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ANNÉE 2015
THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : Chimie
Ecole doctorale : Science De La Matière
présentée par
Sofien CHNITI
Préparée à l’unité mixte de recherche CNRS 6226
Institut des Sciences Chimiques de Rennes
Equipe Chimie et Ingénierie des Procédés
Optimisation de la Thèse soutenue à l’ENSCR

le 9 juillet 2015
bioproduction devant le jury composé de :
Patrick BOURSEAU
d’éthanol par Professeur – Université de Bretagne Sud / rapporteur
Lionel LIMOUSY
valorisation des refus MCF-HDR – Université de Haute Alsace / rapporteur
Didier FLONER
de l’industrie de MCF-HDR – Université de Rennes 1 / examinateur
Anthony SZYMCZYK
conditionnement des Professeur – Université de Rennes1 / examinateur
Hayet DJELAL
dattes Enseignant-Chercheur – EME / Co-directeur de thèse
Abdeltif AMRANE
Professeur – Université de Rennes1 / directeur de thèse
Jacques BREGEON
Président Ecole des Métiers de l’Environnement / Invité
2
DEDICACE
Je dédie ce travail à
Mon père
Pour ses encouragements incessants et son soutien moral aux moments difficiles qui
furent pour moi les meilleurs gages de réussite. Qu’il trouve dans ce travail la preuve
modeste d’une reconnaissance infinie et d’un profond amour.
Mon adorable mère

Qui est toujours présente et continue de l’être pour faire mon bonheur. Merci pour être
sacrifiée pour que ces enfants grandissent et prospèrent. Que dieu la protège et lui donne
bonne santé et qu’elle trouve ici la preuve de ma reconnaissance infinie.
Mes soeurs et mon frère

Pour leur disponibilité, leur soutien moral, leur encouragement incessant, d’être
coopératif et d’assumer à ma place certaine de mes responsabilités familiales.
Ma fiancée
D’être toujours à mes côtés pour me soutenir, pour m’aider dans la mesure du possible,
mais surtout pour donner du goût à ma vie par son amour et sa tendresse, j’espère qu’elle
trouve ici le témoignage de mon profond amour, attachement et respect.
Ma belle-famille
Pour leur soutien, gentillesse et sympathie, pendant cette thèse parfois envahissante, que
dieu les protège et leurs donne une vie pleine de réussite et de bonheur.
3
REMERCIEMENTS
Le présent travail de thèse, qui entre dans le cadre d’un programme de recherche
thèse co-tutelle, a été réalisé dans le Laboratoire de Biotechnologie de l’Ecole des
Métiers de l’Environnement (35) sous la direction de Madame Hayet DJELAL et au
Laboratoire de Génie Chimique (Rennes1 -France) sous la direction de Monsieur Abdeltif
AMRANE.
Je tiens à remercier très vivement et respectueusement Madame Marie-Dominique
DE CAYEUX , Directeur de l’Ecole des Métiers de l’Environnement pour avoir accepté
de m’accueillir au sein de laboratoire de l’Ecole. Et je remercie aussi l’ensemble du
personnel pour leur gentillesse et leur sympathie et je tiens à souligner tout
particulièrement l’acceuil chaleureux et la sympathie de Karinne PICHARD, Fabienne,
Sébastien CHERAUD, Nicolas JOVAN et Laurence THENAISY et tout le personnel de
l’EME.
Avec une rigueur et un intérêt constant, Madame Hayet DJELAL a dirigé ce
travail avec beaucoup d’enthousiasme en me faisant bénéficier de ses compétences
scientifiques. Je tiens à lui exprimer ma très grande reconnaissance et le témoignage de
mon profond attachement pour l’attention qu’elle a porté à cette thèse, pour les
encouragements, pour la confiance qu’elle m’a toujours témoignée, sa constante
disponibilité et la gentillesse dont elle a fait preuve à mon égard.
Je tiens aussi à exprimer ma profonde gratitude au Pr. Amrane ABDELTIF, pour

avoir accepté d’être le directeur côté Français de cette thèse. Son enthousiasme et son
dynamisme m’ont chaque fois permis de rebondir dans les moments difficiles. Je le
remercie vivement pour l’aide scientifique précieuse et tous les conseils qu’il a pu me
fournir.
Je remercie Monsieur Mnasser HASSOUNA mon directeur de thèse coté Tunisien

et Directeur de l’école supérieure des industries alimentaires de Tunis pour l’intérêt qu’il
a porté à ce travail. Je profite de cette occasion d’exprimer ma profonde reconnaissance à
Madame Rim et tout le cadre administratif de l’ESIAT.
4
Je remercie Yvanne et Jeanne et surtout Yvanne pour son professionnalisme et
les conseils qu’il n’a cessé de me prodiguer durant mes séjours au l’école des métiers de
l’environnement à Bruz et pour la confiance qu’elle m’a toujours témoignée.
Je tiens à remercier Mademoiselle Monia JEMNI, chercheur au Centre Régional

de Recherche en Agriculture Oasienne à Dégache, Tozeur en Tunisie pour avoir accepter
de nous envoyer deux microorganismes isolés de sous-produit des dattes.
Je tiens à remercier Mme Hédia CHAABENE, directeur du laboratoire de

Microbiologie, à l’Institut National de Recherche et d’Analyse Physico-chimique en
Tunisie, et Mlle Marwe qui a eu l’aimable volonté le travail expérimentale des mes
stagiaires, tout le long de ces années.
Que tous ceux qui ont fait part, de près ou de loin, à ce travail en Tunisie et en
France, trouvent ici l’expression de mes remerciements et ma profonde gratitude.
5
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Production mondiale des dattes (FAOSTAT, 2014). ...................................................... 25
Figure 2. Répartition de production des dattes dans le monde (FAOSTAT, 2014). ...................... 26
Figure 3. Répartition du palmier dattier en Tunisie. ...................................................................... 26
Figure 4. Evolution de la production des dattes en Tunisie (en tonnes) (FAOSTAT, 2014). ........ 27
Figure 5. Coupe schématique d’une datte (Munier, 1973). ............................................................ 29
Figure 6. Composition biochimique de la datte (Sawaya et al., 1983). ......................................... 31
Figure 7. Opération de transformation des dattes (Estanove, 1990). ............................................. 34
Figure 8. Transformation des sucres continus dans les végétaux en éthanol (Cabal et Gatignol,
2015). ............................................................................................................................................. 46
Figure 9. Conversion de glucose en éthanol (Smith et al., 2006). ................................................. 46
Figure 10. La glycolyse et le cycle de Krebbes. Où HxK : hexokinase ; PFK :
Phosphofructokinase ; FbiP : fructose bi-phosphatase ; PK : Pyruvate kinase ; PDH : pyruvate
dehydrogénase ; PDC : pyruvate decarboxylase ; ADH : alcool deshydrogénase ; AcDH :
acetaldehyde deshydrogénase ; ACS : acetyl-CoA synthase (Poilpré, 2002). ............................... 56
Figure 11. Nœud métabolique du pyruvate et de l’acétaldéhyde (Lei et al., 2001). ...................... 57
Figure 12. Sous-produits de dattes de la variété « Deglet-Nour ».................................................. 73
Figure 13. Processus d’extraction du jus de dattes......................................................................... 78
Figure 14. Altération parasitaire d’une datte. ................................................................................. 90
Figure 15. Surface de réponse traduisant l’impact des intéractions entre les facteurs X1, X2 et X3
sur l’équivalent glucose des jus de dattes (a) interaction (X1- X2), (X1- X3) et (X2-X3). .............. 98
Figure 16. Effet de la stérilisation sur la composition du sirop en sucres. ................................... 102
Figure 17. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
...................................................................................................................................................... 105
Figure 18. Evolution des sucres au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae. ...... 106
Figure 19. Evolution de la concentration en NH4Cl au cours de la fermentation de M-S100, par S.
cerevisiae...................................................................................................................................... 107
Figure 20. Evolution du pH au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae. ............ 107
Figure 21. Evolution de la concentration en éthanol et en glycérol, au cours de la fermentation de
M-S100, par S. cerevisiae. .......................................................................................................... 108
Figure 22. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par S. cerevisiae.................... 111
Figure 23. Concentration en sucres au cours de la fermentation par S. cerevisiae ; (a) M_EL, (b)
Milieu_NH4Cl, (c) M_T ................................................................................................................ 112
Figure 24. Evolution de la concentration en éthanol durant la fermentation par S. cerevisiae. .. 113
Figure 25. Evolution du pH durant la fermentation par S. cerevisiae. ........................................ 114
Figure 26. Schéma de fonctionnement de l’uniport électrophorétique accumulatif responsable de
l’entrée de l’ion ammonium chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon, 1998). ........................... 114
Figure 27. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par S. cerevisiae.................... 116
Figure 28. Concentration en sucres au cours de la fermentation. (a) M-S45, (b) M-S90, (c) M-
S175, (d) M-S350 par S. cerevisiae............................................................................................. 117
Figure 29. Concentration en NH4Cl au cours de la fermentation par S. cerevisiae..................... 118
Figure 30. Concentration en éthanol au cours de la fermentation par S. cerevisiae.................... 119
Figure 31. Concentration en glycérol au cours de la fermentation par S. cerevisiae. .................. 120
Figure 32. Suivi de la croissance des levures au cours de la fermentation pour M-S175(a) et M-
S350(b) ; cultures additionnées de 500 mg.L-1 de NH4Cl. ........................................................... 123
6
Figure 33. Concentration en sucres au cours de la fermentation (Glucose (a), Fructose (b) et
Saccharose (c) dans un milieu de culture à 175 g.L-1 ; additionné de 500 mg.L-1. ....................... 126
Figure 34. Concentration en sucres (Glucose (a), Fructose (b) et saccharose (c) dans un milieu de
culture à 350 g.L-1 ; additionné de 500 mg.L-1. ............................................................................ 126
Figure 35. Concentration en NH4Cl dans les milieux à 175 (a) et à 350 g.L-1 en sucres (b) ;
additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl. .......................................................................................... 127
Figure 36. Réponse de la levure à un milieu hyperosmotique. A : La première réponse de la
cellule. B. L’osmoadaptation de la cellule (Blomberg, 2000) ...................................................... 128
Figure 37. Evolution de la concentration en éthanol (a) et glycérol (b) durant la fermentation sur
milieux à 175 g.L-1en sucres ; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl. .......................................... 129
Figure 38. Evolution de la concentration en éthanol (a) et glycérol (b) durant la fermentationsur
milieux à 350 g.L-1 ; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl. ......................................................... 130
Figure 39. Voies de synthèse de glycérol et de l’éthanol (Djelal et al., 2005)............................. 131
Figure 40. Cinétique de croissance de Z. rouxii, sur des milieux à différentes concentrations
initiales en sucres (175, 250, 350 et 500 g.L-1) ; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl. .............. 138
Figure 41. Cinétique de consommation des sucres durant la culture de Z. rouxii sur milieux à 175
g.L-1 (M-S175), 250 g.L-1 (M-S250), 350 g.L-1 (M-S350) et 500 g.L-1 ; additionnés de 10 mmol.L-
1
de NH4Cl. ................................................................................................................................... 139
Figure 42. Cinétique de consommation de NH4Cl durant la culture de Z. rouxii sur milieux à 175
1
de NH4Cl. ................................................................................................................................... 140
Figure 43. Transport des hexoses lors de la fermentation alcoolique par Zygosaccharomyces
rouxii (Production d’éthanol et de glycérol) (Dakal et al., 2014). ............................................... 141
Figure 44. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol durant la culture de Z. rouxii sur
milieux à 175 g.L-1 (M-S175), 250 g.L-1 (M-S250), 350 g.L-1 (M-S350) et 500 g.L-1 ; additionnés
de 10 mmol.L-1 de NH4Cl............................................................................................................. 143
Figure 45. Cinétique de croissance de Z.rouxii sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de 10
mmol.L-1 de NH4Cl. ..................................................................................................................... 146
Figure 46. Cinétique de consommation des sucres par Z. rouxii sur milieux 350 g.L-1 (M-S350);
additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl. ........................................................................................ 147
Figure 47. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol sur milieux 350 g.L-1 (M-S350);
additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl. ........................................................................................ 148
Figure 48. Cinétique de consommation de NH4Cl sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de
10 mmol.L-1 de NH4Cl. ................................................................................................................ 149
Figure 49. Cinétique de croissance de Z.rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés de 500 (M-
N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl. .................................................. 151
Figure 50. Cinétique de consommation des sucres sur milieux 250 g.L-1; additionnés de 500 (M-
N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl. .................................................. 152
Figure 51. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol par Z. rouxii sur milieux 250 g.L-
1
; additionnés de 500 (M-N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl. ......... 153
Figure 52. Cinétique de consommation de NH4Cl par Z. rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés
de 500 (M-N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl. ................................ 154
Figure 53. Reconstruction phylogénétique par maximum de vraisemblance basée sur l’analyse
d’une portion du gène GyrB incluant 6 séquences issues de souches de B. subtilis subsp. Subtilis
dont la souche type et 6 séquences issues de souches de B. amyloliquefaciens dont la souche type
de B. amyloliquefaciens subsp. Amyloliquefaciens, 5 souches de B. amyloliquefaciens subp.
Plantarum ainsi que la souche testée. .......................................................................................... 160
7
Figure 54. Concentration en sucres dans les milieux M-S175 fermentés par S. cerevisiae (S.c), Z.
rouxii (Z.r) et B. amyloliquefaciens (B. a) ; milieux additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl. ......... 164
Figure 55. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par B. amyloliquefaciens sur M-
S175 et M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl. ............................................................... 166
Figure 56. Evolution de la concentration des sucres au cours de la fermentation par B.
amyloliquefaciens sur M-S175 et M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl. ...................... 167
Figure 57. Evolution de la concentration en éthanol et en glycérol au cours de la fermentation par
B. amyloliquefaciens sur M-S175 et M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl. .................. 168
Figure 58. Procédé industriel de valorisation de sous-produits de dattes..................................... 172
8
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Valorisation biotechnoloique de sous-produit des dattes. ............................................ 38
Tableau 2. Différentes méthodes d’extraction solide-liquide ........................................................ 41
Tableau 3. Propriétés du butanol (Dürre, 2007 ; Lee et al., 2008) ................................................. 44
Tableau 5. Récapitulatif des principaux oligo-éléments (Jones et al., 1981) ................................. 52
Tableau 6. Définision de la pression osmotique, osmolalité et osmolarité. ................................... 68
Tableau 7. Paramètres d’extraction. ............................................................................................... 79
Tableau 8. Plan d’extraction : méthode de surface de réponse (Box-Behnken). ........................... 79
Tableau 9. Composition de milieu Dw........................................................................................... 82
Tableau 10. Temps de rétention des composés quantifiés par HPLC. ........................................... 85
Tableau 11. Caractéristiques physiques des dattes « Deglet-Nour ». ............................................ 89
Tableau 12. Caractériqtiques biochimiques des sous-produits de dattes. ...................................... 91
Tableau 13. Composition en éléments minéraux de pulpe de Deglet-Nour (mg/100 g de matière
fraîche). .......................................................................................................................................... 93
Tableau 14. Analyse de la réponse de surface de l’extraction du jus de dattes. ............................. 95
Tableau 15. Estimation des coéfficients du modèle pour suivre de la concentration en sucres en
jus. .................................................................................................................................................. 96
Tableau 16. Caractéristique biochimique du sirop et de la pulpe de datte Deglet-Nour (72°Brix).
...................................................................................................................................................... 101
Tableau 17. Composition en éléments minéraux du sirop (mg/100 g de matière sèche). ............ 101
Tableau 18. Sucres totaux, sucres consommés, rendement en éthanol, glycérol et taux de
conversion de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae. ..................................................... 109
Tableau 19. Bilan des cultures en discontinu de la souche S. cerevisiae 522D en présence de
différentes concentrations en sucres............................................................................................. 120
Tableau 20. Evolution des prix de production d’éthanol (euros/hectolitre) (OCDEstat, 2013). .. 122
Tableau 21. Fermentation alcoolique du milieu à base de dattes par les levures (après 72 h de
culture) sur M-S175 et M-S350 additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl. ....................................... 132
Tableau 22. Production de bioéthanol à partir de différentes matières premières. ...................... 135
Tableau 23. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii sur milieux à 175
1
de NH4Cl. ................................................................................................................................... 144
Tableau 24. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii sur milieux 350
g.L-1 (M-S350); additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl. .............................................................. 150
Tableau 25. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii. sur milieux 250
g.L-1; additionnés de 500 (M-N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl. ... 155
Tableau 26. Résultats des brins forwards des séquençages 16S de la souche S. ......................... 157
Tableau 27. Résultats des Blast (NCBI) de la réponse 16S forward de la souche S. ................... 158
Tableau 28. Résultats des séquençages d’une partie de la région Gyrase de la souche S. ........... 158
Tableau 29. Résultats des Blast (NCBI) de la séquence GyrB reverse de la souche S. ............... 159
Tableau 4. Condition de croissance de Bacillus ........................................................................... 161
Tableau 30. Paramètres cinétiques de la fermentation alcoolique de M-S175 fermentés par S.
cerevisiae (S.c), Z. rouxii (Z.r) et B. amyloliquefaciens (B. a) ; milieux additionnés d’environ 500
mg.L-1de NH4Cl. .......................................................................................................................... 165
Tableau 31. Paramétres cinétiques des fermentations VHG fermentation par B. amyloliquefaciens
sur M-S175 et M-S350; additionnés d’environ 500 mg.L-1de NH4Cl.......................................... 169
9
LISTE DES ABREVIATIONS
 ABE : Acétone Butanol Ethanol.
 A. acétique : Acide acétique.
 Equ Glu : Equivalent Glucose.
 EtOH : Ethanol.
 h : heures.
 Glu : Glucose.
 Gly : Glycérol.
 Fru : Fructose.
 min : minutes.
 PHB : Poly-β-hydroxybutyrate.
 Q EtOH : Productivité volumique en éthanol.
 Q Gly : Productivité volumique en glycérol.
 rpm : rotation per minute.
 Sacch : Saccharose.
 TCEtOH : Taux de Conversion.
 TR : Taux de Rétension.
 Y EtOH : Rendement en éthanol (g éthanol / g de glucose).
 Y Gly : Rendement en glycérol (g glycérol / g de glucose).
10
TABLE DE MATIERE
Dédicace ........................................................................................................................................... 3
Remerciements ................................................................................................................................. 4
Liste des Figures .............................................................................................................................. 6
Liste des tableaux ............................................................................................................................. 9
Liste des Abreviations .................................................................................................................... 10
Table de matière ............................................................................................................................. 11
Introduction .................................................................................................................................... 18
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE .............................................................................................. 22
CHAPITRE I. LE SECTEUR PHOENICICOLE .......................................................................... 23
1 . Généralités sur le palmier dattier...................................................................................... 23
1.1 . Historique ..................................................................................................................... 23
1.2 . Taxonomie.................................................................................................................... 23
1.3 . Systématique ................................................................................................................ 23
1.3.1 . Morphologie ............................................................................................................ 24
1.3.2 . Ecologie ................................................................................................................... 24
2 . Le secteur dattier .............................................................................................................. 25
2.1 . Le secteur dattier dans le monde .................................................................................. 25
2.2 . Le secteur dattier en Tunisie ........................................................................................ 26
2.2.1 . Répartiton géographique ......................................................................................... 26
2.2.2 . Production annuelle ................................................................................................. 27
2.2.3 . Importance économique du secteur phoenicicole.................................................... 28
2.3 . La datte ......................................................................................................................... 28
2.3.1 . Définition ................................................................................................................ 28
2.3.2 . Evolution physiologique de la datte ........................................................................ 29
2.3.3 . Composition chimique des dattes ............................................................................ 30
3 . Valorisation des sous-produits de dattes .......................................................................... 34
3.1 . Valorisation technologique .......................................................................................... 35
3.1.1 . Pâte de dattes ........................................................................................................... 35
3.1.2 . Farine de dattes........................................................................................................ 35
3.1.3 . Jus de dattes ............................................................................................................. 35
3.1.4 . Sirop de dattes ......................................................................................................... 35
11
3.2 . Valorisation biotechnologique ..................................................................................... 36
3.2.1 . Production de biopolymères .................................................................................... 36
3.2.2 . Production d’acides organiques............................................................................... 36
3.2.3 . Production d’antibiotiques ...................................................................................... 36
3.2.4 . Production de biomasse ........................................................................................... 36
3.2.5 . Production des enzymes .......................................................................................... 36
3.2.6 . Production de Biofuel .............................................................................................. 37
CHAPITRE II. EXTRACTION DE JUS DE DATTES................................................................. 40
1 . Extraction solide-liquide .................................................................................................. 40
1.1 . Définition ..................................................................................................................... 40
1.2 . Influence du solvant ..................................................................................................... 42
1.3 . Influence de la température .......................................................................................... 43
1.4 . Influence de l’agitation................................................................................................. 43
1.5 . Influence de l’humidité ................................................................................................ 43
CHAPITRE III. PRODUCTION DE BIOFUEL ........................................................................... 44
1 . Le Butanol ....................................................................................................................... 44
1.1 . Production de butanol................................................................................................... 44
1.1.1 . Production par voie chimique.................................................................................. 44
1.1.2 . Production par voie biologique ............................................................................... 45
2 . Le Bioéthanol ................................................................................................................... 45
2.1 . La fermentation alcoolique........................................................................................... 46
2.2 . Microorganismes utilisés.............................................................................................. 46
2.2.1 . Les bactéries ............................................................................................................ 46
2.2.2 . Les levures............................................................................................................... 47
3 . La levure........................................................................................................................... 47
3.1 . Caractéristiques structurelles........................................................................................ 47
3.1.1 . Paroi cellulaire......................................................................................................... 48
3.1.2 . Membrane plasmique .............................................................................................. 49
3.2 . Métabolisme et conditions de croissance ..................................................................... 50
3.2.1 . Exigences nutritionelles .......................................................................................... 50
3.2.2 . Métabolisme ............................................................................................................ 53
4 . Procédés de fermentation ................................................................................................. 57
4.1 . Fermentation Batch ...................................................................................................... 57
4.2 . Fermentation fed-batch. ............................................................................................... 58
4.3 . Fermentation en mode continu ..................................................................................... 58
12
4.4 . Le Bioréacteur à recyclage cellulaire ........................................................................... 58
5 . Notion de stress chez les levures ...................................................................................... 60
5.1 . Facteurs influençant le métabolisme de la levure ........................................................ 60
5.1.1 . Effet de l’environnement ......................................................................................... 61
5.1.2 . Effet de la concentration d’éthanol.......................................................................... 62
5.1.3 . Effet de la concentration en substrat ....................................................................... 63
5.1.4 . Effets de la température et du pH ............................................................................ 63
5.1.5 . Effet de l’oxygène et de dioxyde du carbone .......................................................... 64
5.1.6 . Effet de l’acide acétique .......................................................................................... 65
5.2 . Viabilité cellulaire ........................................................................................................ 66
5.3 . Pression Osmotique ...................................................................................................... 66
5.3.1 . Détermination expérimentale .................................................................................. 69
5.3.2 . Impacts biologiques de la pression osmotique ........................................................ 70
5.4 . Les levures osmotolérantes .......................................................................................... 71
6 . Conclusion........................................................................................................................ 71
MATÉRIEL ET MÉTHODES ....................................................................................................... 72
1 . Matériel végétal ................................................................................................................ 73
1.1 . Choix de la variété de datte .......................................................................................... 73
1.1.1 . Echantillonnage ....................................................................................................... 73
1.1.2 . Caractérisation physique ......................................................................................... 74
1.1.3 . Caractéristiques biochimiques des pulpes de dattes ................................................ 74
2 . Optimisation de l’extraction de jus de datte ..................................................................... 77
2.1 . Dispositif expérimental ................................................................................................ 77
2.2 . Etablissement des modèles mathématiques .................................................................. 78
3 . Production de bioéthanol par les levures .......................................................................... 80
3.1 . Matériel biologique ...................................................................................................... 80
3.2 . Milieux de culture ........................................................................................................ 81
3.2.1 . Conservation des souches ........................................................................................ 81
3.2.2 . Milieux de fermentation .......................................................................................... 81
3.3 . Fermentations ............................................................................................................... 83
3.3.1 . Préparation de l’inoculum ....................................................................................... 83
3.3.2 . Ensemencement des milieux ................................................................................... 83
3.4 . Techniques Analytiques ............................................................................................... 83
3.4.1 . Les prélèvements ..................................................................................................... 83
3.4.2 . Suivi de la croissance .............................................................................................. 83
13
3.4.3 . Dosage par HPLC.................................................................................................... 84
3.4.4 . Dosage de NH4Cl, Méthode de MANN (1963) ....................................................... 85
3.4.5 . Evaluation de la fermentation.................................................................................. 85
3.4.6 . Analyse statistique ................................................................................................... 86
RÉSULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................... 87
Partie 1.extraction de jus de dattes ................................................................................................. 88
1 . Caractéristiques physicochimiques des sous-produits de dattes ...................................... 88
1.1 . Caractéristiques morphologiques des sous-produits de dattes ..................................... 88
1.1.1 . Couleur .................................................................................................................... 89
1.1.2 . Consistance.............................................................................................................. 89
1.1.3 . Longueur, poids et largeur des dattes ...................................................................... 90
1.2 . Caractéristiques biochimiques des sous-produits de dattes .......................................... 91
1.2.1 . Taux d’humidité ...................................................................................................... 91
1.2.2 . Le pH ....................................................................................................................... 91
1.2.3 . Teneur en sucres ...................................................................................................... 92
1.2.4 . Composition minérale ............................................................................................. 92
1.3 . Conclusion.................................................................................................................... 93
2 . Optimisation de l’extraction ............................................................................................. 93
2.1 . Dosage des sucres dans le jus ....................................................................................... 93
2.2 . Modélisation ................................................................................................................. 94
2.2.1 . Etablissement des modèles mathématiques ............................................................. 94
2.2.2 . Optimisation de l’extraction .................................................................................... 94
2.3 . Conclusion.................................................................................................................... 98
Partie 2. Sirops de dattes ................................................................................................................ 99
1. Caractérisation du sirop de dattes............................................................................................... 99
1.1. Rendement en sirop ............................................................................................................. 99
1.2. Caractéristiques physico-chimiques de sirop de datte .................................................... 99
1.2.1. pH .............................................................................................................................. 99
1.2.2. Teneur en eau .......................................................................................................... 100
1.2.3. Teneur en cendres.................................................................................................... 100
1.2.4. Teneur en protéines ................................................................................................. 100
1.2.5. Teneur en sucres ...................................................................................................... 100
1.2.6. Eléments minéraux .................................................................................................. 101
2. Effet de la haute température sur la composition du sirop de datte.................................. 102
2.1. Sucres totaux ................................................................................................................ 103
14
2.2. Sucres réducteurs.......................................................................................................... 103
2.3. Saccharose .................................................................................................................... 103
3. Conclusion........................................................................................................................ 104
Partie 3. Production de bioéthanol par des levures ...................................................................... 104
1 . Production de bioéthanol par S. cerevisiae 522D........................................................... 104
1.1. Cinétique fermentaire ................................................................................................... 105
1.1.1. Biomasse ................................................................................................................. 105
1.1.2. Evolution des sucres dans le milieu de fermentation .............................................. 105
1.1.3. Evolution de la source d’azote (NH4Cl) et du pH ................................................... 106
1.1.4. Evolution des produits de fermentation ................................................................... 107
1.1.5. Efficacité fermentaire .............................................................................................. 108
1.1.6. Conclusion ............................................................................................................... 109
2. Influence de la nature de la source d’azote et du substrat sur la production de bioéthanol
110
2.1. Impact de la Nature de source d’azote ......................................................................... 110
2.1.1. Effet des sources d’azote sur la biomasse .............................................................. 110
2.1.2. Effet de l’enrichissement sur La consommation des sucres .................................... 111
2.1.3. Effet de sources d’azote sur la Production d’éthanol .............................................. 113
2.1.4. Effet de la source d’azote sur Le pH du milieu ....................................................... 113
2.1.5. Conclusions ............................................................................................................. 115
2.2. Effet de la concentration en substrat sur la production d’éthanol ................................ 115
2.2.1. Effet sur la biomasse ............................................................................................... 116
2.2.2. Effet sur la concentration en sucres ......................................................................... 116
2.2.3. Effet sur la concentration en NH4Cl ........................................................................ 118
2.2.4. Effet sur la concentration en éthanol et glycérol ..................................................... 118
2.2.5. Conclusions ............................................................................................................. 121
Partie 4. Production de bioethanol par fermentation « VHG » (Very High Gravity) .................. 122
1 . Production de bioéthanol par différentes souches de levures ......................................... 123
1.1. Cinétique fermentaire ................................................................................................... 123
1.1.1. Evolution de la biomasse ......................................................................................... 123
1.1.2. Évolution des sucres au cours de la fermentation.................................................... 124
1.1.3. Évolution du NH4Cl dans les milieux de culture..................................................... 127
1.1.4. Produits de la fermentation alcoolique des sirops de dattes concentrés .................. 128
1.1.5. Conclusions ............................................................................................................. 137
2 . Effet de la fermentation « VHG » sur la production d’éthanol par Z. rouxii ................. 137
15
2.1 . Cinétique fermentaire ................................................................................................. 137
2.1.1 . Evolution de la biomasse ....................................................................................... 137
2.1.2 . Evolution de la consommation des sucres ............................................................. 138
2.1.3 . Evolution de la concentration en substrat d’azote ................................................. 140
2.1.4 . Produits de fermentation ....................................................................................... 142
2.1.5 . Cinétique fermentaire ............................................................................................ 144
3 . Fermentation « VHG » par Z. rouxii : effet du temps de fermentation et de la
concentration initiale en NH4Cl ................................................................................................... 145
3.1 . Effet de la durée de culture ........................................................................................ 146
3.1.1 . Cinétique de la croissance ..................................................................................... 146
3.1.2 . Cinétique de consommation des sucres ................................................................. 147
3.1.3 . Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol. .......................................... 147
3.1.4 . Cinétique de consommation de NH4Cl.................................................................. 148
3.2 . Effet de la concentration en NH4+ .............................................................................. 150
3.2.1 . Cinétique de croissance ......................................................................................... 151
3.2.2 . Cinétiques de consommation des sucres ............................................................... 151
3.2.3 . Cinétique de production d’éthanol ........................................................................ 153
3.2.4 . Cinétique de consommation de NH4Cl.................................................................. 154
3.2.6 . Conclusion ............................................................................................................. 155
4 . Fermentation « VHG » par des microorganismes isolés de sous produits de dattes ...... 156
4.1 . La souche isolée ........................................................................................................ 156
4.1.1 . Identification ......................................................................................................... 156
4.1.2 . Conditions de croissance ....................................................................................... 161
4.1.3 . Conclusion ............................................................................................................. 162
5 . Fermentation « VHG » par la souche identifiée ............................................................ 163
5.1 . Production d’éthanol par B. amyloliquefaciens, Z. rouxii et S. cerevisiae ................. 163
5.1.1 . Dégradation des sucres par les souches utilisées ................................................... 163
5.1.2 . Paramètres cinétiques ............................................................................................ 164
5.2 . Effet de la concentration en substrat sur la capacité fermentaire de Bacillus
amyloliquefaciens ..................................................................................................................... 166
5.2.1 . Evolution de la biomasse ....................................................................................... 166
5.2.2 . Cinétique de dégradation des sucres...................................................................... 166
5.2.3 . Produits de la fermentation.................................................................................... 167
16
5.3 . Conclusions ................................................................................................................ 170
6 . Procédé industriel de production d’éthanol .................................................................... 170
Conclusion générale ..................................................................................................................... 173
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..................................................................................... 176
ANNEXES ................................................................................................................................... 205
Résumé ......................................................................................................................................... 209
Abstract ........................................................................................................................................ 210
17
INTRODUCTION
Les activités agricoles et agro-industrielles génèrent des quantités importantes de

déchets qui constituent une nuisance certaine pour l’environnement et une perte de
matière recyclables.
De nombreuses études ont démontré que ces déchets, riches en matière organique
étaient des produits nobles et constituaient de nouvelles matières pour de nombreuses
industries (Acourene et Ammouche, 2012), on parle alors de matière première
secondaire.
Par ailleurs, leur valorisation par les procédés biotechnologiques représentent une
solution de choix dans la mesure où elle contribue à l’élimination de la pollution que
subit l’environnement, permet de produire des substances à forte valeur ajoutée et de la
bioénergie qui est une alternative à l’épuisement des énergies fossiles et un moyen de
lutte contre les conséquences du changement climatique et contribue enfin, au
développement industriel et agricole du pays. Les déchets des uns constituent la matière
première des autres.
À la lumière de tout cela, une attention particulière doit être accordée à une
meilleure gestion des déchets organiques et en particuliers les sous-produits provenant de
l’agriculture et des agroindustries.
L’agriculture oasienne qui est pratiquée intensivement dans un milieu désertique ou

fortement marqué par l’aridité, repose sur la culture du palmier dattier (Phoenix
dactylifera L.) à laquelle sont associées d’autres cultures : maraîchères, arboricoles ou
fourragères pour former ce qu’on appelle l’écosystème oasien.
En Tunisie, la phoeniciculture constitue le pivot de l’agriculture saharienne avec

une prédominance du palmier dattier qui est planté sur 32 000 hectares de terres irriguées
dans les oasis du sud de la Tunisie. Les oasis de Kebili, Tozeur, Gabès et Gafsa comptent
près de 4 millions de pieds. La production de dattes représente 4 % de la production
agricole totale. En 2014, elle était de 190 000 tonne en Tunisie (Faostat, 2014), avec une
augmentation annuelle moyenne de 3 % (GID, 2014).
18
Cependant, des milliers de tonnes de dattes restent non utilisées et peuvent
dépasser 40 % de la production. Ce sont des dattes qui ne sont pas consommées, soit du
fait de leurs faibles qualités gustatives, soit du fait de leur texture « rébarbative » (trop
dure), soit tout simplement parce qu’elles sont négligées au profil d’aliments plus
attractifs. Elles sont aussi souvent perdues car leur faible valeur marchande ne justifie pas
toujours les frais de récolte, même pour utilisation en alimentation de bétail.
Aujourd’hui, la bioconversion des sous-produits générés par la palmeraie et les

industries de conditionnement des dattes (écarts de tri, dattes ratatinés, véreuses, dattes
communes qui s’écoulent difficilement sur le marché) pourrait constituer un programme
d’avenir pour le développement de l’agriculture saharienne.
Cependant, bien que les techniques de valorisation de ces écarts de triage de dattes dans
les pays arabes soient multiples (pâte, farine, alcool, vinaigre, etc.…), la voie de
transformation la plus répondue en Tunisie reste la fabrication de pâte de dattes pour
confiserie, généralement de qualité microbiologique médiocre (Sanchez-Zapata et al.,
2011) et qui est de plus en plus confrontée à des problèmes d’écoulement. Ainsi, grâce
aux procédés biotechnologiques, il serait possible de mettre sur le marché national une
nouvelle génération de produits dont l’impact socioéconomique est considérable. Cela
permettent également, de créer de nombreuses, petites et moyennes entreprises (PME)
spécialisées génératrices de revenus supplémentaires tant pour les agriculteurs que pour
les industriels.
Il est intéressant de remarquer que cette biomasse, certes un sous-produit de

l’industrie agro-alimentaire, constitue un réservoir considérable de matière organique
facilement fermentescible et source énergétique très importante. Ne pas valoriser, cette
matière première secondaire constitue un manque à gagner non négligeable. Par
conséquent, il s’avère intéressant de proposer des solutions pratiques pour remédier à ce
problème en proposant des voies de valorisation, surtout en termes de production de
produits à intérêt industriel.
Les biocarburants ou agro carburants de première génération sont obtenus à partir

de culture oléagineuse (colza, tournesol …), de cultures sucrières (betterave, canne à
sucre …) et de céréales (maïs, blé …). Leur obtention nécessite l’utilisation de grandes
surfaces agricoles et d’eau. De ce fait, les biocarburants de première génération entrent
19
directement en compétition avec la filière alimentaire et peuvent contribuer à accentuer la
crise alimentaire. Afin, de pallier ces problèmes, une deuxième voie d’obtention de
biocarburants à été imaginée, les biocarburants de deuxième génération sont obtenus à
partir de sous produits agricoles et agro-industriels (Demirbas, 2007).
Ils permettent une valorisation de la totalité de la biomasse et conduisent donc à

de meilleurs rendements. Un avantage supplémentaire est qu’ils n’entrent pas en
compétition avec la filière alimentaire. Les agro-carburants sont couramment utilisés dans
tous type de véhicules puisqu’ils sont incorporés respectivement dans l’essence et le
gazole sans nécessiter de modification des moteurs.
L’utilisation des sucres dérivés des déchets agricoles, essentiellement les sucres
extraits des déchets de dattes tunisiennes, apparaît donc favorable pour produire de
l’éthanol par des microorganismes.
Les fruits de dattes sont dotés de teneurs élevées en sucres (73-83%) (Elleuch et
al., 2008) : glucose, fructose et saccharose (Elarem et al., 2011). Ils contiennent
également des protéines, des lipides, des éléments minéraux et des vitamines (Abou-Zeid
et al., 1991) et représentent par conséquent un substrat de choix pour la production de
nombreuses substances à forte valeur ajoutée (Kaidi et Touzi, 2001).
Les microorganismes les mieux adaptés à la production d’éthanol à partir de

sucres fermentescibles sont les levures du genre Saccharomyces (Olofsson et al., 2008 ;
Sanchez et al., 2007) et Kluyveromyces (Limtong et al., 2007) et la bactérie Zymomonas
(Bai et al., 2008; Patle et al., 2008) et dans un milieu hyperosmotique
Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces baiili (Leandeo et al., 2011), et Candida
peliculusa (Djelal et al., 2011) sont les plus utilisées.
C’est dans ce cadre que s’insère ce travail qui vise à contribuer à la valorisation
des dattes déclassés ou écartés par la production de produits à valeur ajoutée, comme
l’éthanol, le butanol, l’Acétone et le glycérol par fermentation. Cette étude s’insère dans
cette préoccupation et consiste à développer un procédé biotechnologique de production
(par voie fermentaire) d’éthanol.
A l’instar des Etats Unis, qui ont développé des programmes industriels intégrés
pour la production de bio-alcool à partir de blé, de maïs et de déchets industriels (Stewart
20
et al., 2011), la Tunisie, qui possède un potentiel considérable en déchets et sous produits
de dattes, pourrait s’inscrire dans un programme similaire.
Le premier objectif de la thèse est d’étudier et de mettre en place un procédé qui

permet d’extraires les sucres à partir de sous-produits de dattes. Dans un premier temps,
l’action des paramètres les plus influents sur le procédé d’extraction sera analysée et une
approche de planification expérimentale sera mise en place. Les conditions opératoires
les plus performantes seront sélectionnées pour la production à l’échelle laboratoire, d’un
stock de sirop en vue des expériences futures, nécessaires à ce travail de recherche.
La seconde partie de notre projet s’est orientée dans un premier temps sur l’étude
de la production de bioéthanol par Saccharomyces cerevisiae cultivée sur des milieux de
culture à base de sirop de dattes dilué à différentes concentration en sucres, et l’étude de
l’influence de différentes sources d’azotes.
Enfin, dans la dernière partie des résultats, nous avons examiné la production
d’éthanol par fermentation « VHG » en utilisant deux souches osmotolérantes
(Zygosaccharomyces rouxii et Candida pelliculosa) et une souche isolée de sous-produits
des dattes, après caractérisation et identification.
21
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
22
CHAPITRE I. LE SECTEUR PHOENICICOLE
1 . Généralités sur le palmier dattier

1.1 . Historique
Le palmier dattier est l'un des arbres fruitiers les plus anciennement cultivés. Les
documents les plus anciens en Mésopotamie (Irak actuellement) montrent que sa culture
se pratique depuis 3500 ans avant J.C. A la même époque, les dattiers étaient cultivés en
Irak occidental, à travers l'Arabie et jusqu'en l'Afrique du Nord.
Ce n'est qu'au milieu du XIXème siècle que les plantations furent établies dans les
vallées chaudes de Californie et dans l'Arizona méridional. Au cours des siècles, au
Maghreb, le palmier a fait l'objet de différentes plantations réparties dans des lieux
disposant de quantités d’eau relativement importantes. Le palmier dattier permet une
pérennité de la vie dans les régions désertiques. Ses fruits sont un excellent aliment grâce
à leur effet tonique et légèrement laxatif (Munier, 1973).
1.2 . Taxonomie
Le palmier dattier a été dénommé Phoenix dactyliféra par Linne en 1934. Phoenix
dérivé de Phoinix, nom du dattier chez les grecs de l'antiquité qui le considéraient comme
arbre des phéniciens ; dactyliféra vient du latin dactylis, dérivant du grec dactylus,
signifiant doigt (en raison de la forme du fruit), associé au mot latin fero, porté, en
référence aux fruits.
Le genre Phoenix dactylifera L fait parti de la classe des Monocotylédones, d'une

famille de plantes tropicales (Palmoe ou Arecaceae), la mieux connue sur le plan
systématique. Elle est représentée par 200 genres et 2700 espèces réparties en six
familles. La sous famille des Coryphoideae est elle-même subdivisée en trois tribus
(Riedackar et al., 1990).
1.3 . Systématique
La classification botanique du palmier dattier donnée par (Djerbi, 1994) est la suivante:
23
· Groupe : Spadiciflore.S ;
· Embranchement : Angiospermes ;
· Classe : Monocotylédones ;
· Ordre : Palmales ;
· Famille : palmoe ;
· Tribu : Phoenixées ;
· Genre : Phoenix ;
· Espèce : Phoenix dactyliféra L.
Le genre Phoenix comporte au moins douze espèces, la plus connue est le dactylifera,
dont les fruits « dattes » font l’objet d’un commerce international important (Espiard,
2002).
1.3.1 . Morphologie
C'est un grand palmier de 20 à 30 m de haut, au tronc cylindrique (le stipe),

portant une couronne de feuilles, les feuilles sont pennées divisées et longues de 4 à 7 m.
L'espèce est dioïque et porte des inflorescences males ou femelles, les fleurs femelles aux
trois carpelles sont indépendantes, et une seule se développe pour former la datte (le
fruit).
1.3.2 . Ecologie
Le palmier dattier est cultivé comme arbre fruitier dans les régions chaudes arides
et semi-arides. Cet arbre peut s’adapter à de nombreuses conditions grâce à sa grande
variabilité (Gilles, 2000). Le dattier est une espèce thermophile, il exige un climat chaud,
sec et ensoleillé. C’est un arbre qui s’adapte à tous les sols. Il est sensible à l’humidité
pendant la période de pollinisation et au cours de la maturation (Munier, 1973 ; Boufis et
al., 2014).
24
2 . Le secteur dattier
2.1 . Le secteur dattier dans le monde
La production mondiale des dattes s’élève à environ 7,5 millions de tonnes en

2012, produites par plus d’une trentaine de pays. Cela place la datte au 5éme rang des
fruits les plus produits dans les régions arides et semi-arides, après les agrumes, la
mangue, la banane et l’ananas. On en produit dans plus de 30 pays, les plus importants
étant l’égypte, l’Iran, l’Arabie saoudite, les Emirates arabes unies, l’Irak, le Pakiston et
l’Algérie (Figure 1). L’Europe est surtout approvisionnée par l’Afrique du Nord,
principalement la Tunisie et l’Algérie.
Figure 1. Production mondiale des dattes (FAOSTAT, 2014).
La production des dattes en 2013 dans le monde venaient principalement de l’Asie

(64%) et l’Afrique (35,5%) (Figure 2).
25
Figure 2. Répartition de production des dattes dans le monde (FAOSTAT, 2014).
2.2 . Le secteur dattier en Tunisie
2.2.1 . Répartiton géographique
Les palmeraies de dattiers sont réparties sur plusieurs gouvernorats au sud, mais la
plus importante production de dattes se concentre dans les zones de Djerid et Nefzaoua
(Figure 3) autour des villes de Tozeur et Kébili (Rhouma, 1995).
Figure 3. Répartition du palmier dattier en Tunisie.
26
La classification agro-climatique, basée sur les conditions climatiques en rapport
avec la position géographique des oasis, distingue trois types d’oasis tunisiennes :
 Les oasis continentales ou sahariennes situées dans les régions de Nefzaoua et

de Djerid. Ces oasis sont caractérisées par la dominance de la variété Deglet- Nour qui
exige en période de maturation des températures élevées et une atmosphère sèche ;
 Les oasis de montagne (d’attitude ou de pièmont) localisées à Gafsa, qui
comportent une diversité variétale avec une présence de Deglet Nour ;
 Les oasis littorales situées dans la région côtière de Gabès. C’est la seule oasis
maritime du Maghreb. Seules les variétés communes du palmier dattier y sont cultivées
(Rhouma, 1995).
2.2.2 . Production annuelle
Le patrimoine phoenicicole tunisien se caractérise par une diversité, estimé en

1993 à plus de deux cents variétés de dattes qui se différencient par la qualité de leurs
fruits (consistance) et par leur appréciation sur le marché.
Le secteur des dattes enregistre une tendance assez nette à l’augmentation de la
production (Figure 4) et des exportations.
En effet, la production totale de dattes en Tunisie a atteint 190 000 tonnes au
cours de la compagne 2012 contre 95 000 tonnes pour la compagne précédente,
enregistrant ainsi une hausse de 50 % (FAOSTAT, 2014).
Figure 4. Evolution de la production des dattes en Tunisie (en tonnes) (FAOSTAT, 2014).
27
2.2.3 . Importance économique du secteur phoenicicole
Le secteur des dattes en Tunisie contribue beaucoup à l’économie régionale,

nationale et internationale. En effet, la production des dattes n’a cessé de croitre ces
dernières années (figure 4).
Le secteur dattier occupe la troisième place dans les produits agro-alimentaires exportés
après l’huile d’olive et les produits de la mer. Il représente selon le GID (2014) :
 4 % de la valeur totale de la production agricole ;
 7 % de la valeur de la production du secteur de l’arboriculture ;
 13 % de la valeur totale des exportations des produits agroalimentaires.
Actuellement, la Tunisie est le principal acteur sur le marché international des

dattes de qualité supérieure. La variété Deglet-Nour, constitue la quasi-totalité des
tonnages exportés, elle est considérée comme un produit de luxe relativement cher pour
les ménages tunisiens et qui jouit d’une bonne image de marque sur les marchés
européens, où elle est vendue branchée, à l’état naturel et sans transformation (Besbes et
al., 2009).
2.3 . La datte
2.3.1 . Définition
La datte est une baie, de forme généralement allongée, oblongue ou ovoïde. Elle est
constituée de deux parties (Figure 5) :
 Une partie non comestible de la datte, formée par la graine ou le noyau, ayant une
consistance dure.
 Une partie comestible, dite aussi chaire ou pulpe, comporte une enveloppe fine
cellulosique, l’épicarpe. La graine est entourée par une zone interne de teinte plus
claire et de texture fibreuse, l’endocarpe, réduite à une membrane parcheminée. Les
deux sont séparés par le mésocarpe charnu et fibreux dont la consistance varie selon
les variétés, le climat ainsi que la période de maturation (Dowson et Aten, 1963).
28
Figure 5. Coupe schématique d’une datte (Munier, 1973).
La forme, la taille et la couleur des fruits varient selon la variété. Leurs

dimensions sont très variables de 1,5 à 8 cm de longueur et d’un poids de 2 à 15 g. Leur
couleur varie du blanc jaunâtre au sombre très foncé presque noir, en passant par les
ambres, rouges et bruns (Munier, 1973).
2.3.2 . Evolution physiologique de la datte
Depuis la pollinisation jusqu’à la maturation complète de la datte, on peut

observer trois types d’évolution physiologique, qui sont (Munier, 1973):
 Une évolution de taille ;

 Une évolution pondérale ;
 Une évolution de la couleur ;
A partir de cette évolution et selon la classification Irakienne on peut classer

physiologiquement toutes ces périodes en cinq stades (Dowson et Aten, 1963 ; Munier,
1973) :
 Stade Hababouk : Ce stade vient juste après la pollinisation. Il dure de quatre à cinq
semaines après la fécondation. Les fruits sont de forme sphérique et ils sont
caractérisés par une croissance lente et une couleur verte.
 Stade Kimri : Ce stade dure de neuf à quatorze semaines, il se caractérise par une
croissance rapide en poids et en volume des dattes, une teneur élevée en eau, une
accumulation des sucres réducteurs, une augmentation lente de la teneur en sucres
29
totaux et une très forte acidité réelle. Les fruits ont une couleur verte et un goût âpre à
cause de la présence des tanins.
 Stade Khalal : Au début de ce stade, la datte atteint son poids maximum. La couleur
vire du vert au jaune puis au rouge et au brun selon les variétés. Ce stade est marqué
par un accroissement des sucres totaux. L’acidité et le taux d’humidité vont en
diminuant alors que la proportion de saccharose augmente rapidement. Ce stade dure
en moyenne quatre semaines.
 Stade Routab : La durée de ce stade, où le fruit prend une couleur brune, est de deux
à quatre semaines. Ce stade est caractérisé par une légère diminution de poids et de la
teneur en eau et une augmentation de la teneur des monosaccharides qui confèrent au
fruit un goût sucré.
 Stade Tamar : C’est la phase ultime de la maturation. La couleur de l’épiderme
devient de plus en plus foncée (Dowson et Aten, 1963). Au cours de ce stade,
l’amidon de la pulpe se transforme complètement en sucres réducteurs (glucose et
fructose), et en sucres non réducteurs (saccharose) (Djerbi, 1994) ce qui donne un
rapport sucres/eau élevé empêchant, ainsi, la fermentation et assurant la conservation
du fruit.
2.3.3 . Composition chimique des dattes
Les fruits de dattes sont dotés de teneurs élevées en sucres (73-83%) (Elleuch et
al., 2008): glucose, fructose et saccharose (Elarem et al., 2011). Ils contiennent
également des protéines, des lipides, des éléments minéraux et des vitamines (Abou-Zeid
et al., 1991).
La chair des dattes est composée essentiellement d’eau, des sucres réducteurs
(glucose et fructose), des sucres non réducteurs (saccharose), et d’autres composants tels
que les éléments minéraux, les vitamines, les enzymes, les pectines, les lipides et les
protides (figure 6).
30
Figure 6. Composition biochimique de la datte (Sawaya et al., 1983).
2.3.3.1 . Teneur en eau
L’eau est l’un des constituants essentiels du fruit. Sa teneur varie aussi bien avec
le degré de maturité qu’avec le caractère variétal (Ahmed et al., 1995). Elle a une
importance fondamentale sur la stabilité microbienne et biochimique des aliments et agit
sur leur conservation. Les dattes sont qualifiées de molles si elles dépassent un taux
d’humidité de 30 % (mermella, Lemsi, Allig…) et de sèches si ce taux est de moins de 20
% (Kentichi). Les dattes sont demi-molles si le taux est compris entre 20 et 30 % (comme
Garn Gazel) (Reynes et al., 1994).
La teneur en eau peut subir des variations très importantes sous l’action de
différents traitements d’hydratation ou de séchage ou sous l’effet de l’absorption de
l’humidité de l’air environnant.
2.3.3.2 . La fraction glucidique
Les sucres représentent presque la totalité de la matière sèche soluble des dattes
(presque 60 à 70 % du poids total de la chair) ce qui leurs confère une valeur énergétique
importante (3 Kcal/Kg de pulpe). La datte contient trois sucres majeurs : le saccharose
(non réducteur), le glucose et le fructose (sucres réducteurs), ceci n’exclut pas la présence
d’autres sucres tels que le galactose, le xylose et l’arabinose. La teneur en sucres totaux
ainsi que la proportion de sucres réducteurs et de saccharose varient selon les variétés et
les stades de maturation (Reynes et al., 1994).
Il existe une relation étroite entre la nature des sucres et le pourcentage d’humidité
des dattes. En effet, les dattes molles contiennent généralement des taux de sucres
réducteurs plus élevés que leur taux de saccharose. Le cas est inverse pour les dattes
sèches (Dowson et Aten, 1963). Le rapport du taux de sucres totaux sur le taux
31
d’humidité « r » dans les fruits a été défini comme indice de qualité pour la
caractérisation des dattes. On distingue alors selon Munier (1973) trois catégories des
dattes :
 Les dattes molles : L’indice « r » est inférieur à 2 ;

 Les dattes demi-molles : L’indice « r » est comprit entre 2 et 3,5.
 Les dattes sèches : l’indice « r » est supérieur à 3,5.
2.3.3.3 . Les pigments
Les substances colorantes des dattes, mal connues jusqu’à présent, sont variables
selon les stades de maturation (couleur verte au stade Kimri, jaune tacheté en rose ou en
rouge au stade Khalal et couleur brune au stade Routab) et les variétés. Les principaux
pigments des dattes sont (Dawson et Aten, 1963) :
 Les flavones : pigments jaunes de la datte Barhi ;
 Les antocyanes : pigments rouges de la datte Deglet Nour.
Les dattes peuvent être considérées parmi les fruits les plus riches en éléments
minéraux ce qui leur confère une valeur nutritionnelle et diététique assez importante. La
datte « Deglet-Nour » contient de 1,15 à 1,90% de cendres (Munier, 1973).
Les membranes cellulaires des dattes sont constituées essentiellement de
cellulose. Ce constituant, avec d’autres solides insolubles, représente environ 85% de la
matière sèche de la datte verte. Mais, à mesure que la teneur en sucre augmente, le taux
de cellulose diminue.
La teneur en amidon varie selon le stade de développement et selon la variété
(Bouabidi et al., 1996). Dowson et Aten (1963) avaient indiqué que les fruits, peu de
temps après la pollinisation, présentaient une faible teneur en amidon qui disparaissait
ensuite entièrement dans la plupart des cultivars à maturité. Cette réserve se transforme
en sucres grâce à l’action des enzymes invertases.
Les pectines sont des polymères linéaires de l’aide galacturonique dont une partie
des radiaux carboxyles est plus ou moins estérifiée par des radiaux méthyles. Selon leur
degré d’estérification, on peut classer les pectines en pectines solubles et pectines
insolubles qui sont graduellement converties en pectines solubles (Bouabidi et al., 1996).
32
Dowson et Aten (1963) affirment que les substances pectiques augmentent
quantitativement dans les fruits jusqu’à la maturation et influencent les opérations de
fabrication de sirop et de confiture de dattes.
La pulpe de datte contient des vitamines en quantité variable selon les types de
dattes et leurs provenances. En général, elle contient des caroténoïdes, de la vitamine C et
des vitamines du groupe B en quantité appréciable (Munier, 1973 ; Cance et Widowson,
1993).
La pulpe des dattes contient une faible quantité de lipides. Elle est de l’ordre de
0,13 à 1,9 % du poids total du fruit frais. Cette quantité de lipides est concentrée dans
l’épicarpe de la datte, sous forme d’une couche de cires. L’évolution du taux de matière
grasse dans les dattes débute par une accumulation aux premiers stades de développement
suivie d’une diminution puis une stabilisation à la maturité ; à ce stade ultime de
développement le pourcentage est faible (Mrabet et al., 2008).
Les composés aminés jouent un rôle essentiel dans les réactions de brunissement non
enzymatiques (réaction de Maillard) qui interviennent lors de la conservation. Les
cultivars ayant les teneurs les plus élevées en acides aminés sont soumis à un
brunissement rapide lors du stockage (Bouabidi et al., 1996). Les teneurs des différents
cultivars en acides aminés totaux sont très hétérogènes : 140,4 mg/100 g MS pour la
variété « Choddak » contre 507 mg/100 g MS pour la variété « lemsi » qui aurait une
tendance à un brunissement rapide lors du stockage. Les teneurs en acides aminés de la
« Deglet-Nour » et du « Allig » sont respectivement de 256 mg/100 g MS et 204 mg / 100
g MS (Reynes et al., 1994).
La composition en acides aminés de la pulpe de datte révèle la présence de 18
acides aminés (Ahmed et al., 1995).
Les enzymes jouent un rôle important dans les processus de conservation qui ont
lieu pendant la formation et la maturation du fruit. La qualité des dattes, et en particulier
sa qualité organoleptique (texture, goût et couleur), dépend en grande partie de leurs
activités. Parmi ces enzymes, on peut citer l’invertase et les polyphénoloxydases.
L’invertase est une enzyme responsable de l’hydrolyse du saccharose en glucose
et fructose (Mrabet et al., 2008). Son activité augmente au cours de la maturation. En
effet, l’accumulation des sucres réducteurs est rapportée à l’accroissement de l’activité de
cette enzyme. Une température élevée et une forte teneur en eau favorisent cette inversion
(Munier, 1973).
33
Le polyphénoloxydase est une enzyme responsable du brunissement enzymatique
des dattes. Elle est détectée sous forme de traces avant le stade de maturation, son activité
reste basse jusqu’au stade tamar où l’activité atteindra son maximum (Mrabet et al.,
2008).
3 . Valorisation des sous-produits de dattes
Le secteur phoenicicole fournit à chaque récolte un tonnage non négligeable de

déchets. Ces déchets proviennent soit directement des palmeraies, soit des écarts des
stations de conditionnement et sont impropres à la consommation en frais. Ces écarts de
triage subissent un tri sélectif dont 10 % destinés à l’alimentation du bétail et le reste est
traité en vue de la transformation technologique.
La figure 7 illustre les différentes opérations de transformation de la datte et du noyau.
Figure 7. Opération de transformation des dattes (Estanove, 1990).
34
3.1 . Valorisation technologique
3.1.1 . Pâte de dattes
Les dattes molles et demi-molles peuvent servir à la confection de pâte. On ajoute

de la farine de dattes ou de sirop de dattes pour leur donner une consistance convenable.
Elle est utilisée en biscuiterie, en pâtisserie et pour la confection de glaces (Munier,
1973).
3.1.2 . Farine de dattes
La farine des dattes est obtenue à partir des dattes séchées. Après nettoyage, les
dattes sont dénoyautées et coupées puis séchées jusqu’à humidité inférieure à 5 %.
Compte tenu de sa richesse en sucres, cette farine est utilisée en biscuiterie, en pâtisserie
et dans la préparation de nombreux produits alimentaires (Munier, 1973).
3.1.3 . Jus de dattes
La fabrication de jus de dattes est connue depuis l’antiquité dans les pays de
Moyen orient où on trouve une grande quantité de datte de qualité médiocre destinée à la
transformation (Chaira et al., 2007).
Concernant la préparation de jus, les pulpes de datte sont finement hachées et une
quantité d’eau est ajoutée (Mahjoub et Jraidi, 1992), le mélange est ensuite incubé au
bain-marie selon un couple temps-température donnée. Puis, on procède à une étape de
filtration suivie d’une clarification pour éliminer les déchets et les solides insolubles.
D’après Episard (2002), on peut obtenir après six à dix heures de diffusion, selon
la variété, un jus titrant à environ 50 % d’extrait sec soluble mesuré au réfractomètre. Le
jus de datte peut être utilisé dans nombreuses préparations alimentaires telles que les
boissons gazeuses, le vinaigre, l’alcool, etc (Estanove, 1990).
3.1.4 . Sirop de dattes
Les dattes de qualité secondaire, trop molles ou écrasées, peuvent être utilisées
pour la fabrication du sirop (Munier, 1973 ; El-Sharnouby et al., 2009 ; Mostafa et al.,
2012). Ce produit bien que d’aspect sombre, est stable et est utilisé comme édulcorant
dans de nombreuses préparations pâtissières et peut également servir comme base à la
production de boissons gazeuses et peut remplacer aussi le sucre dans la préparation des
crèmes glacées (Mahjoub et Jraîdi, 1992).
35
3.2 . Valorisation biotechnologique
Les sous-produits de dattes riches en sucres fermenscibles, peuvent être

transformés par des procédés biotechnologiques pour obtenir des biopolymères, de
biofuel, des acides organiques, des enzymes et autres produits de valeur (Tableau 1).
3.2.1 . Production de biopolymères
Le jus de dattes (sous-produits), contitue un milieu favorable pour la production

de biopolymères, comme la gomme xanthane (Besbes et al., 2006), le curdlan (Salah et
al., 2011). Le sirop des dattes est valorisé par prodction des carotenoides (Elsanhoty et al.
2012) et de PHB (Omar et al., 2001).
3.2.2 . Production d’acides organiques
Davati et al. (2007) et Tavakkoli et al. (2012), ont montré que le déchet des dattes
constitue un bon milieu pour la production d’acide citrique.
3.2.3 . Production d’antibiotiques
Des chercheurs ont reussis à produire des antibiotiques à partir des sous-produits
de dattes. Abou-Zeid et al.(1991) ont produit d’oxytétracycline par Streptomyces rimosus.
Ils ont trouvé que l’ajout de l’urée comme source d’azote et les cendres de noyau de
dattes, comme source minérale permettent d’améliorer la production de l’antibiotique.
En utilisan le sirop des dattes Radhwan et al. (2010), ont produit de Bleomycine par
Streptomyces mobaraensis.
3.2.4 . Production de biomasse
Les sous-produits de dattes peuvent servir comme substrat pour la production de

levure boulangère (khan et al., 1995).
3.2.5 . Production des enzymes
Des travaux ont été entrepris par des chercheurs qui ont montré qu’un substrat à
base de sous produits des dattes, constitue un milieu de culture favorable à la production
des enzymes, comme le Pectinase (Qureshi et al., 2008), l’endopectinase (Bari et al.,
2010) et l’α-amylase (Acourene et Ammouche, 2012).
36
3.2.6 . Production de Biofuel
Différents types de biofuels ont été produits à partir des sous-produits de dattes,
comme le dihydrogene (Abd-Alla et al., 2011), l’éthanol (Gupta and Kushwaha, 2011;
Acourene et Amouche, 2012 ; Louhichi et al., 2013) et le butanol (Abd-Alla et El-Enany,
2012). Cette partie sera developpée dans le chapitre III « Production de Biofuel ».
37
Tableau 1. Valorisation biotechnoloique de sous-produit des dattes.
Produits Substrat Microorganismes Références
Biopolymères
La gomme xanthane Jus de dattes Xanthomonas campestris Besbes et al., 2006
Jus de dattes X. campestris NRRL, B-1459 Salah et al., 2010
Poly-β-
Sirop de Dattes Bacillus megaterium Omar et al., 2001
hydroxybutyrate
Curdlan Jus de dattes Rhizobium radubacter ATCC 6466 Salah et al., 2011
Carotenoide Sirop de dattes Lactobacillus plantarum QS3 Elsanhoty et al., 2012
Biofuel
E. coli EGY, Clostridium acetobutylicum
Hydrogen Dattes pourries Abd-Alla et al., 2011
ATCC824, Rhodobacter capsulatus DSMZ
Saccharomyces cerevisiae ATCC 36858,
Extrait de Datte Gupta and Kushwaha, (2011)
Saccharomyces cerevisiae STAR brand
Sous-produit de Dattes Saccharomyces cerevisiae SDB Acourene et Amouche (2012)
Ethanol Jus de dattes Saccharomyces cerevisiae Louhichi et al., 2013
Saccharomyces cerevisae
Sirop de dattes Zygosaccharomyces rouxii Chniti et al., 2014.
Candida pelliculosa
Sous-produit de dattes Clostridium acetobutylicum ATCC824 Abd-Alla et El-Enany, (2012)
Butanol
Bacillus subtilis DSM 4451 Abd-Alla et El-Enany, (2012)
Biosurfactant Sirop de dattes Bacillus subtilis 20B Al-Bahry et al., 2013
38
Acides organiques
Corynebacterium glutamicum CECT 690 et
Acide citrique Sous-produit de dattes Davati et al., (2007)
CECT77
Sous-produit de dattes Corynebacterium glutamicum CECT 690 Tavakkoli et al., (2012)
Biomasse
Saccharomyces cerevisae (I)
S. dastorianus NRRL Y12693
Levure boulangère Sucres de Dattes S. cerevisae (III) Khan et al., (1995)
S. dayanus NRRL Y-12624
S. cerevisae NRRL Y-12632
Probiotiques
lactobacille Poudre de dattes Lactobacillus casei ATCC 334 Shahravy et al., (2012)
Antibiotiques
Bleomycine Sirop de dattes Streptomyces mobaraensis Radwan et al., (2010)
Extrait de dates (Pulpe)
Oxytetracycline Streptomyces rimosus Abou-Zeid et al., (1993)
Noyau de dattes
Enzymes
Pectinase Sirop de dattes Bacillus subtilis EFRL 01 Qureshi et al., (2012)
Endopectinase Déchet de dattes Aspergillus niger PC5 Bari et al., (2010)
Alpha amylase Sous-produits de datte Candida guilliermondii CGL-A10 Acourene et Ammouche, (2012)
39
CHAPITRE II. EXTRACTION DE JUS DE
DATTES
1 . Extraction solide-liquide
L’extraction solide-liquide constitue la première opération de séparation de

plusieurs filières de transformations (extraits de fruits) boissons alcoolisées, sucreries,
etc…). Elle constitue la charnière au niveau de laquelle, les industries alimentaires
prennent le relais du domaine agricole.
Cette opération est très ancienne. Elle est largement utilisée en industrie Alimentaire pour
extraire des plantes des composés alimentaires ou pharmaceutiques, par exemple de la
production de boissons ou de médicaments.
1.1 . Définition
L’extraction solide-liquide, encore appelé extraction par solvant est une opération
de transfert de matière destinée à séparer les principes solubles d’un substrat solide par leur
diffusion dans un solvant. Son but est d’extraire, de séparer ou de dissoudre par immersion
dans un liquide ou par arrosage par un liquide, un ou plusieurs composants mélangés à un
solide. La diffusion est réalisée grâce à l’existence d’un gradient de concentration en soluté
à extraire entre la phase solide et la phase liquide. A la fin de l’opération, le système tend
vers l’équilibre. Il s’agit normalement d’une opération à pression constante.
L’extraction solide se présente sous plusieurs variantes (percolation, décoction, infusion et
macération) avec comme dénominateur commun de faire interagir le solvant sur le
matériau solide pour dissoudre ses composés solubles. Les différentes méthodes
d’extraction solide-liquide sont comparées dans le tableau 2.
40
Tableau 2. Différentes méthodes d’extraction solide-liquide
Méthodes Principes Température/Temps Exemple de produits Références

Ecoulement d'un solvant à travers un 100°C / quelques secondes (Blumberg et al., 2008 ;
Percolation solide poreux plus ou moins divisé ou minutes
Café, thè
Chambers et al., 1996)
Extraction des principes actifs d'une
Décoction préparation généralement végétale 100°C / quelques minutes Racine, graine, feuille (Li et al., 2009)
par dissolution dans l'eau bouillante
Extraction de principes actifs ou des
Tisane, thé, composés
arômes d'un végétal par dissolution
Infusion dans un liquide initialement bouillant
25-100°C / quelques minutes pharmaceutiques et Thomas et al., 2005
parfums
que l'on laisse refroidir,
Température ambiante/
Trempage d'un solide dans un
Macération solvant
quelques heures à plusieurs Végétaux, viande, poisson Wongkittipong et al., 2004
mois,
Enlever un soluté fixé à la surface Température ambiante/
Elution d'un solide par contact avec un quelques heures à plusieurs Polyphénol Sun et al., 2010
solvant mois,
41
Les substances à extraire, localisées à l’intérieur des cellules, se présentent sous
forme libre alors que celles qui participent à la structure sont liées à d’autres composés.
Leurs concentrations varient selon les conditions climatiques de croissance, les conditions
de récoltes, l’état de maturité et le conditionnement, c’est pourquoi elles varient beaucoup
d’un lot à l’autre et au sein d’un même lot.
Plusieurs auteurs ont tenté de proposer des corrélations pour le coefficient de
diffusion en fonction des caractéristiques du soluté. Ces corrélations permettent de le
prédire en milieux aqueux et organique avec un écart par rapport aux valeurs
expérimentales respectivement de 10% et 25%.
1.2 . Influence du solvant
Les solvants souvent utilisés sont l’eau, les alcools (méthanol, éthanol), les
hydrocarbures (hexane), le CO2 supercritique. Comme dans le cas du soluté, la taille des
molécules de solvant exerce une influence sur la diffusion. Il est également question de
sélectivité, afin d’extraire le maximum de soluté et le minimum des autres constituants du
cytoplasme et plus généralement de la matière végétale. Car il va falloir ensuite séparer le
soluté des autres molécules extraites. Le choix d’un solvant à faible viscosité et de masse
volumique peu élevée est recommandé pour faciliter la diffusion dans le solvant,
l’agitation et la séparation mécanique (Leybros et Fremeux, 1990).
Le choix du solvant se fait selon plusieurs critères :
- La solubilité des composants spécifiques dans le solvant,
- La régénération du solvant si celui-ci doit être réemployé. Il ne doit pas former
d’azéotrope avec un des composés qu’il solubilise et sa chaleur latente doit être faible,
- La tension interfaciale et la viscosité, car le solvant doit correctement mouiller la
matrice solide,
- Idéalement il doit être non toxique, stable, non réactif, non inflammable, inoffensif
pour l’environnement et peu coûteux.
Dans l’industrie alimentaire ou pharmaceutique, le choix du solvant est très
important. Les normes et les règles d’hygiène et de sécurité sont très strictes. Il ne doit pas
en rester dans les produits finaux ou bien les traces doivent être suffisamment
insignifiantes pour être inoffensives. De manière pratique, les ateliers disposent souvent
d’un « parc » de solvants. Le choix est souvent restreint à ce groupe de solvants qui sont
connus, maîtrisés et acceptables.
42
1.3 . Influence de la température
Une augmentation de la température entraine une augmentation de la solubilité et la

diffusivité de la solution et réduit sa viscosité. Mais elle augmente aussi la perméabilité des
parois cellulaires et donc diminue la sélectivité. La température opératoire est limitée par
les risques de dégradation thermique des produits et par la sécurité de l’installation en
présence de solvants.
Par exemple, Chambers et al., (1996) ont étudié la cinétique lors de l’extraction
d’un soluté des oranges. Ils mettent en évidence l’influence de la température sur la vitesse
d’extraction mais également son implication dans la dégradation du soluté. Son
augmentation facilite la diffusion. Mais il faut trouver un compromis car à température
élevée (80°C), au bout d’un certain temps la cinétique décroît suite à l’altération de
l’extrait. La température favorise aussi l’éclatement des cellules (Wongkihipong et al.,
2004) et entraîne la récupération d’un jus plus concentré en ballast. Celui-ci représente
l’ensemble des éléments extraits de la plante en dehors du soluté, comme la chlorophylle
par exemple.
1.4 . Influence de l’agitation
Une agitation mécanique des particules dans le solvant permet le maintien en

suspension de celles-ci et l’homogénéisation du milieu. Elle a donc une grande influence
sur le transfert de matière à l’interface solide-liquide.
1.5 . Influence de l’humidité
En règle générale, les matières végétales sont séchées pour faciliter leur
conditionnement et surtout leur stockage. Un surplus d’humidité peut donc détériorer le
substrat. De plus, lors de l’utilisation de solvants hydrophobes, la diffusivité est
inversement proportionnelle à la teneur en eau du solide (Leybros et Fremeaux, 1990).
43
CHAPITRE III. PRODUCTION DE BIOFUEL
1 . Le Butanol
Le butanol est considéré comme un biocarburant potentiel, car sa teneur en énergie

est proche de celle de l’essence. Il est donc plus facile à manipuler. (Ni et Sun, 2009).
L’indice octane d’un carburant est très important ; plus l’indice d’octane est élevé, plus le
carburant résiste à l’auto-inflammation. Le butanol avec un indice d’octane de 78 à 96, est
donc similaire à l’essence telle qu’illustré au Tableau 3 qui présente un comparatif de
certaines propriétés de différents carburants.
Tableau 3. Propriétés du butanol (Dürre, 2007 ; Lee et al., 2008)
Propriétés Butanol
Point d’ébullition (°C) 117,7
Température d’inflammation 35
(°C)
Propriétés des carburants
Butanol Essence Ethanol

Densité d’énergie (MJ/L) 29,2 32 19,6
Chaleur de vaporisation (MJ/Kg) 0,43 0,36 0,92
Indice d’octane recherché 96 91-99 129
Indice d’octane moteur 78 78-89 102
1.1 . Production de butanol
1.1.1 . Production par voie chimique
Le butanol peut être produit par trois processus important : (Dürre, 2007 ; Lee et al., 2008 ;
Qureshi et Ezeji, 2008) :
44
- La synthèse « Oxo » (hydroformylation) : le monoxyde de carbone et l’hydrogène
sont ajoutés à la liaison double du carbone-carbone à l’aide d’un catalyseur comme
le colbalt (Co), le rhodium (Rh) ou le ruthènium (Ru). La première étape produit de
l’aldéhyde qui est ensuite hydrogéné pour produire du butanol.
- La synthèse « Reppe » : le propylène, le monoxyde de carbone et l’eau interagissent
en présence d’un catalyseur pour donner directement le butanol à une faible
température et à une faible pression.
- L’hydrogénation crotonaldehyde : consiste à la condensation de l’acétaldéhyde, sa
déshydratation et son hydrogénation.
1.1.2 . Production par voie biologique
La production biologique de butanol, connue sous le nom d’ABE (Acétone,

Butanol, Ethanol) a prospéré au début du 20 éme siècle et elle est devenue le deuxième le
plus grand processus de fermentation industrielle dans le monde, après celui de l’éthanol.
Actuellement, les recherches sur l’optimisation de la production du butanol par

fermentation se concentrent sur la conversion du résidu agricole et industriel en butanol,
sur la performance des souches Clostridium productrices de butanol, ainsi que sur les
techniques de récuperation du butanol (Dürre, 2007 ; Ni et Sun, 2009).
Le butanol peut être fabriqué, à partir des produits de l’agriculture tels que le maїs,
le betterave, la canne à sucre, le blé,… . Toutefois, le principal inconvénient de produire ce
biocarburant à partir des produits agricoles et la disponibilité de ces resources et aussi leur
coût de production. Ces derniers sont les facteurs importants qui influencent le coût des
biocarburants (Qureshi et al., 2008). Il est donc primordial de pousser les recherches plus
loin, pour une énergie propre, à quantité suffisante et à des coûts rasonnables, qui ne
rentreront pas en concurrence avec les débouchets alimentaires.
2 . Le Bioéthanol
Le bioéthanol est le produit de la fermentation alcoolique (ou éthanolique) des

fruits, des céréales, des tubercules et des végétaux riches en sucres (Figure 8) (Demirbas,
2007).
45
Figure 8. Transformation des sucres continus dans les végétaux en éthanol (Cabal et Gatignol, 2015).
2.1 . La fermentation alcoolique
Au cours de la fermentation alcoolique, les sucres fermentescibles contenus dans le

grain sont convertis en éthanol (alcool éthylique) et en gaz carbonique par l’action des
microorganismes, principalement des levures. (Figure 9) (Kaidi et Touzi, 2001).
Figure 9. Conversion de glucose en éthanol (Smith et al., 2006).
2.2 . Microorganismes utilisés
Une grande variété de microorganisme produit de l’éthanol à partir de

polysaccharides. Cependant, peu sont réellement compétitifs en termes :
 De rendement en éthanol par rapport au substrat consommé

 De capacité fermentaire
 De tolérance à l’éthanol élevée
 D’adaptation aux conditions de fermentation.
2.2.1 . Les bactéries
Les bactéries capables de réaliser la fermenatation alcooliques sont peu nombreuses. Les
plus utilisées sont Zymomonas mobilis (Sadae et Batista, 2003 ; Bai et al., 2008 ; Patle et
al, 2008 ; Yanase et al., 2012; Zhao et al., 2014) et Bacillus subtilis (Romero et al., 2007)
2.2.1.1 . La bactérie bacillus

2.2.1.1.1 . Identification phénotypiques et profil biochimique
46
L’espèce Bacillus est une bactérie Gram positif dont la coloration est variable,
avec certaines espèces qui se colorent clairement comme le Gram positif dans les jeunes
cultures uniquement. Elles ont des cellules en formes de bâtonnet avec des extrémités
rondes ou carrées dont la taille varie de 0,5 x 1,2 à 2,5 x 10 µm, elles peuvent se présenter
individuellement ou en chaîne, et la stabilité de ces chaînes détermine la forme de la
colonie, qui peut varier d’une souche à l’autre (Logan et De Vos, 2009 ; Rooney et al.,
2009).
Alors que la plupart des espèces sont aérobies, certaines sont anaérobies
facultatives ou strictes (Logan et De Vos, 2009 ; Murray et al., 1995). Les espèces
Bacillus sont capables de former des spores qui peuvent être cylindriques, ovales, rondes
ou réniformes.
2.2.1.1.2 . Identification moléculaire
Le genre Bacillus est vaste, avec 11 sous-groupes phylogéniques et plus de 140

espèces (Logan et De Vos, 2009). Grâce à l’analyse des séquences génétiques ADNr 16S.
Il est difficile de distinguer la souche B. Subtilis des espèces étroitement apparentées
Bacillus, en particulier l’espèce B. amyloliquefaciens (Ash et al., 1991 ; Logan et De Vos,
2009) ; toutefois, l’espèce B. amyloliquefaciens affiche des différences distinctes dans la
séquence génétiques de l’ARN ribosomique 16S : L’absence de deux sites de ristriction
Rsal dans la région V3 qui la différencie de l’espèce B. subtilis (Jeyaram et al., 2011). Le
manque des sites Rsal est caractéristique de l’espèce B. amyloliquefaciens a été observé
dans la séquence génétique de l’ARN ribosomique.
2.2.2 . Les levures
Les microorganismes les mieux adaptés à la production d’éthanol à partir de sucres

fermentescibles sont les levures du genre Saccharomyces (Brandberg et al., 2007 ; Laluce
et al., 2002 ; Olofsson et al., 2008 ; Sanchez et Cardona, 2007 ; van Dijken et al., 1993) et
Kluyveromyces (Limtong et al., 2007).
3 . La levure
3.1 . Caractéristiques structurelles
Les levures sont des microorganismes unicellulaires qui ont une forme ovale ou
sphérique et leur morphologie peut varier selon les conditions d’environnement ou leur état
47
physiologique ; lorsqu’elles se trouvent dans des conditions favorables (milieu de culture,
température, pH, aération, etc.) elles peuvent se diviser activement par bourgeonnement.
La taille d’une levure peut varier entre 1 et 5 µm en largeur et 1 à 9 µm en longueur.
3.1.1 . Paroi cellulaire
Les principaux rôles de la paroi cellulaire de Saccharomyces cerevisiae sont de

maintenir une structure élastique qui assure une protection osmotique et qui constitue une
barrière physique (Martin-Yken et al., 2003).
La structure de la paroi est constituée de différents composés macromoléculaires
complexes tels que des polysaccharides (-glucanes, de mannanes et chitine), des protéines
et des lipides, assemblés par des liaisons covalentes (Suarit et al., 1988 ; Parou et al., 1997;
Lipke et Ovalle, 1998).
48
3.1.2 . Membrane plasmique
La membrane cellulaire est formée d’une double couche de lipides contenant un

mélange de lipides polaires et de protéines qui, par leurs interactions, assurent la structure
de la membrane. La membrane cellulaire contient notamment des protéines impliquées
dans le transport des solutés, la traduction du signal, l’ancrage du cytosquelette et dans la
synthèse de composants extérieurs de la membrane (Van der Rest et al., 1995 ; Cot et al.,
2007).
La composition lipidique de la membrane cellulaire est complexe et étroitement
régulée, suggérant un rôle précis des lipides dans l'activité des protéines membranaires. Les
lipides annulaires, qui sont en contact direct avec les protéines, semblent servir à stabiliser
les protéines dans une conformation fonctionnelle (Van der Rest et al., 1995).
La plupart des travaux de recherche se sont concentrés sur les changements de la
composition lipidique de la membrane et les effets protecteurs de certains composés vis-à-
vis du stress éthanol. D’autres données suggèrent que la composition lipidique pourrait
avoir un rôle important dans la tolérance aux stress en général et que les niveaux de
résistance sont probablement régis par des proportions différentes des composés lipidiques
plutôt que par une corrélation simple et linéaire entre la quantité de lipides spécifiques et la
tolérance au stress (Prashant et Rajendra, 1989 ; Sajbidor et al., 1995 ; Swan et Watson,
1999).
Il a été montré que des cellules enrichies en acides gras polyinsaturés possèdent une
plus grande tolérance à l'éthanol, que des cellules enrichies avec des acides gras
monoinsaturés (Watson et Rose, 1980). Selon Rozes et al., (1992), l'éthanol induit la
synthèse d'ergostérol avec une augmentation préférentielle de la proportion d’acides gras
insaturés, particulièrement en palmitoleate et en oleate, par rapport à leurs homologues
saturés (le palmitate et le stéarate). Alexandre et al., (1994) ont suggéré que ces
augmentations des proportions d’ergostérol et des niveaux d’acides gras insaturés seraient
impliquées dans la tolérance à l’éthanol. Chi et Arneborg (1999) ont montré qu’une souche
S. cerevisiae est plus tolérante à l’éthanol lorsque le ratio ergostérol/phospholipides est
élevé.
Mais les avis divergent en 1999 avec les travaux de Swan et Watson: selon leurs
travaux, il n'y a aucun rapport évident entre la composition des acides gras et la tolérance
au stress ; ils ont rapporté qu’un enrichissement des membranes en acide oléique (18:1)
49
aboutit à une résistance au stress plus importante qu’avec un enrichissement en acide
linoléique (18:2).
3.2 . Métabolisme et conditions de croissance
Plus de 95% de la production mondiale d’éthanol par fermentation utilise la levure

Saccharomyces cerevisiae. Pour produire efficacement l’éthanol, la levure doit posséder un
nombre important de « propriétés » : tolérance à l’éthanol et à des températures élevées,
capacité fermentaire élevée (faible production de co-produits), capacité d’assimilation de
différents substrats, propriétés de floculation et/ou de sédimentation, osmotolérance,
stabilité génétique.
3.2.1 . Exigences nutritionelles
La levure Saccharomyces cerevisiae est auxtrophe à certaines molécules qui lui

sont nécessaires en faible quantité. Outre le substrat, principale source énergétique de la
levure et classiquement apporté sous forme de glucose, des composés tels l’azote, le
phosphore, le soufre, certains acides aminés, les vitamines et les oligo-éléments sont
indispensables à son développement (Tableau 5). Parmi les éléments majeurs présents dans
un milieu de culture, on s’attardera plus spécifiquement sur les rôles de l’azote, du soufre
et du phosphore.
3.2.1.1 . L’azote
Les cellules de Saccharomyces cerevisiae contiennent 10% environ (de la masse

sèche de la cellule) d’azote ; il doit donc être présent dans le milieu de culture pour être
assimilé (Thomas et Inglewed, 1992). En général une quantité importante d’azote
extracellulaire est apportée sous la forme de sels d’ammonium (phosphate, sulfate,
chlorure et nitrate). La levure peut utiliser des sources d’azote différentes tels les acides
aminés, les peptides, les bases simples (Choline, bétaine), mais l’azote sous forme d’ion
ammonium est plus facilement assimilable (Winter, 1989). Il est transporté de façon
passive et incorporé par transamination après une réaction de fixation sur le glutamate
nécessitant une hydrolyse d’ATP (Jones et al., 1981).
50
3.2.1.2 . Le phosphore
Saccharomyces cerevisiae utilise l’orthophosphate, préférentiellement sous forme

d’ion monovalent, comme unique source de phosphore (Winter, 1989). Il sert à la synthèse
des lipides, des hydrates de carbone et participe au maintien de l’intégrité membranaire
(Jones et al., 1981), ainsi qu’à la synthèse des lipides et des hydrates de carbone (Winter,
1989).
3.2.1.3 . Le soufre
Le soufre est assimilé généralement sous forme inorganique SO42-. Il est

transformé dans la cellule sous forme d’un acide aminé, la méthionine.
3.2.1.4 . Les oligo-éléments
Parmi les oligo-éléments, on distinguera trois classes principales : macro-éléments

(tels que K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+ , Fe2+, Fe3+, Mn2+, Cl-) nécessaires dans une gamme de
concentration de 0,1 à 1mM ; les micro-éléments (tels que Co2+, B2+, Cd2+, Cr+, Cu2+, I- ,
Mo+, Ni2+) nécessaires dans une gamme de concentration de 0,1 à 100μM et les
inhibiteurs (tels que Ag+, As3-, Hg2+, Li+, Ni2+, Pd, Se2-) qui au dessus d’une gamme de
concentration variant de 10 à 100 µM, affectent la croissance et les capacités fermentaires
de la levure (Würmienne et al., 1984 ; Dombek et Ingram, 1986 ; Birch et Walker, 2000 ;
Ferreira et al., 2004).
Les oligo- éléments sont nécessaires à la croissance du microorganisme et à la production
d’éthanol. Les rôles des principaux oligo-éléments sont rassemblés dans le tableau 5.
51
Tableau 4. Récapitulatif des principaux oligo-éléments (Jones et al., 1981)
Classe Ions Rôles
Participe à la régulation du pH intracellulaire..
K+ L'excrétion de K+ sert à contrebalancer l'entrée d'ions du type Zn2+

et Co2+.
Mg2+
Ca2+ est incorporé dans les protéines membranaires et participe à la

Ca2+
Macro-éléments
protection de la levure contre les agressions environnementales.
Zn2+
Mn2+ Stimule la synthèse des protéines.
Fe2+,
Participent aux sites de certaines protéines.
Fe3+
Diffuse passivement à travers la cellule.

Na+
Stimule le transport des sucres.
Cl- Joue le rôle de régulateur avec les ions positifs.
Mo+
Mico-éléments
Co2+
Stimulent la croissance pour de faibles concentrations.
2+
B
3.2.1.5 . Les vitamines
La levure Saccharomyces cerevisiae est auxotrophe aux acides nicotinique et

pantothénique, à la biotine, à la pyridoxine, au myo-inositol et les acides pantothénique et
nicotinique conditionnent les futures capacités de croissance et de production de la levure
52
(Winter, 1989). Ces vitamines jouent un rôle majeur dans la tolérance à l’éthanol et leur
mode d’apport conditionne également le paramètre « tolérance » (Alfenore et al., 2002).
3.2.2 . Métabolisme
La physiologie de la levure est caractérisée par son comportement métabolique. Les

conditions environnementales et la nature de la source carbonée orientent le métabolisme
de la levure qui peut être : soit purement oxydatif, soit oxydo-réductif soit fermentaire.
3.2.2.1 . Métabolisme oxydatif
Il se caractérise par une oxydation complète du glucose via les voies métaboliques
de la glycolyse, du cycle de Krebs (Figure 10) et de la phosphorylation oxydative pour la
production exclusive de biomasse (X) et de dioxyde de carbone. Un tel métabolisme
nécessite des conditions de mise en oeuvre particulières : présence d’oxygène et
concentration en limitation de substrat (150 mg.L-1 environ) afin d’éviter un changement
métabolique vers la production d’éthanol et autres co-métabolites (effet Crabtree). Les
différentes enzymes qui catalysent les réactions du cycle de Krebs sont localisées chez la
levure Saccharomyces cerevisiae dans la matrice mitochondriale. Le bilan énergétique
théorique maximal de cette voie métabolique est décrit par l’équation suivante :
Le rendement de conversion du glucose en biomasse en métabolisme oxydatif

dépend de la souche. Le rendement théorique limite est YX/S = 0,5 g.g-1 (Postma et al.,
1989). Le cycle de Krebs permet la production de co-enzymes réduits NADH et FADH2 et
aussi la synthèse des nombreux précurseurs nécessaires à la formation des principales
macromolécules. La phosphorylation oxydative permet la régénération des co-enzymes
réduits NADH et FADH2 produits lors de la glycolyse. Les électrons libérés sont transférés
à l’oxygène moléculaire pour former une molécule d’eau. Les protons exportés permettent
de maintenir le potentiel transmembranaire entre l’espace intermembranaire et la matrice
de la mitochondrie.
De cette manière, l’entrée des protons à l’intérieur de la mitochondrie permet la
synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique grâce aux l’ATPases
membranaires. L’efficacité de la chaîne respiratoire est illustrée par le rapport du nombre
de moles d’ATP formées par atome d’oxygène consommé, représenté par P/O, qui peut
53
varier selon la souche considérée. La valeur du rapport P/O est fréquemment sujet à
polémique ; pour Saccharomyces cerevisiae, un nombre inférieur à 2 est souvent rapporté
(Bruinenberg et al., 1983). D’autres études réalisées avec la levure Saccharomyces
cerevisiae cultivée sur différents substrats en culture aérobie ont montré que la valeur
moyenne de la relation P/O peut varier entre 1,2 et 1,3 (Nielsen et Villadsen, 2003).
3.2.2.2 . Metabolisme fermentaire
Le plus généralement, ce métabolisme est décrit comme l’ensemble des réactions

qui se réalisent en l’absence d’oxygène comme accepteur final d’électrons. Cette fonction
est alors assurée par des molécules organiques. La cellule utilise d’abord le NAD+ comme
accepteur intermédiaire d’électrons qui est reduit en NADH. La réduction finale de
l’acétaldéhyde en éthanol et en dioxyde de carbone permet ainsi de maintenir l’équilibre de
la balance redox en réoxydant les NADH produits au cours de la glycolyse (figure 10) qui
est la voie principale de dégradation du sucre en pyruvate. Le bilan énergétique de la
transformation du glucose en éthanol est décrit par :
Le rendement théorique limite (YP/S) de conversion de glucose en éthanol est de

0,511 gramme d’éthanol par gramme de glucose. Ce rendement ne tient pas compte du fait
qu’une partie du glucose est transformée en biomasse (moins de 0,1 g.g-1 environ) et en co-
produits. Ainsi le rendement réel correspond à 80-90 % du rendement théorique limite, les
rendements obtenus expérimentalement sont en général moins élevés de l’ordre de 0,4 g.g-1
(Käpelli, 1986 Lebeau et al., 1998 ; Alfenore et al., 2004 ; Alfenore et al., 2006 ; Minteer,
2006 ; Jeihanipour & Taherzadeh, 2009).
3.2.2.3 . Métabolisme oxydo-réductif
Chez certains genres microbiens, comme Saccharomyces cerevisiae, un excès de

glucose en aérobiose fait basculer le métabolisme oxydatif vers un métabolisme
oxydoréductif, condition communément appelée effet Crabtree; Saccharomyces cerevisiae
étant sensible au glucose, cette levure est définie comme une levure crabtree positive. Les
cultures aérobies en mode continu (chémostat) sont le meilleur moyen de mettre en
évidence ce changement de métabolisme en contrôlant le taux de croissance () par le flux
de sucre. En réalisant des cultures oxydatives en limitation de glucose, la levure peut se
54
comporter de deux manières différents : pour des taux de croissance inférieurs à un taux de
croissance critique ( crit), la levure présente un métabolisme purement oxydatif ; pour
des taux de croissance supérieurs à ce taux de croissance critique (crit) le
métabolisme devient oxydo-réductif , une production d’éthanol (Figure 10) et une chute du
rendement de production de biomasse, cette transition correspond à l’effet Crabtree.
55
Figure 10. La glycolyse et le cycle de Krebbes. Où HxK : hexokinase ; PFK : Phosphofructokinase ; FbiP :
fructose bi-phosphatase ; PK : Pyruvate kinase ; PDH : pyruvate dehydrogénase ; PDC : pyruvate decarboxylase ;
ADH : alcool deshydrogénase ; AcDH : acetaldehyde deshydrogénase ; ACS : acetyl-CoA synthase (Poilpré, 2002).
Une autre interprétation du shift métabolique chez la levure (oxydatif/oxydo-

réductif) est basée sur le phénomène d’overflow du carbone au niveau des noeuds pyruvate
et acétaldéhyde (Figure 11). Au niveau du noeud pyruvate, la pyruvate déshydrogénase a
56
une affinité plus forte pour le pyruvate que la pyruvate décarboxylase, mais sa vitesse
maximale est plus faible. Aux faibles flux glycolytiques, le pyruvate est converti via le
pyruvate déshydrogénase vers le cycle de Krebs. Quand le flux glycolytique dépasse une
valeur critique, l’enzyme pyruvate déshydrogénase est saturée et de l’acétaldéhyde est
formé.
Il en est de même au niveau du noeud acétaldéhyde (Figure 11). Celui-ci est
préférentiellement converti en acide acétique mais lorsque l’acétaldéhyde déshydrogénase
est saturé, l’acétaldéhyde serait transformé en éthanol (Lei et al., 2001).
Figure 11. Nœud métabolique du pyruvate et de l’acétaldéhyde (Lei et al., 2001).
4 . Procédés de fermentation
La production d’éthanol a fait l’objet de très nombreux travaux académiques et

industriels afin d’améliorer les performances des procédés de production. Il existe
plusieurs modes de conduite et de configuration du bioréacteur, qui sont primordiaux et
doivent être déduites du métabolisme du microorganisme afin d’optimiser ses capacités de
production (Fadel et al., 2013).
4.1 . Fermentation Batch
La culture en mode batch permet de considérer le réacteur comme un système

fermé contenant une quantité fixée de milieu de culture, on inocule avec des
microorganismes ayant éventuellement subi plusieurs phases d’adaptation. La culture en
mode batch est caractérisée par une productivité faible, limitée par les concentrations en
biomasse liée à la concentration maximale admissible en substrat évitant toute inhibition
des capacités fermentaires du microorganisme.
57
4.2 . Fermentation fed-batch.
On peut décrire les cultures en mode fed-batch comme des cultures alimentées de
façon séquentielle ou continue, éléments nutritifs et substrats. La conduite en mode fed-
batch permet d’atteindre de plus hautes concentrations en biomasse et produits que le mode
batch en évitant l’inhibition par la concentration en substrat et la limitation en éléments
nutritifs et en réduisant les effets toxiques des produits par dilution lors des apports
(Roukas, 1994 ; Ward, 1989).
4.3 . Fermentation en mode continu
Le réacteur en mode continu est un système ouvert, dans lequel le milieu de culture
est continûment additionné et le milieu de fermentation qui contient les métabolites
produits, est continûment extrait, avec un volume réactionnel constant (Ward, 1989). La
fermentation en mode continu peut combiner une cuve et un système de recyclage
cellulaire ; dans ce cas une fraction de la biomasse cellulaire est recyclée dans la cuve (Lee
et Chang, 1987 ; Warren et al., 1994; Djelal et al., 2012a). La fermentation en mode
continu permet l’obtention de productivités élevées (Vasconcelos et al., 2004), facilite le
contrôle du procédé et la maitrise des rendements. Les inconvénients de ce mode de
conduite est la limitation du taux de dilution afin d’éviter le lessivage du réacteur ainsi que
l’inhibition du métabolisme (croissance et production) par les produits de la réaction
biochimique et la perte de viabilité. En ce sens, plusieurs techniques ont été couplées telles
que l’évaporation, l’extraction avec des solvants et filtration membranaire (Kargupta et al.,
1998) comme cela est développé dans le paragraphe suivant.
4.4 . Le Bioréacteur à recyclage cellulaire
Les réacteurs continus à recyclage cellulaire sont les mieux adaptés pour combiner
l’obtention des hautes concentrations en biomasse, le découplage entre le temps de séjour
de la biomasse et du liquide pour la maîtrise de l’environnement et le soutirage des
produits, éventuels composés inhibiteurs du métabolisme. Les bioréacteurs bi-étagés
présentent l’avantage de pouvoir découpler la production de biomasse de celle du produit
lorsque le modèle biologique le permet (Aldiguier et al., 2004). Entre tous les systèmes
développés pour augmenter les performances des procédés biologiques, les bioréacteurs à
membrane ont permis l’obtention des meilleurs résultats comparés aux autres procédés de
séparation pour le recyclage des cellules (centrifugation, floculation et décantation)
58
(Aldiguier et al., 2004 ; Lafforgue et al., 1987 ; Escobar et al., 2001 ; Mercier-Bonin et al.,
2001).
Parmi les bioréacteurs utilisant des modules de filtration membranaire, deux types
sont disponibles : filtration frontale et filtration tangentielle. La limite du procédé provient
du colmatage des membranes. La filtration frontale conduit à un colmatage plus rapide que
la filtration tangentielle (Chang et al., 1994). Le module de filtration tangentielle peut être
interne ou externe au bioréacteur. La filtration tangentielle est la méthode la plus
fréquemment utilisée pour augmenter la concentration en biomasse viable dans les
réacteurs à recyclage cellulaire car elle permet d’avoir un réacteur homogène avec un
meilleur contrôle de la viabilité. Parmi les résultats les plus notables :
- En mode continu avec recyclage de biomasse dans un bioréacteur mono-étagé muni
d’une boucle externe de microfiltration, de très hautes concentrations en biomasse ont été
obtenues expérimentalement de l’ordre de 300 g Masse sèche/L (Lafforge et al., 1994 ;
Lafforge et al., 1987).
- le recyclage cellulaire utilisant un module de filtration externe a donné des résultats
positifs concernant le maintien d’une haute concentration cellulaire dans le bioréacteur
(Chang et al., 1994).
- Du point de vue de la productivité, en mode continu à recyclage cellulaire avec un seul
fermenteur, Park et al., (1999) ont obtenu une productivité de 13 g.L-1.h-1, cette valeur
correspond à 3,3 fois la productivité en éthanol obtenue par fermentation en mode continu
conventionnel (chémostat) sans recyclage cellulaire. Lee et Chang (1987) ont obtenu une
productivité de 85 g.L-1.h-1 avec une concentration d’éthanol de 65 g.L-1, une concentration
en biomasse de 210 g Masse Sèche/L lors de cultures en fermenteur couplé avec un
module d’ultrafiltration externe. Aldiguier et al, (2004) et Ben Chaabane et al, (2006) ont
stabilisé un régime permanent de 20 h, une concentration en éthanol a été maintenue autour
de 65 g.L-1 à une concentration en biomasse de 160 g.L-1 et une concentration en substrat
résiduel proche de zéro ; ces conditions ont permis l’obtention d’une productivité de 41
g.L-1.h-1.
59
5 . Notion de stress chez les levures
5.1 . Facteurs influençant le métabolisme de la levure
La notion de stress en biotechnologie est difficile à définir ; on peut le considérer

comme l’ensemble des conditions qui provoquent des changements de processus
physiologiques conduisant éventuellement à des dégâts, dommages, blessures, inhibition
de croissance ou du développement. Graumlich et al., (1979) définissent le stress comme
une force ou une influence hostible qui tend à empêcher un système de fonctionner
normalement. Suite à cette définition, on pourrait considérer le stress comme des variations
effectuées dans le milieu de culture de la levure qui affectent son comportement et par
conséquent ses capacités de croissance et de production. Les causes de ce stress peuvent
être multiples et peuvent provoquer différentes « réponses dynamiques » du
microorganisme à différents niveaux (macroscopique, microscopique, moléculaire),
comme par exemple une modification du métabolisme cellulaire, des capacités de
croissance et des fonctions physiologiques, des rendements et des productivités. Un certain
nombre de paramètres comme la composition du milieu de culture (Gancedo, 1998 ;
Bafmcova et al., 1999 ; Oliveira et al., 1999 ; Alfenore et al., 2002 : Voit, 2003 ; Wang et
al., 2007), le mode de conduite du procédé (Schügerl, 2000 ; Gryta et al., 2000 ; Escobar et
al., 2001 ; Takaya et al., 2002 ; Kourkoutas et al., 2004 ; Gibson et al., 2007 ; Lei et al.,
2007), la pression osmotique (Gervais et Beney, 2001, Beney et al., 2001 (a,b) ; Mager et
Siderius, 2002 ; Laroche et Gervais, 2003 ; Laroche et al., 2005 ; Fullerton et al., 2006 ;
Yokozeki, 2006 ; Djelal et al., 2005), la température (Laluce et al., 2002 ; Aldiguier et al.,
2004), l’accumulation d’éthanol (Alfenore et al., 2004 ; Bai et al., 2004 ; Giannattasio et
al., 2005 ; Tagaki et al., 2005 ; Canetta et al., 2006 ; Hirasawa et al., 2007 ; Lei et al.,
2007 ; Wei et al., 2007) et la formation de sous-produits (Nevoigt et Stahl, 1997 ;
Samokhvalov et al., 2004 ; Ferreira et al., 2004 ; Karasu et Özbas, 2004) peuvent
influencer le métabolisme et les capacités dynamiques de la levure Saccharomyces
cerevisiae.
En fermentation alcoolique, l’éthanol semble représenter la principale cause de
stress pendant la culture (Martini et al., 2004). En réponse à ces perturbations externes, la
cellule va réagir passivement ou activement en essayant de prévenir la dénaturation de
l’intégrité cellulaire et sa perte d’activité. Le mode de réponse actif est généralement
considéré comme une modification métabolique consommant de l’énergie (modification de
la synthèse des molécules intracellulaires et/ou de la composition lipidique de la membrane
60
plasmique, de la morphologie de la cellule, de la composition intracellulaire). Par contre, la
réponse passive dépend seulement de la vitesse de la perturbation physique entre le milieu
intra- et extracellulaire. Les réponses des levures aux perturbations peuvent causer des
dommages irréversibles dans la cellule et même sa mort (Maréchal et al., 1999).
Lorsqu’une perturbation survient dans le milieu de culture, la cellule essaie de
s’adapter à cette nouvelle condition en protégeant ses composantes vitales et s’il le faut en
« reprogrammant » ses activités cellulaires pour assurer sa survie pendant les conditions
stressantes (Birch et Walker, 2000). Les réponses des levures ont été caractérisées de
différentes manières : par l’augmentation du niveau intracellulaire de tréhalose (Plourde-
Owobi et al., 2000) et de glycérol (Omori et al., 1996 ; Wang et al., 2001 ; Aldiguier et
al.,2004 ; Alfenore-Bideaux et al.2006), l’altération de la composition lipidique de la
membrane (Petrov et Okorokov, 1990) ; l’altération de la synthèse de protéines, la
modulation des processus d’échange ionique, une réduction de l’acitivité métabolique
provoquant une diminution de l’assimilation du glucose et par conséquent une diminution
de la vitesse de croissance et de la production est observée (Martini et al., 2004).
5.1.1 . Effet de l’environnement
Les conditions environnementales impactent le comportement de la levure en

affectant ses capacités de croissance et de production : ces paramètres sont la température,
le pH, l’apport d’oxygène, les apports nutritionnels (sels, vitamines, glucose, etc.), ainsi
que la concentration en éthanol ou co-produits dans le milieu de culture (Gibson et al.,
2007 ; Hirasawa et al., 2007). En fonction de l’intensité de ces grandeurs, elles peuvent
avoir une influence qui vise à ralentir ou arrêter l’activité des levures (Sainz et al., 2003).
Les substances inhibitrices sont parfois difficiles à éviter puisqu’elles sont souvent
substrats ou produits de la réaction biochimique considérée (Gryta et al., 2000).
Le comportement du microorganisme est une dynamique : de croissance et/ou de

production ; la réponse de la levure face à un stress est également mise en œuvre de façon
dynamique avec une capacité ou non d’adaptation aux conditions environnementales en
fonction du temps (Attfield, 1997 ; Sonnleitner, 1998 ; Henson, 2003 ; Lacroix et Yildirim,
2007).
61
5.1.2 . Effet de la concentration d’éthanol
La présence d’une concentration élevée d’éthanol dans le milieu de fermentation est

à l’origine de modifications de perméabilité et de fluidité membranes des levures, causant
une diminution de la vitesse de croissance, de la viabilité cellulaire, de l’activité
métabolique et de la capacité de production de la levure Saccharomyces cerevisiae sont
observés (Olivera et al., 2003 ; Furukawa et al., 2004 ; Pina et al., 2004 ; Aguilera et al.,
2006 ; Canetta et al., 2006 ; Hu et al., 2006 ; Hirasawa et al., 2007 ; kitagaki et al., 2007 ;
Lei et al., 2007 ; Wang et al., 2007 ; Watanabe et al., 2007 ; Wei et al., 2007).
Des concentrations de l’ordre de 1-2 % (w/v) sont suffisantes pour diminuer la

croissance cellulaire et pour une concentration de 10 % (w/v) d’éthanol, la vitesse de
production du microorganisme est stoppée (Roehr, 2001). Selon Bai et al., (2004),
l’éthanol conduit à une inhibition totale de la croissance cellulaire et la vitesse de
production à une concentration de 13 % (w/v) dans le milieu. Ce résultat corrobore les
travaux de Casey et Ingledew (1986) qui mentionnent une inhibition totale de la croissance
cellulaire lorsque la concentration en éthanol est comprise entre 11,8 et 13 % (w/v) et ce
pour quatre souches différentes. Les effets inhibiteurs de l’éthanol agissent à différentes
niveaux dans la cellule. Aux fortes concentrations en éthanol, un découpage entre
croissance et production d’éthanol est observé. La croissance cellulaire s’arrête dans un
premier temps à 60-100 g.L-1 d’éthanol (Dasari et al., 1990). Ghose et Taygir (1979) ont
réalisé des travaux expérimentaux sur la tolérance à l’éthanol et ont trouvé que 87 g.L-1, la
croissance cellulaire est complètement stoppé et à 114 g.L-1 il n’y a plus de production
d’éthanol. Par contre, les travaux effectués par Alfenore et al., en 2002, ont montré que la
tolérance de la levure à l’éthanol peut être augmentée par un apport contrôlé de vitamines,
conduisant à un arrêt de croissance cellulaire à 115 g.L-1 et un arrêt de la production
d’éthanol à 147 g.L-1. De ce fait, en contrôlant les apports nutritionnels, les auteurs
atteignent une concentration en éthanol de 147 g.L-1 en 45 h de culture.
L’effet de l’éthanol est un phénomène polygénique : plusieurs enzymes et fonctions

physiologiques sont impliquées. La membrane plasmique serait la première cible de
l’éthanol, avec des changements dans la composition lipidiques de la membrane, ainsi que
l’inhibition et la dénaturation de plusieurs protéines intracellulaires et enzymes glycoliques
telles que l’inhibition de l’hexokinase, de la pyruvate décarboxylase et de l’alcool
déshydrogénase, ainsi qu’une diminution de la diminution de la concentration en eau
62
intracellulaire (Alexandre et al., 1994 ; Jones et Greefield, 1982). L’éthanol peut exercer
son effet inhibiteur en modifiant la structure de la membrane cytoplasmique augmentant
ainsi sa perméabilité aux molécules plus petites et aux ions avec pour effet de déséquilibrer
les charges transmembranaires perturbant le transport de certains composés cellulaires
comme les sucres. En considérant l’importance des glucides, les cellules plus vieilles, qui
contiennent des réserves plus importantes, sont généralement plus tolérantes au stress
causé par les hautes concentrations en éthanol que les cellules plus jeunes (Giannattasio et
al., 2005). Il a été reporté que les gènes impliqués dans la réponse cellulaire au stress
éthanolique sont également impliqués dans la régulation du cycle de vie de la cellule
(Samokhvalov, 2004). Jakubowski et al. (2000) ont démontré, lorsque l’âge de la levure
Sacchormyces cerevisiae augmente que le processus d’oxydation des radicaux libres dans
ces cellules s’intensifie chronologiquement.
5.1.3 . Effet de la concentration en substrat
En général, l’inhibition par le substrat se manifeste de façon importante pour des

concentrations qui varient entre 150 et 250 g.L-1 de glucose et à 400 g.L-1, la croissance est
totalement stoppée (Wang et al., 1979).
5.1.4 . Effets de la température et du pH
Conformément aux lois thermodynamiques la température influence les réactions

biologiques. Néanmoins, comme tout organisme vivant, la levure ne peut fonctionner que
dans une gamme de température « optimale » et jusqu’à une température critique au delà
de laquelle elle ne peut survivre. Aldiguier et al., (2004) ont réalisé plusieurs cultures de
Saccharomyces cerevisiae CBS8066 en mode fed-batch, en conditions de température
contrôlée variant de 27°C à 39°C. Le taux de croissance maximal a été obtenu à une
température de 30°C alors que la vitesse spécifique de production d’éthanol maximale a été
obtenue à une température de 33°C. Pour des températures supérieures à 30°C, des
diminutions de la capacité de croissance et de la quantité finale de biomasse sont
observées.
Une température supérieure à 30°C accroît la vitesse de production d’éthanol mais
augmente leur sensibilité à l’éthanol ce qui entraîne une perte de viabilité. La température
accroît l’effet néfaste des stress (chocs osmotiques, inhibition par l’éthanol en entraînant
une diminution de la viabilité (Beney et al., 2001 (a)) et de l’activité cellulaire (Maréchal
et al., 1999).
63
Les limites de pH reportées dans la littérature pour maintenir une croissance de la
levure Saccharomyces cerevisiae se situent entre 2,4 et 8,6, avec un pH optimal entre 4 et
4,5 (Jones et al., 1981). Le maintien du pH cytoplasmique est indispensable à la survie de
la levure. Ainsi Jones et al., (1981) considèrent que le stress éthanolique provoque une
chute du pH cytoplasmique, ce qui induit le décès cellulaire ; cette diminution du pH
intracellulaire peut être due soit à un influx de protons (Birch et Walker, 2000 ; Kasemets
et al., 2006) ou à une accumulation d’intermédiaires de la réaction (ex. acide acétique,
glycérol, etc.) (Ferreira et al., 2004).
5.1.5 . Effet de l’oxygène et de dioxyde du carbone
La concentration en oxygène dissous dans le milieu de culture est un paramètre

important qui va orienter (en fonction de la souche utilisé, du mode de conduite, …) le
métabolisme du microorganisme considéré. Quelques auteurs (Ryu et al., 1984 ; Djelal et
al., 2006) ont démontré que la tolérance à l’éthanol peut augmenter notablement lorsqu’on
maintient un apport de faibles quantités d’oxygène dans le système.
La solubilité du dioxyde du carbone (par conséquent sa concentration dans le
milieu) peut être influencé par plusieurs facteurs tels que le pH ou la température (Aguilera
et al., 2005). Le dioxyde du carbone (CO2) présent dans le ciel gazeux du réacteur et
produit in-situ par les réactions biologiques, peut être dissous dans le milieu liquide sous
forme d’acide carbonique (H2CO3), lequel est dissocié en bicarbonate (HCO3 -), carbonate
(CO3 -2) et hydrogène (H+) (Debs-Louka et al., 1999 ; Garcia-Gonzalez et al., 2007).
Un effet négatif sur le métabolisme microbien est causé par la présence du CO2
dans le milieu de culture, en inhibant la croissance et la production (Aguilera et al., 2005).
Le mécanisme d’inactivation lié à la présence de CO2 est proposé en différents étapes :
(a) solubilisation du CO2 dans la phase liquide ;
(b) modification de composition de la membrane cellulaire ;
(c) diminution du pH intracellulaire ;
(d) inactivation des enzymes/ inhibition du métabolisme cellulaire du à
l’abaissement du pH ;
(e) effet inhibiteur directe du CO2 et HCO3 - moléculaires sur le métabolisme ;
(f) désordre de la balance des électrons ;
64
(g) modification des composants vitaux de la levure (Garcia-Gonzalez et al., 2007).
Le CO2 peut être à la fois activateur et inhibiteur du métabolisme levurien (Hirasawa et al.,
2007 ; Kunkee et Ough, 1966). Il initie les voies anaplérotiques à faible concentration:
Jones et Greenfield (1982) ont montré que le rendement de conversion du substrat
augmentait de 25% lors d’une croissance en aérobie sur glucose sous une pression partielle
de 0,2 bar de CO2. Par ailleurs, une augmentation trop importante de la pression partielle
en gaz carbonique semble entraîner une chute de la viabilité cellulaire (Ben Chaabane et
al., 2006).
5.1.6 . Effet de l’acide acétique
Le rôle de l’acide acétique, co-métabolite du métabolisme oxydo-réductif, est un

sujet peu investigué à ce jour (Ferreira et al., 2004). Pourtant ce co-métabolite semble plus
toxique pour la levure que l’éthanol.
La production d’acide acétique pendant la fermentation alcoolique semble avoir un effet
inhibiteur de la croissance cellulaire en provoquant une diminution de la production de
biomasse (Giannattasio et al., 2005). En milieu acide, les acides faibles non dissociés
peuvent diffuser à travers la membrane plasmique, dans un environnement intracellulaire
plus alcalin (cytoplasme) où la dissociation a lieu (Imai et Ohno, 1995 ; Ferreira et al.,
1997 ; Pampulha et Loureiro-Dias, 2000). Lors de cultures à pH 4, du fait du gradient de
pH transmembranaire au niveau de la membrane plasmique, la concentration de la forme
anionique de l’acide acétique intracellulaire est supérieure à la concentration
extracellulaire. L’augmentation de la concentration intracellulaire de l’acide acétique
dissocié peut perturber l’activité cellulaire en exerçant par exemple un effet découplant sur
la respiration ou l’inhibition sur l’activité de certaines enzymes. L’égalité des
concentrations de la forme non dissociée de part et d’autre de la membrane cytoplasmique
conduit à l’expression suivante (Guillouet et Engasser , 1995) :
L’ajout de l’acide acétique dans le milieu de culture peut provoquer la mort

programmée chez les levures (Fröhminch et Madeo, 2001 ; Knorre et al., 2005 ; Gourlay et
al., 2006 ; Zadrag et al., 2006). Les travaux reportés par Ludovico et al., (2002)
considèrent que la concentration en acide acétique (1,2 à 4,8 g.L-1) ajouté dans le milieu de
65
culture provoque une mort programmée (apoptose) au microorganisme ; pour des
concentrations égales ou plus hautes de 7,2 g.L-1, la levure présente un changement
morphologique ainsi que le phénomène de nécrose. Un effet synergique de l’acide acétique
et de l’éthanol induisant le décès cellulaire a été proposé dans les travaux de Ben Chabaane
et al. (2006) en bioréacteur bi-étagé à recyclage cellulaire, en mentionnant une diminution
de la viabilité cellulaire lorsque la concentration en acétate est supérieure à 2 g.L-1 alors
que la concentration en éthanol ne dépasse pas 60 g.L-1.
5.2 . Viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire est définie comme la capacité d’exécuter toutes les fonctions
nécessaires pour la survie dans des conditions données, de se reproduire et former une
colonie (Countinho, 2005).
5.3 . Pression Osmotique
La pression osmotique est la pression nécessaire pour empêcher la pénétration

d’eau dans un compartiment à travers une membrane rigide semi-perméable (perméable à
l’eau mais pas aux ions). Dans le domaine appliqué à la biologie, la pression osmotique ou
osmolarité désigne la concentration de tout soluté dans une solution aqueuse, souvent
exprimée en osmol (ou milliosmol) ; ceci correspond au nombre de moles de particules par
litre de solution (Guillouet et Engasser, 1995 ; Yokozeki A. 2006 ; Djelal et al., 2005 ;
Djelal et al., 2012b). La pression osmotique ou osmolarité est liée à l’agitation moléculaire
des molécules en solution dans le solvant (Granik et al., 2002). Par contre Wood (1999)
considère que l’osmolalité « est la pression osmotique d’une solution à une température
donnée ; elle est exprimée en moles de soluté par kilogramme de solvant ; elle peut être
mesurée, mais pas calculée et que l’osmolarité est une estimation de l’osmolalité, exprimée
en moles de soluté par litre de solution ; l’osmolarité est calculée à partir de l’adition des
concentrations de solutés osmotiquement actives dans une solution». Vinet, (2003)
considère que la pression osmotique dépend uniquement du nombre total de particules en
solution et pas de leur nature. Selon son équation de la pression osmotique (Tableau 5),
une solution contenant 1 mol/kg d’eau exerce une pression osmotique de 1 atm. Cet auteur
considère qu’il existe un écart osmotique entre l’osmolalité mesurée et celle calculée qui
peut varier de 10 à 20 mosm/kg selon cet auteur. Guillouet et Engasser. (1995) considère
que la pression osmotique en solution idéale et suffisamment diluée, est déterminée par la
loi de Van’t Hoff tandis que pour les solutions non idéales, il est nécessaire d’introduire le
66
coefficient d’activité (). Il considère aussi que l’osmolarité et l’osmolalité se définissent à
partir de la molarité et de la molalité des solutés dissous. Debnm, (2005) considère que la
seule différence entre l’osmolarité et l’osmolalité sont les unités dans lesquelles elles sont
exprimées ; osmoles/kg de solvant pour l’osmolalité et osmoles/Litre de solution pour
l’osmolarité. Cependant aucun de ces auteurs ne donne de modèle pour déterminer la
pression osmotique.Pour toute substance non-électrolytique en solution, la pression
osmotique est égale à la concentration molaire (molarité). Pour une substance
électrolytique, on doit tenir compte de toutes les espèces ioniques en présence; la
concentration osmotique est supérieure à la molarité de la solution.
67
Tableau 5. Définision de la pression osmotique, osmolalité et osmolarité.
La pression osmotique L’osmolarité

6 Auteurs
Osmolalité :
Pression osmotique (∏) d’une solution aqueuse diluée : Osmolalité = γ nc
Π = m RT γ: coefficient osmotique du soluté.
7 Vinet
m : la molalité de la solution n : nombre de particules dans le soluté.
(2003)
c : concentration en osmol/ kg d’eau.
Osmolarité (estimation
de l’osmolarité) :
Pression osmotique (∏) d’une solution aqueuse : Pression osmotique exprimée en
Osmolarité = ΢ Ci
∏ = - (RT/Vw) In aw. termes d’osmolalité (osmoles/kg)
= π / (RT)
8 Wood Vw : volume molaire partiel de l’eau. :
Ci : concentration
(1999) Aw : activité de l’eau. Osmolalité = π / (RT)
molaire des solutions
osmotiquement actives.
Pression osmotique (∏) :
Osmolalité Osmolarité
Solutions non-idéales Π = ΦRT Vm .ρ Π = ΦRT VC soluté
Guillouet et Solution Idéales
Π= (RT/Vw)ln (1-x soluté) V : nombre d’ions par molécule.
Engasser. (1995) Π= (RT/Vw)ln (1-x soluté)
Π= ΦRT C soluté (non électrolytes) M : molalité (mol / kg solvant) V : nombre d’ions
Π = RT C soluté Ρ : densité de la solution molécule.
Π= ΦRT C soluté ( électrolytes)
68
8.1.1 . Détermination expérimentale
L’osmolarité peut être mesurée avec des osmomètres. Leur fonctionnement est basé
sur un des deux principes, soit l’abaissement du point de fusion, soit l’abaissement de la
tension de vapeur. La majorité des osmomètres utilisent la détermination du point de
fusion. Dans ces appareils, l’abaissement du point de congélation de la solution par rapport
à l’eau distillée permet une mesure directe de la concentration osmolaire (milliosmol/Kg
eau).
La pression osmotique est fréquemment exprimée en Pascal (Pa) (Gervais et Marechal,
1994 ; Marechal et al., 1995 ; Marechal et al., 1999 ; Beney et al., 2001 (a, b) ; Gervais et
Beney, 2001 ; Laroche et Gervais, 2003 ; Laroche et al., 2005). En accord avec la loi de
Van’t Hoff dans des solutions diluées, (solutions idéales car les molécules sont très
éloignées les unes des autres, sans interaction. Les valeurs de la pression osmotique en
Pascal sont corrélées aux concentrations des composés dans le milieu de culture
(Yokozeki, 2006).

où
: Pression osmotique [Pa]
R : constante des gaz parfaits [8.314m3Pa/°Kmol]
T : Température absolue [°K = °C + 273,15]
Ci : concentration molaire en substances dissoutes en mol/m3.
D’autres auteurs (Kopell et Westhead, 1982 ; Csonka et Hanson 1991 ; Vinet, 2003
; Fulletrton et al., 2006) considèrent qu’il n’existe pas une corrélation linéaire entre la
pression osmotique mesurée et celle calculée avec l’équation de Van’t Hoff (Tableau 6);
ces travaux sont réalisés lorsque la concentration de la substance d’étude augmente et que
la solution devient non idéale. La pression osmotique pour des solutions non idéales peut
être déterminée par l’équation de Gibbs.
 
Où :
: Pression osmotique (Pa)
R : constante des gaz parfait (m3 Pa / K mol)
69
T : température absolue (°K)
Vsol : volume molaire partiel du solvant (m3/mol)
Xsol : fraction molaire partielle du solvant.
8.1.2 . Impacts biologiques de la pression osmotique
La disponibilité de l’eau, est un des facteurs les plus importants qui affectent la
croissance et la survie d’un microorganisme. Une variation de pression osmotique cause un
mouvement de l’eau en direction du gradient osmotique, en provoquant un gonflement
voire un éclatement (dans des milieux hypotoniques ou hypo-osmotique) ou une
plasmolyse (dans les environnements hyper-osmotiques) ; en général, le microorganisme
répond plus rapidement à un environnement hypo-osmotique qu’hyper-osmotique, étant
donné que le risque d’éclatement est plus sévère (Wood, 1999).
La cellule est capable de détecter un changement de la pression osmotique du
milieu extérieur par déformation de la membrane cellulaire ou par un changement de
l’hydratation des protéines de la membrane (Deardorff, 1980 ; Kopell et Westhead, 1982 ;
Hohmann, 2002 ; Fullerton et al. 2006 ; Sun et al. 2007).
Les réponses de la levure Saccharomyces cerevisiae placée dans un milieu hyperosmotique
sont nombreuses avec :
a) Des changements immédiats (perte d’eau intracellulaire et donc perte de la structure

cellulaire) comme conséquence directe des forces physico-mécaniques qui opèrent sous
ces conditions ; les travaux de Plourde-Owobi et al. (2000) et Wojda et al. (2003) ont
montré que la membrane cellulaire est la cible principale des dommages, les
modifications structurelles (tels que la fluidité de la membrane cellulaire, la perte de
l’eau intracellulaire,…) survenant ultérieurement. Une augmentation de la
concentration des ions intracellulaires, spécialement les ions sodium à travers la
membrane cellulaire, est supposée être impliquée dans la dénaturation des
macromolécules intracellulaires (protéines et enzymes) causée par le stress osmotique
(Beney et al., 2001 (b)).
b) Une réponse de la cellule, cherchant à se protéger, réparer et/ou récupérer ses capacités
avec arrêt temporaire de la croissance cellulaire, production de substances
osmoprotectrices (i.e. glycérol) ; diminution du volume cellulaire (Marechal et al.,
1995).
70
c) Des changements du métabolisme (répression ou activation de diverses enzymes) qui
permettront à la cellule de s’adapter aux nouvelles circonstances (Mager et Siderius,
2002 ; Wojda et al., 2003 ; Sun et al., 2007). Le choc osmotique (vers un milieu
contenant une pression osmotique plus grande) peut donc évidemment endommager les
performances de la levure et par conséquence diminuer la production d’éthanol
(Dragone et al., 2004). Il a été démontré que la viabilité et la croissance cellulaire de
plusieurs microorganismes, Saccharomyces cerevisiae compris, sont fortement
affectées par une augmentation de la pression osmotique (Beney et al., 2000 ; Beney et
al., 2001(a) ; Beney et al., 2001(b) ; Hohmann, 2002 ; Laroche et al., 2005). Laroche et
Gervais (2003) considèrent que l’influence négative de la pression osmotique sur la
viabilité cellulaire, ne dépend pas seulement de l’intensité du choc osmotique, mais
aussi de la température auquel le milieu réactionnel se trouve. Une diminution de la
viabilité est mentionnée en présence d’une pression osmotique élevée de l’ordre de 50
à100 MPa (Beney et al., 2001 (a)). Le mécanisme impliqué dans la mort cellulaire
après un choc hyper osmotique n’a donc pas encore été complètement résolu.
8.2 . Les levures osmotolérantes
Certaines levures sont osmotolérantes, telles que Candida pelliculosa (Djelal et al.,
2012a), Zygosaccharomyces rouxii (Dakal et al., 2014), Debarymyces hansenii et Pichia
farinosa (Bubrová et al., 2014). Ces levures peuvent supporter des pressions osmotiques
elevées, des pressions auxquelles aucun autre microorganisme ne peut se developper. Les
mécanismes de résistance se manifestent par l’accumulation de polyols afin de minimiser
la différence de pression osmotique entre le milieu intracellulaire et le milieu
extracellulaire.
9 . Conclusion
L’objectif de cette étude consiste à développer un procédé biotechnologique pour

pouvoir utiliser les sucres des sous produits de dattes de la variété « Deglet-Nour » pour
produire un biocarburant et etudier les fortes teneurs en sucres dans les milieux de cultures
sur la capacité fermentaire des micoorganismes utilisés.
71
MATÉRIEL ET MÉTHODES
72
1 . Matériel végétal
1.1 . Choix de la variété de datte
Le substrat utilisé pour cette étude est constitué des déchets de dattes (fruits avec
défaut de texture, fruits très humides, fruits altérés par les microorganismes et les
insectes…) produit par la variété de datte Tunisienne « Deglet-Nour » (Figure 12) la plus
abondante et la plus commercialisée, venant de l’unité Tunisienne de conditionnement des
dattes « ALKHALIG » installée à Nabeul.
Le choix de cette variété se justifie par son abondance à l’échelle nationale (60 %
de la production annuelle) (Besbes et al., 2009), et sa composition (richesse en sucre) qui
présente un milieu favorable pour la croissance et le développement des levures et par
conséquent la production d’éthanol suite à un métabolisme fermentaire.
Figure 12. Sous-produits de dattes de la variété « Deglet-Nour ».
1.1.1 . Echantillonnage
Le déchet de « Deglet-Nour » est exposé à l’air libre et à la température ambiante à

l’unité de conditionnement. Après prélèvement, les échantillons sont conservés à 4°C afin
de ralentir tout métabolisme et toute réaction chimique.
73
1.1.2 . Caractérisation physique
Les caractéristiques physiques sont réalisées sur 10 fruits prélevés au hasard, pour
lesquels sont déterminés : Les dimensions du fruit entier et de son noyau (longueur et
largeur) au moyen d’un pied à coulisse. Le poids de la datte entière, de la pulpe, ainsi que
le noyau au moyen d’une balance analytique de précision.
1.1.3 . Caractéristiques biochimiques des pulpes de dattes
1.1.3.1 . Détermination de la teneur en eau (MH%)
La teneur en matière sèche a été déterminée par dessiccation de 2 g de pulpe, dans

une étuve isotherme WEISEN à une température de 105°C et à la pression atmosphérique,
jusqu’à l’obtention d’une masse constante de l’échantillon.
Avec :
 MH% : Teneur en matière sèche (%).
 Mi : Masse du creusé vide (g).
 Mf : Masse final « après dessiccation » (Matière sèche + capsule) (g).
 Pe : Masse de la prise d’essai (g).
1.1.3.2 .Détermination du pH
Les valeurs du pH ont été déterminées en utilisant la méthode de Dowson et Aten

(1963). Quatre grammes de pulpe de datte découpés en petits morceaux, ont été dispersés
dans 200 mL d’eau bouillante. Après refroidissement, cette solution est utilisée afin de
déterminer le pH par un pH-mètre thermo-scientific, Orion 2 star.
1.1.3.3 . Détermination de l’acidité titrable (NF V05-101, 1974)
Elle consiste à effectuer un titrage de l’acidité d’une solution aqueuse avec une
solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N en présence de phénophtaléine comme indicateur
coloré.
L’acidité titrable est exprimée en gramme d’acide acétique pour 100 g de produits (dattes):
74
Avec :
 m : masse de la prise d’essai (g).

 V : volume de filtrat pris pour le titrage (mL).
 V1 : volume de la solution d’hydroxyde de sodium 0.1 N (mL).
 0,06 : le facteur de conversion de l’acidité titrable en équivalent d’acide acétique.
1.1.3.4 . Détermination de la teneur en cendres. (NF V05-113, 1972)
Le dosage des cendres est basé sur la destruction de toute la matière organique sous
l’effet de la température élevée (500±25°C). Des capsules d’incinération vides sont pesées.
5 g de matière fraîche ou 1 g de matière sèche sont ajoutés et la masse de l’ensemble est
notée. Les échantillons sont alors soumis à une température de 550°C dans un four à
moufle MERAEUS type MR170, pendant une nuit. Après refroidissement dans un
dessiccateur, les capsules contenant les cendres sont pesées à nouveaux. Le dosage est
réalisé en triplicat pour chaque échantillon.
La teneur en cendres des échantillons est calculée selon la formule suivante :
Avec :
 C (%) : teneur en cendres.

 M0 : masse en g de la capsule vide.
 M1 : masse en g de la capsule et les échantillons (avant incinération).
 M2 : masse en g de la capsule avec les cendres (après incinération).
1.1.3.5 . Analyse des éléments minéraux
La spectrophotométrie d’absorption atomique (Nouva 400) est utilisée pour ce

dosage. Elle est basée sur la capacité d’un élément donnée d’émettre une radiation
caractéristique lorsqu’on lui fournit de l’énergie. L’intensité de l’émission des raies est
alors proportionnelle au nombre d’atomes en présence.
 Préparation de la solution à analyser
Pour chaque échantillon, 100 mg de cendres obtenues par incinération sont

humectés de 2 à 3 mL d’eau distillé. Le mélange est chauffé jusqu’à l’apparition d’une
75
première vapeur puis quelques ml d’eau distillée sont ajoutés. La solution ainsi obtenue est
filtrée et rincée plusieurs fois avec de l’eau distillée tiède puis de l’eau distillée froide pour
récupérer le plus d’éléments minéraux possibles. Le volume est enfin ajusté à 100 mL avec
de l’eau distillée.
 Dosage des éléments minéraux
Une gamme étalon est préparée à partir d’une solution mère de concentration
connue pour chaque élément. La solution à analyser est diluée à différentes concentrations
avec de l’eau distillée en présence de lanthane 0,2%.
Les échantillons et les gammes étalons sont introduits dans le spectrophotomètre

d’absorption atomique. Les raies d’absorption pour le Mg, Ca, Na, et K sont
respectivement 285,2 nm ; 422,7 nm ; 589 nm ; et 766,5 nm. Les densités optiques sont
mesurées et une courbe étalon de la densité optique en fonction de la concentration est
établie pour chaque élément. La concentration en éléments des échantillons est alors
déduite en comparant leurs densités optiques à la courbe d’étalonnage convenable.
1.1.3.6 . Dosage de la matière grasse
 Principe
La méthode normée du Soxhlet (NF EN ISO 659) a servi de référence pour
l’extraction et la détermination de la teneur en matière grasse. Cette méthode consiste en
une extraction de l’huile par un solvant organique (hexane) sur une matrice solide (broyat
du matériel végétal).
L’extraction est réalisée en enceinte fermée selon un processus semi continu à partir
de 20g de broyat. Cette technique permet de renouveler le solvant sans intervenir sur le
dispositif. Cette méthode est longue (24h) et plusieurs extractions sont nécessaires pour
extraire la totalité de l’huile.
 Expression des résultats
Avec :
 M1 : Masse de ballon vide.
 M2 : Masse de ballon après extraction et évaporation de l’hexane.
76
 Pe : Prise d’essai de l’échantillon.
2 . Optimisation de l’extraction de jus de datte
Plusieurs techniques d’extraction peuvent être mises en œuvre. Parmi les

techniques, on trouve l’extarction par soxhlet et l’extraction en mode batch par agitation.
L’énergie consommée par la première technique est très importante (Chandrika, Fereidoon,
2005), en plus les solavants utilisés comme l’éthanol, le méthanol et le benzène peuvent
présenter des risques. Pour cela, nous avons choisi l’extraction à l’eau chaude en mode
batch.
2.1 . Dispositif expérimental
L’extraction standard des sucres a été effectuée selon la procédure décrite sur la
figure 13. Les dattes subissent comme traitement préliminaire, un lavage, un dénoyautage
et elles sont ensuite découpées en petits morceaux (0,5 à 1 cm) (Al-Farsi et al., 2007).
Ensuite, l’extraction est réalisée en une seule phase. La filtration de l’extrait est effectuée
en premier lieu sur un tissu gazes, puis une deuxième clarification par centrifugation
pendant 30 min à 5000 rpm à 4°C pour obtenir un extrait clair. Ainsi, pour l’étude de
l’extraction, le mélange pulpe/eau est réalisé dans des flacons de 250 ml et placés dans un
bain-marie agitateur (JULABO 090), réglé à la température de travail. A la fin de
l’extraction, les flacons sont sortis du bain-marie et immédiatement refroidis avec de l’eau
froide jusqu’à 25°C. Ils sont ensuite filtrés et l’extrait est immédiatement stocké à basse
température jusqu’à analyses.
77
Figure 13. Processus d’extraction du jus de dattes.
2.2 . Etablissement des modèles mathématiques
Les facteurs exploités ont été ceux qui ont facilité le processus d’extraction du jus.
Ces facteurs ont été, la température (X1), le temps d’extraction (X2), et le ratio datte/eau
(X3) (Tableau 7). Le plan d’expérience de Doehlert à 3 facteurs a été utilisé pour
l’exécution des manipulations. Les facteurs retenus ont conduit à la construction d’une
matrice d’expérience (W). Ces facteurs ont été choisis à cause de leur importance sur la
qualité du jus final.
78
Tableau 6. Paramètres d’extraction.
Variable Minimum Maximum
Temperature (°C) X1 70 90
Temps (min) X2 30 90
Dilution X3 1:2 1:4
Après le choix de la conception du plan d’expérience (Tableau 8) (celui de Doehlert pour

ce qui nous concerne), l’équation modèle a été définie et des coefficients de l’équation
modèle ont été prévus. Le modèle utilisé dans la méthode des surfaces de réponses a été
généralement une équation quadratique pleine ou la forme diminuée de cette équation. Le
modèle du second degré a pu être écrit (Kuila et al., 2011) comme suit :
Avec β0 : la constante, ε : l’erreur et les βj βjj et βij ont été les coefficients du modèle.
Tableau 7. Plan d’extraction : méthode de surface de réponse (Box-Behnken).
Température Temps d'extraction Ratio

d'extraction (°C) (min) (pulpe/eau)
N°
X1 (X1) X2 (X2) X3 (X2)
1 80 (0) 60 (0) 1:2 (-1)
79
2 80 (0) 90 (1) 1:4 (1)
3 90 (1) 60 (0) 1:2 (-1)
4 90 (1) 90 (1) 1:3 (0)
5 90 (1) 60 (0) 1:4 (1)
6 80 (0) 60 (0) 1:3 (0)
7 70 (-1) 90 (1) 1:3 (0)
8 70 (-1) 60 (0) 1:4 (1)
9 70 (-1) 60 (0) 1:2 (-1)
10 80 (0) 90 (0) 1:2 (-1)
11 80 (0) 30 (-1) 1:2 (-1)
12 70 (-1) 30 (-1) 1:3 (0)
13 80 (0) 30 (-1) 1:4 (1)
14 90 (1) 30 (-1) 1:3 (0)
15 80 (0) 60 (0) 1:3 (0)
3 . Production de bioéthanol par les levures

3.1 . Matériel biologique
Les travaux ont été réalisés avec des souches de levures, 3 souches commercialisées
par I‘institut Pasteur (France) ; une souche de genre Saccharomyces cerevisiae 522D, et
deux autres osmotolérantes : Zygosaccharomyces rouxii IP 2021.92 et Candida
80
Pelliculosa IP 820.63 et deux autres souches isolées des sous-produits des dattes, par le
laboratoire et qui feront l’objet d’une publication.
3.2 . Milieux de culture
3.2.1 . Conservation des souches
Les souches sont stockées à - 20°C dans des tubes de cryoconsevation, contenant
un milieu Sabouraud (Merck) liquide (1 ml), supplémentés en glycérol (Carlo Ebra) (30
%), qui protège les cellules à l’éclatement par le froid.
Avant utilisation, les souches sont repiquées stérilement sous hotte à flux laminaire
et sur gélose incliné et conservées à 4°C. La composition du milieu pour un litre de gélose
de Sabouraud est la suivante suivante : Peptone (10 g), Extrait de levure (10 g), Glucose
(20 g), Agar-agar (15 g) dans l’eau osmosée (Merck MILLIPORE) qsp 1000 ml.
3.2.2 . Milieux de fermentation
3.2.2.1 . Milieu synthétique.

Le milieu minéral de culture utilisée pour cette étude, est le milieu Dw (Djelal et al.,
2012a) (milieu modifié de wikerham, 1951). La composition est la suivante (Tableau 9) :
81
Tableau 8. Composition de milieu Dw.
Constituants Milieu Dw (mg.L-1)
KH2PO4 5200
MgSO4, 7H2O 1200
CaCl2, 6 H2O 150
FeSO4, 7H2O 100
ZnSO4,7H2O 30
CuSO4,5H2O 0,79
H3BO3 15
KI 2
Na2 M0O4, 2H2O 5
MnSO4, H2O 32
CoCl2,6H2O 5,2
EDTA 100
La source d’azote est le chlorure d’ammonium (NH4Cl, 500 mg.L-1), la source de carbone
un sucre simple, fermentescible. Les milieux sont « stérilisés » par filtration sur filtre 0,2
µm. Le pH est ramené à 5,5 à l’aide de KOH 1 mol.L-1.
3.2.2.2 . Milieu enrichi avec des sels minéraux, oligo-éléments et une source
d’azote.
Le pH dans les différents lots expérimentaux est ajusté à 5,5 par une solution KOH
1 mol.L-1. Les flacons sont stérilisés par autoclavage à une température de 121°C pendant
82
20 min. Sauf les oligo-éléments (Tableau 9) qui sont préparés séparément et sont stérilisés
par des filtres à seringue 0,2 µm.
3.3 . Fermentations
3.3.1 . Préparation de l’inoculum
Les levures sont pré-cultivées pendant 18 h à 28°C sous agitation (INNOVA 40,
New Bruswik, USA) à 180 rpm. Les précultures sont réalisées dans des flacons de 250 mL
contenant 25 mL de milieu constitué de glucose 10 g.L-1, peptone 10 g.L-1 et d’extrait de
levure 10 g.L-1. Après l’obtention d’une culture dont l’absorbance à 610 nm correspond à 1
unité d’absorbance, la suspension est centrifugée (4°C, 1800 g, 5 min). Le culot est ensuite,
récupéré puis remis en suspension à l’aide de 25 ml de KCl (150 mmol.L-1). Après une
seconde centrifugation dans les mêmes conditions, le culot est repris dans 10 ml de KCl
(150 mmol.L-1) et est utilisé pour ensemencer les cultures (Djelal et al., 2005).
3.3.2 . Ensemencement des milieux
Les essais de fermentations sont dupliqués dans des flacons de 500 mL fermés par
des bouchons à vis, contenant 300 mL de milieu. Les différents milieux sont inoculés par
200 µl de suspension de levure dans du KCl 150 mmol.L-1 (Djelal et al., 2005) et incubés
par la suite dans un Shaker (New brunswick, INNOVA 40) à 28°C, sous une agitation de
180 rpm.
3.4 . Techniques Analytiques
3.4.1 . Les prélèvements
Le suivi de la fermentation est réalisé, en effectuant des points de prélèvements de

5 ml à différents moments de fermentation. Les prélèvements sont ainsi effectués dans des
tubes soigneusement annotés et conservés à -18°C en attente de dosage.
3.4.2 . Suivi de la croissance
3.4.2.1 . Densité optique
Le suivi de la croissance se fait par lecture de l’absorbance des suspensions de levures,

juste après le prélèvement, à l’aide d’un spectrophotomètre PRIM SECOMAM à 600 nm.
83
3.4.2.2 . Dénombrement sur gélose
Cette méthode permet un dénombrement de la biomasse viable, c'est-à-dire capable

de se produire et donc pouvant former une colonie. Pour avoir un nombre significatif de
colonies et que celles-ci soient bien isolées le nombre de colonies par boite doit être
compris entre 30 et 300. Pour cela des dilutions décimales successives de l’échantillon sont
faites dans l’eau physiologique (NaCl : 9 g.L-1) jusqu’à la dilution désirée pour l’étalement.
Le milieu gélosé est un milieu PCA (plate Count Agar (AES Chemunex)) contenant une
faible concentration en glucose ce qui permet une croissance plus lente et donc un meilleur
isolement des colonies.
Composition du milieu PCA :
- Tryptone : 5 g.L-1.
- Extrait de levure : 2,5 g.L-1.
- Glucoe : 1 g.L-1.
- Agar : 15 g.L-1.
50 µL de deux dilutions sont déposés en triplicata, les boites sont ensuite incubées 48 h à
28°C et le nombre d’unités formant une colonie (UFC) est déterminé.
3.4.3 . Dosage par HPLC
3.4.3.1 . Préparation des échantillons
L’échantillon est centrifugé (1800 rpm, 10 min, 4°C), le surnageant est prélevé et
placé dans un nouveau tube identifié en attente d’analyse à 4°C.
3.4.3.2 . Matériel
Le Chromatographe utilisé est une chaîne WATERS ® (BIO-RAD, Hercules, CA,

USA), équipé d’une pompe (Milford, MA, USA). La séparation des différents composés
est effectuée au sein d’une colonne d’exclusion d’ions HPX-87 H (300 x 7,8 mm, BIO-
RAD). Elle est maintenue à 45°C dans un four (Cro-Cir TM, Cluzeau Info-Labo, ste Foy La
Grande, France), en sortie de la colonne, un réfractomètre différentiel ERC 7512 permet le
suivi des différents composés.
La phase mobile utilisée est une phase polaire d’un mélange d’acide sulfurique
(H2SO4) dans de l’eau ultrapure (Merck MILLIPORE). La concentration en acide
sulfurique est de 0,01 N. L’éluant est préalablement dégazé sous vide. Le débit de la phase
mobile est fixé à 0,7 mL.min-1.
84
3.4.3.3 . Molécules recherchées
La HPLC permet de quantifier les concentrations des molécules suivantes :
- Les oses et diholosides tels que le saccharose, glucose, fructose, xylose,

- Les polyols tels que le glycérol,
- Les acides organiques tels que l’acide acétique,
- Les alcools tels que l’éthanol, et le butanol.
La détection des différents composés se fait à l’aide d’un réfractomètre ERC 7512
(Saitama, Japan). Le logiciel utilisé est IC Net version 2.3, Metrohm AG, Herisau,
Switzerland.
Tous ces composés ont fait l’objet d’un étalonnage (Tableau 10). Les temps de
rétention tr permettent alors d’identifier les composés présents dans les échantillons
prélevés.
Tableau 9. Temps de rétention des composés quantifiés par HPLC.
Sacchrose Glucose Fructose Glycérol Acide acétique Ethanol
4
tr(min) 5,98 7,16 7,87 10,87 12,39 17,16
4.1.1 . Dosage de NH4Cl, Méthode de MANN (1963)
La concentration en NH4Cl dans les milieux au cours de la fermentation a été déterminée

par une réaction colorimétrique développée par MANN en 1963.
4.1.2 . Evaluation de la fermentation
4.1.2.1 . L’équivalent glucose
Le calcul de la concentration en sucres totaux en équivalent glucose (Equi Glu) est effectué
grâce à la relation proposée par Carrasco et al., 2001 :
Le °Brix des milieux est determiné par un refractomètre manuel (ZUZI) à 3 échelles (0-
90°), avec 0,2°Brix de précision. Le °Brix est la fraction de sucres dans un liquide, c'est-à-
dire le pourcentage de matière séche soluble.
85
4.1.2.2 . Rendement de la fermentation et Conversion du substrat
Nous avons caractérisé la fermentation par des grandeurs autres que les
concentrations en produits, afin de pouvoir comparer les résultats avec l’ensemble des
essais réalisés. Nous avons calculé, les rendements globaux en bioéthanol (YEtOH), en
glycérol (YGly), et la productivité de l’éthanol et de glycérol, à la fin de la fermentation par
rapport au substrat consommé (s).
4.1.2.2.1 . Rendements en éthanol et en Glycérol
YEtOH s’exprime en « quantité d’éthanol produite (EtOH) par quantité de substrat

(S) consommé (par exemple g d’éthanol par g de substrat).
YGly s’exprime en « quantité de Glycérol produite (Gly) par quantité de substrat (S)
consommé (par exemple g de Glycérol par g de substrat).
4.1.2.2.2 . Productivités volumiques horaire globale (Q)
Q est le rapport Ethanol ou Glycérol produit par durée globale de la fermentation

(par exemple g (EtOH) par litre par heure).
4.1.3 . Analyse statistique
L’ensemble des résultats a été analysé à l’aide du logiciel XLSTAT ; l’analyse

ANOVA, a été réalisée pour étudier les variables qualitatives. L’optimisation de
l’extraction des jus a été réalisée par JMP 10 (SAS institute Cary, NC, USA).
86
RÉSULTATS ET DISCUSSION
87
PARTIE 1.EXTRACTION DE JUS DE DATTES
1 . Caractéristiques physicochimiques des sous-produits de dattes
Le substrat utilisé dans ce travail de recherche, nous a été fourni par l’unité de
conditionnement « ALKHALIGI » installée à Nabeul en Tunisie.
La variété « Deglet-Nour », est la variété la plus répondue et la plus commercialisée. Elle
constitue à l’heure actuelle, l’unique variété appréciée sur les marchés nationaux et
internationaux et de ce fait, elle est très plus sensible à l’altération et se conservant mal sur
les lieux de production et les unités de conditionnement.
D’après Acourène et al., (2001), une datte est dite de qualité physique et biochimique
acceptable lorsque les critères suivants sont respectés :
 Aucune anomalie et non endommagé ;

 Un poids supérieur ou égal à 6 g ;
 Un poids en pulpe supérieur ou égale à 5 g ;
 Une longueur supérieure ou égale à 3,5 cm ;
 Un diamètre supérieur ou égal à 1,4 cm ;
 Un pH supérieur ou égal à 5,4 ;
 Une humidité comprise entre 10 – 30 % ;
 Une teneur en sucres supérieure ou égale à 65%.
1.1 . Caractéristiques morphologiques des sous-produits de dattes
Les caractéristiques morphologiques des dattes « Deglet-Nour » sont mentionnées dans le

tableau 11.
88
Tableau 10. Caractéristiques physiques des dattes « Deglet-Nour ».
Paramètres Datte Deglet-Nour
Couleur Brune
Consistance Demi-molle
Poids de la datte entière (g) 8,7±1,51
Poids de la pulpe (g) 7,87±1,51
Poids du noyau (g) 0,81±0,11
Longueur de la datte (cm) 4,03±0,41
Largeur de la datte (cm) 1,87±0,21
Noyau / datte entière (%) 9,31
Pulpe / datte entière (%) 90,45
Longueur/Largeur 2,16
1.1.1 . Couleur
La couleur des fruits (déterminée visuellement) est brune. La couleur est due à la
composition biochimique et aux critères génétiques. Il convient de rappeler ici
l’importance de la couleur en tant que critère objectif de qualité, car elle varie avec le
niveau de maturité des dattes et peut être un indicateur de l’état de fraîcheur ou
d’altération. Pour les consommateurs, il s’agit d’un critère de choix pour l’appréciation de
la qualité de produit.
1.1.2 . Consistance
Selon leur consistance, les dattes sont classées comme suit :

- Datte molle : elles ont une chaire très aqueuse ;
89
- Datte demi-molle : dont la teneur en eau est moins importante que la catégorie
précédente, mais qui reste de consistance molle ;
- Datte sèche : dont la pulpe est naturellement sèche (Munier, 1973).
La consistance des fruits utilisés est généralement demi- molle, avec un petit pourcentage
des dattes molles et sèches.
1.1.3 . Longueur, poids et largeur des dattes
D’après les résultats mentionnés dans le tableau 11, la longueur moyenne des fruits
est de 4,03 cm et la largeur de 1,87 cm, conforme avec les mesures trouvées par El Arem et
al (2011) sur des dattes commerciales et qui ont trouvé 4,10 cm et 1,60 cm. Le poids
moyen de la datte entière est de 8,7 g, tandis que celui de la pulpe est de 7,87 g, bien
inférieur aux résultats trouvés par El Arem et al, (2011) 10,49 g et 9,5 g. Cette différence
de poids, est expliquée par la contamination par des parasites qui dégradent les dattes
durant le stockage.
Les caractéristiques morphologique des dattes utilisées, présente une valeur

supérieure à celle mentionnée par Acourene et Ammouche, (2012). Mais, ces dattes sont
considérées comme déchets à cause des altérations physiques qui se produisent au cours
des différentes opérations de manipulation (Chocs, écrasement et dessèchement). Ces
altérations provoquent des lésions qui accélèrent les processus d’altération biologique, qui
comprennent les altérations microbiologiques causées par les levures et les moisissures et
les altérations parasitaires par les insectes ravageurs qui dégradent les dattes stockées et
causent une perte de poids et une dépréciation de la valeur commerciale du fruit (figure 14)
Figure 14. Altération parasitaire d’une datte.
90
1.2 . Caractéristiques biochimiques des sous-produits de dattes
Le tableau 12 regroupe les caractéristiquesbiochimiques du substrat utilisé.
1.2.1 . Taux d’humidité

L’eau est l’un des constituants essentiels du fruit. Elle a une importance
fondamentale sur la qualité de la datte et agit sur sa conservation. Le taux d’humidité des
sous-produits utilisés est de 21,7% (Tableau 12). Ces résultats sont en accord avec ceux
trouvés par Besbes et al (2006).
De nombreux auteurs utilisent cette variable pour classer les dattes. Pour Toutain
(1977), les dattes sont qualifiées de molles si elles dépassent un taux d’humidité de 30% et
de sèches si ce taux est de moins de 10%. Les dattes sont demi-sèches ou demi-molles si le
taux est compris entre 10 et 30%. Selon ce classement, les dattes utilisées dans ce travail
sont demi-molles.
1.2.2 . Le pH
Le pH est un indice de qualité déterminant l’aptitude à la conservation des aliments.

Il est donc important de mesurer le pH, afin de connaître la stabilité de l’aliment vis-à-vis
des microorganismes.
Selon Meligi et sourial (1982), on peut classer les dattes en trois groupes selon leur pH :
 Dattes de mauvaise qualité : pH inférieur à 5,4. ;

 Dattes de qualité acceptable : pH compris entre 5,4 et 5,8 ;
 Dattes de bonne qualité : pH supérieur à 5,8.
Les résidus de dattes utilisé a un pH 5,3 ; ce qui montre que les dattes sont de mauvaise
qualité.
Tableau 11. Caractériqtiques biochimiques des sous-produits de dattes.
Pulpe
Matière sèche (%)(*) 78,5±0,05
pH (*) 5,3±0,08
Acidité titrable (g /100 g du poids sec) (*) 0,27±0,01
Protéines (g / 100 g du poids sec) (*) 0,34±0,01
91
Cendre (%)(*) 0,61±0,11
Sucres totaux (%) (*) 65,3±0,23
Glucose (*) 16,20±0,16
Fructose (*) 15,3±0,03
Saccharose (*) 33,8±0,18
Matière grasse (%)(*) 0,19±0,05
(*) Valeur exprimée par rapport à la matière sèche (MS).
1.2.3 . Teneur en sucres
Les sous-produits des dattes sont considérés comme un substrat riche en sucres.
Ceux-ci existent sous deux formes : saccharose et sucres réducteurs. Les sucres réducteurs
principaux sont le fructose et le glucose. L’analyse de la composition des déchets utilisés
montre un taux remarquable de sucres qui dépasse 60% du poids sec des fruits (MS)
(Tableau 12).
Les sucres totaux sont composés de sucres en C12 (Saccharose) et de sucres

simples ou sucres réducteurs en C6. La majorité des sucres est du saccharose (33,8%), le
substrat montre un taux de fructose (15,3%) presque égal au taux de glucose (16,2%). Ces
résultats sont en accord avec ceux de El-Arem et al. (2011), qui ont trouvé un taux de
saccharose de 33,3% et un taux de sucres réducteurs de 29,8%.
1.2.4 . Composition minérale
La composition des dattes en matière minérale est présentée dans le tableau 13,
Deglet-Nour contient 0,61% de cendres (tableau 12). Dans notre analyse, le potassium, le
magnésium et le calcium sont les minéraux qui ont les teneurs les plus élevés et qui
présentent respectivement 596,8, 92,2 et 38,7 mg/100 g de matière fraîche.
92
Tableau 12. Composition en éléments minéraux de pulpe de Deglet-Nour (mg/100 g de matière fraîche).
Na K Mg Cu Fe Ca Zn
Pulpe 13,37±1,83 596,79±0,01 92,176±4,8 <0,1 1,5±0,41 38,70±1,2 0,72±0,009
1.3 . Conclusion
Les caractéristiques morphologiques et physicochimiques des fruits constituant la

biomasse utilisée montrent qu’ils sont majoritairement constitués de dattes de la
variétédemi-molle ; ils renferment une humidité de 21,5%, ont un pH légèrement acide, un
taux de protéine supérieur à 0,34% et un taux de sucres totaux qui dépasse les 60%. Ces
résultats montrent que le sous-produit des dattes est un substrat très riche en sucres
fermentescibles et qui peut donc être intéressant pour la transformation en bioéthanol par
des levures.
2 . Optimisation de l’extraction
Le choix du plan d’expérience pour l’optimisation des conditions opératoires de

l’extraction de jus du sous-produit de dattes prend en compte plusieurs critères. Tout
d’abord, les paramètres à optimiser sont trois variables continues et supposées dépendantes
les unes des autres : la température (X1), le temps d’extraction (X2) et le ratio pulpe/eau
(X3). L’objectif est d’optimiser ces trois facteurs et de modéliser leur influence sur la
concentration en sucres, tout en réalisant un minimum d’expériences.
La macération est effectuée sous agitation en faisant varier le temps d’extraction. Une fois
le temps de macération écoulé, le tout est filtré, puis conservé pour analyses
physicochimiques.
2.1 . Dosage des sucres dans le jus
La concentration en sucres (glucose, fructose et saccharose) est déterminée par

HPLC (voir Partie Matériel et méthodes 4.3). Les teneurs sont exprimés en g.L-1.
93
2.2 . Modélisation
2.2.1 . Etablissement des modèles mathématiques
Le plan d’expérience de Doehlert à 3 facteurs a été utilisé pour l’exécution des

manipulations. Les facteurs retenus ont conduit à la construction d’une matrice
d’expérience. Ces facteurs ont été choisis en raison de leur importance et de leur influence
sur la composition du jus final. En effet, le ratio pulpe/eau (X1) a une influence sur la
qualité du jus. Le temps de macération (X2) et la température d’extraction ont un impact
sur la diffusion des constituants de la chair dans l’eau de macération. La réponse qui a été
retenue après la filtration est le rendement en sucres exprimés en Equivalent Glucose (Equi
Glu) g.L-1.
2.2.2 . Optimisation de l’extraction
Les manipulations effectuées à partir du plan d’expérience de Doehlert (3 facteurs)

ont conduits aux résultats consignés dans le tableau 14. Le modèle mathématique obtenu
tient compte des variables codées et se présente comme suit pour le suivi de la
concentration en sucres des jus.
Y (X1, X2, X3) = modèle mathématique pour le suivi de la concentration en sucres des jus
de datte ;
X1 = température (°C) ;
X2 = temps d’extraction (min) ;
X3 = Ratio dattes/eau.
Les facteurs des modèles sont linéaires (X1, X2, X3), quadratiques (X12, X22, X32) et
avec interaction (X1X2, X1X3, X2X3). Ils sont statistiquement considérés significatifs pour
la concentration en sucres des jus des dattes si la probabilité (P) est ≤ 0,05 (Tableau 14).
Le tableau 14 présente l’impact des différents facteurs sur la réponse. Il ressort du
tableau 14 que, toutes singulières (X2 et X3) et quadratique (X32) ont un impact significatif
sur la concentration en sucres du jus de dattes (p < 0,05).
94
Tableau 13. Analyse de la réponse de surface de l’extraction du jus de dattes.
Ratio Equi Glu prédite

T (°C) Temps (min) (pulpe/eau) Equi Glu (g.L-1) (a) (b) Res (c)
1 80 60 1:3 156 156,0 0
2 90 30 1:3 154 158,3 -4,25
3 70 90 1:3 174 169,8 4,25
4 80 90 1:2 216 219,4 -3,375
5 90 60 1:2 218 215,6 2,375
6 90 60 1:4 126 125,1 0,875
7 80 60 1:3 156 156,0 0
8 70 60 1:4 122 124,4 -2,375
9 80 30 1:2 212 210,1 1,875
10 80 60 1:3 156 156,0 0
11 80 30 1:4 120 116,6 3,375
12 90 90 1:3 165 164,0 1
13 70 60 1:2 218 218,0 -0,875
14 70 30 1:3 154 155,0 -1
15 80 90 1:4 126 127,9 -1,875

(a) Valeurs expérimentales.
(b) Valeurs théoriques.
(c) Résidus.
95
2.2.2.1 . Effet du ratio pulpe/eau (X3) sur la concentration en sucres
La figure 15 présente l’influence de différents facteurs sur la concentration en

sucres des dattes. En présence du ratio pulpe/eau le plus faible (1:2), nous avons obtenu la
concentration de jus la plus élevée (218 g.L-1). Cette concentration diminue jusqu’à
atteindre un minimum de concentration de 120 g.L -1 à un ratio de pulpe/eau de 1:4, pour la
même température 70°C (figure 15b) et le même temps d’extraction (60 min). En effet, la
macération des pulpes dans l’eau, permettrait le passage des sucres dans l’eau. D’après le
modèle mathématique, dans sa forme linéaire (X2 et X3) et quadratique (X32), le ratio
pulpe/eau a un impact significatif sur l’équivalent Glucose dans le jus, soit les probabilités
0,0154, 0,0001 et 0,0035 successivement (tableau 15).
Tableau 14. Estimation des coéfficients du modèle pour suivre de la concentration en sucres en jus.
Terme Estimation Standard T Prob
constante 156 2,32 67,24 < 0,0001
X1 -0,625 1,42 -0,44 0,6784
X2 5,125 1,42 6,61 0,0154
- <
X3 -46,25 1,42 32,55 0,0001
X1*X2 -2,25 2,01 -1,12 0,3137
X1*X3 1 2,01 0,5 0,6398
X2*X3 0,5 2,01 0,25 0,8134
X12 4,125 2,09 1,97 0,1056
X22 1,625 2,09 0,78 0,4723
X32 10,875 2,09 5,2 0,0035
96
2.2.2.2 . Effet du temps d’extraction sur la concentration en sucres
La figure 15b présente l’influence du temps de macération (X2) sur la concentration

en sucres. On constate qu’en présence du ratio pulpe/eau le plus faible (correspondant à -1
en valeur codée et 25% en valeur réelle) et temps de macération le plus court (30 minutes),
on a également une concentration de 120 g.L-1. Cette concentration augmente jusqu’à
atteindre un maximum de concentration de 126 g.L-1 pour un temps de macération de 90
minutes. En effet, un contact prolongé (X2) des dattes (pulpe) avec l’eau, permettrait une
extraction plus grande des sucres.
97
Figure 15. Surface de réponse traduisant l’impact des intéractions entre les facteurs X1, X2 et X3 sur l’équivalent
glucose des jus de dattes (a) interaction (X1- X2), (X1- X3) et (X2-X3).
2.3 . Conclusion
L’objectif de cette première partie de l’étude était d’optimiser la concentration en

sucres des jus extraits des sous-produits de dattes « Deglet-Nour ». Ainsi, au terme de ce
travail, nous avons constaté que la concentration en sucres du jus de dattes respecte un
modèle du second degré avec interaction et que le ratio pulpe/eau et les temps de
macération ont un impact significatif sur la concentration finale en sucres du jus obtenu.
Cette étude a également permis de définir des conditions permettant d’extraire un jus très
riches en sucres et qui sont (80°C, 90 min et 1:2 ratio pulpe/eau). La concentration en
sucres fermentescibles est un élément important pour transformer le sirop en bioéthanol par
des levures.
98
PARTIE 2. SIROPS DE DATTES
Le jus des dattes obtenu juste après l’extraction peut être transformé en sirop par
condensation ou déshydratation. La condensation est une opération essentielle permettant
d’inhiber les réactions enzymatiques, faciliter l’entreposage et diminuer le développement
des microorganismes, ce qui améliorela conservation du produit.
Le sirop des sous-produits de dattes, faisant l’objet de la présente étude, est obtenu par la
méthode d’extraction par diffusion (décrite ci-dessus). Il présente une coloration foncée et
il est limpide, ce qui permet d’éviter d’avoir recours aux procédés de clarification. Ses
caractéristiques sont données ci-dessous.
1. Caractérisation du sirop de dattes
Le jus de fruits est le liquide non fermenté, mais fermentescible, tiré de la partie
comestible de fruits (Codex Stan, 2005).
Le concentré de jus ou sirop est le produit obtenu à partir des jus de fruit, après
l’élimination d’une quantité suffisante d’eau pour porter la valeur de °Brix à un niveau
supérieur de 50% au moins de la valeur initiale de °Brix de jus utilisé (Codex Stan, 2005).
Dans notre cas, le jus de dattes, on peut le nommé sirop de dattes à partir de 300 g
de sucres par litre de jus.
1.1. Rendement en sirop
Le rendement d’extraction de jus de dattes est de 62,5%. Après condensation à

80°C, le rendement en sirop (72°Brix) diminue pour atteindre une valeur finale de 25%.
1.2. Caractéristiques physico-chimiques de sirop de datte

1.2.1. pH
Le sirop présente un pH 4,9, cette valeur est relativement faible comparativement

au pH des dattes entières (pH 5,8). La diminution du pH peut être due à la présence d’une
quantité élevée d’eau dans le sirop, ce qui permet d’entraîner les acides préexistants de la
datte vers son extrait. Ces acides organiques (acide acétique, acide citrique) sont produits
99
par des microorganismes tels que les levures et les moisissures qui se trouvent
naturellement dans les dattes. Nos résultats se rapprochent de ceux de Mekki et al. (1983)
qui ont trouvé un pH 4,85 dans du jus concentré des dattes.
1.2.2. Teneur en eau
La teneur en eau du sirop est de 26,33%, ce qui indique que la vitesse de

détérioration des constituants du sirop est très faible. En effet, l’humidité constitue le
principal facteur favorisant le développement des microorganismes. Ceci permet de classer
le sirop des dattes parmi les aliments à faible humidité dont la conservation est très facile.
1.2.3. Teneur en cendres
Les résultats obtenus (tableau 16) indiquent que le sirop renferme des taux
appréciables d’éléments minéraux (1,49 %). Al-Farsi et al., 2006 qui ont travaillé sur des
dattes provenant du Sultanat d’Oman, ont montré que le sirop (72°Brix) obtenu renferme
une teneur en cendre comprise entre 1,23 et 1,76%, ce qui esten accord avec nos résultats.
1.2.4. Teneur en protéines
Le taux de protéines du sirop de datte Deglet-Nour (72°Brix) est de 0,97 g /100g de

matière sèche) (tableau 16), très proche de la valeur citée par Alfarsi et al. (2007) qui ont
trouvé 0,95, 0,95 et 1,09 pour respectivement les sirops obtenus à partir les variétés
Mabseeli, Um-sellal et shahal provenant du Sultanat d’Oman.
1.2.5. Teneur en sucres
Les sucres sont les constituants les plus importants dans le sirop de dattes (73,7%
MS). Les résultats présentés dans le tableau 16 montrent que le sirop renferme 56,14% de
sucres réducteurs et 17,4% de saccharose.
100
Tableau 15. Caractéristique biochimique du sirop et de la pulpe de datte Deglet-Nour (72°Brix).
Sirop Pulpe
Matière sèche (%)(*) 73,65±0,67 78,5±0,07
pH (*) 4,34±0,02 5,3±0,08
Acidité titrable (g/100 g du poids sec) (*) 0,22±0,03 0,27±0,01
Protéines (g/100 g du poids sec) (*) 0,97±0,02 0,34±0,01
Sucres totaux (%)* 73,65±0,09 65,3±0,23
Glucose (%)* 33,06±0,04 16,2±0,16
Fructose (%)* 23,08±0,05 15,3±0,03
Saccharose (%)* 17,37±0,02 33,8±0,18
Cendre (%)* 1,49±0,52 0,61±0,11
Matière grasse (%)(*) 0,03±0,02 0,19±0,05

(*) Valeur moyenne ± écart-type, exprimée par rapport à la matière sèche.
1.2.6. Eléments minéraux
Les résultats de la composition minérale des sirops obtenus à partir des sous-
produits des dattes sont présentés dans le tableau 16. Les teneurs en Mg et Ca sont
respectivement de 123,5 et 47,5 mg/100 g de matière fraîche (sirop) (tableau 17).
Tableau 16. Composition en éléments minéraux du sirop (mg/100 g de matière sèche).
Na (*) K (*) Mg (*) Cu (*) Fe (*) Ca (*) Zn (*)
Sirop 80,1±2,12 670,7±0,01 123,5±3,32 <0,1 0,8±0,57 47,5±1,5 0,67±0,012

(*) Valeur moyenne ± écart-type exprimée par rapport à la matière sèche.
101
Le sirop de dattes est très riche en oligo-éléments, qui sont nécessaires à la
croissance de la levure et donc à la production d’éthanol. L’extrait concentré de déchets de
datte est très riche en K+ (670,7 mg par 100 g) (tableau 17), qui participe à la régulation du
pH intercellulaire, et en Ca+ (47,5 mg par 100 g), qui s’incorpore dans les protéines
membranaires et participe à la protection de la levure contre la pression osmotique causé
par les concentrations élevé en sucres et qui augmente sa tolérance contre la concentration
élevé en éthanol (Regina et al. 1988), ainsi qu’en Na+ (80,1 mg par 100g) qui diffuse
passivement à travers la cellule et stimule le transport des sucres (Jones et al. 1981).
2. Effet de la haute température sur la composition du sirop de
datte
La stérilisation est un traitement thermique qui a pour finalité de détruire toute

forme microbienne vivante. Il consiste à chauffer les milieux de culture à 120°C pendant
20 min avant leur utilisation pour la production d’éthanol.
La haute température (120°C) affecte les caractéristiques physico-chmiques de

milieu traité. Ce qui nous a amené à étudier son effet sur la composition du sirop de dattes
le substrat qui va être utilisé pour la production d’éthanol par fermentation. Les résultats
sont illustrés dans la figure 16.
140.0
120.0
Concentration en sucres (g.L-1)
100.0
80.0 sirop stérilisé
60.0 Sirop non stérilisé
40.0
20.0
0.0
Sacch Glu Fru
Figure 16. Effet de la stérilisation sur la composition du sirop en sucres.
102
2.1. Sucres totaux
La teneur en sucres totaux du sirop avant traitement thermique est 269,3 g.L-1, cette
valeur augmente après le traitement thermique pour atteindre 302 g.L-1. D’après les
résultats présentés figure 16, seuls les sucres réducteurs augmentent dans le milieu
contrairement au taux de saccharose qui diminue. Cette augmentation est probablement
expliquée par l’hydrolyse de la cellulose et du mannose présents dans le sirop traité à haute
température (120°C) durant 20 minutes à pH 5,3. Ce résultat est validé par Shafiei et al.,
(2010), qui ont travaillé sur l’hydrolyse de fibres de dattes.
2.2. Sucres réducteurs
La teneur en sucres réducteurs (Glucose et Fructose) augmente dans le sirop

autoclavé. Le glucose est également influencé par la haute température (120°C) et le pH
acide (5,3), qui génèrent des dérivés furfuraliques, en raison de l’instabilité des oses en
milieu acide et à chaud. Par ailleurs, certains phénomènes biologiques (réaction de
Maillard, oxydation…), sensible à la temérature (120°C), pourraient être à l’origine de la
diminution de la teneur en sucres réducteurs. D’après Weil, (2001), la fonction
aldéhydique des oses est en effet susceptible d’être oxydée en présence de sels.
2.3. Saccharose
La teneur en saccharose du sirop traité est inférieure à celle de sirop non stérilisé
(figure 16). Quand on chauffe le sirop de dattes durant la stérilisation, les liaisons de
saccharose se cassent pour former du glucose et du fructose. L’action de la température
élevée 120°C durant l’autoclavage (20 minutes), provoque l’hydrolyse du Saccharose en
sucres réducteurs (Glucose et fructose).
La couleur du sirop de dattes devient plus foncée après le traitement thermique.

Roufergari-Nejad, (2002) affirme que les substances colorantes sont le résultat d’un
brunissement non enzymatique (Reaction de Maillard) qui est définie comme l’ensemble
des intéractions résultant de la réaction initiale entre un sucre réducteur et un groupement
aminé. Les mélanoides produits de réaction de Maillard sont les responsables majeur de la
couleur foncée du sirop (Wang et al., 2001 ; Nasehi et Ansari, 2012),.
103
3. Conclusion
Le jus de datte obtenu par la méthode d’extraction par diffusion est transformé en
sirop par concentration, ce qui entrave le développement des microorganismes et facilite la
conservation du produit. Le sirop est caractérisé par une teneur élevée en sucres
fermentescibles (glucose, fructose et saccharose) et éléments minéraux. Ce substrat riche
en matière organique doit être valorisé. Pour cela, nous avons développé un procédé
biotechnologique pour pouvoir utiliser le sirop obtenu pour produire du biocarburant à
l’aide de microorganismes, tels les levures.
PARTIE 3. PRODUCTION DE BIOETHANOL PAR DES

LEVURES
Les fermentations alcooliques présentées dans cette thèse ont été réalisées en mode
« batch » sur milieu de culture (décrit dans la partie Matériel et méthodes) utilisant le sirop
des sous-produits des dattes comme substrat carboné et le NH4Cl et l’extrait de levure
comme source d’azote, ainsi que les sels et les oligo-éléments. Des milieux non enrichis
ont été aussi fermentés afin de vérifier de la pertinence de rajouter une source d’azote.
Les travaux ont été réalisés avec 3 souches de levures, commercialisées par
L’Institut Pasteur (France) ; une souche de Saccharomyces cerevisiae 522D, et deux autres
osmotolérantes : Zygosaccharomyces rouxii IP 2021.92 et Candida Pelliculosa IP
820.63, ainsi qu’une souche isolée des sous-produits de dattes, par Monia JEMNI au centre
régional de la recherche en Agriculture Oasienne de Deguech à Tozeur en Tunisie.
1 . Production de bioéthanol par S. cerevisiae 522D
La première expérience a été réalisée en mode batch (en duplicata), contenant une
concentration de 90 g. L-1 en substrat. Les flacons stérilisé à une température de 120°C
durant 20 minutes sous pression de 1 bar, ont été ensemencés avec la levure
Saccharomyces cerevisiae 522D et incubés à 28°C, durant 72 h sous une agitation de 180
rpm.
104
1.1. Cinétique fermentaire
1.1.1. Biomasse
La fermentation se caractérise par un profil en deux phases (figure 17). Lors de la

première phase, la production d’éthanol et de glycérol sont couplées à la croissance
cellulaire. Le taux de croissance maximale est atteint après 48 heures de la fermentation
(Figure 17). On observe ensuite le début de la seconde phase correspondant à une phase
stationnaire.
16
14
12
10
D.O 600 nm
0
0 20 40 60 80
Temps de culture (h)
Figure 17. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
1.1.2. Evolution des sucres dans le milieu de fermentation
Au cours de la fermentation, la concentration en sucres résiduels est quantifiée.

Durant les premières heures de fermentation, la levure a dégradé le glucose et le fructose,
qui diminuent de 31,8 g.L-1 et 33,6 g.L-1 initialement à respectivement 21,3 g.L-1 et 14,4
g.L-1 en fin de culture. En revanche, le saccharose n’est pas consommé.
Les sucres simples (glucose et fructose), pouvant pénétrer facilement à travers la

paroi et la membrane cellulaire des levures, sont par conséquent rapidement fermentés. Par
contre, le saccharose, ne pénètre dans la cellule que si la membrane est pourvue d’une
perméase spécifique, ou après hydrolyse enzymatique.
L’augmentation de la quantité de fructose de 14,4 g.L-1 (18 heures de fermentation)

à 16,5 g.L-1 (24 heures de fermentation), alors que la quantité de saccharose diminue de
23,6 g.L-1 à 9,8 g.L-1 durant le même laps de temps (figure 18), montre bien que le
saccharose est hydrolysé par les levures qui sont capables de sécréter une invertase dans le
milieu extracellulaire.
105
Le saccharose est un diholoside formé d’une molécule de glucose et d’une molécule
de fructose reliées par une liaison osidique α (12) β. D’après Siqueira et al., 2008, le
saccharose, par l’effet de l’enzyme invertase (β–fructofuranosidase) secrété dans le milieu
extracellulaire par Saccharomyces cerevisiae, s’hydrolyse en glucose et en fructose, ce qui
permet son assimilation par la levure.
40
Concentration en sucres résiduaires
35
30
25
(g.L-1)
20 Glucose
15 Fructose
10 Saccharose
5
0
0 20 40 60 80
Figure 18. Evolution des sucres au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae a consommé la totalité des sucres après 48 heures de

fermentation.
1.1.3. Evolution de la source d’azote (NH4Cl) et du pH
La fermentation sur le milieu à base de sirop de datte (10°Brix) peut être découpée
en deux périodes, de 0 à 18 heures, la production de bioéthanol et de glycérol est faible
(respectivement 6,4 g.L-1 et 1,8 g.L-1), alors que la quantité de NH4Cl diminue rapidement
dans le milieu, de 570,7 mg.L-1 à 79,1 mg.L-1 après 18 heures de fermentation (Figure 19).
106
700
Concentration en NH4Cl (mg.L-1)

600
500
400
300
200
100
0
0 20 40 60 80
Figure 19. Evolution de la concentration en NH4Cl au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
Cette croissance a un impact sur l’évolution du pH, qui diminue de pH 5,0 à pH 3,4
(Figure 20).
4
pH du milieu
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Figure 20. Evolution du pH au cours de la fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
Au cours de la fermentation, la consommation des sucres par la levure conduit à la

formation d’acides organiques typiques de la fermentation, les plus importants sont l’acide
succinique, l’acide lactique et l’acide acétique. D’après Torija et al. (2003), Les acides
organiques consommés ou produits subissent une dissociation et libèrent des ions
hydrogènes dans le milieu de fermentation influençant ainsi le pH. Les auteurs précisent
aussi que certains ions hydrogènes proviennent de l’assimilation de la source azotée
notamment des ions ammonium et des acides aminés qui pourraient contribuer à la chute
du pH par assimilation des acides aminés de charge positive.
1.1.4. Evolution des produits de fermentation
Au début de la fermentation (0 heure à 18 heures), la production de bioéthanol et

de glycérol est faible (respectivement 6,4 g.L-1 et 1,8 g.L-1), elle devient ensuite
107
conséquente pour atteindre 40 g.L-1 d’éthanol et 5 g.L-1 de glycérol après 72 heures de
fermentation (Figure 21). Selon Hohmann, (2002), les levures doivent en permanence
mettre en œuvre des mécanismes de régulation pour s’adapter à leur environnement et
maintenir leur homéostasie. Le glycérol produit joue un rôle majeur dans l’osmoadaptation
au stress chez S. cerevisiae, il est particulièrement important dans l’adaptation au stress
osmotique. La réponse la plus significative à ce stress consiste en l’accumulation de solutés
neutres dans le cytoplasme, en particulier des polyols, pour contrebalancer la pression
osmotique (Djelal et al., 2012b). Ceux-ci, en augmentant l’osmolarité de la cellule,
permettent de préserver l’eau dans le cytoplasme, assurant le maintien de la pression de
turgescence et du volume de la cellule.
45
Concentration en éthanol et en
40
35
glycérol (g.L-1)
30
25
20 Ethanol
15 Glycérol
10
5
0
0 20 40 60 80
Figure 21. Evolution de la concentration en éthanol et en glycérol, au cours de la fermentation de M-S100, par S.
cerevisiae.
1.1.5. Efficacité fermentaire
Au cours de la fermentation alcoolique, les sucres fermentescibles contenus dans

le milieu de culture peuvent êtres convertis en éthanol (alcool éthylique) et en gaz
carbonique par l’action des microorganismes, principalement des levures.
Selon l’équation (2), une mole de glucose serait convertie par la levure en deux
moles d’éthanol et deux moles de CO2. A partir de cette relation nous avons calculé la
quantité théorique d’éthanol produite à partir de la quantité initiale de sucres totaux du
milieu, exprimée en équivalent glucose et nous avons comparé la quantité d’éthanol
obtenue à la fin de la fermentation et la quantité d’éthanol théorique, pour pouvoir ensuite
calculer le TCEtOH.
108
Tableau 17. Sucres totaux, sucres consommés, rendement en éthanol, glycérol et taux de conversion de la
fermentation de M-S100, par S. cerevisiae.
Milieu à base de sirop de datte
Equi Glu (g.L-1) 90,6
Sucres totaux consommés : Equi Glu (g.L-1) 88,2
Concentration finale en éthanol (g.L-1) 40,0
Rendement en éthanol (g.g-1) 0,4
Rendement en glycérol (g.g-1) 0,05
Concentration théorique en éthanol (g.L-1) 45,1
TC EtOH (%) 88,8
(*) Les concentrations en sucres simples du milieu synthétique sont similaires à celles du milieu de culture à base de
sirop de dattes.
L’éthanol obtenu est inférieur à l’éthanol théorique. Le milieu de culture à base de

sirop de datte présente un taux de conversion élevé (88,8%) (Tableau 18). Ce résultat est
expliqué par le fait qu’une partie des sucres consommés par les S. cerevisiae, est détournée
vers des fonctions de maintenance à l’interieur de la cellule.
1.1.6. Conclusion
Le présent travail a montré que la valorisation des dattes en général, écarts de triage
de la variété Deglet-Nour, la plus commercialisée en Tunisie, en vue de leur éventuelle
transformation en bioéthanol est possible. Après l’extraction des sucres du déchet de
dattes, le jus obtenu a été concentré et utilisé par la suite comme milieu de culture pour
produire du biocarburant (Bioéthanol) par Saccharomyces cerevisiae 522 D.
Les objectifs que nous nous étions fixés étaient de produire des bio-alcools et
d’examiner leur évolution quantitative au cours d’une fermentation sur sirop de dattes. Sur
ce substrat, Scerevisiae 522D a produit 40 g.L-1 d’éthanol, et 5 g.L-1 de glycérol comme
produit secondaire de la fermentation.
109
2. Influence de la nature de la source d’azote et du substrat sur la
production de bioéthanol
2.1. Impact de la Nature de source d’azote
Pour déterminer l’effet de l’enrichissement en source d’azote sur la production de

bioéthanol, des cultures ont été effectuées sur des milieux à base de sirop de dattes avec
une concentration en sucres de 90 g.L-1 et en présence de deux types de sources d’azote ;
une source minérale (NH4Cl) et une source organique (Extrait de levure).
Trois types de milieux de fermentation ont été utilisés : un milieu enrichi par une
source d’azote minérale, le chlorure d’ammonium (M_NH4Cl) à une concentration de 500
mg.L-1 et un autre enrichi par une source organique, l’extrait de levure (M_EL) à une
concentration de 16 g.L-1 ; et un dernier milieu non enrichi et qui sert de témoin (M_T).
Les cultures sont conduites en duplicata, en mode batch et sont ensemencées par la levure
Saccharomyces cerevisiae. Toutes les cultures sont incubées 55 heures à 28°C à 180 rpm et
à pH initial de 5.
L’évolution de la biomasse ainsi que les concentrations en éthanol, en sucres et le

pH ont été suivies au cours de la fermentation.
2.1.1. Effet des sources d’azote sur la biomasse
Il est bien clair que la croissance de S. cerevisiae 522D est plus appréciable pour
les milieux enrichis en azote. En effet, à la fin de la fermentation, la biomasse, dans un
milieu enrichi par le NH4Cl est presque deux fois plus importante qu’un milieu non
enrichi ; elle atteint 4,85 108 UFC. mL-1, alors que le milieu enrichi par l’extrait de levure a
une densité cellulaire trois fois plus élevé (7,51 108 UFC.mL-1) (Figure 22).
110
6.E+08
5.E+08
UFC.(mL-1)
4.E+08
3.E+08
2.E+08
1.E+08
0.E+00
0 10 20 30 40 50 60
Fermentation time (h)
M_T M_EL M_NH4Cl
Figure 22. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par S. cerevisiae.
L’extrait de levure favorise la croissance cellulaire, il donne une meilleure

croissance cellulaire suivi de NH4Cl, alors que le milieu non enrichi présente une
croissance cellulaire faible, par rapport aux milieux enrichis, ce qui prouve que le sirop de
datte contient de l’azote assimilable par la levure comme les acides aminés (Assiery et al.,
2015) mais pas en quantité suffisante. D’après Henschke et Jiranck, (1993), Les acides
aminés pénétrent dans les cellules par transport actif et peuvent s’y accumuler. Une fois à
l’intérieur, les acides aminés, selon les cas, sont intégrés directement dans les protéines,
dégradés en ammonium (NH4+) ou convertis en glutamate.
Ces résultats coincident avec ceux de Laopaiboon et al. (2009), qui ont étudié
l’effet de l’ajout de différentes sources d’azote (Extrait de levure et (NH4)2SO4), sur la
production d’éthanol à partir de jus de sorgho, et qui ont trouvé que la levure se developpe
aussi sur le milieu non enrichi, comme sur les milieux enrichis par le (NH4)2SO4 et l’exrait
de levure.
2.1.2. Effet de l’enrichissement sur La consommation des sucres
L’observation des courbes (a), (b) et (c) de la figure 23, fait ressortir la différence
entre les effets de l’azote ammoniacal (NH4Cl) et de l’azote organique (Extrait de levure)
sur la consommation des sucres existants dans le moût.
Environ 24 et 42 h sont nécessaires pour une consommation totale des sucres dans le cas
d’un ajout respectivement d’extrait de levure et de NH4Cl. Par contre, dans le cas du milieu
non enrichi, même après deux jours de culture, il reste du saccharose dans le milieu. Dans
les trois milieux, la diminution de la concentration en saccharose est faible les 18
111
premières heures de fermentation (Figure 23, (a), (b), (c)), par rapport à celles des
monomères.
(a) 40
35
30

25
20
15
10
5
0
0 20 40 60
Temps de culture (heures)
Glucose Fructose Saccharose
(b) 40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60
40
(c)
35
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60
Figure 23. Concentration en sucres au cours de la fermentation par S. cerevisiae ; (a) M_EL, (b) Milieu_NH4Cl,
(c) M_T
Selon Bely et al. (1990) l’azote assimilable est généralement le nutriment le plus
limitant dans les milieux de culture pour les levures ; il joue donc un rôle essentiel sur la
cinétique fermentaire. Ils confirment que les carences en azote assimilable peuvent être
considérées comme les causes essentielles des fermentations «lentes».
112
2.1.3. Effet de la source d’azote sur la Production d’éthanol
L’ammonium, assimilé très rapidement par la levure, a un impact significatif sur la

croissance, qui est cependant moins remarquable que l’impact d’un substrat complexe
comme l’extrait de levure. produit à partir des cellules de levures (Chae et al., 2001). Ces
résultats sont dus essentiellement à la richesse de l’extrait de levure en glutamate,
glucanes, nucléotides et en vitamine B, composés indispensables pour la régénération et la
formation des molécules (Jorgensen, 2009).
60
Concentration en éthanol
50
40
30
(g.L-1)
20
10
0
0 20 40 60
M_T M_EL M_NH4Cl
Figure 24. Evolution de la concentration en éthanol durant la fermentation par S. cerevisiae.
Le taux d’éthanol pour les trois milieux augmente pour atteindre une valeur
maximale de 50 g.L-1 pour le milieu enrichi par l’extrait de levure ; il est de 36,8 g.L-1 en
présence de NH4Cl et de 24,8 g.L-1 en absence de supplémentation azotée (Figure 24).
La production d’éthanol est meilleure en présence d’extrait de levure qu’en

présence d’une source d’azote inorganique comme le NH4+. Ces résultats sont validées par
Laopaiboon et al.(2009) qui ont trouvé que l’extrait de levure permet une meilleur
production d’éthanol à partir d’un jus de sorgho à 30°Brix.
2.1.4. Effet de la source d’azote sur Le pH du milieu
Le profil de pH indique une évolution très faible pour le milieu non enrichi et le
milieu enrichi par de l’extrait de levure, il diminue d’une valeur proche de 5 initialement à
3,9 en fin de culture ; alors que le pH du milieu enrichi par du NH4Cl diminue plus
rapidement pour se stabiliser à 2,4 en fin de culture (Figure 25).
113
5
pH
2
0
0 18 24 42 50
M_T M_EL M_NH4Cl
Figure 25. Evolution du pH durant la fermentation par S. cerevisiae.
Diverses études (Kotyk, (1989) et Sigler et al., (1981)) ont montré qu’au cours de la
fermentation alcoolique par S. cerevisiae sur un milieu ou l’ion ammonium est la seule
source d’azote, il y’ a une baisse du pH. Cette assimilation de l’ion ammonium serait donc
liée à l’excrétion des protons dans le milieu extracellulaire. Ainsi, selon Won et al. (1993),
une mole d’ions ammonium assimilée correspond à une mole de protons excrétée
(Equation 17).
Figure 26. Schéma de fonctionnement de l’uniport électrophorétique accumulatif responsable de l’entrée de l’ion
ammonium chez Saccharomyces cerevisiae (Salmon, 1998).
Pour des raisons d’équilibre de charge de part et d’autre de la membrane plasmique,

l’entrée de l’ion ammonium est couplée à l’excrétion d’un proton par la pompe ATPase de
la membrane selon le mécanisme présenté dans la figure 26.
114
2.1.5. Conclusions
Les résultats ci-dessus montrent que les carences en azote assimilables peuvent donc être
considérées comme les causes essentielles des fermentations « lentes ».
D’après Liu. (2013) et Pandey et al, (2014), les sources d’azotes organiques comme
l’extrait de levure, sont onéreuses par rapport aux sources d’azote minérales comme les
sels d’ammonium. Ils affirment aussi que ces derniers sont les plus étudiés à l’échelle
industrielle. Nous avons donc choisit l’utilisation de NH4Cl comme source d’azote pour le
reste de notre étude.
2.2. Effet de la concentration en substrat sur la production d’éthanol
Un des objectifs de ces travaux de recherche est d’étudier la tolérance des levures
utilisées à une concentration élevée en substrat pour identifier les phénomènes biologiques
impliqués. Les travaux antérieurs de Hohmann en 2002 et Djelal et al. en 2005 s’accordent
sur le fait qu’une concentration élevée en sucres inhibe la croissance cellulaire et la
capacité fermentaire de la levure et réduit la viabilité cellulaire. En ce sens, une 3éme série
de fermentation a été réalisée en mode batch. 4 milieux contenant 500 mg.L-1 de NH4Cl et
différentes concentrations initiales en Equivalent glucose 45, 90, 175 et 350 g.L-1,
nommées respectivement M-S45, M-S90, M-S175 et M-S350 ont été ensemencés avec la
même quantité de levure S. cerevisiae et incubés à 28°C, à 180 rpm. Toutes les cultures ont
été dupliquées.
L’impact de la pression osmotique causée par la concentration élevée en sucres sur le
comportement macro-cinétique (croissance cellulaire, capacités et performances
(rendement, production, …) a été analysée, afin de contribuer à l’identification et à la
caractérisation de la réponse du microorganisme à son environnement pour optimiser son
activité et intensifier les performances de production de bioéthanol.
115
2.2.1. Effet sur la biomasse
Pour une concentration initiale en Equivalent glucose de 175 g.L-1, une faible
activité est observée en début de culture (Figure 27). Après 24 heures, seulement 10,9 g.L-1
d’Equi Glu ont été consommés. S.cerevisiae 522 D, a donc besoin d’une période
d’adaptation plus longue lorsque la concentration initiale en sucres est élevée.
16
14
12
D.O 600 nm
10
8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
M-S45 M-S90 M-S175 M-S350
Figure 27. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par S. cerevisiae.
2.2.2. Effet sur la concentration en sucres
La figure 28 présente l’évolution en fonction du temps des concentrations en

sucres. La consommation des sucres est presque totale après 40 heures de culture pour les
milieux contenant initialement 45 g.L-1 et 90 g.L-1 d’Equi Glu, alors que pour les milieux
contenant 175 g.L-1 d’Equi Glu, la consommation des sucres est presque totale après 70
heures de fermentation. Pour une concentration initiale de 350 g.L-1, nous avons observé
une inhibition totale de toute activité fermentaire.
(a) 20
15
10
0
0 20 40 60 80
Temps de fermentation (h)
116
(b) 40

30
20
10
0
0 20 40 60 80
Glucose Fructose Sucrose
(c) 70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
Temps de fermentation(h)
(d) 160
140
Concentration en sucres (g. L-1)
120
100
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80
Figure 28. Concentration en sucres au cours de la fermentation. (a) M-S45, (b) M-S90, (c) M-S175, (d) M-S350 par
S. cerevisiae.
Les résultats montrent une inhibition totale de toute activité fermentaire pour une
concentration en sucres dans le milieu à 350 g.L-1 et une légère inhibition à 175 g.L-1,
puisque la phase de latence (24 h) pour M-S175 est plus importante que pour M-S45 et M-
S90. Les sucres du M-S175 sont totalement consommés au bout de 72 heures de
fermentation.
Une forte concentration en sucres (350 g.L-1) occasionne un stress osmotique des
levures puisque l’eau va diffuser à travers la membrane cytoplasmique des cellules pour
équilibrer les concentrations intra et extra-cellulaires. Cette perte d’eau peut s’avérer fatale
pour certaines levures, ce qui est le cas pour S .cerevisiae 522D.
117
2.2.3. Effet sur la concentration en NH4Cl
Les fermentations sur les milieux à 45 g.L-1 et 90 g.L-1 en substrat, nous

montrent d’après les figures qui suivent, une première phase de 0 à 18 h, ou la production
de bioéthanol et de glycérol est faible (respectivement 7,4 g.L-1 et 1,1 g.L-1). La quantité de
sucres réducteurs diminue rapidement dans le milieu (Figure 31). Durant la première
phase, la levure a bien dégradé 90,4% de glucose, 80,1% de fructose qui peuvent pénétrer
facilement à travers la paroi et la membrane cellulaire et 72,5% de Saccharose dans le
Milieu M-S45. Pour le milieu M-S90, S. cerevisiae a métabolisé durant les 24 premières
heures de fermentation environ 60% des sucres ; 68,5% de glucose, 50,8% de fructose et
73,4% de saccharose.
L’évolution de NH4Cl suit l’évolution des sucres dans les milieux. Dans M-S45
et M-S90, le NH4Cl diminue rapidement à 79,1 mg.L-1. Pour M-S175, la consommation de
NH4Cl commence après 18 heures de fermentation pour atteindre une concentration de 59
mg.L-1 après 42 heures de fermentation (Figure 29).
700
600
500
400
300
200
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
M-S45 M-S90 M-S175 M-S350
Figure 29. Concentration en NH4Cl au cours de la fermentation par S. cerevisiae.
Généralement, lors de la fermentation alcoolique, les ions ammonium sont totalement

consommées au bout des 50 premières heures de la fermentation (Jiranek et al., 1990 ;
Beltran et al., 2004).
2.2.4. Effet sur la concentration en éthanol et glycérol
L’étude de l’effet de la concentration en substrat, montre d’après la figure 30, que

ce facteur a une influence significative sur la production d’éthanol, les valeurs optimales
sont comprises entre 20 g.L-1 pour le milieu à 45 g.L-1 à 70 g.L-1, pour le milieu à 175 g.L-
118
1
. A 350 g.L-1 et en absence de croissance, aucune production de bioéthanol n’a été
observée (Figure 30).
Ces résultats sont confirmés par Lin et al. (2012), qui ont étudié l’influence de la
concentration initiale en Substrat (20, 40, 80, 160, et 300 g.L-1) sur la production d’éthanol
en mode « batch », par S. cerevisiae et qui ont trouvé que la production d’éthanol diminue
de 28 g.L-1 pour 160 g.L-1 de glucose à 15 g.L-1 à 300 g.L-1 en glucose.
80
Concentration en éthanol (g.L-1)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
M-S45 M-S90 M-S175 M-S350
Figure 30. Concentration en éthanol au cours de la fermentation par S. cerevisiae.
La concentration en glycérol produit est directement proportionnelle à la reprise ou

pas de l’activité métabolique du microorganisme. A mesure que la concentration en
substrat dans le milieu augmente, la quantité de glycérol produit augmente, elle passe de
2.2 g.L-1 dans le milieu M-S45 à 5,2 g.L-1 dans le milieu M-S175 (Figure 31). Ces résultats
sont validés par les travaux de Petrovska et al, (1999) qui ont étudié la production de
glycérol par les levures dans des milieux dont la concentration en glucose varie de 50 g.L-1
à 200 g.L-1 et qui ont trouvé que la production de glycérol par S. cerevisiae augmente de 1
g.L-1 dans le milieu le moins concentré à 4,7 g.L-1 dans le milieu le plus concentré en
glucose ; ce comportement peut être lié au rôle attribué au glycérol, un soluté compatible,
qui agit comme soluté osmoprotecteur permettant à S. cerevisiae de survivre au stress
osmotique causé par la concentration initiale élevée en sucres. Selon plusieurs auteurs, cet
osmoprotecteur s’accumule dans le cytoplasme des cellules afin d’équilibrer la pression
osmotique entre le milieu intracellulaire et le milieu extracellulaire (Wang et al., 2001 ;
Taherzadeh et al., 2002 ; Aldiguier et al., 2004 ; Djelal et al., 2005 ; Geertman et al.,
2006).
119
7
Concentration en glycérol (g.L-1)

6
5
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80
M-S45 M-S90 M-S175 M-S350
Figure 31. Concentration en glycérol au cours de la fermentation par S. cerevisiae.
Le tableau 19, montre un bilan des concentrations, rendements et productivités

globales en éthanol, glycérol produit et en sucres résiduels observés à l’arrêt des cultures.
Tableau 18. Bilan des cultures en discontinu de la souche S. cerevisiae 522D en présence de différentes
concentrations en sucres.
M-S45 M-S90 M-S175 M-S350

Equi Glu 45 (a) 90 (b) 175 (c) 350 (d)
Equi Glu consommé (%) 98 (a) 97,4 (a) 94,4 (b) 2,8 (c)
Ethanol (g.L ) -1 19,9 (a) 40,8 (b) 62,9 (c) < LD (*)
Glycérol (g.L-1) 2,5 (a) 4,2 (b) 5,2 (c) < LD (*)
Y EtOH (%) 43 (a) 45 (a) 38 (b) < LD (*)
Y Gly (%) 5 (a) 4 (b) 3 (c) < LD (*)
Q EtOH (g.L-1 h-1) 0,3 (a) 0,6 (b) 1,1 (c) < LD (*)
Q Gly (g.L-1 h-1) 0,03 (a) 0,05 (b) 0,07 (c) < LD (*)
(*)
< LD: Inférieur à la limite de détection.
Les moyennes portant les mêmes lettres dans la même ligne ne sont pas significativement différentes (p<0,05).
Une augmentation de la productivité d’éthanol de 100% est observée en passant de

M-S45 à M-S90. Cette augmentation s’accentue à mesure que la concentration en sucres
augmente dans le milieu M-S175 (Q EtOH = 1,1 g.L-1.h-1).
Les rendements globaux YEtOH(%), diminuent de manière très nette pour M-S175
(YEtOH=38%), par rapport au M-S45 et M-S90 qui sont respectivement 43% et 45%. Ces
résultats sont accords avec ceux de Petrovska et al, (1999) qui ont remarqué que le
rendement en éthanol diminue de 44,4% dans un milieu à 50 g.L-1 en glucose à 35,3% dans
un milieu à 200 g.L-1. La capacité de production semble donc plus faiblement affectée par
la concentration initiale en substrat. Dès que la concentration initiale en substrat augmente
à 350 g.L-1, les capacités de croissance et de production sont altérées.
120
Un effet négatif de l’augmentation de la concentration en substrat sur les
paramètres globaux de croissance, de production et sur la productivité globale du
microorganisme est donc observé et quantifié.
2.2.5. Conclusions
La levure, comme les autres cellules, est capable de détecter un changement de la

pression osmotique du milieu extérieur et y répondre par une déformation de la membrane
cellulaire ou par un changement de l’hydratation des protéines de la membrane (Hohmann,
2002 ; Fullerton et al., 2006 ; sun et al., 2007). Le mécanisme de résistance de S cerevisiae
se traduit par l’accumulation dans la cellule de glycérol. Mais à une concentration élevée
en sucres (350 g.L-1), l’environnement hyper-osmotique a causé un dysfonctionnement
pouvant aller jusqu’à une inhibition totale de la croissance.
Notre objectif était la production de bioéthanol à partir de sirop extrait des sous-produits de
dattes. Toutefois, les fortes teneurs en sucres induisent une forte pression osmotique qui
limite la capacité fermentaire de la levure utilisée (Saccharomyces cerevisiae 522D), ce qui
nous a amené à utiliser pour la suite de notre étude des souches osmotolérantes qui sont
Zygosaccharomyces rouxii et Candida pelliculosa.
121
PARTIE 4. PRODUCTION DE BIOETHANOL PAR
FERMENTATION « VHG » (VERY HIGH GRAVITY)
Afin d’augmenter la productivité et diminuer les coûts de la production, de
nombreuses recherches ont été menées sur la fermentation VHG (Das Neves et al., 2006).
Ces fermentations sont dites VHG car les milieux utilisés contiennent plus de 250 g.L-1 de
sucre, ce qui permet d’obtenir en théorie en fin de fermentation 15% (v/v) d’éthanol
contrairement aux 10 à 12% généralement obtenus dans la plupart des distilleries à travers
le monde (Pulligandla et al., 2011). Les fermentations VHG possèdent de nombreux
avantages (Bvochora et al., 2000 ; Laopaiboon et al., 2009 ; Pulligundla et al., 2011) car
elles permettent de :
- Augmenter les capacités de production sans modification de la structure de
production ;
- Augmenter la concentration en éthanol dans le milieu ;
- Diminuer les coûts énergétiques par litre d’éthanol, pour les étapes : fermentation et
distillation. En effet, cette dernière est facilitée par des concentrations plus élevées
en éthanol.
- Limiter les risques de contamination grâce à des pressions osmotiques élevées et
aux fortes concentrations en éthanol.
- Diminuer la consommation en eau et la quantité d’effluents à traiter.
Tous ces facteurs ont un impact direct et significatif sur les coûts de production de
l’éthanol qui ne cesse d’augmenter d’une année à une autre (Tableau 20) et pourraient
donc augmenter la compétitivité de ce carburant vis-à-vis de l’essence. Cette technique de
fermentation pourrait aussi permettre une amélioration significative de la balance
énergétique de ce biocarburant.
Tableau 19. Evolution des prix de production d’éthanol (euros/hectolitre) (OCDEstat, 2013).
2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
UE28 55,55 (P) 57,11(F) 63,19 (F) 62,23(F) 64,98 (F) 66,54(F) 68,98 (F) 67,95(F)
(P) Valeur projetée, (F) Valeur provisoir.
122
1 . Production de bioéthanol par différentes souches de levures
La forte sensibilité de Saccharomyces cerevisiae 522D à de forte teneur en sucres

dans le milieu de culture à base de sirop des dattes, nous a poussé à chercher des levures
plus performantes pour la production de bioéthanol et particulièrement résistantes à des
taux élevés en sucres et capables de s’adapter dans un milieu hyperosmotique et de croître
rapidement dans ces conditions. Deux souches de levures osmophiles ont été
sélectionnées : Zygosaccharomyces rouxii et Candida pelliculosa. Des fermentations
contenant les concentrations élevées en sucres 175 g.L-1 (M-S175) et 350 g.L-1 (M-S350)
et une concentration initiale en NH4Cl de 10 mmol.L-1, ont été ensemencées avec des
levures osmotolérantes (Z. rouxii et C. pelliculosa et avec la souche témoin S. cerevisiae).
1.1. Cinétique fermentaire

1.1.1. Evolution de la biomasse
Le milieu M-S175, permet une évolution normale de la biomasse au cours de la

fermentation. Les deux souches Z. rouxii et C. pelliculosa donnent après 72 h de la culture,
une quantité de biomasse presque deux fois plus élevé que S.cerevisiae, ce qui nous amène
à dire qu’elles résistent mieux aux facteurs stressants (hyperosmolarité), lors de la
fermentation.
(a) 20
15
D.O 600 nm
10
0
0 20 40 60 80
S.cerevisae Z.rouxii C.pelliculosa
(b) 20
15
10
D.O 600 nm
0
0 20 40 60 80
S.cerevisiae z.rouxii C.pelliculosa
Figure 32. Suivi de la croissance des levures au cours de la fermentation pour M-S175(a) et M-S350(b) ; cultures
additionnées de 500 mg.L-1 de NH4Cl.
123
La comparaison des cinétiques de croissance (Figure 32) montre que le passage
d’une concentration de 175 g.L-1 à 350 g.L-1 a perturbé la croissance, non seulement de S.
cerevisiae, mais également de C. pilliculosa. Seule Z.rouxii arrive à croître à une teneur en
sucres de 350 g.L-1 (Figure 32b).
1.1.2. Évolution des sucres au cours de la fermentation
Le taux de croissance des levures atteint son maximum à la phase exponentielle,

durant laquelle les microorganismes sont complètement adaptés au milieu, ils se
multiplient le plus rapidement possible (Figure 32), durant laquelle la totalité des sucres
sont consommés (Figure 33 et 34).
Dans les milieux à base de sirop de dattes, les principaux sucres fermentescibles
sont le glucose, le fructose et le saccharose. Ils présentent des quantités équivalentes des
deux hexoses (glucose et fructose). Saccharomyces cerevisiae et Candida pelliculosa
métabolisent le glucose de préférence ; C’est pourquoi, à la fin de la fermentation,
l’analyse des sucres dans le milieu M-S175 révèle la prédominance de fructose et de
saccharose.
Au niveau moléculaire, les travaux de recherche (Perez et al., 2005 ; Guillaume et

al., 2007) ont identifiés les gênes associés au transport des hexoses dans la levure
Saccharomyces cerevisiae. Dans des conditions de fermentation, plusieurs gènes de la
famille HXT participent à la régulation du transport des sucres. On compte 20 gènes dont
les principaux transporteurs, Hxt1 et Hxt7. Hxt2, Hxt6 et Hxt7 sont des transporteurs à
haute affinité, et Hxt1 et Hxt3 sont des transporteurs à basse affinité. Plusieurs gènes Hxt
sont considérés comme des transporteurs à affinité intermédiaire. Les transporteurs à haute
comme à basse affinité préfèrent le glucose au fructose, ce qui peut influencer la vitesse à
laquelle ces deux sucres seront utilisés. Aussi la concentration des hexoses peuvent avoir
un impact sur l’expression des gènes HXT (Guillaume et al., 2007).
Zygosaccharomyces rouxii métabolise de préférence le fructose. Lorsque la plus

grande partie de fructose a été consommée, Z. rouxii métabolise le glucose. D’après Pina et
al., 2004 ; Leandro et al., 2011 ; Leandro et al., 2013 ; Dakal et al., 2014), Z. rouxii,
présentent deux type de transporteurs : ZrFfz1 et ZrFsy1, à haute affinité au fructose et
ZrFfz2 qui a une affinité pour le fructose et le glucose aussi. Sousa-Dias et al., 1996, ont
124
trouvé qu’une concentration élevée en fructose dans le milieu de culture cause
l’inactivation des transporteurs de glucose, ce qui explique la non consommation de
glucose durant les premières 48 heures de fermentation (Figure 33 a,b).
Les fortes concentrations initiales en sucres, 175 g.L-1 et 350 g.L-1 conduisent à une
utilisation incomplète du substrat pour la durée de fermentation considérée (72 h). Une
inhibition totale est observée au M-S350 pour S. cerevisiae et C. pelliculosa, contrairement
à Z. rouxii qui est une levure plus tolérante que les deux autres levures aux fortes
concentrations initiales en substrat (Figure 34).
125
(a) 70 (a) 160
60 140
Concentration en glucose (g.L-1)

Concentration en glucose (g.L-1)
120
50
100
40
80
30
60
20 40
10 20
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
Temps de culture (h) Temps de culture (h)
S.cerevisiae Z.rouxii C.pelliculosa S.cerevisiae Z.rouxii C.pelliculosa
(b) 70 (b)
140
60
Concentration en Fructose (g.L-1)
Concentration en Fructose (g.L-1)

120
50
100
40
80
30
60
20
40
10
20
0
0
0 20 40 60 80
0 20 40 60 80
(c) 50 (c) 100
Concentration en saccharose (g.L-1)
Concentration en saccharose (g.L-1)
40 80
30 60
20 40
10 20
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
Temps de culture (h) Temps de culture (h)
Figure 33. Concentration en sucres au cours de la Figure 34. Concentration en sucres (Glucose (a),
fermentation (Glucose (a), Fructose (b) et Saccharose Fructose (b) et saccharose (c) dans un milieu de
(c) dans un milieu de culture à 175 g.L-1 ; additionné de culture à 350 g.L-1 ; additionné de 500 mg.L-1.
500 mg.L-1.
Ces résultats suggèrent que la fermentation alcoolique de milieu à forte teneurs

initiales en substrat carboné par les levures est principalement limitée par la faible
tolérance à une pression osmotique élevée. De plus, l’éthanol, dont la concentration
126
augmente, a un effet toxique sur la cellule (Lina-Costa et al., 2012 ; Abe et al., 2009 ; Hou
et al., 2009 ; Pratt et al., 2003 ; Ansanary-Galeote et al., 2001) et par conséquent, réduit
également la capacité de consommation des sucres.
1.1.3. Évolution du NH4Cl dans les milieux de culture
En présence de 175 g.L-1 de sucres, la quantité de NH4Cl diminue rapidement dans

le milieu, de 500 mg.L-1 à 55 mg.L-1, après 42 heures de fermentation (Figure 35a). Par
contre, sur le milieu à 350 g.L-1, la consommation de NH4Cl par Saccharomyces cerevisiae
et Candida Pelliculosa est presque nulle (Figure 35b).
(a) 700
600
500
400
300
200
100
0
0 18 24 42 48 66 72
S.cerevisiae Z.rouxii C.pelliculosa
(b) 600
500
Concentration en NH4Cl (mg. L-1)
400
300
200
100
0
0 18 24 42 48 66 72
Figure 35. Concentration en NH4Cl dans les milieux à 175 (a) et à 350 g.L-1 en sucres (b) ; additionnés de 500
mg.L-1 de NH4Cl.
127
1.1.4. Produits de la fermentation alcoolique des sirops de dattes
concentrés
Une forte concentration en sucres occasionne un stress osmotique des levures
puisque l’eau va diffuser au travers de la membrane cytoplasmique des cellules pour
équilibrer les concentrations intra et extra cellulaires. Cette perte d’eau peut s’avérer fatale
pour les levures sensibles, ce qui est le cas pour C. pelliculosa mais surtout pour S.
cerevisiae. L’osmoadaptation des levures, cultivées sur les deux milieux, caractérisés par
une faible activité en eau, se fait par la production soluté compatible qui sera accumulé en
partie dans le cytoplasme. Dans notre cas le principal soluté compatible produit est le
glycérol. Une partie du glycérol sera retenue par la levure pour contrebalancer la pression
osmotique de part et d’autre de la paroi cytoplasmique (Figure 36) mais une partie
variable, selon le microorganisme et la composition du milieu de culture, diffusera et
s’accumulera dans le milieu extracellulaire ; plus la cellule est osmotolérante et plus elle
retiendra du glycérol (Taherzadeh et al., 2002 ; Djelal et al., 2005 ; Djelal et al, 2012b).
Figure 36. Réponse de la levure à un milieu hyperosmotique. A : La première réponse de la cellule. B.

L’osmoadaptation de la cellule (Blomberg, 2000)
La quantité de glycérol produite, par Z. rouxii augmente de 54% en passant du M-

S175 au M-S350 (Figure 37b). L’augmentation de la quantité de glycérol produite est liée
au rôle osmoprotecteur de la levure en condition stressante en accord avec plusieurs
auteurs (Taherzadeh et al., 2002 ; Djelal et al., 2005 et Geerman et al., 2006).
128
(a) 80

70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
(b)
14
Concentration en glycérol (g,L-1)
12
10
0
0 20 40 60 80
Figure 37. Evolution de la concentration en éthanol (a) et glycérol (b) durant la fermentation sur milieux à 175
g.L-1en sucres ; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl.
Les performances fermentaires des levures fermentant les milieux à 17,5°Brix et

35,8°Brix, sont très dépendantes de la concentration en sucres du milieu de culture.
L’augmentation du degré brix inhibe la croissance et la production d’éthanol par S.
cerevisiae et C. pelliculosa (Figure 38a); à 35,8°Brix seule la souche Z. rouxii peut
produire de l’éthanol.
Avec Z. rouxii les performances fermentaires maximales sont observées aussi

lorsque S0 = 35,8°Brix, l’éthanol est alors produit avec un rendement de 38,1% et une
efficacité de conversion des sucres consommés en éthanol d’environ 74,7% (Tableau 21).
129
(a) 80

70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
(b)
14
Concentration en glycérol (g.L-1)
12
10
8
6
4
2
0
0 20 40 60 80
Figure 38. Evolution de la concentration en éthanol (a) et glycérol (b) durant la fermentationsur milieux à 350 g.L -
1
; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl.
Ces résultats suggèrent que la fermentation alcoolique d’un milieu à forte teneur
initiale en substrat par les deux levures S. cerevisiae et C. pelliculosa est principalement
limitée par leur faible tolérance à la pression osmotique du milieu de culture, contrairement
à Z. rouxii qui possède un remarquable potentiel de croissance et d’adaptation dans les
mêmes conditions de culture. La performance fermentaire est donc, très dépendante de la
souche de levure utilisée et de la concentration en sucres. Le tableau 21 regroupe les
différentes concentrations obtenues pour les produits de la fermentation.
L’apparition d’un stress osmotique dans le milieu de culture se traduit au niveau du
métabolisme des cellules par des modifications des flux de carbone et d’énergie. Ainsi, une
partie du carbone (sucres) est détournée vers la production de glycérol, qui est accumulé
dans la cellule pour assurer son adaptation à son environnement et qui permet aux levures
de préserver son métabolisme fermentaire en produisant de l’éthanol (Figure 38).
130
Figure 39. Voies de synthèse de glycérol et de l’éthanol (Djelal et al., 2005).
131
Tableau 20. Fermentation alcoolique du milieu à base de dattes par les levures (après 72 h de culture) sur M-S175 et M-S350 additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl.
Equi Glu Equi Glu consommé

EtOH (g.L-1) Gly (g.L-1) YEtOH(%) YGly (%) TC EtOH (%)**
(g.L-1) (%)
174±0,2 94,0±0,2 63,0±0,1 10,0±0,1 38,3±0,5 3,0±0,1 75,3±1,1
S. cerevisiae
349,0±0,8 4,0±0,1 < LD (*) < LD (*) < LD (*) < LD (*) < LD (*)
169,0±1,7 67,0±2 33±2 4,6±0,1 29±0,1 4±0,1 57,2 ± 0,06
Z.rouxii
357,0±1 41,0±0,6 55±1,0 10,0±0,1 38±0,1 7±0,1 74,7 ± 2,5
168,0±0,1 71,0±0,1 41±0,3 4,6±0,1 34±0,2 4±0,1 66,9 ± 0,5
C.pelliculosa
356,0±0,2 3,0±0,4 < LD (*) < LD (*) < LD (*) < LD (*) < LD (*)
< LD : inférieur à la limite de détection.

(*)
(**) TC EtOH : EtOH expérimental / EtOH théorique x 100
132
133
Les rendements éthanol sur substrats consommés (YEtOH) pour les trois souches, sur une
même durée de culture (72 h), sont de 38, 29 et 34%, respectivement pour S. cerevisiae, Z.
rouxii et C. pelliculosa sur milieu à 175 g.L-1 de sucre. Le rendement est nul pour S.
cerevisiae et C. pelliculosa sur milieu à 350 g.L-1 de sucre et il est de 38% pour Z. rouxii
(Tableau 21).
L’apparition d’un stress osmotique dans le milieu de culture se traduit au niveau du
métabolisme des levures par des modifications des flux de carbone et d’énergie. Une partie
du carbone est détournée vers la production de glycérol (Figure 39). Ainsi la composition
de la membrane pourrait engendrer une modification de la perméabilité de celle-ci au
glycérol, qui est en partie accumulé dans la cellule en tant que principal soluté compatible
(Hohmann, 2002).
Différentes substrats sont utilisés pour produire de l’éthanol (tableau 21). Parmi
ceux-ci, on trouve la canne à sucre, la betterave à sucre, le sorgho doux, les amylacés les
plus courants sont le mais et le blé. Les rendements d’éthanol varient considérablement
d’un substrat à un autre dans une fourchette comprise entre 29 g.L-1 pour le melasse de soja
et 120 g.L-1 pour le sorgho doux. Ces variations tiennent surtout aux différences dans
l’efficacité de conversion des différentes matières premières (Hydrolyse, extraction…) et
le procédé de fermentation utilisé.
134
Tableau 21. Production de bioéthanol à partir de différentes matières premières.
Concentration
Fermentation
Matière première initiale en sucres Microorganisme Temps de culture (h) Ethanol (g.L-1) Productivité (g.L-1h-1) Reférences
(F)
(g.L-1)
S. cerevisiae 522D 63 0,87 Chniti et al., 2014

175 Z. rouxii 33 0,45 Chniti et al., 2014
Sirop des dattes Batch 72
C. pelliculosa 41 0,56 Chniti et al., 2014
350 Z. rouxii 55 0,76 Chniti et al., 2014
K. marxiancs DMKU
200 batch 42-96 67,9 1,42 Limtong et al., 2007
3-1042
166 batch P. Kudriavizevii 24 71,9 4 Dhaliwal et al., 2011

Jus de canne à
sucre 173 Repeated batch S. cerevisiae 32 89,73 2,48 Liang et al., 2008
K marxianus DMKU
220 batch 3,1042 and S, 72 77,3-81,3 1,07-1,1 Eiadpum et al., 2012
cerevisiae M30
Souches de
180 F continue 117 13,3-19,4 * Wendhausen et al., 2001
Saccharomyces
200 F. continue S. cerevisiae IR-2 72 90 1,8 Paiva et al., 1996
S, cerevisiae TISTR
Jus de sorgho 190 Fed-batch 108 116,62-120,28 1,08-1,11 Laopaiboon et al., 2007
5048
240-320 batch S, cerevisiae NP 01 40-72 120,68 2,01 Loapaiboon et al., 2009
Zymomonas mobilis
Mélasse de soja 200 batch 29,3 * Letti et al., 2012
NRRL 806
135
136
1.1.5. Conclusions
La levure, comme les autres cellules, est capable de détecter un changement de la

pression osmotique du milieu extérieur. En général, elles répondent plus rapidement à un
environnement hypo-osmotique qu’à un milieu hyper-osmotique, puisque le risque
d’éclatement est plus sévère. Le mécanisme de résistance des levures se traduit par
l’accumulation dans la cellule de polyols, solutés compatibles. C’est le cas de
Zygosaccharomyce rouxii, souche xérotolérante, qui accumule du glycérol. Cette souche a
été très remarquable grâce à sa résistance au stress osmotique ; cette souche est restée
viable en raison de sa tolérance à des concentrations en sucres allant jusqu’à 350 g.L-1 ;
concentration totalement inhibitrice pour S. cerevisiae et C. pelliculosa.
2 . Effet de la fermentation « VHG » sur la production d’éthanol par
Z. rouxii
L’objectif des expériences présentées dans la partie suivante est de quantifier et de

caractériser l’adaptation de Zygosaccharomyces rouxii à une fermentation « VHG ». La
4éme série d’expériences a été réalisée en mode « Batch » durant 72 heures, à 500 mg.L-1 en
NH4Cl, des concentrations élevées en sucres (175, 250, 350 et 500 g.L-1).
Les cinétiques de réponse de la levure, doivent permettre de comprendre les
mécanismes mis en jeu dans le maintien de la viabilité cellulaire en fonction de la
concentration élevée en substrat. L’impact de la fermentation « VHG », est analysé sur le
comportement macro-cinétique (croissance cellulaire, capacité et performances,
rendement, production, …) afin de contribuer à l’identification et la caractérisation de la
réponse de Z. rouxii à une fermentation « VHG » pour optimiser son activité et identifier
les meilleures performances de production de bioéthanol.
2.1 . Cinétique fermentaire
2.1.1 . Evolution de la biomasse
La figure 40, présente l’évolution de la biomasse au cours de la fermentation (72

heures). La durée de la phase de latence est influencée par la concentration initiale en
sucres.
137
25
20
D.O 600 nm
15 M-S175
M-S250
10
M-S350
5
M-S500
0
0 18 24 42 48 66 72
Figure 40. Cinétique de croissance de Z. rouxii, sur des milieux à différentes concentrations initiales en sucres
(175, 250, 350 et 500 g.L-1) ; additionnés de 500 mg.L-1 de NH4Cl.
2.1.2 . Evolution de la consommation des sucres
La figure 41 montre que la consommation du fructose est totale après 48 heures de

culture pour la fermentation de M-S175 après 66 heures pour les fermentations M-S250,
M-S350 et M-S500. Zygosaccharomyces a donc été capable de consommer la totalité de
fructose quelque soit la concentration initiale en sucres ; par contre elle ne consomme pas
les autres sucres (glucose et saccharose) de la même façon, c’est une souche fructophile
(Leandro et al., 2011 et Leandro et al., 2013). En observant les temps de consommation,
nous avons constaté que Z. rouxii consomme systèmatiquement le glucose après
l’épuisement en fructose, traduisant ainsi la préférence de cette levure pour le fructose,
plutôt que le glucose.
Le transport des sucres est une étape essentielle dans le métabolisme des sucres ; il
détermine le taux de consommation des sucres par la levure. Zygosaccharomyces rouxii a
plusieurs gènes codant les tranporteurs d’hexoses (Figure 43), 3 d’entre eux (ZrFsy1,
ZrFfz1p et Zrfz2p) jouent un rôle significatif dans la fermentation alcoolique (Sousa-Dias
et al., 1996 ; Pina et al., 2004 ; Leandro et al., 2011 ; Dakal et al., 2014).
138
M-S175 M-S250
120
70

60 100
50 80
40 Glucose 60 Glucose
30
Fructose Fructose
20 40
10 Saccharose Saccharose
20
0
0 20 40 60 80 0
Temps de culture (h) 0 20 40 60 80
M-S350 M-S500
160

160
140 140
120 120
100 100
80 Glucose
80 Glucose
60 Fructose 60
40 Fructose
Saccharose 40
20 Saccharose
20
0
0 20 40 60 80 0
0 20 40 60 80
Figure 41. Cinétique de consommation des sucres durant la culture de Z. rouxii sur milieux à 175 g.L-1 (M-S175),
250 g.L-1 (M-S250), 350 g.L-1 (M-S350) et 500 g.L-1 ; additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl.
Le fructose est préférentiellement et totalement utilisé par Z. rouxii. Des études

menées sur la fructophilie des souches Zygosaccharomyces par Sousa-Dias et al. (1996),
Pina et al. (2004), Leandro et al. (2011) et Loureiro-Dias et al. (2013), ont révélé que le
processus d’utilisation des sucres dépend de la nature des transporteurs d’hexoses présents
dans la paroi de la levure. Ils ont déterminé plusieurs transporteurs de sucres particuliers,
nommé Ffz (Fructose Facilitator of Zygosaccharomyces) ; ZrFfz1 spécifiques au fructose
et ZrFfz2 transporte le glucose et le fructose (Affinité similaire). Sousa-Dias et al. (1996),
ont montré que le transport de glucose de milieu extracellulaire vers le milieu
intracellulaire dépend de la concentration en fructose dans le milieu extracellulaire et qu’à
certaines concentration, ZrFfz2 sont bloqués, ne laissant passer que le fructose (Figure 43).
Récement Leandro et al. (2013) ont caractérisé un nouveau transporteur de fructose

ZrFsy1 (High Affinity Fructose/H+ Symporter) qui ne transporte pas le glucose, et qui est
en activité lorsque la concentration en fructose dans le milieu extracellulaire est inférieure
à 0,2%.
139
2.1.3 . Evolution de la concentration en substrat d’azote
700
600

500
M-S175
400
M-S250
300
M-S350
200
M-S500
100
0
0 20 40 60 80
Figure 42. Cinétique de consommation de NH4Cl durant la culture de Z. rouxii sur milieux à 175 g.L-1 (M-S175),
La concentration en azote assimilé est variable suivant la concentration en sucres

des milieux de fermentation. Pour les milieux M-S175, M-S250 et M-S350, l’azote
ammoniacal passe de 550 à 50 mg.L-1 après 40 heures de fermentation ; alors que pour le
milieu M-S500, l’azote ammoniacal passe à 204,7 mg.L-1 après 68 heures de fermentation
(Figure 42).
140
Figure 43. Transport des hexoses lors de la fermentation alcoolique par Zygosaccharomyces rouxii (Production d’éthanol et de glycérol) (Dakal et al., 2014).
141
2.1.4 . Produits de fermentation
Les figures 44, montrent que l’éthanol et le glycérol sont produits tout au long de
la fermentation alcoolique, parallèlement à la consommation des sucres. Les quantités
d’éthanol produites sont sensibles à la concentration initiale en sucres ; elles augmentent de
37,6 g.L-1 pour le milieu M-S175 à 61,2 g.L-1 pour M-S500.
M-S175
70
Produits de fermentation (g.L-1)
60
50
40
30 EtOH
20 Gly
10
0
0 20 40 60 80
M-S250
70
60
50
40
30 EtOH
20 Gly
10
0
0 20 40 60 80
M-S350
70
60
50
40
30 EtOH
20 Gly
10
0
0 20 40 60 80
142
M-S500

70
60
50
EtOH
40
Gly
30
20
10
0
0 20 40 60 80
Figure 44. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol durant la culture de Z. rouxii sur milieux à 175
g.L-1 (M-S175), 250 g.L-1 (M-S250), 350 g.L-1 (M-S350) et 500 g.L-1 ; additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl.
La quantité de glycérol produite augmente avec la quantité de sucre dans le milieu,

en accord avec le rôle d’osmoprotecteur du glycérol (Wang et al., 2001; Taherzadeh et al.,
2002, Aldiguier et al., 2004 ; Geertman et al ; 2006).
Pour le milieu M-S350 la figure 44 montre bien que la concentration en glycérol

dans le milieu de culture est inférieure à celles relevées pour les autres milieux, en réponse
au stress osmotique (8 g.L-1) ;
En absence de pression osmotique élevée, Le rôle du glycérol produit est de

maintenir l’équilibre rédox et l’excès sera rejeté dans le milieu extracellulaire par transport
facilité à travers un canal protéique Fps1. La majeure partie de la diffusion du glycérol se
fait à travers le Fps1, qui est une aquaglycéroporine, membrane de la famille des canaux
protéiques MIP (Major Intrinsic Protein), codée par le gène Fps1.
Fps1 permet aux levures d’ajuster rapidement la permeabilité de la membrane pour

le glycérol et aussi de régler le flux de glycérol sortant de la cellule (Luyten et al., 1995 ;
Tamas-Luyten et al., 1999). Cette protéine joue un rôle majeur dans l’adaptation des
cellules aux chocs hypo-osmotiques, en permettant la sortie du glycérol. Elle est aussi
impliquée dans la réponse au stress hyperosmotique ; ainsi, dans ce cas, une diminution du
flux de glycérol à travers la membrane est observée pour M-S500 ou la quantité de
glycérol trouvée dans le milieu extracellulaire est 8 g.L-1, inférieure à celle trouvée dans le
milieu M-S350 (10 g.L-1) est peut être due à la fermeture des canaux Fsp1 (Petelenz-
Kurdziel et al., 2013) pour maintenir le glycérol qui continue à sortir en faible quantité soit
par diffusion passive grâce à ses propriétés liposolubles et/ou par un phénomène de
transport actif (Oliveira et al., 2003).
143
2.1.5 . Cinétique fermentaire
Le bilan des concentrations, rendements, et productivités volumiques en éthanol et

glycérol obtenus à l’arrêt des cultures (72 h) est donnée au tableau 23. Le rendement en
éthanol des milieux utilisés est compris entre 29 et 45%. L’analyse statistique (Test
Duncan) des résultats montre que les valeurs moyennes des rendements en éthanol sont
significativement différentes d’un milieu à un autre (p<0,05), à l’exception de M-S250 et
M-S500 qui sont statistiquement identiques avec un rendement en éthanol de 45%.
Le rendement en glycérol produit à la fin de la fermentation varie significativement avec la

concentration initiale en sucres ; il augmente de 0,04% pour M-S175 à 0,07% pour M-
S350. Les rendements en glycérol de M-S350 et M-S500 sont statistiquement identiques
(0,07%).
Tableau 22. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii sur milieux à 175 g.L-1 (M-S175),
M-S175 M-S250 M-S350 M-S500

3
Equi Glu (g.L-1) 168,7 256,9 360,7 488,4
Equi Glu consommés (%) 67,1 53 41,4 24
[EtOH] g.L-1 33,7± 1,33 (a) 61,2± 0,3 (b) 55,3± 0,6 (c) 53,2± 0,5(c)
[Glycérol] g.L-1 4,6± 0,01 (a) 7,6± 0,05 (b) 10± 0,06 (c) 8± 0,01 (d)
Y EtOH g.g-1 0,29± 0,01 (a) 0,45± 0,02 (b) 0,37± 0,01(c) 0,45± 0,01 (b)
Y Gly g.g-1 0,04± 0(a) 0,05± 0 (b) 0,07± 0(c) 0,07± 0 (c)
Q EtOH g.L-1.h-1 0,46± 0,02 (a) 0,85± 0 (b) 0,76± 0,01 (c) 0,74± 0(c)
Q gly g.L-1.h-1 0,06± 0,001 (a) 0,10± 0,001(b) 0,13± 0,001(c) 0,11± 0,001(d)
Le tableau montre que la productivité volumique QEtOH dans M-S250 (0,85 g.L-1.h-1) est
supérieure à la productivité en éthanol des autres milieux. Les productivités (QEtOH) de M-
S350 et M-S500 sont statistiquement identiques.
L’osmorégulation à la suite d’un choc osmotique peut se décomposer en 2 ou 3 phases :
- Une phase passive : purement thermodynamique : un efflux d’eau de la cellule. Ce

mouvement d’eau est passif et simplement régi par la loi de l’osmose. Cette sortie
d’eau entraîne souvent une variation du volume cellulaire. Cette étape est très
rapide et dure quelques secondes.
- Une phase active : au cours de cette phase, la cellule tend à restaurer son volume
initial. Elle va accumuler un certain nombre restreint de solutés dans le cytoplasme
144
afin de rétablir une pression de turgescence. Cette accumulation de solutés peut se
faire par synthèse (solutés compatible) ou simplement par transport (composés
osmoprotecteurs) s’ils sont présents dans le milieu de culture. Cette accumulation
de solutés entraîne un flux d’eau vers l’intérieur de la cellule et permet donc de
restaurer le volume cellulaire initial. Cette phase active, consommatrice d’énergie a
une durée plus longue que la première. A la fin de cette dernière phase, du fait des
nouvelles conditions intracellulaire, l’ensemble des réactions métaboliques peuvent
reprendre. Une reprise de la croissance des cellules est observée (après 18 heures de
fermentation).
- Une phase d’osmorégulation homoéostatique qui correspond au maintien de la
pression de turgescence (Dromigny, 2008).
Il faut noter qu’il est souvent difficile de distinguer le moment de transition entre ces trois
phases.
4 . Fermentation « VHG » par Z. rouxii : effet du temps de

fermentation et de la concentration initiale en NH4Cl
Comme cela est développé dans la première partie de ce chapitre, la difficulté
majeure de la fermentation « VHG » est la sensibilité de la levure à la pression osmotique
du milieu de culture. Z. rouxii semble être la seule levure qui arrive à produire de l’éthanol
dans un milieu à 500 g.L-1 de sucres. D’après la littérature il paraît que c’est la première
fois qu’on arrive à produire de l’éthanol à partir d’un substrat à une telle concentration ;
Eiadpum et al. (2012) ont produit 81 g.L-1 d’éthanol à partir de jus de canne à sucre à 220
g.L-1 de sucres en utilisant Saccharomyces cerevisiae M30 et Klyveromyces marxianus. Le
Jus de sorgho (240-320 g.L-1 en sucres) a été utilisé par Loapaiboon et al. (2009), qui ont
réussi à produire 120 g.L-1 d’éthanol par Saccharomyces cerevisiae. La bactérie
Zymomonas mobilis NRRL806, a été utilisée par Letti et al. (2012) pour produire 29,3 g.L-
1
à partir de Mélasse de soja à 200 g.L-1 en sucres (Tableau 22).
A partir de 350 g.L-1, le substrat utilisé est nommé « Sirop » (Partie 2.1). L’objectif
des expériences présentées dans les deux parties qui suivent est d’optimiser la production
d’éthanol à partir de sirop de dattes, en se focalisant sur la durée de fermentation d’une
part, et d’autre part, étudier l’effet de la concentration initiale en NH4Cl.
145
4.1 . Effet de la durée de culture
La stratégie expérimentale choisie consiste à cultiver Z. rouxii dans un milieu à 350

-1
g.L en substrat (M-S350) à base de sirop de dattes et de prolonger le temps de
fermentation « VHG » de 72 heures à 230 heures, afin de définir les cinétiques
d’osmoadaptation et le temps nécessaire pour obtenir le rendement maximal en éthanol. Le
mode de réponse et les dynamiques d’adaptation des cellules durant la fermentation seront
quantifiés par une analyse dynamique de culture (rendement, productivité) après 72, 160
et 230 h de fermentation.
4.1.1 . Cinétique de la croissance
Toute cellule en croissance dans un milieu de culture donné se trouve dans un état
d’équilibre osmotique et elle tend à maintenir dans son cytoplasme une pression osmotique
supérieure à celle du milieu de culture. Cette différence positive entre osmolarité intra- et
extracellulaire est appelée pression de turgescence. Une modification de la pression
osmotique du milieu extracellulaire modifie donc cet état d’équilibre. On parlera ici de
choc osmotique.
Pour une concentration initiale en sucres de 350 g.L-1, la phase de latence est très
courte (Figure 45), et Après 72 heures de fermentation, commence la phase stationnaire,
durant la quelle Z. rouxii ne se multiplie plus et l’activité cellulaire diminue.
18
16
14
12
D.O 600 nm
10
8
6
4
2
0
0 50 100 150 200 250
Figure 45. Cinétique de croissance de Z.rouxii sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de 10 mmol.L-1 de
NH4Cl.
146
4.1.2 . Cinétique de consommation des sucres
Les concentrations en sucres ont été quantifiées durant la culture. La levure a bien
dégradé le fructose qui diminue très vite dans le milieu de culture. Après avoir consommé
la totalité du fructose, la consommation du glucose débute, qui diminue progressivement
dans le milieu de 140 g.L-1 au début de la fermentation à 85,5 g.L-1 à 136 heures de
fermentation. En revanche, les cellules n’arrivent pas à dégrader le saccharose ; aucune
dégradation de ce derniern’est observée. Un arrêt de la consommation des sucres est
observé après 136 h (Figure 46).
160
140
120
100 Glucose
Fructose
80
Saccharose
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250
Figure 46. Cinétique de consommation des sucres par Z. rouxii sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de 10
mmol.L-1 de NH4Cl.
Pour la concentration en sucres de 350 g.L-1, l’allongement de la durée de culture

permet à Z. rouxii, qui est une souche fructophile, de consommer presque 60% du glucose
présent dans le milieu.
Une partie du fructose consommé par Z. rouxii a été utilisée pour la production de
soluté compatible (glycérol) qui sera accumulé dans le cytoplame de la cellule, afin de
rétablir une pression de turgescence et qui permet la reprise de la croissance et l’ensemble
des réactions métaboliques (dégradation de fructose, glucose pour produire de l’éthanol et
de glycérol).
4.1.3 . Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol.
La figure 47 présente la production de bioéthanol et le glycérol au cours la

fermentation. La production de bioéthanol devient maximale et dépasse 80 g.L-1 après 160
heures de fermentation, puis reste stable jusqu’à l’arrêt de culture.
147
100
Concentration en EtOH et Gly (g.L-1)

90
80
70
60
50 EtOH
40
Gly
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250
Figure 47. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de 10
mmol.L-1 de NH4Cl.
Le profil du glycérol dans le milieu M-S350 est différent de ceux observés pour
l’éthanol (Figure 47). La concentration en glycérol augmente pendant les premières heures
jusqu’à une concentration de 13 g.L-1 et se stabilise jusqu’à l’arrêt de la culture, alors
qu’après 66 heures de fermentation, la concentration en éthanol atteinte est de 40 g.L-1, qui
continue à augmenter pour atteindre 82 g.L-1 après 160 h et se stabilise autour de 85 g.L-1
jusqu’à la fin de la culture.
Z. rouxii accumule le glycérol dans le cytoplasme durant le stress osmotique

exercé par la concentration élevée en sucres (350 g.L-1). La majeur partie du glycérol
diffusée vers le milieu extracellulaire se fait par transport facilité à travers un canal
protéique FSP1 qui permet aux levures d’ajuster rapidement la perméabilité de la
membrane pour le glycérol et ainsi de régler le flux de glycérol sortant de la cellule
(Luyten et al., 1995 ; Tamás et al., 2003). FSP1 est impliquée dans la réponse de Z. rouxii
au stress hyperosmotique dans le milieu M-S350 ; ainsi, dans ce cas, une diminution du
flux de glycérol à travers la membrane est observée. Cette diminution est principalement
due à la fermeture des canaux FSP1. (Petelenz-Kurdziel et al., 2013), ce qui explique la
stabilité de quantité de glycérol dans le milieu de culture jusqu’à la fin de culture.
4.1.4 . Cinétique de consommation de NH4Cl
La figure 48, présente l’évolution de la concentration de NH4Cl dans le milieu de

culture au cours de la fermentation. Au cours des premières 18 heures de fermentation,
l’activité métabolique lente se traduit par une faible consommation de substrats et de
production de métabolites (éthanol et glycérol) et de biomasse. Durant la seconde phase,
148
l’activité métabolique est plus importante. La biomasse augmente fortement. Les
productions d’alcool et de glycérol passent respectivement à 85 g.L-1 et 15 g.L-1.
L’ammonium a été pratiquement totalement consommé après 136 heures ; il diminue de de
462,5 mg.L-1 à 10 mg.L-1 à la fin de la culture.
500
450
400
350
[NH4Cl] mg. L-1
300
250
200
150
100
50
0
0 50 100 150 200 250
Figure 48. Cinétique de consommation de NH4Cl sur milieux 350 g.L-1 (M-S350); additionnés de 10 mmol.L-1 de
NH4Cl.
L’azote est un nutriment essentiel au bon déroulement de la fermentation. La

carence en azote dans le milieu a un effet inhibiteur sur le métabolisme de Z. rouxii et a
augmenté le ralentissement et l’arrêt de la fermentation. Le NH4Cl est un facteur limitant
pour Z. rouxii.
Le tableau 24 présente un bilan des concentrations, rendements et productivités

volumiques en éthanol et glycérol obtenus à 72 h, 160 h et 230 heures de fermentation.
L’allongement de la durée de fermentation, permet d’augmenter la production de
bioéthanol, de 54 g.L-1 à 72 h à 82,3 g.L-1 en fin de culture, c’est à dire un gain de 52 %.
Quant au rendement en éthanol YEtOH, il augmente de 0,37 g.g-1 après 72 h à 0,47 g.g-1 en
fin de culture.
Il convient de noter que le rendement en glycérol reste le même pour les trois temps de
fermentation (0,08 g.g-1). La productivité en glycérol à 72 de fermentation est
statistiquement différente (p<0,05) de la productivité à 160 h, et cette dernière est
statistiquement identique à Q Gly à 230 heures de fermentation.
149
Tableau 23. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii sur milieux 350 g.L-1 (M-S350);
additionnés de 10 mmol.L-1 de NH4Cl.
72 h 160 h 230 h
EtOH (g.L-1) 55,3 ± 0,64 (a) 82,1 ± 3,95 (b) 82,3 ± 2,47 (b)
Gly (g.L-1) 11,9 ± 0,14 (a) 15,11 ± 2,37 (a) 14,4 ± 0,89 (a)
Y EtOH (g.g-1) 0,37 ± 0,02 (a) 0,45 ± 0,02 (b) 0,47 ± 0,02 (b)
Y Gly (g.g-1) 0,08 ± 0,003 (a) 0,08 ± 0,017 (a) 0,08 ± 0,01 (a)
Q EtOH (g.L-1.h-1) 0,76 ± 0,02 (a) 0,51 ± 0,03 (b) 0,35 ± 0,02 (c)
Q Gly (g.L-1.h-1) 0,16 ± 0,001 (a) 0,09 ± 0,001 (b) 0,06 ± 0,001 (b)
Les productivités instantanées en éthanol et en glycérol diminuent avec la durée de la

culture. A 72 heures, nous avons obtenus les productivités les plus élevées en éthanol (0,76
g.L-1.h-1) et en glycérol (0,16 g.L-1.h-1).
4.2 . Effet de la concentration en NH4+
Il est possible de calculer la quantité d’azote nécessaire dans le milieu pour obtenir
une production maximale de microorganismes. On peut calculer la quantité d’azote qui
doit être disponible pour obtenir une culture de levure à 1 g.L-1 en poids sec. La
composition moyenne de la levure est C : 47%, H : 6,5%, O : 31% et N : 7,5% (Atkinson et
al., 1983). La masse moyenne d’une levure est 10-9g. 1 gramme de levure contient 0,075 g
d’azote qui constitue le minimum disponible obligatoire, soit 320 mg de NH4Cl. Si l’on
tient compte des pertes lors de l’intégration de ce composé, il faut au moins multiplier cette
valeur par 2. Sachant que ce calcul n’est pas précis mais permet d’avoir une idée de la
composition minimale du milieu.
Afin d’évaluer expérimentalement l’impact de la concentration en substrat azoté sur

la production d’éthanol pour une fermentation « VHG », des milieux de culture à 250 g.L-1
150
ont été enrichis par différentes concentration en NH4Cl (500 mg.L-1 le minimum disponible
obligatoire (M-N500), 1500 mg.L-1 (M-N1500) et 3000 mg.L-1 (M-N3000)) et ensemencés
par Z. rouxii. Dans cette expérience, la fermentation en mode « batch » a été
volontairement arrêtée après 72 heures.
Nous nous intéressons à l’évolution de la biomasse, des sucres, de l’éthanol, du glycérol et

de NH4Cl.
4.2.1 . Cinétique de croissance
La figure 49 montre que l’évolution de la biomasse au cours de la fermentation est

similaire pour les trois milieux de culture. Les 20 premières heures de culture,
correspondent à la phase de latence, pendant laquelle, nous observons une faible croissance
cellulaire et une faible consommation des sucres et également une production quasi-nulle
d’éthanol et de glycérol, comme cela sera discuté ci-dessous. Même en fin de culture, au
bout de 72 h, la phase stationnaire n’est pas atteinte.
25
20
D.O 600 nm
15
M-N500
10
M-N1500
M-N3000
5
0
0 20 40 60 80
Figure 49. Cinétique de croissance de Z.rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés de 500 (M-N500), 1500 (M-
N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl.
4.2.2 . Cinétiques de consommation des sucres
Comme précédemment, le fructose est préférentiellement assimilé (figure 50); le

glucose est assimilé après épuisement de ce dernier. En revanche, L’assimilation du
saccharose est négligeable. Ces résultats confirment que Z. rouxii est une levure
fructophile.
151
M-N500
120

100
80
60 Glucose
Fructose
40
Saccharose
20
0
0 20 40 60 80
M-N1500
120
100
80
60 Glucose
Fructose
40
Saccharose
20
0
0 20 40 60 80
M-N3000
120
100
80
60 Glucose
Fructose
40
Saccharose
20
0
0 20 40 60 80
Figure 50. Cinétique de consommation des sucres sur milieux 250 g.L-1; additionnés de 500 (M-N500), 1500 (M-
N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl.
152
4.2.3 . Cinétique de production d’éthanol
En lien avec la croissance, les productions d’éthanol et de glycérol ne débutent

qu’après la phase de latence. La concentration en éthanol atteint 61 g.L-1 pour M-N500 et
est d’environ 72 g.L-1 pour les deux autres milieux (Figure 51). Les concentrations en
glycérol sont de 7,6 g.L-1 pour le milieu M-N500 et 8,4 g.L-1 pour les deux autres milieux.
M-N500
Produits de la fermentation (g.L-1)
70
60
50
40
30 EtOH
20 Gly
10
0
0 20 40 60 80
M-N1500
80
70
60
50
40
30 EtOH
20 Gly
10
0
0 20 40 60 80
M-N3000
80
70
60
50
40 EtOH
30
Gly
20
10
0
0 20 40 60 80
Figure 51. Cinétique de production de bioéthanol et de glycérol par Z. rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés de
500 (M-N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl.
153
4.2.4 . Cinétique de consommation de NH4Cl.
La figure 52 illustre l’évolution de la concentration en NH4Cl dans les milieux de

cultures au cours de la fermentation, qui est similaire à celle observée pour les autres
paramètres ; une latence de près de 40 h, puis une consommation de l’ammonium, presque
totale pour 500 mg.L-1 de NH4+, et 30 et 50% pour les milieux supplémentés avec 1500
mg.L-1 et 3000 mg.L-1 en NH4Cl.
3500
3000
2500
2000
M-N500
1500
M-N1500
1000 M-N-3000
500
0
0 20 40 60 80
Figure 52. Cinétique de consommation de NH4Cl par Z. rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés de 500 (M-N500),
1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl.
Généralement, lors de la fermentation alcoolique les ions ammonium sont

totalement consommés au bout des 50 premières heures (Beltran et al., 2004), ce qui
confirme les résultats obtenues, pour les 3 milieux utilisés ou la consommation de NH4Cl
s’arrête après 50 heures de fermentation.
L’évolution du substrat azotée des milieux de culture au cours de la fermentation

dépend de sa concentration. Selon Beltran et al.(2004) et Tailandier et al. (2007), l’ion
ammonium est généralement totalement utilisé par les levures, ce qui n’est pas le cas pour
les milieux M-N1500 et M-N3000.
Pour les deux milieux M-N1500 et M-N3000, la consommation de NH4Cl s’arrête

au bout de 50 heures, sans épuisement total de l’ammonium. D’après Beltran et al.(2004),
il existe 3 transporteurs (Perméases) pour l’ion ammonium (NH4+) MEP1, MEP2 et MEP3.
Cette activité de transport nécessite la présence d’une source de carbone énergétique pour
être fonctionnelle et la répression des gènes responsables de l’expression des transporteurs
de NH4+, par la concentration élevée en source d’azote.
154
Le tableau 25 présente le bilan des concentrations, rendements et productivités volumiques

en éthanol et glycérol obtenus à l’arrêt des cultures (72 heures). Les rendements en éthanol et
glycérol produits ne sont pas statiquement différents à un niveau de probabilité fixé à 5% pour les
trois milieux enrichis avec différentes concentration en NH4Cl.
L’augmentation de la concentration initiale en NH4Cl, induit une augmentation de la

productivité volumique en éthanol ; il y a une différence statistiquement significative entre le
milieu enrichi avec 500 mg. L-1 et les deux autres milieux. Les milieux M-N1500 et M-N3000,
présentent des productivités en glycérol qui ne sont pas statistiquement différentes.
Tableau 24. Paramètres cinétiques des fermentations alcooliques par Z. rouxii sur milieux 250 g.L-1; additionnés
de 500 (M-N500), 1500 (M-N1500) et 3000 (M-N3000) mg.L-1de NH4Cl.
M-N500 M-N1500 M-N3000
Equi Glu consommés (g.L-1) 136,21 ± 6,45(a) 167,84 ± 3,84 (b)

169,68 ± 6,72 (b)
EtOH (g.L-1) 61,22 ± 0,32 (a) 72,17 ± 0,81 (b) 72,32 ± 0,37(b)
Glycérol (g.L-1) 7,57 ± 0,06 (a) 8,35 ± 0,08 (b) 8,35 ± 0,02 (b)
Y EtOH (g.g-1) 0,44 ± 0,03 (a) 0,42 ± 0,01(a) 0,42 ± 0,02 (a)
YGly (g.g-1) 0,05 ± 0,00 (a) 0,05 ± 0,00 (a) 0,05 ± 0,00 (a)
Q EtOH (g.L-1.h-1) 0,84 ± 0,01(a) 0,99 ± 0,01(b) 1,00 ± 0,01(b)
Q Gly (g. l-1.h-1) 0,10 ± 0,00(a) 0,11 ± 0,01 (a)

0,11 ± 0,01 (a)
4.2.6 . Conclusion
L’ion ammonium NH4+, aussi appelé sel d’ammonium ou azote ammoniacal ; il est
de synthèse chimique et peu coûteux. Ce type d’apport est assimilé rapidement par la
levure et il favorise leur multiplication rapide et importante. Dans notre cas, il est
155
intéressant d’augmenté la quantité de NH4Cl de 500 mg.L-1 à 1500 mg.L-1, mais pas à 3000
mg.L-1. L’analyse statistique a montré que les résultats des milieux M-N1500 et M-N3000
sont statistiquement identiques. L’augmentation de la concentration initiale en NH4Cl,
nous a permis d’augmentation de la concentration finale en éthanol (72 g. L-1) et la
productivité Q EtOH (0,99 g. L-1. h-1).
5 . Fermentation « VHG » par des microorganismes isolés de sous

produits de dattes
La levure est capable de détecter un changement de la pression osmotique du milieu
extérieur et y répond par l’accumulation dans la cellule d’un osmoprotecteur qui est le
glycérol. L’environnement hyper-osmotique des milieux de cultures à base de sirop de
dattes, a causé un dysfonctionnement de métabolisme des deux levures Saccharomyces
cerevisiae et Candida pelliculosa.
Zygosaccharomyces rouxii a été très remarquable grâce à ces propriétés résistantes

au stress osmotique ; cette souche est restée viable en raison de sa tolérance à des
concentrations en sucres élevés allant jusqu’à 500 g.L-1, des conditions qui sont inhibitrices
pour les autres levures. La fermentation VHG a montré que Z. rouxii est une souche
fructophile, mais incapable de dégrader le saccharose. Afin de pallier cet inconvénient
nous avons testé un microorganisme isolé des sous produits de dattes ; un microorganisme
endogène, adapté au substrat, au milieu extrême, robuste et local.
En ce sens, un microorganisme a été gracieusement fourni par Mademoiselle Monia

JEMNI, chercheur au Centre Régional de Recherche en Agriculture Oasienne de Degueche
à Tozeur en Tunisie qui a isolé cette souche à partir de sous-produits des dattes (les écarts
de triage).
5.1 . La souche isolée
5.1.1 . Identification
L’identification et la caractérisation ont été réalisées au Centre de Ressources en

Qualité et Sécurité dans l’Agriculture et les industries Agro-alimentaire à Plouzané. Nous
reprenons ci-dessous le rapport édité par l’AQUASA sous la direction de Mme Amélie
WEILL.
156
L’analyse microscopique a montré que la souche isolée était une bactérie. Pour
identifier et caractériser l’espèce bactérienne ou la communauté de microorganismes à
laquelle elle appartient, une analyse des séquences d’ARNr16s a été effectuée. C’est l’une
des méthodes les plus utilisées pour l’identification des espèces bactériennes.
D’après Drancourt et al., (2004) qui ont découvert 11 nouvelles espèces parmi 1404
isolats analysés par PCR 16S, des pourcentages de similarité supérieurs à 99% avaient été
choisis pour assimiler une souche à une espèce déjà décrite ; de 97 à 99% pour l’assimiler
au niveau du genre ; et inférieur à 97% pour décrire une nouvelle espèce. La PCR 16S est
donc un outil majeur d’exploitation de la diversité bactérienne (Drancourt et al., 2004 ;
Janda and Abbot, 2007).
L’ADNr 16S et une partie du gène codant la gyrase (gyrB), ont été amplifié. Les
résultats de séquençage ont été traités par le logiciel « BioNumerics » et comparées aux
bases de données NCBI (Tableau 26).
Tableau 25. Résultats des brins forwards des séquençages 16S de la souche S.
Souche Séquences
S832 pb >S_16S
CTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACA
AACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC
ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTC
GAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTT
AACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAG
CCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCG
GTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTA
AGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA
CGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA
CGTCTTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTCTGGCGGCG
TGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGAT
GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACT
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCG
CATGGTTCAGACATAAAAGGTCTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT
ACGGGAGGGATCAGTATGGAATCTTCCGCA.
La qualité du séquençage, n’a permis d’exploiter qu’une seule des deux séquences
obtenues.
157
Tableau 26. Résultats des Blast (NCBI) de la réponse 16S forward de la souche S.
Identification E value Coverage Identity
Bacillus methylotrophicus strain WZ-4 0.0 98% 99%
Bacillus amylolquefaciens strain S-14 0.0 100% 99%
Bacillus amyloliquefaciens strain P-329 0.0 100% 99%
Bacillus subtilis strain S-111 0.0 100% 99%
Bacillus subtilis strain VIT-SPS2 0.0 100% 99%
La séquence de l’ADNr 16s obtenue pour la souche isolée a été comparée avec
celles de plusieurs bases de données internationales. La bactérie appartient au genre
Bacillus et aux espèces B. subtilis ou B. amyloliquefaciens (Tableau 27).
Cependant, la région étudiée ne permet pas de différencier l’espèce. D’après Larsen

et al., (2014), une portion du gène codant une partie de la gyrase semble plus spécifique
pour différencier ces deux espèces (Tableau 28).
Tableau 27. Résultats des séquençages d’une partie de la région Gyrase de la souche S.
Souche Séquences
S378 pb >S_GryR
TCTTCTCCGATTCCTGTTCCGAGGGCCGTGATCATTGATCTGACCTCATTG
TTTGAGAGAATCTTATCAAGTCTGGCTTTCTCAACGTTCAGAATCTTACC
GCGCAGCGGCAGAATGGCTTGGAAATGACGGTCCCGTCCCTGTTTCGCTG
ATCCGCCCGCAGAGTCACCCTCTACGATATACAAGCTCGGAAATGCTCG
GATCTTTAGAAGAACAGTCCGCCAAGTTTGCCCGGCTAGATTGGAAATCT
CAAGCGCACTTTTGCGCCGGGTCAATTCCCGGGCTTTTTTCGCCGCCA/AC
CTGTGGCCGATCTTGAAGTGATCGGCGAAACTGATAAGACCGGAACGAT
TACGCACTTCGTTCCGGACCCGGAAATTT.
158
La qualité du séquençage, n’a permis d’exploiter qu’une seule des deux séquences
obtenues, qui a été comparée aux séquences de la base de données NCBI (Tableau 29).
Tableau 28. Résultats des Blast (NCBI) de la séquence GyrB reverse de la souche S.
Identification E value Coverage Identity
Bacillus amyloliquefaciens LFB112, complete genome 3 e-147 100% 99%
Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum strain 15536 3 e-147 78% 99%
Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum strain 15528 3 e-147 78% 99%
Bacillus amyloliquefaciens strain Y41a 3 e-147 100% 99%
Bacillus amyloliquefaciens strain CH92 3 e-147 100% 99%
Afin d’affiner l’identification de la souche un arbre phylogénétique, basé sur

l’analyse d’une portion du gène gyrB, avec des souches de B. subtilis et B.
amyloliquefaciens a été construit à l’aide du logiciel Figtree (Figure 53).
159
Figure 53. Reconstruction phylogénétique par maximum de vraisemblance basée sur l’analyse d’une portion du
gène GyrB incluant 6 séquences issues de souches de B. subtilis subsp. Subtilis dont la souche type et 6 séquences
issues de souches de B. amyloliquefaciens dont la souche type de B. amyloliquefaciens subsp. Amyloliquefaciens, 5
souches de B. amyloliquefaciens subp. Plantarum ainsi que la souche testée.
Les analyses des résultats des séquençages suggèrent que la souche appartient à l’espèce
Bacillus amyloliquefaciens, possiblement la sous-espèces plantarum. Ce resultat a été
confirmé par l’utilisation d’un test phénotypique : API50CHB (Biomérieux). Les
pourcentages d’identification étaient supérieurs à 98%.
Le genre Bacillus comprend au moins 36 espèces. Le genre Bacillus appartient à la

famille des Bacilllaceae.
- Règne : Bactérie.
- Embranchement : Firmicutes.
- Classe : Basilli.
- Ordre : Bacillales.
- Famille : Bacillaceae.
- Genre : Bacillus.
Il est difficile de distinguer la souche B. subtilis des espèces étroitement

apparentées Bacillus, en particulier l’espèce B. amyloliquefaciens (Ash et al., 1991 ;
160
Logan et De Vos, 2009), toutefois, L’espèce B. amyloliquefaciens affiche des différences
des distinctes dans la séquence génétique de l’ARN ribosomique 16S : L’absence de deux
sites de restriction Rsal dans la région V3 qui la différencie de l’espèce B. subtilis
(Jeyaram et al., 2001).
5.1.2 . Conditions de croissance
Les plages de températures de croissance et de pH varient entre les souches

(Tableau 4) (Logem et De Vos, 2009 ; Rooney et al., 2009).
Tableau 29. Condition de croissance de Bacillus
Plage de Température de
Espèces température de croissance optimale Plage de pHa
croissance (°C) (°C)
B. amyloliquefaciens 15-50 30-40 5,5-8,5b
B. atrophacus 5-55 28-30 5,3-5,7c
B. lichenifornus 15-55 30-40 5,7-6,8b
B. subtilis sous-
5-55 28-30 5,5-8,5b
espèce subtilis
B. subtilis sous-
espèce 15-55d 28-30d 5,5-5,7d
inaquorsorum
a
pH dans un bouillon Voges-Proskaner.
b
(Logan et De Vos, 2009)
c
(Nakamura, 1989)
d
(Rooney et al., 2009)
Les espèces B. licheniformis et B. subtilis sous-espèce inaquosorum sont anaérobies
facultatives et certaines souche de B. subtilis ont une croissance restreinte dans des
conditions anaérobies (Logan et De Vos, 2009).
 B. amyloliquefaciens
161
C’est un microorganisme produisant des enzymes (amylase, isopène, protéase,
ribonuclénase et phylase), biosurfacants, antibiotiques et détergents destinés à des
applications industrielles et commerciales (Madslien et al., 2012) y compris des
applications de nettoyage, de dégraissage et antibactériennes (Madslien et al., 2012 ;
Moons et al ; 2009 ; Perez-Garcia et al., 2011 ; Rendueles et Ghigo, 2012, Rivardo et al.,
2009).
 B. subtilis
C’est un microorganisme produisant des lipopeptides (biosurfactants), des

enzymes (amylase, protease) ainsi que des composés antibiotiques (aterrimin) (Moons et
al., 2009 ; Rendueles et Ohigo, 2012 ; Rivardo et al., 2009.
B. subtilis est également utilisé dans le traitement de l’eau et des eaux usées pour réduire
les efflorescences algales, les odeurs, l’accumulation de boue, les fosses septiques et les
fosses de déchets agricoles (Roe Tech, 2014), ou encore pour le fermentation d’aliments
traditionnels (Inatus et al., 2006).
Les Bacillus sont fréquement retrouvées dans le sol et dans les denrées alimentaires ;
Diorisio et Keiko, (2009) et Daayf et al., (2003) ont isolé Bacillus amyloliquefaciens,
respectivement de la surface de fruits de banane et de pomme de terre qui sont très riches
en sucres. La souche identifiée dans ce travail de recherche a été isolée de sous-produits de
dattes, un sustrat très riche également en sucres.
5.1.3 . Conclusion
La souche « S » a été identifiée comme étant Bacillus amyloliquefaciens d’aprés les

analyses génotypiques et phénotypiques effectuées. Cette bactérie est décrite dans la
littérature (Saha et al., 2014 ; Deb et al., 2013 ; Singh et al., 2013) comme productrice de
l’α-amylse, un enzyme nécessaire à l’hydrolyse de l’amidon et de cellulose en sucres
simples. Mais il est nécessaire de vérifier si cette souche allochtone, cultivée dans les
mêmes conditions que celles décrites précédemment, produit de l’éthanol.
162
6 . Fermentation « VHG » par la souche identifiée
Deux series de fermentation « VHG » ont été réalisées en mode « Batch » suivant le
protocole décrit dans la partie « Matériel et Méthodes ». La premirère série sur sirop de
dattes contenant une concentration initiale en sucres d’environ 175 g.L-1. Les flacons ont
été ensemencés par la même quantité d’inoculum. Trois souches ont été utilisées : la
bactérie identifiée Bacillus amyloliquefaciens et les souches de réferences
Zygosaccharomyces rouxii et Saccharomyces cerevisiae. La deuxième serie de
fermentation VHG a été réalisée pour tester l’adaptation de la souche identifiée à un
environnement hyperosmotique, c’est à dire des cultures à 28°C durant 160 heures sur M-
S175 et M-S350, ensemencés par B. amyloliquefaciens.
6.1 . Production d’éthanol par B. amyloliquefaciens, Z. rouxii et S.

cerevisiae
6.1.1 . Dégradation des sucres par les souches utilisées
Les histogrammes de la figure 54, présentent les quantités des sucres résiduels dans
les milieux de cultures ensemencés par différentes souches à 72 heures et 160 heures de
fermentation.
72 h
60
50 Glucose
40 Fructose
30
Saccharose
20
10
0
B. a S. c Z. r
Souche
163
160 h

40
35
30 Glucose
25
20 Fructose
15
Saccharose
10
5
0
B. a S.c Z. r
Souche
Figure 54. Concentration en sucres dans les milieux M-S175 fermentés par S. cerevisiae (S.c), Z. rouxii (Z.r) et B.
amyloliquefaciens (B. a) ; milieux additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl.
La souche indigène Bacillus amyloliquefaciens présente l’avantage de dégrader tous les

sucres présent dans le sirop de datte, ce qui est particulièrement intéressant pour le
saccharose, qui n’est pas assimilé par Z. rouxii. Ainsi l’intégralité des sucres présents dans
la biomasse seraient convertie en produit à haute valeur ajoutée.
6.1.2 . Paramètres cinétiques
Le tableau 30 présente un bilan des concentrations, rendements et productivités

volumiques en éthanol et en glycérol.
Pour la même concentration en sustrat (175 g.L-1), B. amyloliquefaciens produit environ 77

g.L-1 d’éthanol après 72 heures de fermentation et 87 g.L-1 en fin de culture (160 heures).
B. amyloliquefaciens a la capacité de fermenter un milieu qui a une concentration de 175
g.L-1 en substrat.
Pour s’adapter au son environnement hyperosmotique, B. amyloliquefaciens comme les

levures, produit du glycérol, près de 8,4 g.L-1 pour les deux milieux.
164
Tableau 30. Paramètres cinétiques de la fermentation alcoolique de M-S175 fermentés par S. cerevisiae (S.c), Z. rouxii (Z.r) et B. amyloliquefaciens (B. a) ; milieux additionnés de 500
mg.L-1de NH4Cl.
Equi Glu consommés Y EtOH YGly Q EtOH Q Gly

Temps (h) EtOH (g.L-1) Gly (g.L-1)
(g.L-1) (g.g-1) (g.g-1) (g.L-1.h-1) (g.L-1.h-1)
7
72 100% a 77,46±2,2a 8,41 ±0,47 a 0,41±0,01a 0,046± 0,004a 1,07±0,001a 0,117±0,001a
B. a
160 100%a 87,11±2,26b 8,40 ±0,21a 0,46 ±0,01a 0,045 ±0,0008a 0,54±0,001bc 0,053±0,001b
72 85%b 69,60±2,15de 7,42±0,01c 0,46±0,02a 0,050±0,001a 0,96 ±0,02e 0,103±0,006d
S. c
160 89,2b 73,62±0,1ad 7,33±0,13c 0,47±0,0006a 0,,047±0,0008a 0,46±0,002cf 0,046±0,0001be
72 57,1%c 44,52±4,5f 5,69±0,7d 0,44±0,07a 0,057±0,,0007c 0,61±0,006b 0,079±0,0001f
Z. r
160 84,1%b 64,65 ±0,08e 6,26±0,05d 0,44±0,01a 0,043±0,002a 0,40±0,001f 0,039±0,002e
Les moyennes portant les mêmes lettres dans la même colonne ne sont pas significativement différentes (p<0,05).
165
Les rendements en éthanol pour les souches B amyloliquefaciens, S cerevisiae et Z. rouxii
varient de 41% à 47% pour 72 h et 160 h de fermentation. Les rendements sont
statistiquement non affectés ni par la durée de fermentation, ni par la souche utilisée. Le
rendement en ethanol obtenu par Bacillus amyloliquefaciens, n’est pas significativement
différent (p<0,05) de ceux obtenus avec Saccharomyces cerevisiae et Zygosaccharpmyces
rouxii.
Toutefois, nous souhaitons étudier le comportement de Bacillus amyloliquefaciens face à la

composition du milieu de culture en sucres.
7.1 . Effet de la concentration en substrat sur la capacité fermentaire de

Bacillus amyloliquefaciens
7.1.1 . Evolution de la biomasse
L’évolution de la biomasse au cours des fermentations est représentée sur la figure

55. On observe une phase de latence de près de 50 h. la phase stationnaire est atteinte au
bout de 72 h pour M-S175. Pour le milieu M-S350, la phase de latence est de près de 72
heures et la croissance n’est pas terminée au bout de 160 h.
30
25
20
DO 600nm
15 M-S175
10 M-S350
0
0 50 100 150 200
Figure 55. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation par B. amyloliquefaciens sur M-S175 et M-S350;
additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl.
7.1.2 . Cinétique de dégradation des sucres
La figure 56 montre la cinétique de dégradation des sucres.
166
M-S175

90
80
70
60 Glucose
50
40 Fructose
30
Saccharose
20
10
0
0 50 100 150 200
M-S350
160
140
120 Glucose
100
Fructose
80
60 Saccharose
40
20
0
0 50 100 150 200
Figure 56. Evolution de la concentration des sucres au cours de la fermentation par B. amyloliquefaciens sur M-
S175 et M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl.
D’après Deutsher et al. (2002), les sucres mono et di saccharides sont transportés et
catalysés à l’intérieur de la cellule. Les sucres simples (glucose et fructose) représentent
des sources de carbonne priviléigiées de Bacillus amyloliquefaciens (Steinmetz, 1993)
7.1.3 . Produits de la fermentation
La production d’éthanol est de 89,8 g.L-1 après 160 heures de fermentation pour les
deux milieux de culture (Figure 57).
167
M-S175
Produits de la fermentation g. L-1

100
90
80
70
60
50
40 EtOH
30 Gly
20
10
0
0 50 100 150 200
M-S350
100
90
Produits de la fermentation g.L-1
80
70
60
50
EtOH
40
Gly
30
20
10
0
0 50 100 150 200
Figure 57. Evolution de la concentration en éthanol et en glycérol au cours de la fermentation par B.

amyloliquefaciens sur M-S175 et M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl.
La quantité d’éthanol trouvée après 160 heures de fermentation « VHG » d’un milieu
de culture à base de sirop de dattes (M-S175 et M-S350), par la bactérie Bacillus
amyloliquefaciens dépasse 90 g.L-1; c’est largement supérieur aux résultats obtenus pour la
levure Z. rouxii ; 64 g.L-1 pour M-S175 et 82 g.L-1 pour M-S350 après 160 heures de
fermentation. La figure 56, montre que quelle que soit la concentration en sucres, B.
amyloliquefaciens a été capable de consommer la totalité des sucres. En observant les
temps de consommation, on constate que systématiquement le fructose est épuisé en même
temps que le glucose, traduisant ainsi la préference de cette bactérie pour le glucose et le
fructose ; quant au saccharose, il a été consommé en totalité pour M-S175 et à 50% pour
M-S350. Comparés à ceux obtenus sur Z. rouxii, ces résultats sont très intéressants. En
effet, Z. rouxii, qui est une souche fructophile, ne consomme le glucose qu’après
épuisement de fructose de milieu ; de plus, elle ne peut pas dégrader le saccharose quelle
que soit la concentration de milieu en substrat.
168
L’augmentation de la concentration en sucres à 350 g.L-1 se traduit par un
allongement du temps d’osmoadaptation de B. amyloliquefaciens (Figure 57), avec un
rendement plus faible en éthanol (31%) et en glycérol (3%) (Tableau 31).
Tableau 31. Paramétres cinétiques des fermentations VHG fermentation par B. amyloliquefaciens sur M-S175 et
M-S350; additionnés de 500 mg.L-1de NH4Cl.
M-S175 M-S350
Equi Glu inital 204. 338,5
Equi Glu consommés (g.L-1) 100%(a) 86,8%(b)
EtOH (g.L-1) 89,8 92,4
Gly (g.L-1) 10 8,3
Y EtOH (g.g-1) 0,45±0,04(a) 0,31±0,07(b)
Y Gly (g.g-1) 0,05±0,003(a) 0,03±0,001(b)
Q EtOH (g.g-1.h-1) 0,56±0,008(a) 0,57±0,007(a)
Q Gly (g.g-1.h-1) 0,06±0,001(a) 0,05±0,001(b)
Le rendement théorique en éthanol, appelé rendement de Gay-Lussac, établit que

51,5 kg d’éthanol peuvent être fabriqués à partir de 100 kg de glucose. (Balleini, 2011). En
pratique, les réactions de maintenance, les réactions de synthèse des infrastructures
cellulaires et des coproduits (glycérol, …) limitent le rendement de conversion à 80-90%
de sa valeur théorique (0,511 g.g-1).
Le rendement YEtOH pour le milieu M-S350 est de 0,31 g.g-1, 60% du rendement
théorique limite (0,511 g.g-1), bien inférieur à celui de M-S175 0,45 g.g-1 qui représente
88% de rendement théorique. Ceci est peut être expliqué par le stress osmotique subit par
les cellules et induit par les fortes teneurs en sucre. La réponse au choc osmotique se
traduit au niveau de métabolisme de B. amyloliquefaciens par modification des flux de
169
carbone et d’énergie ; une partie du carbone a été détournée vers l’osmoadaptation des
cellules.
Cette serie d’expérience a montré que, comme Z. rouxii, la souche isolée de sous-produits
de dattes est tolérante aux fortes concentrations en substrat et elle fermente l’ensemble des
3 sucres, contrairement à Z. rouxii qui est une souche fructophile.
7.2 . Conclusions
La souche isolée des sous-produits des dattes et identifiée comme étant un Bacillus
amyloliquefaciens a été capable de convertir les trois types de sucres présents dans le
milieu hyper-osmotique (glucose, fructose et saccharose) en éthanol, contrairement à Z.
rouxii qui est une souche fructophile et qui ne consomme pas le saccharose et le glucose
qu’après épuisement du milieu en Fructose. Le rendement YEtOH de B. amyloliquefaciens
pour le milieu M-S175 est de 0,45 g.g-1, bien supérieure à ceux de S. cerevisiae, C.
palliculosa et Z. rouxii qui donnent respectivement 0,38, 0,29 et 0,34 g.g-1. Pour le milieu
M-S350 ; le rendement en éthanol de B. amyloliquefaciens est 0,31 g.g-1, inférieur à celui
de Z. rouxii (0,38 g.g-1), la seule levure qui a pu fermenter le milieu M-S350.
Cette souche allochtone est capable de se développer dans un environnement hyper-
osmotique. La fermentation VHG pour produire de l’éthanol avec cette souche nous semble
prometteuse pour valoriser un substrat très riche en sucres fermentescibles.
8 . Procédé industriel de production d’éthanol
Notre objectif est atteint à l’échelle laboratoire, mais il faut transformer l’essai au
niveau de la production industrielle qui reste une condition indispensable à la réussite de
chaque projet de recherche. Dans ce cadre je propose à la fin de notre travaille de
recherche, un procédé industriel de transformation de sous-produits de dattes (Figure 58)
qui comprend un procédé principal de production d’éthanol.
Il est composé d’une succession d’opérations unitaires :
 Lavage et dénoyautage des dattes ;

 Extraction des sucres par de l’eau géothermale ;
 Concentration de jus obtenue à 72°Brix ;
 Fermentation par des microrganismes osmotolérantes ;
170
 Séparation d’éthanol par distillation.
Les co-produits de la production d’éthanol comme les noyaux et les pulpes obtenues
après l’opération d’extraction sont destinés à l’alimentation de betail (séchage et broyage).
171
Figure 58. Procédé industriel de valorisation de sous-produits de dattes.
172
CONCLUSION GENERALE
Le présent travail a montré que la valorisation des sous-produits de dattes de la

variété « Deglet-Nour », la plus commercialisée en Tunisie, en vue de leur éventuelle
transformation en bioéthanol est possible. Ce substrat est très riche en sucres
fermentescibles, dont la transformation par voie fermentaire semble prometteuse.
Dans un premier temps, afin de pouvoir bien exploiter le déchet des dattes, nous
avons optimisé l’extraction des sucres de dattes en utilisant un plan d’expérience. Il est
possible de définir les conditions permettant d’extraire un jus très riches en sucres qui sont
(80°C, 90 min, 1 :2 ratio pulpe /eau). Le jus obtenus est concentré en sirop à 720 g.L-1 de
sucres fermentescibles (Glucose, Fructose et Saccharose).
La seconde étape de ces travaux a été la production d’éthanol par S. cerevisiae. Les
fermentations « batch », nous ont permis de produire 60 g.L-1 d’éthanol et 5 g.L-1 de
glycérol à partir d’un milieu à 175 g.L-1 en sucres enrichi avec 500 mg.L-1 de NH4Cl. Mais
à une concentration élevée en sucres (350 g.L-1), l’environnement hyper-osmotique a
limité la capacité fermentaire de S. cerevisae, qui est une levure sensible à la pression
osmotique.
Le mécanisme de résistance des levures aux fortes concentrations en sucres se

traduit par la production et l’excrétion partielle dans le milieu de culture de glycérol (Djelal
et al., 2005 ; Djelal et al., 2012a). C’est le cas de Z. rouxii, la seule souche qui a résistée
au stress osmotique causée par la concentration élevée en sucres (350 g.L-1), et qui a
totalement inhibé S. cerevisiae et C. pelliculosa.
Des fermentations « VHG » sur des milieux à base de sirop de dattes, avec des
concentrations en sucres allant jusqu’à 500 g.L-1 ont montré que Z. rouxii était capable de
croître même à cette teneur en sucres. Z. rouxii est une souche fructophile ; elle consomme
rapidement le fructose, et une consommation du glucose n’est observée qu’après
disparition du fructose de milieu de culture. Elle peut métaboliser 60% de glucose après
136 heures de fermentation dans le milieu M-S350. Par contre elle ne métabolise pas le
saccharose.
173
L’ion ammonium NH4+, aussi appelé sel d’ammonium et azote ammoniacal ; de
synthèse chimique et peu coûteux, ce type d’apport est assimilé rapidement par Z. rouxii et
il favorise en effet leur multiplication rapide et importante. Dans notre cas, il est intéressant
d’augmenté la quantité de NH4Cl de 500 mg.L-1 à 1500 mg.L-1. L’augmentation de la
concentration initiale en NH4Cl, a permis l’augmentation de la concentration finale en
éthanol (72 g. L-1) et la productivité Q EtOH (0,99 g. L-1. h-1).
La souche isolée des sous-produits des dattes et identifiée comme étant un Bacillus
amyloliquefaciens a été capable de convertir les trois types de sucres présents dans le
milieu hyper-osmotique (glucose, fructose et saccharose) en éthanol, contrairement à Z.
rouxii qui est une souche fructophile et qui ne consomme le glucose qu’après épuisement
de milieu en Fructose . Le rendement YEtOH de B. amyloliquefaciens pour le milieu
M-S175 est 0,45 g.g-1, bien supérieure à ceux de S. cerevisiae, C. palliculosa et Z. rouxii
qui représentent respectivement 0,38, 0,29 et 0,34 g.g-1. Pour le milieu M-S350, le
rendement en éthanol de B. amyloliquefaciens est 0,31 g.g-1, inférieure à celui de Z. rouxii
(0,38 g.g-1), la seule levure qui a pu fermenter le milieu M-S350. Cette souche allochtone
est capable de se développer dans un environnement hyper-osmotique. La fermentation
VHG pour produire d’éthanol avec cette souche nous semble prometteuse pour valoriser un
substrat très riche en sucres fermentescibles.
La question suivante se pose : est-il préférable de travailler avec une souche connue
pour sa production en éthanol, S. cervisiae et une concentration en sucres totaux de 200
g.L-1 ou alors avec une souche allochtone, B. amyloliquefaciens et une concentration en
sucre totaux de 350 g.L-1. Dans le premier cas la souche impliquée est exogène, les
quantités produites en éthanol plus faible mais la quantité d’énergie apportée sera plus
faible. Il faut aussi se pose la question des quantités d’eau nécessaire au procédé
d’extraction ainsi que du devenir du résidu de la fermentation après extraction de l’éthanol
par distillation. Ce résidu pourrait-il être utilisé comme amendement pour la culture dans
les palmeraies ? Quel est l’impact d’un tel procédé sur l’environnement, est ce que des
impacts peuvent être évités ? Une analyse cycle de vie (ACV) serait intéressante pour
évaluer le procédé dans sa globalité.
174
175
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Biotechnology and Bioengineering, 26(4), 301-307.
Yokozeki, A. 2006. Osmotic pressures studied using a simple equation-of-state and its
applications. Applied Energy, 83, 15-41.
204
ANNEXES
205
LISTE DES TRAVAUX ET PUBLICATIONS
Articles soumis dans un journal scientifique international :
 CHNITI, S., DJELAL, H., HASSOUNA, M., AMRANE, A. 2014. Residue of dates
from the food industry as a new cheap feedstock for ethanol production. Biomass and
Bioenergy, 69, 66-70.
 CHNITI, S., DJELAL, H., BENTAHAR, I., HASSOUNA, M., AMRANE, A. 2014.
Optimisation de l’extraction des jus de sous-produits de dates (Phoenix dactyliphera L.)
et valorisation par production de bioethanol. Revue des Energies Renouvelables, 17(4),
529-540.
Article en cours de rédaction pour soumission dans un journal scientifique

international :
 CHNITI S., CHAABENE H., LELIEVRE Y., AMRANE A., HASSOUNA M.,
DJELAL H., Effect of nitrogen source on bioethanol production from Syrup dates by
using Saccharomyces cerevisiae.
Articles soumis dans un Congrès scientifique international :
 CHNITI S., DJELAL H ., HASSOUNA M., AMRANE A., Production de bioéthanol

et valorisation de déchets de dattes par des levures. Récents Progrès en Génie des
Procédés, Numéro 104 - 2013 ISSN: 1775-335X ; ISBN: 978-2-910239-78-7, Ed.
SFGP, Paris, France
COMMUNICATION ORALE AVEC ACTE DANS UN CONGRES INTERNATIONAL

 CHNITI, S., DJELAL, H., BENTAHAR, I., HASSOUNA, M., AMRANE, A. 2014.
Optimisation de l’extraction des jus de sous-produits de dates (Phoenix dactyliphera L.)
et valorisation par production de bioethanol, conférence Internationale des Energies
Renouvelables, CIER’13, Sousse, Tunisie.
 CHNITI S., AMRANE A., LELIEVRE Y., CHAABANE H., HASSOUNA M.,
DJELAL H. 2012. Valorisation de déchets de dattes tunisiennes : production de
bioéthanol, 2ème Colloque International sur la Maitrise de l’Energie et les Applications
des Energies Renouvelables, CIE’2012, Tozeur, Tunisie.
 CHNITI S., BENREJEB Z., CHABAANE H., HASSOUNA M., AMRANE A.,
CHAABANE H., DJELAL H., 2012, Production de bioéthanol à partir des sirops de
206
dattes Tunisiennes par des levures., 5ème Colloque International sur L’Innovation au
service de l’Environnement, CITET’, Tunis, Tunisie.
COMMUNICATIONS PAR AFFICHAGE AVEC ACTE DANS UN CONGRES

INTERNATIONAL
 CHNITI, S., AMRANE, A., HASSOUNA, M., DJELAL, H. 2013. Effect of

ammonium concentration on alcoholic fermentation kinetics by using
Zygosaccharomyces rouxii on syrup of dates. International Chemical Engineering
Congress, Djerba, Tunisie.
 CHNITI, S., AMRANE, A., HASSOUNA, M., DJELAL, H., 2013, Osmoadaptation
de la levure xérotolérante Zygosaccharomyces rouxii cultivée sur un milieu naturel à
base de sirop de dattes, Journée des Doctorants, Ecole Docotrale Siences De La
Matière » , Rennes, France.
 CHNITI, S., BENREJEB, Z., CHAABENE, H., HASSOUNA, M., AMRANE, A.,
DJELAL, H., 2012, Influence de la source d’azote sur la production de bioéthanol à
partir de déchets de dattes par Saccharomyces cerevisiae, 2ème Colloque International
sur la Maitrise de l’Energie et les Applications des Energies Renouvelables,
CIE’2012, Tozeur, Tunisie.
 CHNITI, S., AMRANE, A, HASSOUNA, M., DJELAL, H., 2012, Ethanol production
from date by-products by using yeasts, Journée des Doctorants, UR1, UMR 6226,
Rennes, France.
207
208
Résumé
Les unités de conditionnement des dattes génèrent des quantités importantes de déchets
issues des écarts de triage. Cette biomasse, considérée jusqu’alors comme un déchet avec
un impact sur l’environnement peut être transformée en produit à haute valeur ajouté. La
valorisation des sous-produits de l’industrie des dattes en biocarburant s’inscrit dans une
démarche économique et environnementale. Mais les fortes teneurs en sucres dans les
sirops de dattes induisent une forte pression osmotique qui limite la capacité fermentaire
des micro-organismes tel que Saccharomyces cerevisiae. Ceci nous a conduit à utiliser des
souches osmotolérantes comme Zygosaccharomyces rouxii et Candida Pelliculosa.
Différents essais ont été menés dans des milieux de culture à base de sirop de dattes, à
différentes teneurs en sucres, en milieu discontinue et parfaitement agité. Les essais menés
dans un milieu de culture à base de jus de dattes à 17,4 °Brix, conduisent à la production
d’éthanol aux concentrations de 63 g L-1, 41 g L-1 et 33 g L-1 respectivement pour les
levures Saccharomyces cerevisiae, Candida Pelliculosa et Zygosaccharomyces rouxii. Les
essais menés dans le milieu à 35,8 °Brix (milieu de culture se rapprochant le plus des
sirops de dattes brutes) montrent que la croissance des levures Saccharomyces cerevisiae et
Candida Pelliculosa est inhibée par la pression osmotique élevée causée par la haute
concentration en sucres. Seule la levure xérotolérante Zygosaccharomyces rouxii s’est
adaptée au milieu en produisant 55 g L-1 de bioéthanol.
La souche isolée des sous-produits de des dattes comme étant un Bacillus

amyloliquifaciens est une souche allochtone capable de se developper dans un milieu
hyper-osmotique et convertir les trois sucres (glucose, fructose et saccharose) en éthanol,
contrairement à Z. rouxii qui est une souche fructophile. Le rendement en éthanol de B.
amyloliquefaciens pour le milieu M-S175 est de 0,45 g.g-1, bien supérieur à ceux de S.
cerevisiae, C. pelliculosa et Z. rouxii qui donnent respectivemnt 0,38, 0,29 et 0,34 g.g-1.
En produisant 90 g.L-1 d’éthanol pour le milieu M-S350, B. amyloliquefaciens nous semble
prometteuse pour valoriser un substrat très riche en sucres fermentescible.
Mots-clés : Bioéthanol; Valorisation biomasse; Fermentation; Levures; Souches

osmotolérantes.
209
Abstract
Conditioning unit’s dates generate large amounts of wastage after sorting. This biomass,
previously regarded as waste product with a high impact on the environment can be
transformed into a highly valued product. The use of by-products of date fruit into biofuel
industry is a part of an environmentaly friended economic process. But high levels of
sugars in the syrups of dates induce high osmotic pressure which limits the ability of
fermentative microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae. This led us to use
osmotolerant strains, Zygosaccharomyces rouxii and Candida pelliculosa. Various tests
were conducted in culture media containing date juice at different levels in sugars, and
perfectly stirred in batch conditions. The tests performed in a culture medium based on
date juice at 17.4 ° Brix, led to the production of 63 g L-1, 41 g L-1 and 33.1 g L-1 of
ethanol for the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Candida pelliculosa and
Zygosaccharomyces rouxii, respectively. Tests conducted at 35.8 °Brix (culture medium
close to syrup raw dates) show that the growth of yeast Saccharomyces cerevisiae and
Candida pelliculosa is inhibited by high osmotic pressure caused by the high concentration
of sugars. Only the xerotolerante yeast Zygosaccharomyces rouxii is adapted to the
environment and produced 55 g L-1 of bioethanol.
The strain isolated from by-products of dates, identified as bacillus

amyloliquefaciens, is able to develop in a hyper-osmotic environment and convert the three
sugars (glucose, fructose and sucrose) into ethanol, unlike Z. rouxii which is a fructophilic
strain. The yield of ethanol for the M-S175 is 0.45 g.g-1, higher than those of S. cerevisiae,
C. pelliculosa and Z. rouxii which give respectivemnt 0.38, 0.28 and 0.34 g.g-1. By
producing 90 g.L-1 of ethanol for M-S350, B. amyloliquefaciens seems promising to
valorize a very rish substrate in fermentable sugars.
Keywords: Bioethanol; Biomass valorization; Fermentation; Yeasts; Osmotolerant strains.
210

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ANNÉE 2015

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

Optimisation de la Thèse soutenue à l’ENSCR

Mon adorable mère

Mes soeurs et mon frère

Je tiens aussi à exprimer ma profonde gratitude au Pr. Amrane ABDELTIF, pour

Je remercie Monsieur Mnasser HASSOUNA mon directeur de thèse coté Tunisien

Je tiens à remercier Mademoiselle Monia JEMNI, chercheur au Centre Régional

Je tiens à remercier Mme Hédia CHAABENE, directeur du laboratoire de

Les activités agricoles et agro-industrielles génèrent des quantités importantes de

L’agriculture oasienne qui est pratiquée intensivement dans un milieu désertique ou

En Tunisie, la phoeniciculture constitue le pivot de l’agriculture saharienne avec

Aujourd’hui, la bioconversion des sous-produits générés par la palmeraie et les

Il est intéressant de remarquer que cette biomasse, certes un sous-produit de

Les biocarburants ou agro carburants de première génération sont obtenus à partir

Ils permettent une valorisation de la totalité de la biomasse et conduisent donc à

Les microorganismes les mieux adaptés à la production d’éthanol à partir de

Le premier objectif de la thèse est d’étudier et de mettre en place un procédé qui

1 . Généralités sur le palmier dattier

Le genre Phoenix dactylifera L fait parti de la classe des Monocotylédones, d'une

· Espèce : Phoenix dactyliféra L.

C'est un grand palmier de 20 à 30 m de haut, au tronc cylindrique (le stipe),

2.1 . Le secteur dattier dans le monde

La production mondiale des dattes s’élève à environ 7,5 millions de tonnes en

Figure 1. Production mondiale des dattes (FAOSTAT, 2014).

La production des dattes en 2013 dans le monde venaient principalement de l’Asie

2.2 . Le secteur dattier en Tunisie

2.2.1 . Répartiton géographique

Figure 3. Répartition du palmier dattier en Tunisie.

 Les oasis continentales ou sahariennes situées dans les régions de Nefzaoua et

2.2.2 . Production annuelle

Le patrimoine phoenicicole tunisien se caractérise par une diversité, estimé en

Le secteur des dattes en Tunisie contribue beaucoup à l’économie régionale,

Actuellement, la Tunisie est le principal acteur sur le marché international des

La forme, la taille et la couleur des fruits varient selon la variété. Leurs

2.3.2 . Evolution physiologique de la datte

Depuis la pollinisation jusqu’à la maturation complète de la datte, on peut

 Une évolution de taille ;

A partir de cette évolution et selon la classification Irakienne on peut classer

2.3.3 . Composition chimique des dattes

2.3.3.1 . Teneur en eau

2.3.3.2 . La fraction glucidique

 Les dattes molles : L’indice « r » est inférieur à 2 ;

2.3.3.3 . Les pigments

3 . Valorisation des sous-produits de dattes

Le secteur phoenicicole fournit à chaque récolte un tonnage non négligeable de

La figure 7 illustre les différentes opérations de transformation de la datte et du noyau.

Figure 7. Opération de transformation des dattes (Estanove, 1990).

3.1.1 . Pâte de dattes

Les dattes molles et demi-molles peuvent servir à la confection de pâte. On ajoute

3.1.2 . Farine de dattes

3.1.3 . Jus de dattes

3.1.4 . Sirop de dattes

Les sous-produits de dattes riches en sucres fermenscibles, peuvent être

3.2.1 . Production de biopolymères

Le jus de dattes (sous-produits), contitue un milieu favorable pour la production

3.2.2 . Production d’acides organiques

3.2.3 . Production d’antibiotiques

3.2.4 . Production de biomasse