteur (pour un complexe EI)
mais il ne peut pas former un complexe EIS : jamais les 2 en même temps (jamais ESI)
car l’inhibiteur comme le substrat cherche à interagir avec l’enzyme sur le même site, donc
les 2 ne peuvent pas s’y fixer en même temps. 


Ainsi en augmentant la concentration de I on aura une majorité de complexe EI, et en

augmentant la concentration de S on aura une majorité de complexe ES.

L'inhibiteur compétitif ressemble au substrat et se lie au site actif de l’enzyme.

Le substrat est alors empêché de se lier au même site actif. 


Page 31 sur 56
Un inhibiteur compétitif diminue la vitesse de catalyse en réduisant la proportion de
molécules d’enzymes liées au substrat.

➜ À une concentration d'inhibiteur donnée, l’inhibition compétitive peut être levée par
augmentation de la concentration du substrat.

Exemple d’inhibiteur compétitif à potentiel thérapeutique :

L’éthanol et l’intoxication par l’alcool à bruler.


On peut utiliser les inhibiteurs compétitifs en thérapeutique notamment dans le traitement

médical de certaines intoxications, c’est le cas de l’intoxication par l’alcool à brûler.

Ce composé ménager est composé d’éthanol volontairement additionné de méthanol
(environ 5% en volume) pour éviter sa consommation.


Or, le méthanol possède une forte toxicité tissulaire, en effet l’alcool déshydrogénase
(ADH) métabolise le méthanol en formaldéhyde très toxique pour les tissus dont le
cristallin.
alcool déshydrogénase + méthanol ⎯⎯
→ formaldéhyde

Le formaldéhyde est très toxique pour les tissus, notamment le cristallin, il y a un risque
irréversible de perdre la vue en cas d’intoxication aiguë (= cécité).

Pour bloquer la formation de formaldéhyde, on perfuse une solution diluée d’éthanol qui
se comporte alors comme un inhibiteur compétitif de l’enzyme (afin de bloquer la
formation de complexes Enzyme-méthanol, jusqu'à ce que le méthanol soit éliminé par les
urines). 



Grâce à cette inhibition compétitive, au lieu d’avoir formation de formaldéhyde, on aura la
synthèse de l’acétaldéhyde (non toxique)


L’éthanol est donc utilisé ici comme agent thérapeutique en cas d’intoxication aiguë au
méthanol.

Page 32 sur 56
 Si le substrat se trouve directement dans la
solution, on peut avoir E-S directement. 


Sinon on peut passer de EI quand la

concentration de substrat augmente. Quand
on augmente la concentration en substrat on
va libérer des inhibiteurs, ça va amener à plus
de complexes E-S.


Ce qui va amener à plus de complexes


Enzyme-Produit

b) Les inhibiteurs non compétitifs :

Dans l’inhibition non compétitive, l’inhibiteur se lie à un site de l’enzyme autre que le
site de fixation du substrat, ce qui altère la conformation de l’enzyme et produit une
inactivation réversible du site catalytique.

Les inhibiteurs non compétitifs se fixent réversiblement à la fois à l’enzyme libre et au

complexe ES pour former des complexes inactifs EI et EIS (à l’inverse de l'inhibition
compétitive).

L’inhibition non compétitive contrairement à l’inhibition compétitive ne peut être surmontée

par l’augmentation de la concentration du substrat.
(S augmente, on ne peut pas agir la vitesse de réaction, elle reste la même)

Ajout du substrat à E+I (il y a +I donc pas de

complexe formé), donc il va y avoir des enzymes
qui vont interagir avec le substrat, sans que
l'inhibiteur n’ait eu le temps d'interagir, il va donc il
y avoir formation de l'enzyme + produit.


Ajout du substrat à EI, on va avoir ESI et on aura

zéro produit. Le complexe E-S-I va se stabiliser.

 Il y aura toujours de temps à autre un complexe E-
S-I qui va se libérer de son inhibiteur pour donner
un complexe E-S, puis Enzyme + Produit

Différences entre compétitive/ non compétitive :


Les mesures de la vitesse de catalyse à différentes concentrations de substrats et

d’inhibiteurs permettent de faire la distinction entre l’inhibition compétitive et non
compétitive.

• Dans l’inhibition compétitive : L’inhibiteur rentre en compétition avec le Substrat

pour le site actif. 


La constante de dissociation de l’inhibiteur est donnée par la formule :

KI =
[ E ].[ I ]
[ EI ] Page 33 sur 56
Étant donné que l’augmentation de la quantité de S peut surmonter l’inhibition, Vmax
peut être atteinte en présence d’un inhibiteur compétitif.

Le caractère propre d’une inhibition compétitive est qu’elle peut être levée par une
concentration suffisamment élevée de substrat.

Dans une inhibition compétitive, la Vmax ne va pas changer puisque je suis capable de la
retrouver mais le Km va changer.


La valeur apparente de Km est modifiée.

L’effet d’un inhibiteur compétitif est d’augmenter la valeur apparente de Km.

Quand la valeur de la concentration de l’inhibiteur augmente, la valeur de Km

apparente augmente. En présence d’un inhibiteur compétitif, une enzyme aura la même
vitesse maximale qu’en l’absence de ce dernier

• Dans l’inhibition non compétitive:

Le substrat peut encore se lier au complexe EI, cependant le complexe EIS ne donne
pas naissance à un produit.

Cas non compétitif: La valeur de Vmax est diminuée à une valeur de Vmax apparente
alors que la valeur de Km est inchangée.

L’inhibiteur abaisse la concentration de l’enzyme.

Par nature, l'inhibiteur abaisse simplement la concentration de l’enzyme fonctionnelle,

l’enzyme restante se comporte comme une solution diluée d’enzyme. → Vmax est
abaissée mais Km est la même.


L’inhibition non compétitive ne peut pas être levée par augmentation de la

concentration en substrat à la différence de l'inhibition compétitive.

Page 34 sur 56
Les analogues de l’état de transition sont de puissants inhibiteurs des enzymes.
La structure du substrat état de transition peut être mimée par une molécule stable
désignée analogue de l’état de transition.


La synthèse des composés qui ressemblent plus étroitement à l’état de transition que le
substrat lui même peut conduire à des inhibiteurs très puissants et très spécifiques des
enzymes.
FIN DU COURS 20/10/17

Les inhibiteurs suicides : 


Hors concours car « l’année dernière ça a posé problème »

Ce sont des substrats modifiés qui rapportent le moyen le plus spécifique de modifier le
site actif d’une enzyme. L’inhibiteur se lie à l’enzyme comme un substrat et il est tout
d’abord traité par le mécanisme catalytique normal. 



Ce dernier génère ensuite un intermédiaire chimiquement réactif qui inactive l’enzyme
par modification covalente.
Le fait que l’enzyme participe à sa propre inhibition irréversible suggère fortement que le
groupe de l’enzyme modifié par covalence est catalytiquement vital.


On peut prendre comme exemple le mécanisme d'action de la pénicilline, cette dernière

tue les bactéries en inactivant la trans-peptidase, enzyme catalysant la dernière étape de
la synthèse du peptido glycane de la paroi des bactéries.


La pénicilline et les céphalosporines, en général, réagissent avec le groupe hydroxyle du

site actif de l'enzyme (réagissant avec la sérine), ce qui conduit à la formation d'un
acylenzyme très stable.


Avec la pénicilline, le complexe EI (instable et réactif) est non covalent et EI* (très stable
et facteur limitant de la réaction) est covalent.

Avant la catalyse, EI*, on peut sauver l’enzyme en augmentant la concentration de

substrat.


L'étape de libération du produit à partir du complexe EI* correspond à l'hydrolyse de

l'acylenzyme, elle est très lente contrairement à la formation du complexe EI* qui est très
rapide.

E + I —> EI (K1 très importante), étape réversible

EI —> EI* (K2 très importante)

K3 est très faible par rapport aux 2 précédentes.


Ces caractéristiques assurent l'immobilisation de l'enzyme sous forme d'un complexe

acylé inactif et explique l'efficacité de cette famille d'antibiotiques.


Étant donné que la peptidase participe à sa propre inactivation, la pénicilline agit comme
un inhibiteur suicide.

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IV) Cancers :
Mutations du récepteur à l’EGF (EGFR) dans le cancer du poumon et de BRAF dans les
mélanomes.

1) CBNPC: cancer bronchique non à petites cellules :

L’EGFR un coeur de la carcinogenèse à l’origine d’une cascade de mécanismes

tumoraux :



















- Il a une activité enzymatique intrinsèque à son récepteur: la kinase qui permet

l’autophosphorylation (a lieu 24/24h) du récepteur une fois que le ligand est fixé.


- Il intervient dans la communication intercellulaire, peut être à l’origine d’une cascade de

mécanismes tumoraux car l’autophosphorylation a lieu de façon permanente.


La famille des récepteurs de EGFR est formée par 4 membres (4 protéines qui se
dimérisent ou s’hétérodimérisent pour donner l’EGFR): 



HER1 HER2 HER3 HER4 

= Erb 1, Erb 2, Erb3, Erb 4


Seul HER2 n’a pas de ligand, les autres ont chacun un ligand spécifique. Le HER2 est
sur-exprimé dans le cancer du sein qui est traité grâce à l’AC: le trastuzumab.

- Il y a un contact entre ligand et la protéine correspondante, puis ils vont interagir avec le
deuxième partenaire (au niveau de la membrane plasmique) pour former un récepteur
biologiquement actif. 



On a alors possibilité d’induire un signal de transduction intracellulaire qui entrainera
une cascade active biologiquement à l’intérieur de la cellule.


- L’autophosphorylation du récepteur est possible grâce à son activité kinase

intrinsèque qui va activer les voies de signalisation : MAPkinase, STAT et PI3K par
recrutement de protéines cytologiques telles que SOS par exemple.


Page 36 sur 56
- SOS—>RAS—>RAF—> MAPkinase


- Une augmentation de l’activation de 3 voies majeures de signalisation interviennent dans

les phénomènes de survie, transcription et prolifération.


- Si une cellule mute (cancer) et que le domaine kinase est muté, le domaine
d’autophosphorylation ne dépend plus de l’interaction avec le ligand à l’EGF


- En physiologie normale le récepteur ne reste pas phosphorylé.


- TKI : Tyrosine Kinase Inhibiteur qui va devenir une sorte de leurre pour le récepteur à
l’EGF. L’ATP est le substrat pour donner l’ADP. Le récepteur à l’EGF a la possibilité de
phosphoryler 8 phosphates.


- Ras possède une activité de déphosphorylation


- La phosphorylation est un phénomène en cascade (ou en « étage ») le premier étage va

phosphoryler l’étage en dessous et ainsi de suite (notamment grâce à l’activité GTPase).


- La cellule reçoit un message de stimulation, pour ne pas avoir de prolifération

anarchique


- Activation continue d’un des partenaires du récepteur à l’EGF


- L’EGFR est Erb1 (le ligand de HER 1 est l’EGF)


- Il ne fonctionne pas seul: on le trouve sous forme d’homo/hétérodimères 


(Exemple : d’hétérodimère EGFR et HER2). Quand le récepteur est muté, il n’est pas
endocyté, et il a pour rôle de stimuler la prolifération.

Ce récepteur sous forme d’homodimère ou hétérodimère est capable de reconnaitre un

ligand EGF ou TGF.


Lorsqu’EGF reconnait EGFR, on a différentes voies de transduction qui sont activées.


EGFR est doté d’une activité enzymatique intrinsèque grâce à des kinases : activité de
phosphorylation qui dépend de la présence de l’ATP. Mutation au niveau de la tyrosine
kinase —> le récepteur n’a plus besoin d’un ligand. On peut couper la région
extracellulaire. La phosphorylation ligand-indépendante

Altérations génomiques à la base d’une augmentation de l’activité kinase :


Cellule normale : quelques récepteurs à l’EGF

Cellule cancéreuse : marquage noir sur les récepteur à l’EGF : il y a des récepteurs à
l’EGF de partout —> Anarchie —> voie de prolifération anormale

- Substitution d’AA
- Insertion d’AA
- Délétion d’AA
- Amplification qui se traduit par une surexpression de l’activité kinase

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Deux chromosome cassés : la région 5’ de l’un rencontre la 3’ de l’autre

Exemple de mutation de l’EGFR au niveau des exons 19 et 21 :


Une délétion peut être à l’origine de la phosphorylation permanente du récepteur à l’EGF.

Sur l’exon 19 : délétion de 5 AA —> EGFR* (muté) -> activation permanente, de façon
constitutive

Sur l’exon 21 : une thymidine a été substituée par une guanine. 


Au lieu d’avoir une leucine on aura une arginine.



Les mutations sont mutuellement exclusives (ne peuvent pas avoir lieu ensemble, soit
mutation exon 19 soit mutation exon 21).

Ce sont des mutations activatrices qui va activer 24h sur 24 le récepteur à l’EGF. 

L’EGF n’a plus besoin de contact avec l’extérieur : il est toujours actif.


Les exons de 18 à 24 codent pour le domaine à tyrosine kinase de l’EGFR

EGF: facteur de croissance épidermique

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- Rôle important dans les processus de transformation maligne
- Une surexpression de l’EGFR est retrouvée dans de nombreux cancers dont 62% de
CBNPC


Une activation du récepteur en 3 étapes :


1) Fixation du ligand

2) Auto-phosphorylation dépendante de l’ATP (activité kinase cytosolique avec l’ATP

en substrat) On peut avoir 8, ou 6 groupes de phosphate

3) Induction des voies de transduction

Augmentation de l’activation de 3 voies majeures (MAPKinase, STAT et P3Kinase) de

signalisation: survie de la cellule, augmente la transcription, stimuler sa prolifération (que
la cellule soit cancéreuse ou non).


Si on est dans le cas d’un cancer on vérifie si l’origine est une surexpression du ligand ou
si le récepteur n’a plus besoin du ligand: exemple : une mutation activatrice non corrigée
sur un des exons du gène. 



Cela peut venir du promoteur qui s’est transloqué sur le chromosome 11 pour se mettre en
amont de l’EGFR, or ce promoteur n’est pas régulé, ce qui a pour conséquence une
sécrétion constitutive de l’EGFR. Par immunocytochimie on trouve que l’EGFR est situé
partout sur la membrane plasmique.

Dans une boite plastique on cultive 100 cellules atteintes de la mutation. 5 jours plus tard
on les sacrifie et on les compte. Il y en a 10 millions.



4/5 (80%) des cancers du poumons viennent de la cigarette.

La cible thérapeutique dans le cancer du poumon est EGFR.


Il y aurait des mutations dans le gène qui code pour EGFR portées par les exons 19 et
exons 21 qui activent le récepteur sans qu’il y ait besoin d’avoir une interaction avec
l’ATP, et qui pourrait donc être activé n’importe quand.


On prend le gène EGFR avec exons 19 et 21. On met dans un plasmide qu’on injecte
dans une cellule, dès qu’il est installé, on installe EGFR à la membrane.

Ce processus est identique à une personne qui a le cancer. Cette prolifération est très
accrue. C’est la raison pour laquelle on cherche des médicaments pour arrêter ce EGFR
qui est biologiquement actif à cause de mutations.


Erb2 ne possède pas de ligand : 20 à 30% des patients surexpriment HER2.


On a un monomère sur la membrane plasmique, si on a une protéine qui interagit avec le

ligand, complexe basé sur la formation d’un homodimère.


EGFR complexé à HER2 forme un hétérodimère.


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Domaine de l’auto-phosphorylation qui active le récepteur en cas d’activation, en biologie
le ligand arrive, formation d’un complexe, puis endocytose pour faire disparaitre le
récepteur, mais le récepteur muté ne peut-être ubiquitinylé pour être endocyté et s’installe
au niveau de la membrane plasmique.

Le récepteur utilise 4 ATP comme substrats pour s’auto-phosphoryler.

C’est un phénomène incontrôlable lorsqu’il a subi des altérations.


Le gène qui code pour ERGF au niveau du chromosome 7 est constitué de 28 exons.


Il existe un lissage alternatif qui ne garde que les exons.

Cette activité constitutive de phosphorylation, dont la mutation provient des exons 18 à 21,
Entraine chez le patient qui porte ce gène dans cette région là une activité 24/24h de
EGFR.

Différentes mutations :


Mutation ponctuelle : mutations ou délétions au niveau des exons 18 à 21.


Forte activité du récepteur en cas d’amplification : on récupère l’ADN, on cherche si le

gène a subi une duplication ou non. 


On peut savoir si EGFR chez le patient X a subi une amplification à hauteur de 15 copies
de son gène.

Séquence mutante : 



Délétion de 15 nucléotides (5 AA) donc on se retrouve devant une nouvelle protéine :
EGFR 1 - 5AA —> EGFR active 24h/24. 



Avant même d’analyser la séquence, quand on voit une séquence perturbée on sait qu’il y
a un problème. 


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Sur le schéma : Au lieu d’avoir 2 pics noirs et 2 pics verts on a 4 pics verts. Je perds aussi
les deux pics rouges, les deux pics verts. On perd donc 5 AA. 

Vu que l’exon 19 fait partie de la séquence kinase de (pas la suite). L’EGFR devient donc
tout le temps actif.


Les femmes atteintes du cancer du poumon avec une surexpression de HER2 subissent
une amplification de tout le gène. 15 copies codent pour HER2, chaque bloc transit donne
une protéine, une cellule normale code pour une 1 protéine de HER2 alors qu’ici on a 15
copies de HER2, après transcription de 15 copies de la protéine de HER2.

La quantité beaucoup plus importante de cette protéine devient une cible potentielle avec
l’AC qui va faire asphyxier ces cellules.

Altération génomique à la base d’une augmentation de l’activité kinase

En résumé on peut avoir :

- Amplification de la totalité de l’unité transcriptionnelle. 




Exemple : 



Au lieu d’avoir sur le chromosome 7 une seule copie de l’EGFR, à chaque transcription il
y a 15 copies de l’EGFR

- Mutation ponctuelle.

- Une translocation, protéine chimère qui peut être une enzyme.

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Le spectre des mutations de l’EGFR :

Une prévalence de 10 à 16,6% de mutations dans la population caucasienne : sur le

chromosome 7, sur les exons qui codent pour la fonction kinase :


Exon 18: 5% (G719K)


Exon 19: ≈ 45% (delE746-A750) active le récepteur: phosphorylation continue du

domaine cytosolique du récepteur.


Exon 20: ≈ 5% (T790M)


Exon 21: ≈ 45% (L858R) active le récepteur: phosphorylation continue du domaine

cytosolique du récepteur.

N-Term est la partie extracellulaire, elle comporte le site de fixation au ligand.

C-Term est la partie intracellulaire, elle comporte la partie qui possède l’activité kinase.
Entre il y a un domaine transmembranaire.



Les exons 18,19,20 et 21 sont les trois domaines qui codent pour l’activité kinase du
récepteur EGF. Ils sont toujours touchés par les mutations.

Mutation exon 18 et 20 : mutations résistantes : elles résistent aux médicaments

Mutation exon 19 et 21 : mutations activatrices


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Mutations activatrices : Del 747-752 et L861Q

La région kinase de la phosphorylation est codée par les exons 18 à 21.


On utilise des techniques non vagues : séquençage : on recherche une mutation déjà
connue, on met en banque de données les nouvelles séquences connues.


Les exons 19 et 21 sont les exons activateurs. Après la mutation, plus de dépendance à
l’ATP et au ligand.

Le récepteur muté va activer les 3 voies : MAPK, STAT et MUT

La mutation de l’EGFR est une mutation clé, il ne pourra plus reconnaitre l’ATP : on va
traiter le patient avec une molécule qui ressemble à l’ATP (inhibiteur = TKI). On se
rapproche de l’état de transition de l’ATP.

On utilise des inhibiteurs pour traiter le patient en question, 2 molécules réversibles dont
une porte le nom de Erlotinib (TARCEVA) et l’autre le nom de Gefinitinib (IRESSA, nom du
médicament commercialisé) et font partie toutes les 2 de la famille des inhibiteurs de la
famille des ITK.

Aujourd’hui nous avons une 3ème molécule découverte de cette famille : Afatinib qui elle
reconnait sur le EGFR la cystéine en position 797, 803 et 805. ne pas retenir les chiffres
mais retenir l’interaction avec la cystéine.

Il existe une troisième génération de molécule avec moins d’effets secondaires :

Osemertinib.
Sa spécificité, il est capable de reconnaitre avec erbB1/EGFR : la cystéine 797, avec
erbB2/HER2 : la cystéine 805 et avec erbB4 /HER4 la cystéine 803

Quand le récepteur n’est pas muté, l’inhibiteur ne peut pas reconnaitre le récepteur.

Les ligands sont capables d’interagir avec différentes voies de transduction.

BIM : protéine pro apoptotique. Il faut la garder intacte pour qu’elle puisse aller tuer les
cellules cancéreuses.


Quand je traite le patient avec IRESSA, j’éteins ERK (qui avait un signal négatif sur BIM)
et donc BIM retrouve sa fonction apoptotique normale.

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EGFR : Voie de signalisation :

On va bloquer la voie RAS, et on va donc déphosphoryler la protéine ERK et donc retirer

le frein sur la protéine BIM (voies de l’apoptose) et donc reconduire les cellules
cancéreuses vers la mort cellulaire.


Ce qui explique qu’au bout d’une semaine la grande majorité des cellules cancéreuses a
déjà disparu.
La stimulation de l’EGFR va jouer un rôle important dans l’inhibtion du système
apoptotique de la cellule. BIM responsable de la mort de la cellule.
Activation soutenue de la voie MAK kinase et répression de BIM. On traite le patient avec
les inhibiteurs, inhibition des phosphoryaltions de l’étage de SOS (voir schéma)

Étude IPASS qui a montré l’efficacité d’IRESSA


Efficacité significativement supérieure d’IRESSA chez les patients EGFR M+


Quand on ne savait pas que le cancer venait d’une mutation on envoyait les patients en
chimiothérapie. Le traitement fonctionne beaucoup mieux sur des personnes qui
présentent des mutations : l’espérance de vie augmente.

Si il ne porte pas la mutation, le traitement par inhibiteur est dangereux, mais quand il
porte la mutation il y a un grand bénéfice. Sa probabilité de survie avec le traitement à
l’IRESSA baisse.

S’il y a absence de mutation, ne surtout pas donner de médicament de la thérapie ciblée.

Avec les nouvelles thérapies ciblées, on peut basculer de 4 mois de survie à quelques
années, selon le prof, c’est une nouvelle vie qui s’ouvre à nous.

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Parmi les molécules qu’on retrouve dans le sang il y'a de l’ADN circulant, 160 paires de
base pour la taille de l’ADN, sa concentration de l’ADN circulant se trouve dans le plasma,
fourchette de 2,5ng/ml de plasma jusqu’a 18ng/ml de plasma, la médiane est de 6-7 ng/ml
et atteindre jusqu’à 100ng/ml pour quelqu’un qui fait de la boxe et qui s’est fait « casser la
gueule » la veille.

Toutes les 24h, la tumeur sécrète 3 à 4% de son contenu d’ADN dans la circulation
sanguine, on cherche ensuite dans le sang l’absence ou pas de la délétion l’ADN 19, et
ainsi cela permet de savoir s’il y a tumeur ou pas.

Si on prélève du plasma, il y a de l’ADN. On peut trouver la mutation dans l’ADN en faisant

un séquençage. Si lors du traitement on ne constate pas de diminution de la sécrétion
d’ADN muté on conclue que le traitement ne marche pas: on change de traitement.

On cherche la mutation (délétion 19) dans la circulation sanguine et on décide de la

traiter :

- Si au bout d’un mois la délétion 19 continue de proliférer dans la circulation sanguine

cela signifie que le traitement ne marche pas → changement de traitement.


- Si au bout d’un mois la délétion a vraiment diminué, le patient répond bien au traitement
donc on continue. Certains patients sont sous TKI (inhibiteur de la tyrosine kinase)
depuis 4 ans


- Si après une diminution il y a une ré-augmentation : c’est un signe qu’il va y avoir une
récidive (T798M par exemple). On peut le voir sur les analyse 3 mois avant que la
récidive se produise vraiment. Ça permet à l’oncologue de chercher, préparer un
nouveau traitement

Qu’il y ait ou pas de mutation, la chimiothérapie ne fait pas de différence.

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Sur la survie sans progression chez les patients EGFR M+ : Efficacité significativement
supérieure d’IRESSA chez les patients EGFR M+

Premier étude qui montre l’efficacité des TKI dans le cadre de la thérapie ciblée.

Si le patient ne porte pas de mutation du récepteur il ne faut pas le traiter !

Cette étude date de plusieurs années mais elle est celle qui a mis les boites
pharmaceutiques sur la voie.

Aujourd’hui grâce a cette thérapie ciblé chez un patient atteint d’un cancer du poumons
avec une mutation du récepteur on observe ne net amélioration du temps de survie on
peut basculer de 4 mois de survie à quelques années.


La grande majorité des décès dans le cancer est d’origine métastatique (incontrôlable).


Cette technique permet de savoir 3 mois à l’avance les premiers symptômes cliniques.

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Chez les patients portant un tumeur toute les 24 heures 3 et 4 % de l’ADN tumoral qui
rentre dans le circulation.

—> Extraction d’ADN dans le sang puis séquençage à la recherche de la délétion 19

Ce qui nous permet de rapidement connaitre l’efficacité du traitement et la réponse du

patient a ce traitement, au vue de combien d’ADN circulent baisse du taux d’EGF19
circulant.


Si on observe au augmentation on peut au bout d’un mois ou deux, le traitement ne

répond pas au médicaments, le médecin peut décider de changer de traitement.
Cela permet une adaptation du traitement plus rapide ( de façon classique on doit attendre
6 mois pour pouvoir faire une radio des poumons et voir une diminution significative de la
taille de la tumeurs).

Ré-augmentation de la tumeur en Février 2013, changement de traitement, on prend

souvent la génération d’après.


Les effets secondaires des inhibiteurs ont moins d’effets secondaires que la
chimiothérapie, cela permet de vivre une vie plus « normale ».

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Cancer de peau : mélanome
La protéine est la B-RAF, c’est une mutation qui va changer une Valine en position 600 en
lysine ou glutamine, à une autre de 40 à 60% dans le mélanome

Gènes impliqués dans le développement des mélanocytes et mélanomes :

Le c-KIT va stimuler RAS qui va phoshporyler RAF qui va phosphoryler MEK etc.
Une fois que le MITF est phosphorylé, il va être transloqué dans le noyau et va aller
stimuler la transcription des gènes qui jouent un rôle dans l’apoptose, la différenciation…


Mutations de type « exclusives »  « quand y’en a une qui est là, les autres sont pas là »


L’activation par constitution constitutive de BRAF ne s’occuperait donc plus d’un signal qui
vient de dessus (CF schéma).

Les médicaments utilisés sont le DABRFENIB, VERMURAFENIB (zelboraf : nom

commercial) si il possède une mutation V600 E (valine en position 600 échangée contre
acide glutamique) ou K (changement vers une lysine).

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La mutation de l’EGFR : une mutation clé

Une mutation à l’origine de changements conformationnels et fonctionnels du

récepteur : moins grande affinité à l’ATP, le site catalytique a changé, on s’en sert pour
trouver un inhibiteur (réversible ou non) qui rentre en compétition avec l’ATP, il faut qu’il ait
une plus grande affinité que l’ATP pour être efficace

Voie MAPK : phosphorylation de l’EGFR, qui phosphoryle Ras, qui phophoryle Raf

Si il n’y a pas de mutation mais une surexpression, pour bloquer l’action on utilise un Ac
anti-EGFR, cela les conduit vers la mort cellulaire (exemple: dans le cancer colorectal du
colon)

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Il y a 3 molécules sur le marché utilisées comme médicaments dans le cancer du poumon,
quand il y a une mutation du récepteur :


- Erlotinib (réversibles)


- Gefitinib (réversibles)
Ce sont des TKI (inhibiteurs de la tyrosine kinase) de 1ère génération


- Afatinib: c’est un TKI irréversible, il interagit avec la cystéine C797 et d’autres membres
de la famille de l’EGFR (2 sur C805 et 4), 2ème génération: covalence

Sur un récepteur M- qui n’est pas muté le gefitinib ne reconnait pas le site catalytique
Sur un récepteur M+, le site muté ne reconnait pas l’ATP mais la gefitinib a pu s’insérer et
reconnaitre le site actif. En découle une inhibition du RM+.

Région BH3 de BIM joue un rôle important dans l’adressage à la mort cellulaire.

Vemurafenib provoque la guérison des gens complètement criblés de métastases sur la

peau. En bloquant BRAF je vais bloquer ce qui se trouve en dessous et donc « libérer » la
protéine BIM.

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Patient atteint de mélanome métastatique :

Après le traitement on voit sur le Petscan que toutes les métastases ont disparu.

En 1983 on était capable de guérir 1 patient sur 69, aujourd’hui on est à 23/69

Très peu de patients n’ont pas répondu positivement au zelboraf, beaucoup ont eu une
réponse positive et chez quelques patients la maladie a totalement disparue.

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Dans un mélanome :


Mutation de BRAF à 40/60% devient activatrice de BRAF, la cellule cancéreuse n’a plus
besoin de cKit et NRAS.


Il suffit d’inhiber BRAF pour stopper la prolifération des cellules cancéreuses.

Le Petscan fonctionne grâce au D-Glucose. Il y en a beaucoup dans le cerveau.
En 2 semaines on arrive à éradiquer toutes les métastases. On utilise des polythérapies.


Vemurafenib (zelboraf), on peut assister à une disparition de la maladie chez certains

patients, d’autres ne répondent pas au traitement (thérapie ciblée).


Zelboraf est le nom du médicament de la Vemurafenib

Différents inhibiteurs en cours d’utilisation :

Crisotinib : Médicament ayant de très très bon résultat. Entre la conception et la mise sur
le marché seulement 3 ans se sont écoulés.

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Réponses aux questions 2017 :

- Inhibiteur qui fait une liaison covalente avec l’enzyme —> inhibiteur irréversible. Si pas
de liaison covalente, inhibiteur réversible

- Inhibiteurs non compétitifs reconnaissent une structure différente du site actif de

l’enzyme, impossible de lever l’inhibition par augmentation de la concentration en
substrat

- PAL : activité lyase ( ≠ ligase )


- Toutes les enzymes ne sont pas des protéines : les ribozymes


- À pH = 5 : l’hydrolyse du carbone alpha affaibli la liaison Cɑ - N mais la liaison est

stable. À pH = 7 la liaison est tellement affaibli qu’elle va se couper seule sans
intervention de PAL. Donc PHM fonctionne à pH=5 mais elle peut aussi fonctionner à 

pH = 7


- Le coenzyme ne fait pas partie du site actif de l’enzyme


- item 19B de l’année dernière est vrai car un effecteur peut aussi bien être un activateur
ou un inhibiteur


ARNm de la PAM comme vecteur de cellules thérapeutiques ? Bonne idée mais pas tout
de suite !

Un substrat en présence d’une enzyme qui n’a aucun lien = pas de réaction enzymatique.

Si la PAM possède toujours un domaines transmembranaires, elle est cliver ou utilisation

d’un détergeant. 


PAM : forme numéro 1 possède Lys-Lys.

PAL = lyase.

Enzyme = Que protéine dans le cour.

PAM agit a pH acide

PHM : réaction en présence de cuire, a acrobate … a pH acide cette réaction va donner

AAC double liaison O - NH - Calpha-OHH-COOH.
hydroxyde cartonne alpha.

La suite dépend du pH et ou de la présence de la lyase.

hydroxylation du carbon alpha affaiblis la laissons entre le carbone alpha et le groupement

azote. Mais a PH acide elle reste stable.
Sauf si j’ai la présence de de la PAM qui va catalyser la réaction.
Ou on passe a ph 7 et la coupure devient spontanée sans besoin d’avoir la lyase.

Soit catalyseur biologique ou chimique dans une réaction.

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Interaction avec le co-enzyme ne fais pas partie du site actif de l’enzyme.

Un effecteur peu modifier l’activité enzymatique. Un effecteur peu être un activateur ou un

inhibiteur.

Les endopeptidases : pas d’importance N ou C term. il a juste a couper entre 2 AA. Les
exopeptidases sont spécifiques.

Température PCR

94°C : 30s
60°C : 2 minutes
72 : 2 minutes

Pro-enzyme : précurseur de l’enzyme. Biologiquement inactif.

Apo-enzyme : partie protéique de l’holoenzyme.

E1+S -> <- ES -> E+P.

Cyclo-oxygénase est un inhibiteur suicide.

Magnésium est le co-facteur de la taq-polymérase.

Précurseur TRH = glutamine.

Réponse aux questions 2015 :

Il ne faut pas connaitre les 3 sites actifs (page 4)

Les exemples sont là pour aider à comprendre le texte, il dit qu’il galère avec les
exemples pour les donner le matin/aprem alors qu’il a pas le droit etc, il s’est fait
engueuler par la scolarité l’année dernière…

Site de liaison/ site actif :


Le site actif est responsable de la catalyse

Le site de liaison permet aux molécules de se lier (ex inhibiteurs)
Il ré-explique l’amidation avec la PAM
On dit un ou une enzyme c’est pareil.

Réponse aux questions 2016 :

Le NAD est un coenzyme

Comment on dose la PAM :

PAL : dans granules secretions pH acide PAL va hydroxyler le peptide

Mais si dans pH basique pas besoin de PAL puisque coupure se fait seule

Tous les precurseurs non amidés ne se terminent pas par une proline
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Toutes les enzymes sont des protéines sauf les ribozymes mais toute les protéines ne sont pas
forcément des enzymes. De manière générale, le peptide signal fait entre 20 et 30 AA.

Exemple : 



TRH (3 AA et précurseur de haut PM pGly-His-Pro-amine) et son précurseur à 185 AA, qui contient
5 copies de la TRH (même mécanisme que pour la partie avec la PAM).

L’ACTH est l’hormone de la peur.

Dans l’hypothalamus, il existe un peptide TRH qui va être transféré dans

l’hypophyse.
Ce peptide est de la forme pGlu-His-Pro-NH2
Le p correspond à pero ce qui veut dire que le peptide s’est cyclisé pour ne
pas être attaqué en N-terminal lors de son passage dans le sang
Ce peptide est aminé en C-terminal donc il a subi l’action de la PAM
Le précurseur de TRH possède 185 AA mais il comprend 5 box de TRH.
Donc 1 précurseur donne 5 peptides TRH

Sensibilité : capacité à reconnaitre le substrat à de faibles concentrations, donc la

concentration rentre en jeu.


Spécificité : L’enzyme ne connait que ce substrat

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