Libération Contrôlée Thèse PDF

Systèmes injectables biodégradables pour la libération
prolongée d’ivermectine
Javier-Andrés Camargo-Pardo
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Javier-Andrés Camargo-Pardo. Systèmes injectables biodégradables pour la libération prolongée
d’ivermectine. Médecine humaine et pathologie. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 2010. Français.
�NNT : 2010NAN10068�. �tel-01746377�
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Ecole Doctorale Biose (Biologie-Santé-Environnement)
Thèse
Présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE

Mention « Sciences de la vie et de la Santé »
Par Javier-Andrés CAMARGO
SYSTEMES INJECTABLES BIODEGRADABLES POUR LA LIBERATION

PROLONGEE D’IVERMECTINE
Soutenue le 05 Novembre 2010
MEMBRES DU JURY
Rapporteurs
M. Alf LAMPRECHT Professeur, Faculté de Pharmacie, Université de Franche-comté
M. Hatem FESSI Professeur, Faculté de Pharmacie, Université de Lyon
Examinateurs
M. Roland BODMEIER Professeur, Faculté de Pharmacie, Freie Universität Berlin
Mlle Cécile NOUVEL Maître de Conférences, ENSIC, Université de Nancy
M. Patrick FORGET Chef Projet Formulation, CEVA Santé Animal, Libourne
Mme Anne SAPIN Maître de Conférences, Faculté de Pharmacie, Université de Nancy
M. Philippe MAINCENT Professeur, Faculté de Pharmacie, Université de Nancy
EA 3452 – Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie, Faculté de Pharmacie de Nancy

5, Rue Albert LEBRUN BP 80403 – 54001 NANCY Cedex 01
1
A mes parents.
REMERCIEMENTS
Je voudrais tout d’abord remercier spécialement mon directeur de thèse le Pr.Dr. Philippe
MAINCENT pour la chance qu’il m’a offerte de travailler sous sa responsabilité, pour la confiance
qu’il m’a témoignée tout au long de mon travail, pour ses conseils scientifiques et personnels et
pour sa générosité qui m’a permis de découvrir un peu plus le monde de la recherche et de
l’industrie pharmaceutique.
Je voudrais remercier le Pr.Dr. Alf LAMPRECHT, le Pr.Dr. Hatem FESSI, le Pr. Dr. Roland
BODMEIER, le Dr. Cécile NOUVEL, le Dr. Patrick FORGET et le Dr. Anne SAPIN d’avoir
accepté l’invitation pour intégrer le jury de ce travail de thèse.
Je voudrais particulièrement remercier le Pr.Dr. Roland BODMEIER, référent scientifique

dans ma recherche, pour ses multiples conseils ainsi que pour la confiance qu’il m’a accordée en me
permettant de travailler dans son laboratoire à la Freie Universität Berlin. J’ai pu approfondir lors de
ce séjour mes connaissances au sein d’un groupe de travail très accueillant et professionnel.
Je veux rendre hommage au Dr. Nathalie UBRICH pour tous ses conseils, pour sa
participation dans la partie initiale de mon travail. Elle a su m’apprendre à lutter pour ce que nous
aimons le plus.
Je tiens aussi à remercier le Dr. Anne SAPIN d’avoir co-dirigé mon travail de thèse. Elle a
su me guider grâce à ses conseils et me transmettre ses connaissances dans la réalisation des essais
in vivo. Je suis également reconnaissant de la gentillesse qu’elle m’a exprimée.
Je remercie également le Dr. Vassilios KALSATOSE, le Dr. Florence GUIMBERTEAU et

le Dr. Patrick FORGET de la societé CEVA- Santé Animale, pour leurs apports scientifiques qui
m’ont permis d’avancer dans mon travail. Je les suis également très reconnaisant de la grande
gentillesse qu’ils m’ont exprimée.
J’aimerais également remercier le Dr. Cécile NOUVEL pour le temps qu’elle m’a dédiée
dans le cadre de la réalisation des études physico-chimiques des polymères au sein du Laboratoire
de Chimie Physique Macromoléculaire à l’ENSIC. Je lui suis reconnaissant pour son engagement,
ses explications, ses conseils ainsi que sa grande gentillesse.
Je veux également remercier le Dr. Dominique DALOZ par son aide lors des essais de
microscopie électronique à balayage réalisés sous sa direction à l’Ecole des Mines de Nancy. Son
engagement dans mon travail, sa patience, sa grande gentillesse et ses conseils m’ont été précieux.
Je voudrais aussi exprimer ma gratitude au Pr.Dr. Isabelle LARTAUD, au Pr.Dr. Pierre

LEROY, au Dr. Christiane DAMGE et au Dr. François BONNEAUX membres de l’EA 3452, qui
m’ont prodigué de précieux conseils pour le développement de mon travail de thèse. Je leur suis très
reconnaissant pour leur gentillesse et disponibilité.
Je suis également reconnaissant du temps accordé par le Dr. Martin KÖRBER pour
l’encadrement de mon stage au Laboratoire de Pharmacie Galénique de la Freie Universität Berlin.
Je le remercie pour sa gentillesse et pour ses conseils scientifiques de grande valeur.
Je voudrais aussi remercier le Dr. Jean-Luc SIX ainsi que le Dr. Michelle LEONARD du
Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire à l’ENSIC, pour le temps qu’ils ont dédié à la
discussion de mes résultats ; je suis également très reconnaissant pour leur sympathie.
Je tiens à remercier le Pr.Dr. Milaslava RABIŠKOVÁ pour ses conseils scientifiques et

personnels, pour les bons moments que nous avons partagés pendant ses séjours en France et pour
sa très grande gentillesse et humanité.
Je voudrais remercier les secrétaires du laboratoire, Melle Pascale CARNET et Mme

Géraldine REPEL, ainsi que les techniciens, M. Patrick LIMIÑANA, Cristophe MOTT et Mme
Marie-Christine GRASSIOT, pour leur grande efficacité, leur gentillesse et leur aide continue.
Je veux exprimer ma gratitude à toutes les personnes que j’ai eu la chance de rencontrer tout
au long de ma thèse soit au laboratoire, soit durant mes stages. J’adresse ainsi mes remerciements
particulièrement à Lucie JAVOT, Julien SCALA-BERTOLA, Ahmed SHEIKH-HASAN,
Housamm EIDI, Myriem GARGOURI, Juliana PEGO, Marc MUCHOW, Marie SOCHA, Eliza
GLOWKA, Yohana MOTTA, Charlotte DUVAL, Cristina LOIRA, Ariane BOUDIER et Olivier
JOUBERT.
Je voudrais dédier spécialement quelques lignes à mes amis Lucie JAVOT et Julien
SCALA-BERTOLA qui m’ont offert leur amitié sincère depuis mon arrivée en France et avec
lesquels j’ai pu avoir des discussions scientifiques très riches mais aussi partager des expériences de
vie qui ont bâti notre amitié. Je vous remercie pour votre soutien et pour les bons moments vécus
ensemble.
Je ne peux pas finir mes remerciements sans adresser ma profonde gratitude à mon cher
frère Mauricio CAMARGO et à Laure MOREL, qui ont toujours été à mes côtés pour me montrer
le chemin, pour m’encourager, pour me soutenir et pour me donner des conseils. Ceci a eu pour moi
une valeur inestimable. Je leur exprime toute mon affection et tendresse.
Enfin, mais de tout mon cœur, je remercie à ma chérie Julie KARMANN pour sa tendresse,
pour son aide et pour sa compréhension dans les moments difficiles, merci d’être toujours là.
TABLE DES MATIERES
1 INTRODUCTION....................................................................................................................15
2 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE..............................................................................................20
2.1 Introduction..........................................................................................................................20
2.1.1 Marché mondial des produits vétérinaires .....................................................................20
2.1.2 Défis et considérations dans le développement des produits vétérinaires .....................21
2.2 Parasitoses et Ivermectine...................................................................................................23
2.2.1 Les parasitoses chez l’animal.........................................................................................23
2.2.2 Chimiothérapie des parasitoses......................................................................................25
2.2.2.1 Les lactones macrocycliques (avermectines).............................................................26
2.2.2.2 Optimisation galénique des traitements parasitaires..................................................30
2.3 Les différentes possibilités d’optimisations galéniques ....................................................31
2.3.1 Le système de classification biopharmaceutique (BCS)................................................33
2.3.2 Polymères biodégradables pour la libération prolongée des principes actifs ................36
2.3.2.1 Synthèse des polymères d’acide lactique et/ou glycolique........................................39
2.3.2.2 Dégradation et érosion des polymères d’acide lactique et/ou glycolique..................41
2.3.2.3 Mécanisme de libération des principes actifs à partir des polymères d’acide lactique
et/ou glycolique..........................................................................................................................47
2.3.3 Systèmes implantables biodégradables..........................................................................48
2.3.3.1 Systèmes préformés ...................................................................................................48
2.3.3.1.1 Implants monolithiques........................................................................................49
2.3.3.1.2 Microparticules ....................................................................................................50
2.3.3.1.2.1 Obtention par émulsion et évaporation/extraction de solvant.......................53
2.3.3.1.2.1.1 Simple émulsion (O/W) .........................................................................53
6
2.3.3.1.2.1.2 Double émulsion (W/O/W)....................................................................57
2.3.3.1.2.2 Obtention par séparation de phases (coacervation).......................................58
2.3.3.1.2.3 Obtention par séchage par dispersion (« spray drying »)..............................59
2.3.3.2 Systèmes in situ..........................................................................................................61
2.3.3.2.1 Implants in situ (ISI) ............................................................................................61
2.3.3.2.1.1 Pâtes thermoplastiques..................................................................................61
2.3.3.2.1.2 Systèmes polymériques de réticulation in situ..............................................62
2.3.3.2.1.2.1 Thermosets.............................................................................................62
2.3.3.2.1.2.2 Gels ion – réticulés.................................................................................65
2.3.3.2.1.3 Systèmes de gélification in situ par température .......................................65
2.3.3.2.1.4 Cubosomes in situ .........................................................................................66
2.3.3.2.1.5 Systèmes in situ par précipitation .................................................................67
2.3.3.2.1.5.1 Systèmes par précipitation pH dépendante ............................................67
2.3.3.2.1.5.2 Systèmes par précipitation-extraction dépendante.................................68
2.3.3.2.1.5.2.1 Systèmes non polymériques............................................................68
2.3.3.2.1.5.2.2 Systèmes polymériques...................................................................70
2.3.3.3 Microparticules in situ (ISM).....................................................................................78
2.3.3.3.1 ISM par coacervation...........................................................................................78
2.3.3.3.2 ISM par extraction de solvant ..............................................................................79
2.4 Caractérisation physicochimique et comportement des polymères en solution.............81
2.4.1 Paramètres de solubilité .................................................................................................82
2.4.2 Viscosité des polymères en solution ..............................................................................85
3 TRAVAIL EXPERIMENTAL................................................................................................89
3.1 Objectifs ................................................................................................................................89
7
3.2 Microparticules biodégradables pour la libération prolongée d’ivermectine et destinées
à la voie parentérale: caractérisation in vitro et effet de quelques variables de formulation ...90
3.3 Implants injectables de formation in situ à base de PLA pour la libération contrôlée
d’un principe actif BCS classe II: sélection du solvent à partir d’une caractérisation physico-
chimique..........................................................................................................................................118
3.4 Systèmes biodégradables d’administration parentérale pour la libération prolongée
d’ivermectine: comparaison in vitro et in vivo .............................................................................147
4 DISCUSSION GENERALE..................................................................................................172
4.1 Contexte ..............................................................................................................................172
4.2 Conception des systèmes de libération.............................................................................172
4.3 Etudes de préformulation et formulation ........................................................................173
4.4 Toxicité cellulaire ...............................................................................................................181
4.5 Etudes in vivo .....................................................................................................................182
4.5.1 Libération in vivo et biodiponibilité ............................................................................182
4.5.2 Douleur et injectabilité des formes proposées .............................................................183
4.6 Perspectives.........................................................................................................................185
5 CONCLUSION.......................................................................................................................188
6 BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................................190
8
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 Quelques produits commerciaux à libération prolongée d’administration parentérale à

base de PLA ou PLGA.......................................................................................................................38
Tableau 2. Paramètres pharmacocinétiques d’IVM pour des différents types de formulations
injectées chez le rat. .........................................................................................................................161
Tableau 3. Propriétés physico-chimiques modifiant la libération d’IVM à partir des ISI...............176
Tableau 4. Niveaux de douleur observés chez les rats lors de l’administration des différentes
formulations .....................................................................................................................................184
Tableau 5. Injectabilité apparente des formulations chez le rat.......................................................184
9
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Marché vétérinaire mondial par région en 2008.................................................................20

Figure 2. Marché vétérinaire mondial par segment thérapeutique en 2008.......................................21
Figure 3. Cycle de vie du « ver du cœur » (AHS, 2010). ..................................................................24
Figure 4. Vers du cœur dans des chiens infestés ; artère pulmonaire (gauche) et cœur (droite) (AHS,
2010). .................................................................................................................................................25
Figure 5. Structure chimique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009)..................................27
Figure 6. Mécanisme d’action des avermectines (dont l’ivermectine) (Omura, 2008). ....................28
Figure 7. Pharmacocinétique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009)..................................30
Figure 8. Représentation du système de classification biopharmaceutique (BCS) (Pouton, 2006)...33
Figure 9. Niveaux systémiques obtenus à partir de formes à libération immédiate (gauche) et
prolongée (droite)...............................................................................................................................35
Figure 10. Biodégradation des copolymères d’acide lactique/glycolique (PLGA). ..........................39
Figure 11. Synthèse de PLGA par ouverture de cycle à partir des lactones cycliques des monomères
............................................................................................................................................................40
Figure 12. Changements physiques subis dans une matrice polymérique suite à une dégradation
dans la masse ou à la surface (Burkersroda et al., 2002) ...................................................................43
Figure 13. Demi-vie chez le rat des implants à base des homopolymères de PLA et PGA et de leurs
copolymères de PLGA (Miller et al., 1977).......................................................................................45
Figure 14. Importance de la taille sur l’effet « autocalytique » lors de la dégradation de
microparticles à base des polyesters d’acide lactique et/ou glycolique. Les régions sombres au
centre des cercles représentent le micro-pH acide à l’intérieur du système (région claire: pH neutre ;
région foncée: pH faible) (Klose et al., 2008)...................................................................................46
Figure 15. Dispositifs pour l’administration d’implants. Pistolet Ralgro Gun (Intervet Schering-
Plough) (gauche) et trocart KangYou (Hangzhou Kangyou Medical Equipment Co., Ltd.). .........49
10
Figure 16. Méthodes les plus utilisées pour l’obtention de microparticules (Mundargi et al., 2008).
............................................................................................................................................................52
Figure 17. Principales étapes suivies lors de la préparation de microparticules biodégradables par la
méthode d’émulsion (O /W) / évaporation de solvant. ......................................................................54
Figure 18. Classification des dépôts in situ en fonction des mécanismes participant dans leur
formation............................................................................................................................................64
Figure 19. Structure cubique tridimensionnelle de la phase cristalline glycerilmonooleate – eau
(Shah et al., 2001). .............................................................................................................................67
Figure 20. Structure chimique de l’acétate isobutirate de Saccharose (SAIB) (Okumu et al., 2002).
............................................................................................................................................................68
Figure 21. Dispositif utilisé pour l’émulsification de phases avant l’injection chez le patient. ........79
Figure 22. Phénomène d’inversion de phases lors de l’obtention de ISM ; (A) Injection de
l’émulsion (O/O) ou (O/W) dans le milieu aqueux ou les tissus (B) diffusion du solvant
biocompatible et vers le milieu extérieur (C) précipitation des ISM. ( ) phase polymérique interne,
( ) phase externe, ( ) ISM, ( ) milieu aqueux extérieur..................................................................80
Figure 23. Régimes de concentration des solutions polymériques (Teraoka, 2002). ........................85
Figure 24. Principales propriétés physico-chimiques d’IVM à prendre en compte pour la
formulation.......................................................................................................................................173
Figure 25. Profils de libération d’IVM à partir d’ISI réalisés en utilisant trois polyesters et trois
solvants différents ; (A) NMP, (B) 2P et (C) TA.............................................................................177
Figure 26. Profils de libération d’IVM à partir d’ISM réalisés en utilisant trois solvants et trois
polymères différents ; (A) PLGA H, (B) PLGA S et (C) PLA S.....................................................179
Figure 27. Toxicité des solvants biocompatibles utilisés dans les formulations in situ sur des
macrophages alvéolaires de rat NR8383 par la méthode du MTT. Les données correspondent à la
moyenne ± écart type. ( =8). ...........................................................................................................181
n
11
LISTE DES ABREVIATIONS
IVM : Ivermectine
2P : 2- pyrrolidone
BCP : Biocompatible
BSA : Sérum albumine bovine (bovin serum albumin)
CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance
DD: Dosage direct
DDS : Dodecyl sulfate de sodium
DDS : Système de délivrance de médicament (Drug Delivery System)
DI : Dosage indirect
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DRX : Diffraction de Rayons X
DSC: Calorimétrie différentielle à balayage
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique
EMEA: Agence européenne des médicaments
FDA: Food and Drug Administration
GnRH : Gonadolibérine
HSP : Paramètres de solubilité d’Hansen
I.M: Intra musculaire
ISI: Implantsin situ
ISM : Microparticules « in situ »
LH-RH : Gonadoréline
Log :
P Coefficient partage octanol / eau
MEB : Microscopie électronique à balayage
NMP : N-méthyl-2-pyrrolidone
O/O : Emulsion huile dans huile (oil in oil)
O/W : Emulsion huile dans l’eau (oil in water)
PCL : Poly-ε-caprolactone
PDE: Permitted daily exposure
PEG : Polyethyleneglycol
12
PLA : Polymère d’acide lactique
PLGA : Copolymère d’acide lactique et glycolique
PP : Polypropylene
PVA : Alcool polyvinylique
CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance
SAIB : Acétate isobutirate de saccharose
SC: Sous-cutanée
Span 80 : Sorbitan monooleate
TA : Triacetine
Tg : Température de transition vitreuse
Tween® 80 : polyéthylène glycol sorbitan monooleate
UV: Ultra violet
W/O : Emulsion eau dans l’huile (water in oil)
13
1. INTRODUCTION
14
1. Introduction
1 INTRODUCTION
Dans le domaine vétérinaire, la pharmacothérapie des parasitoses a une importance majeure en

raison des problèmes économiques que la persistance de cette maladie entraîne (Ahmed and
Kasraian, 2002; Winzenburg et al., 2004). En effet, les parasitoses frappent différentes espèces y
compris les animaux de la ferme et les animaux de compagnie. Dans le premier cas, l’impact
économique des infestations parasitaires est important, ayant comme conséquence directe une
diminution de la productivité alimentaire. En ce qui concerne les animaux de compagnie, les frais
investis par les maîtres pour le traitement des parasitoses sont de plus en plus importants, dus aux
étroites relations qu’ils établissent avec leurs animaux. Cependant, l’éradication des parasites oblige
une pharmacothérapie pendant de longues périodes de temps (mois voire années) ce qui entraîne des
efforts considérables. Par exemple, les traitements médicamenteux doivent être administrés
fréquemment et la probabilité qu’ils échouent est élevée car le respect des thérapies peut être
facilement abandonné. D’autre part, l’administration des médicaments antiparasitaires, souvent par
voie orale, est confrontée aux contraintes d’absorption des principes actifs antiparasitaires de faible
biodisponibilité et aux différences d’absorption interespèces (Martinez et al., 2002a; Martinez et al.,
2002b).
Ainsi, dans le domaine vétérinaire, le développement de médicaments antiparasitaires injectables à

libération prolongée est d’une importance majeure notamment dans le traitement des parasitoses,
qui constituent le problème de santé le plus fréquent chez l’animal. En effet, lorsqu’un médicament
est conçu sur la base d’une formulation libérant très rapidement le principe actif, il doit être
administré à des doses élevées et à des fréquences relativement importantes pour combattre la
maladie. Cette pratique entraîne fréquemment des effets indésirables chez l’animal (patient) et un
contrôle inefficace de la pharmacothérapie. Ainsi, le développement de médicaments permettant la
1. Introduction
libération prolongée et contrôlée des principes actifs, a suscité un vif intérêt durant les 50 dernières
années (Hoffman, 2008).
La principale méthode utilisée pour l’obtention d’une libération contrôlée, a été l’incorporation du
principe actif dans des polymères (par exemple biopolymères) (Wise, 2000). Lors des premiers
travaux réalisés afin d’obtenir la libération prolongée de principes actifs administrés par la voie
parentérale, des polymères non-biodégradables tels que le silicone ont été utilisés pour la fabrication
d’implants préformés (Folkman and Long, 1964; Folkman et al., 1966). Bien que compatibles et
efficaces, ces polymères présentent l’inconvénient de devoir être retirés du patient par des
procédures chirurgicales, une fois la thérapie terminée. Néanmoins, l’introduction des polymères
biodégradables dans le domaine biomédical a surmonté cette problématique. Une fois administrés,
ces polymères sont dégradés dans l’organisme libérant ainsi le principe actif qu’ils « contiennent ».
Parmi les polymères biodégradables, les polyesters de l’acide lactique et/ou glycolique (PLA et
PLGA) sont les plus répandus en raison de la sécurité que leur utilisation entraîne (Anderson and
Shive, 1997). De plus, en fonction du polymère choisi, la libération du principe actif peut être
prolongée pendant de longues périodes de temps, facilitant ainsi la thérapie des maladies
chroniques.
Plusieurs systèmes parentéraux à libération prolongée tels que des implants et des microparticules
ont été conçus en utilisant les polymères de l’acide lactique et / ou glycolique. De même, des
méthodes de fabrication différentes ont été utilisées pour la mise en forme de ces systèmes. Les
implants, peuvent, par exemple, être obtenus par compression puis administrés chez le patient par
des procédures chirurgicales, ce qui constitue une limite certaine à leur utilisation (Hatefi and
Amsden, 2002). Au contraire, les microparticules peuvent être préparées par diverses méthodes,
puis injectées chez le patient suite à leur suspension dans un véhicule approprié. Cependant, la
1. Introduction
fabrication de microparticules par les méthodes classiques est difficile à transposer au niveau
industriel, coûteuse et soumise à des contraintes de toxicité à cause des solvants utilisés.
Comme alternative aux problèmes liés à l’utilisation des systèmes préformés, des nouvelles
méthodes dites de formation in situ , pour la préparation d’implants (Dunn et al., 1990) et de
microparticules (Bodmeier, 1998), ont été développées. Par ces méthodes, les systèmes de libération
sont préparés extemporanément, comme des « liquides », et lors de leur injection chez le patient, le
contact avec les fluides corporaux induit la précipitation du polymère et l’obtention du système
« solide » souhaité.
Ainsi, ces travaux de thèse ont eu pour objectif l’obtention d’implants et de microparticules in situ à
base des polyesters de l’acide lactique et/ou glycolique pour l’administration parentérale et la
libération prolongée d’ivermectine (IVM), un antiparasitaire de faible biodisponibilité orale. Ces
systèmes de formation in situ ont été développés, caractérisés par des études in vitro et in vivo et
comparés aux microparticules préformées obtenues par la méthode classique d’émulsion simple -
évaporation du solvant. Ce travail de thèse est donc organisé de la manière suivante : i) une revue
bibliographique (chapitre 2) permettant une meilleure compréhension de la problématique abordée
et présentant les principaux systèmes in situ existants, ii) une partie expérimentale (chapitre 3)
expose alors les résultats des travaux de recherche réalisés au laboratoire. Le chapitre 3 comprend
tout d’abord un rappel des objectifs du travail, puis une publication portant sur l’obtention de
microparticules par la méthode d’émulsion simple / évaporation du solvant (section 3.2). Une autre
publication concernant le choix des solvants biocompatibles pour l’obtention des implants in situ
(section 3.3) est alors présentée. Enfin, l’étude de la libération in vitro et in vivo d’IVM à partir de
microparticules in situ est exposée dans la section 3.4. La comparaison des microparticules
obtenues in situ par rapport aux implants permet mieux comprendre les inconvénients et les
avantages de chacun des systèmes, iii) Le document se termine par une discussion générale
(chapitre 4), contenant les aspects les plus importants pour le développement des systèmes étudiés,
et contenant certains résultats non discutés précédemment mais utiles pour une compréhension
globale de la problématique exposée. Des perspectives et une conclusion sont enfin proposées.
18
2. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2. Etude bibliographique
2 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.1 Introduction
2.1.1 Marché mondial des produits vétérinaires
Le marché mondial des produits pour la santé animale (vétérinaires) a été de 19,2 milliards de
dollars (M$) en 2008, Pfizer, ISP et Merial étant les laboratoires pharmaceutiques leaders dans ce
secteur. D’un point de vue géographique, 65 % de ce total est détenu par l’Amérique du nord (6,3
M$) et l’Europe de l’ouest (6,2 M$) (Figure 1). Les produits anti-parasitaires et les vaccins ont
participé à ce marché à hauteur de 28% et 25% respectivement (Figure 2). Pour l’année 2014 un
chiffre global d’affaires de 24,1 M$ est attendu, soit une croissance estimée d’environ 5% par an
(Merck-Sanofi-Aventis, 2010).
4,8%
32,8%
Extrême-orient
32,3% Europe de l'est

Europe de l'ouest
Rest du monde
Amerique du Nord
Amerique Latine
12,0%
2,4%
15,6%
Figure 1. Marché vétérinaire mondial par région en 2008.
20
Anti-parasitaires
Anti-infectieux
Vaccins
13,0%
16,0% Additifs alimentaires
Autres médicaments
25,0%
28,0%
18,0%
Figure 2. Marché vétérinaire mondial par segment thérapeutique en 2008.
2.1.2 Défis et considérations dans le développement des produits vétérinaires

L'industrie pharmaceutique vétérinaire est confrontée d’une certaine manière aux mêmes défis de
formulation que l’industrie pharmaceutique humaine. Néanmoins, la diversité d’espèces et de races,
la différence de poids, les différences entre les régions, les différences métaboliques et biologiques
entre les animaux, compliquent les stratégies des formulations vétérinaires. Parmi les inconvénients
interespèces, représentant un problème pour la conception et pour la performance des formulations,
on peut citer : i) les différences d’ADME (absorption, distribution, métabolisme et élimination), ii)
les habitudes alimentaires, iii) l’environnement, iv) l’âge et v) le comportement. Par exemple, la
vitesse d’absorption de la kanamycine chez le cheval est six fois plus rapide que chez le chien suite
à son administration intramusculaire (Ahmed and Kasraian, 2002). Bienque plusieurs problèmes de
formulation des produits pour les animaux de compagnie et de ceux pour le bétail soient similaires,
les implications thérapeutiques et de sûreté peuvent diverger. A titre d’exemple, la douleur et le
gonflement liés à l’administration d’une formulation injectable pour un animal de compagnie peut
engendrer un problème d’acceptabilité pour son maître, tandis que pour le bétail le problème le plus
important peut être lié à l’endroit de l’injection et aux résidus restant dans les tissus et l’organisme
de l’animal suite à l’administration du médicament. Concernant les médicaments parentéraux, les
21
produits à libération prolongée sont préférés pour des raisons liées au coût suite à des moindres
manipulations du produit et au suivi du traitement qui est alors plus facilement respecté. Cependant,
les produits injectables à libération prolongée sont plus difficiles à développer et les options
technologiques plus limitées, spécialement dû aux contraintes de prix. La viscosité des produits est
souvent un obstacle pour leur administration chez le bétail, nécessitant l’utilisation de pistolets
d’injection. De plus, les résidus et la douleur lors de l’administration sont plus importants lorsque
des produits hautement concentrés sont administrés. Le problème des résidus n’est pas seulement
issu du principe actif lui-même mais concerne aussi les excipients choisis lors de la formulation. Ce
problème limite donc le choix des technologies et des excipients qui sont appropriés pour la
formulation d’injectables à libération prolongée.
De plus, l’utilisation de plusieurs technologies de libération contrôlée est limitée à des principes
actifs agissant à faible dose. Ainsi, la formulation et les nouvelles technologies de libération de
principes actifs hautement efficaces, stables et libérant de façon prolongée le principe actif, sont
intéressantes car elles peuvent permettre d’augmenter la satisfaction du patient, de faciliter le
traitement et d’améliorer la performance commerciale de produits. Par exemple, l’utilisation de
formulations à libération prolongée à base d’implants peut être une bonne alternative dans les
traitements à long terme pour les animaux de compagnie par rapport à l’utilisation de comprimés
oraux où le goût du produit joue un rôle très important dans l’administration du médicament. De la
même façon, ces systèmes représentent une alternative aux problèmes que l’utilisation de la voie
orale entraîne tels que i) la perte de la dose à administrer, ii) la fermeture de la cavité esophagique
iii) les effets du flux digestif et iv) les problèmes de biodisponibilités orales propres des principes
actifs. De plus, ces systèmes seraient particulièrement adaptés aux traitements nécessitant la
libération du principe actif pendant de longues périodes (mois voire années) telles que les
parasitoses, les infections bactériennes et les traitements hormonaux. D’autre part, l’utilisation de
22
matériaux biodégradables pour la formulation des implants et la possibilité de réaliser leur

administration par des voies autres que des procédures chirurgicales ou de l’usage des pistolets,
sont quelques uns des besoins du secteur de la santé animale. Ainsi, l’utilisation de systèmes
microparticulaires biodégradables pouvant être injectés avec des seringues conventionnelles peut se
révéler d’une grande utilité dans les thérapies animales (Ahmed and Kasraian, 2002; Sun et al.,
2004)
2.2 Parasitoses et Ivermectine

2.2.1 Les parasitoses chez l’animal
Les parasitoses représentent un important problème de santé autant pour les animaux agricoles et
domestiques, que pour l’homme. La contamination humaine peut avoir lieu à cause de l’étroite
relation entre l’homme et l’animal, soit en tant que source d’alimentation, soit en raison de leur
proximité comme dans le cas des animaux de compagnie (zoonose). De ce fait, les frais associés
aux maladies parasitaires ne correspondent pas exclusivement à ceux des traitements vétérinaires
mais aussi à ceux issus des pertes économiques du secteur agroindustriel ainsi qu’à ceux des
parasitoses humaines dérivées de la consommation de produits contaminés. Par exemple,
l’infestation des vaches laitières pour des ectoparasites tels que les puces, les mouches, les tiques
et/ou les mites peut conduire à la perte de poids des animaux et à une moindre production de lait ce
qui amène à une faible productivité (Winzenburg et al., 2004).
L’une des parasitoses animales la plus problématique, est la dirofiliariose cardiovasculaire. Cette
pathologie potentiellement mortelle, est issue de l’infestation pour le parasite Dirofilaria immitis
populairement connu comme le « ver du cœur » (Heartworm), des artères pulmonaires et du cœur
d’un animal hôte. Ce nématode est transmis par la piqûre d’un moustique vecteur à plusieurs
espèces de mammifères y compris les loups, les renards, les furets, les lions de mer et rarement à
23
l'homme (FDA, 2005). Cependant les chiens et les chats de toutes races ou âges, habitant dans des
régions chaudes ou tropicales où la population de moustiques est importante, sont spécialement
sensibles à cette infestation. A titre d’exemple, on peut citer des études épidémiologiques dans
certaines régions des Etats-unis et de l’Italie, montrant une prévalence du « ver du cœur » jusqu’à
70% chez le chien (McTier et al., 2000). De ce fait, l’infestation avec le « ver du cœur » est
considérée comme un problème clinique mondial (FDA, 2005).
Figure 3. Cycle de vie du « ver du cœur » (AHS, 2010).
Le cycle d’infestation (Figure 3) commence avec la libération dans le sang de l’animal hôte, des
microfilariaes (forme primaire du parasite), par une femelle adulte du parasite. Le moustique
devient infecté par la microfilariae lors de la piqûre des animaux alors qu’il se nourrit de leur sang.
Pendant les 10-14 jours suivants, la microfilariae mature à l’intérieur du moustique jusqu’à devenir
une larve. Dès lors, le moustique va introduire la larve dans un nouvel animal sensible à chaque
nouvelle piqûre. Une fois chez l’animal, la larve devient un ver adulte au bout de 6-7 mois. Il est
important de remarquer que la microfilariae ne peut pas devenir un ver adulte sans être passée
24
préalablement par le moustique. Les chiens qui viennent d’être infestés peuvent ne pas avoir de
signes de la maladie, alors que ceux fortement infestés peuvent éventuellement avoir des signes
cliniques tels qu’une toux persistante, une réticence à se déplacer ou à faire de l'exercice, une
fatigue après un exercice modéré, une réduction de l'appétit et une perte de poids.
L’infestation par le « ver du cœur » de chiens apparemment sains, est couramment détectée par des
tests sanguins ou par des antigènes spécifiques soit du ver soit de la microfilariae. Cependant, les
test ne sont complètement positifs que sept mois après l’infestation. L’infestation par ce parasite,
peut aussi éventuellement être détectée par des images d’ultrason et / ou des rayons- x du cœur ou
des poumons. La probabilité d’acquérir le parasite sans un traitement prophylactique, dépend de
l’exposition au moustique. Néanmoins, il existe un risque de thromboembolisme et donc de mort de
l’animal lors du traitement contre les vers adultes lorsqu’ils se détachent de leur emplacement dans
le cœur droit de l’animal (FDA, 2005) (Figure 4). D’autre part, il peut aussi avoir des risques liés
aux effets indésirables des médicaments utilisés pour le traitement.
Figure 4. Vers du cœur dans des chiens infestés ; artère pulmonaire (gauche) et cœur (droite) (AHS, 2010).
2.2.2 Chimiothérapie des parasitoses

Depuis les années 1960, des molécules telles que les benzimidazoles (par exemple, levamisole,
pyrantel et morantel) ont été utilisées de différentes manières par les vétérinaires afin d’optimiser le
contrôle des nématodes chez le bétail et chez les animaux de compagnie. Cependant, l’apparition au
25
milieu des années 70 des lactones macrocycliques, avec une puissance plus élevée et un spectre plus
large, a conduit à un contrôle plus efficace des parasites (Geary, 2005).
2.2.2.1 Les lactones macrocycliques (avermectines)

La prophylaxie contre les parasites a été transformée dans les derniers 25 ans grâce à l’introduction
des lactones macrocycliques (McTier et al., 2000; Omura, 2008). Ces composés sont des produits
naturels de fermentation de bactéries vivant dans le sol appartenant au genre Streptomyces. Ils
possèdent une large marge d’activité contre des parasites internes (endo parasites) et externes (ecto
parasites) tels que les nématodes (y compris le ver du coeur) et les arthropodes, respectivement. Les
lactones macrocycliques comprennent deux groupes principaux : les avermectines et les
milbemycines (FDA, 2005). Les avermectines comprennent principalement l’ivermectine,
l’abamectine, la doramectine, l’éprinomectine et la sélamectine. Au groupe des milbemycines
appartiennent la moxidectine, la némadectine et la milbémycine-oxime (Houdré, 2003; Lifschitz et
al., 2004). Les lactones macrocyclicles approuvées chez le chien sont l’ivermectine, la moxidectine,
la milbémycine-oxime et la sélamectine. Parmi les signes de toxicité des lactones macrocycliques
chez les mammifères on peut citer : des pupilles dilatées, des vomissements, de la diarrhée, de la
salivation, une désorientation, une manque de coordination, des contractions musculaires, des
tremblements, de la dépression et du coma (FDA, 2005). De ce fait, l’un des antiparasitaires les plus
utilisés est l’ivermectine en raison de son large spectre d’action associé à une marge de sécurité
importante (Gokbulut et al., 2006).
L’ivermectine (IVM) a été la première lactone macrocyclique découverte et la première à être

commercialisée. Cette molécule produite par Streptomyces avermectilis a été découverte par
laboratoires Merck au milieu des années soixante-dix dans le cadre de son programme de
« screening » (Geary, 2005). L’IVM correspond à un mélange de deux composants, l’IVM B1a et
l’IVM B1b. L’ IVM B1a représente 80% du produit et l’ IVM B1b correspond au 20% restant
26
(Gonzalez Canga et al., 2009). L’ IVM, comme les autres avermectines, possède un seul
groupement pharmacophore responsable de son activité thérapeutique. Il s’agit d’une chaîne
macrocyclique principale de 16 atomes à laquelle une fonction benzofurane et une fonction
spiroketale sont liées. L’ IVM possède également une fraction de sucre connue sous le nom de
bisoleandrosyloxy dans le carbone C-13 (Figure 5).
Figure 5. Structure chimique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009).
L’ IVM bloque la neurotransmission en interférant avec la synapse neuromusculaire (Figure 6). En

effet, le pharmacophore de l’ IVM possède une forte affinité pour les canaux chlorures glutamate-
dépendants présents dans les cellules nerveuses et musculaires lesquelles sont communes dans les
nématodes et dans les arthropodes. Sa fixation sur ces canaux, favorise une augmentation de la
perméabilité membranaire aux ions chlorures entraînant une hyperpolarisation de la cellule
27
nerveuse ou musculaire. Il en résulte une paralysie des muscles pharyngés et somatiques pouvant
entraîner la mort du parasite. Chez les vertébrés, l’ IVM stimule la libération de l’acide gamma
amino butyrique (GABA) au niveau des neurones du cerveau cependant, grâce à la barrière hémato-
encéphalique le principe actif est très sûr pour les mammifères (Omura, 2008).
Figure 6. Mécanisme d’action des avermectines (dont l’ivermectine) (Omura, 2008).
Depuis son introduction en 1981, de nombreuses études pharmacocinétiques sur l’ IVM ont été
réalisées. Le principe actif peut être administré par la voie orale, intramusculaire (IM), sous-cutanée
(SC) ou topique en fonction des espèces animales ciblées (Figure 7). Les propriétés
pharmacocinétiques dépendent de la dose qui est généralement entre 200 et 500 µg/kg. De ce fait, la
biodisponibilité augmente de façon linéaire avec la dose administrée. La voie d’administration et la
28
formulation affectent fortement la pharmacocinétique de l’ IVM. La biodisponibilité la plus grande

pour l’ IVM est obtenue par injection sous-cutanée (Gonzalez Canga et al., 2009). L’administration
parentérale retarde l’absorption d’IVM par rapport à la voie orale cependant, elle fournit une
biodisponibilité plasmatique globale plus élevée, une prolongation de l’activité et une efficacité
supérieure. Bien qu’elle soit un principe actif de classe II selon le système de classification
biopharmaceutique (BCS) (Takano et al., 2006)(voir chapitre 2.3.1), donc avec une bonne
perméabilité gastrointestinale, la faible solubilité dans l’eau de l’IVM (4µg/mL) (Gonzalez Canga et
al., 2009) associée à une fixation aux aliments au niveau intestinale (Gokbulut et al., 2006) et la
prise en charge par la glycoprotéine d’efflux P intestinale (Gonzalez Canga et al., 2009), expliquent
que sa biodisponibilité orale soit faible et variable entre les différentes espèces animales. En raison
de sa lipophilicité élevée (Log = 3,22) (Loffler and Ternes, 2003), l’IVM se distribue largement
P
dans tout l’organisme dans toutes les espèces. De plus, elle s’accumule dans le tissu gras, lequel agit
à son tour comme un réservoir du principe actif. L’IVM est fortement liée à l’albumine et aux
protéines plasmatiques. D’autre part, ce principe actif est peu métabolisé. Les principaux
métabolites de l’IVM trouvés chez le rat, le mouton et les bovins sont le 24-OH-H2B1a et le 24-OH-
H2B1b. De ce fait, la plupart de la dose administrée est éliminée sans aucun changement. L’IVM est
principalement éliminée dans les fèces (>90%) pour toutes les espèces indépendamment de la voie
d’administration. Seulement environ 2% de l’IVM administrée sont éliminés dans l’urine. Puisque
la glycoprotéine P est aussi présente dans les canaux biliaires, ceci peut contribuer à un fort degré
d’excrétion fécale de l’IVM. Elle peut aussi être éliminée par les glandes mammaires chez les
vaches laitières, les ovins et les caprins du fait de sa haute lipophilicité. Suite à une administration
intraveineuse, la demi-vie plasmatique de l’IVM est plus longue dans les espèces ruminantes que
dans les espèces monogastriques. L’excrétion de l’IVM est aussi affectée par la formulation étant
plus faible lorsque le principe actif est formulé dans un véhicule non aqueux que dans un véhicule
aqueux (Gonzalez Canga et al., 2009).
29
Figure 7. Pharmacocinétique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009).
2.2.2.2 Optimisation galénique des traitements parasitaires

Depuis sa découverte, l’IVM a été formulée de différentes manières et sous différentes formes
pharmaceutiques afin de combattre les parasitoses vétérinaires. De ce fait, les formulations sur le
marché comprennent des formes classiques telles que des solutions pour l’application externe
« pour-on » (Ivomec Pour-On), des comprimés à croquer (Heartgard-30), des pâtes à usage oral
(Noramectin) et des solutions injectables (Ivomec 1%). Cependant, ces formulations doivent être
administrées régulièrement, ce qui constitue un problème, particulièrement dans le cas des animaux
30
de compagnie, où l’oubli d’une administration du médicament est plausible. De plus, les produits
doivent être correctement administrés, ce qui peut être problématique pour certains maîtres. Dans le
cas des produits administrés par voie orale, il existe aussi la probabilité qu’ils soient crachés ou
vomis par l’animal. En ce qui concerne le traitement contre le « ver du cœur » l’oubli d’une dose
pendant plus de 30 jours, représente un fort risque pour l’animal d’être infesté par le parasite. Enfin,
un traitement non respecté peut entraîner l’apparition de résistances des parasites aux molécules
antiparasitaires. Un certain nombre de cas de résistance à l’IVM sont apparus sur des petits
ruminants dans des régions où les traitements contre les nématodes sont intensifs afin d’optimiser la
productivité des animaux. Cependant, il n’existe pas de cas rapportés de résistance du « ver du
cœur » à l’IVM chez le cheval (Geary, 2005).
2.3 Les différentes possibilités d’optimisations galéniques
L’une des solutions à l’apparition des résistances des molécules est la recherche de nouvelles
molécules antiparasitaires, un processus par ailleurs très coûteux et souvent peu rentable à long
terme pour les industries pharmaceutiques à cause de l’expiration des brevets d’exploitation. La
découverte et le développement d’un antiparasitaire peut coûter environ 1 M$ (Geary and
Thompson, 2003). De nos jours, une approche plus attractive consiste à modifier la
pharmacocinétique des principes actifs existants afin d’optimiser leur utilisation. De ce fait, dans le
but d’améliorer les traitements à base d’IVM et de surmonter les inconvénients liés à une
application répétée des formulations existantes et à la faible biodisponibilité orale de l’IVM,
quelques efforts ont été réalisés notamment dans le domaine de la formulation de médicaments
parentéraux à libération prolongée. Ces formulations maximisent la biodisponibilité du principe
actif à l’interface hôte-parasite pendant une longue période, étant alors plus efficaces (Hennessy,
1997). Ainsi, de nouveaux systèmes de libération « intelligents » tels que des liposomes (Bassissi et
al., 2006), des implants de silicone (Maeda et al., 2003) et des microparticules biodégradables à
31
base de protéines de maïs (Liu et al., 2005) ou de polyesters synthétiques (Clark et al., 2004; Miller
et al., 1999; Miller et al., 1998) ont été développés afin d’augmenter le temps de libération de
l’IVM. Cependant, les coûts associés au développement de ces technologies par rapport aux revenus
perçus de leur commercialisation, représentent une forte contrainte dans le domaine du
développement pharmaceutique vétérinaire. De ce fait, jusqu’à présent, il n’existe pas de produits
injectables à libération prolongée à base d’IVM pour le traitement à long terme du « ver du cœur »
chez le chien. Néanmoins, la sensibilité au prix des produits pour les animaux de compagnie est
moins importante par rapport à celle des produits pour les animaux de ferme qui sont source
d’aliments (Rothen-Weinhold et al., 2000). Seul le produit ProHeart® 6 (Fort Dodge) à base de
moxidectine (10% w/w) a été mis sur le marché en 2001 aux Etats-Unis pour le traitement de cette
parasitose (FDA, 2010). Les versions européenne et Japonaise de ce produit sont commercialisées
sous le nom de Guardian® SR (Fort Dodge) (Glickman et al., 2005) et de Moxidec® SR (Fort-
Dodge, 2008), respectivement. ProHeart® 6 est une préparation injectable microparticulaire à base
de triestearate de glycéryle pour l’administration sous-cutanée, libérant le principe actif pendant 6
mois, ce qui élimine le problème des administrations répétées (Fort-Dodge, 2010). De plus, le
produit est administré par un professionnel vétérinaire, garantissant ainsi sa correcte application.
Cependant, ce produit a conduit à de nombreux effets indésirables (réactions anaphylactiques, des
maladies du foie, des maladies auto-immunes et des convulsions) qui ont conduit au décès de
plusieurs chiens aux Etats-Unis. Ainsi, après plusieurs révisions d’étiquette demandées par la FDA
et des lettres ‘Cher Docteur’ (« Dear Doctor ») diffusées aux vétérinaires, le produit a été
volontairement retiré du marché en 2004. Sa réintroduction au marché a été réalisée en 2008 suite à
la réalisation d’un contrôle strict des risques réalisé par Fort Dodge Animal Health (Fort-Dodge,
2010).
32
2.3.1 Le système de classification biopharmaceutique (BCS)

Sur la base de leur solubilité et de leur perméabilité intestinale, les principes actifs on été classés
selon un système dit de classification biopharmaceutique (BCS) (Amidon et al., 1995). Ce système
comprend quatre groupes différents de molécules (Figure 8). Celles qui possèdent une haute
solubilité et une haute perméabilité (Classe I) n’ont généralement pas de problèmes de
biodisponibilité, étant rapidement absorbées par l’organisme. Les molécules dont la solubilité dans
les fluides du tractus gastro-intestinal est faible (classe II et IV), que leur perméabilité soit élevée ou
faible, ont moins de chance d’être absorbées. Enfin, les principes actifs de la classe III, à haute
solubilité et basse perméabilité pour lesquels le franchissement de la barrière intestinale est difficile,
sont rapidement éliminés par voie digestive.
Figure 8. Représentation du système de classification biopharmaceutique (BCS) (Pouton, 2006).
Un des problèmes les plus étudiés par l’industrie pharmaceutique est l’augmentation de la solubilité
(Classe II et IV) ou de la perméabilité (Classe III et IV) des principes actifs afin d’améliorer
également leur biodisponibilité orale puisque cette voie, la plus naturelle, est la plus souvent
utilisée. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour augmenter la solubilité aqueuse des principes
33
actifs très faiblement solubles, telles que i) la réduction de la taille des particules de principe actif
par des méthodes physiques (comme par exemple la micronisation) (Pouton, 2006), ii) leur
formulation dans des systèmes à base de lipides tels que les nanocapsules lipidiques (Heurtault et
al., 2000; Huynh et al., 2009), les nanoparticules solides lipidiques (Lucks and Müller, 1991; Souto
and Müller, 2010; Varshosaz et al., 2010) ou les systèmes auto-émulsifiants (Pouton, 2006), iii) leur
compléxation avec des molécules les rendant plus hydrophiles comme la polyvinyl-pyrrolidone
(PVP) (Kubin et al., 2008; Palmieri et al., 2002; Ruan et al., 2005) ou les cyclodextrines (Carrier et
al., 2007; Gamsiz et al., 2010; Ruan et al., 2005), iv) sans oublier leur éventuelle modification
chimique afin d’obtenir des sels plus solubles dans l’eau (Pouton, 2006; Stella and Nti-Addae,
2007). Cependant, même si la solubilité d’un principe actif a été améliorée par certaines des
méthodes précédentes, sa perméabilité intrinsèque n’en sera pas moins affectée par les facteurs
environnementaux rencontrés lors de son passage le long du tractus gastrointestinal tels que la
présence d’aliments (fixation), le pH (dégradation) ou l’existence de protéines d’efflux comme la
glycoprotéine P (efflux) (Huynh et al., 2009; Lespine et al., 2007). La voie orale n’est donc pas
toujours recommandée et d’autres voies d’administration doivent alors être utilisées. Ce problème
peut devenir plus critique lorsque le patient visé est un enfant, un malade, une personne âgée ou un
animal, cas où l’administration orale est beaucoup plus compliquée.
Ainsi, si le recours à la voie orale s’avère impossible, une des voies envisagées peut être la voie
parentérale : elle comprend principalement, les voies intraveineuse (IV), intramusculaire (IM) et
sous-cutanée (SC). Malgré une acceptation limitée par les patients, la voie parentérale possède un
nombre d’avantages importants tels que i) un effet thérapeutique rapide, ii) une complète
biodisponibilité du principe actif dans le cas de la voie IV iii) l’affranchissement de l’effet de
premier passage hépatique iv) l’absence de dégradation ou de fixation du principe actif lors du
transit gastro-intestinal v) ou encore la possibilité de constituer un réservoir à partir duquel la
34
libération prolongée des principes actifs peut avoir lieu. Ce dernier avantage a été très exploité soit
chez l’homme soit chez l’animal, pour des thérapies concernant la fertilité, la
vaccination/immunisation, l’hormonothérapie, la thérapie à base de protéines thérapeutiques, le
traitement des pathologies chroniques comme les infections bactériennes ou virales, les infestations
parasitaires, le cancer, les maladies auto-immunes, les maladies du système nerveux central entre
autres, où des traitements à long terme sont souvent nécessaires. Cependant, la toxicité et la
pharmacocinétique du principe actif doivent être suffisamment connues et maîtrisées (Burgess et al.,
2002).
Les formulations parentérales à libération prolongée ont été utilisées pour améliorer la réponse
thérapeutique en assurant des niveaux sanguins plus appropriés et stables par rapport à ceux obtenus
avec les formulations à libération immédiate (Figure 9).
Figure 9. Niveaux systémiques obtenus à partir de formes à libération immédiate (gauche) et prolongée (droite).
En règle générale, moins d’effets indésirables sont observés en raison de la moindre quantité de
principe actif nécessaire pour atteindre les niveaux systémiques souhaités. De plus, l'observance et
le confort du patient sont améliorés compte tenu du plus faible nombre d’administrations. Parmi les
systèmes parentéraux à libération prolongée se trouvent les suspensions, les liposomes, les
35
microsphères, les gels et les implants. Les microsphères et les implants peuvent être utilisés pour
obtenir des profils de libération des principes actifs qui couvrent de très longues périodes (mois,
voire années) tandis que les suspensions, liposomes et gels ont des effets généralement beaucoup
plus courts (Burgess et al., 2002).
La libération prolongée des principes actifs peut être obtenue par leur incorporation dans des
matériaux polymériques (par exemple à base de polymères biodégradables) afin d’obtenir des
profils de libération prédéfinis et beaucoup plus reproductibles (Winzenburg et al., 2004).
2.3.2 Polymères biodégradables pour la libération prolongée des principes actifs

La distinction entre polymères dégradables et non-dégradables n’est pas complètement claire et elle
est en réalité arbitraire car tous les polymères sont en effet dégradables. Cependant cette différence
semble être fondée sur le temps de dégradation du polymère par rapport au temps pendant lequel il
est encore fonctionnel. Par exemple, un matériel dégradable peut être défini comme celui dont la
dégradation a lieu durant ou tout suite après que son application soit terminée. Par contre, les
matériaux non-dégradables sont ceux dont la dégradation couvre un temps beaucoup plus long que
la durée de leur application thérapeutique.
Les polymères peuvent être dégradés par plusieurs facteurs tels que les rayons UV, la température,
le stress mécanique et par des agents chimiques. Si la dégradation d’un polymère peut être catalysée
par le système enzymatique ou l’environnement chimique (ex. acide) généré par l’organisme
biologique qui le contient, le terme « biodégradable » est utilisé pour désigner ce polymère. Tous
les polymères biodégradables contiennent des liaisons hydrolysables. De ce fait, leur principal
mécanisme de dégradation est l’hydrolyse soit chimique soit enzymatique (Bastioli, 2005;
Göpferich, 1996).
36
Dans un premier temps, des polymères non-biodégradables, mais biocompatibles, tels que les
silicones (Folkman and Long, 1964; Folkman et al., 1966; Hoffman, 2008), les polyuréthanes et les
copolymères d’acétate de vinyle éthylène ont été utilisés pour la fabrication de systèmes
parentéraux à libération prolongée notamment dans le domaine vétérinaire (Winzenburg et al.,
2004). Malgré leurs bonnes performances, l’utilisation de ces systèmes est limitée car ils doivent
être retirés du patient par voie chirurgicale une fois leur fonction achevée (Bodmeier and McGinity,
1988; Uhrich et al., 1999; Winzenburg et al., 2004). Ainsi, des polymères naturels biodégradables
tels que l’albumine de sérum bovin (ASB), l’albumine de sérum humain (ASH), le collagène et la
gélatine ont été utilisés pour la préparation de systèmes à libération contrôlée. Cependant, en raison
de leur coût, de la non reproductibilité des différents lots préparés avec ces polymères, ainsi qu’aux
risques de contamination virale ou par des prions (collagène et albumine), ces polymères naturels
ont été largement remplacés par des polymères biodégradables synthétiques (Jain, 2000; Matschke
et al., 2002).
Ainsi, les polymères synthétiques biodégradables tels que les poly(anhydrides), les
poly(orthoesters), les poly(amides) et surtout les poly(esters) aliphatiques [(polymères d’acide
lactique (PLA), copolymères d’acides lactique et glycolique (PLGA), et poly-ε-caprolactone (PCL)]
sont principalement utilisés pour le développement de formes galéniques innovantes (Matschke et
al., 2002; Uhrich et al., 1999). Parmi eux, les polymères les plus attractifs et donc les plus
couramment utilisés sont le PLGA, le PLA et la PCL (Winzenburg et al., 2004). De plus, leur
utilisation dans la libération des principes actifs (Anderson and Shive, 1997; Jain, 2000; Legrand et
al., 2007; Matschke et al., 2002) a été autorisée par la FDA (Food and Drug Administration) ou
l’EMEA (European Medicines Agency). Le tableau 1 contient une liste de produits commerciaux à
libération prolongée fabriqués à partir de PLGA et/or PLA.
37
Tableau 1 Quelques produits commerciaux à libération prolongée d’administration parentérale à base de PLA ou
PLGA
Produit Laboratoire Forme Principe actif

Pharmaceutique
Profact£ Depot Aventis Pharma Implant Acétate de busereline
Zoladex£ AstraZeneca Implant Acétate de gosereline
Lupron Depot£ Takeda-Abott Microparticules Acétate de Leuprolide
Nutropin Depot£ Genetech Microparticules Hormone humaine de croissance
Posilac£ Monsanto Microparticules Somatropine bovine recombinante
Decapeptyl£ Debiopharm Microparticules Triptoreline
Risperidal Consta£ Janssen-Cilag Microparticules Risperidone
Trestal£ Depot Dephiopharm Microparticules Pamoate de triptoreline
Uropeptyl£ Depot Uropharm Microparticules Acétate de triptorelin
Pamorelin£ LA Ipsen Pharma Microparticules Acétate de triptorelin
Eligard Atrix Laboratoires Implant injectable Acétate de leuprolide
Doxirobe Pfizer Implant injectable Doxycycline
Atridox£ Atrix Laboratoires Implant injectable Doxycycline hyclate
Les polyesters à base d’acide lactique (PLA), d’acide glycolique (PGA) et leurs copolymères
d’acide lactique-co-glycolique (PLGA) sont les polymères biodégradables les plus étudiés et les
mieux caractérisés (Uhrich et al., 1999). Ces polymères ont été les premiers à être utilisés pour la
fabrication de sutures utilisables chez l’homme grâce à leurs caractéristiques de résorption (Dexon
sutures -1970) (Brannon-Peppas and Vert, 2000).
En effet, leurs excellentes propriétés de biocompatibilité et de biodégradabilité (Anderson and

Shive, 1997; Bastioli, 2005; Jain, 2000; Lewis, 1990) en ont fait des polymères très intéressants
pour l’obtention de systèmes à libération prolongée (Brannon-Peppas, 1995; Brannon-Peppas and
Vert, 2000). Ainsi, lors de leur dégradation dans le corps, ces polymères sont hydrolysés jusqu’à
l’obtention de produits facilement assimilés par l’organisme (Park, 1995). Par exemple, le PLGA
est dégradé en acide lactique et glycolique. L’acide lactique intègre alors le cycle de l’acide
tricarboxylique pour être ensuite métabolisé puis éliminé sous la forme de dioxyde de carbone et
38
d’eau. L’acide glycolique est éliminé, soit sans être métabolisé, soit après sa transformation par le
cycle de l’acide tricarboxylique sous la forme de dioxyde de carbone et d’eau (Jain, 2000) (Figure
10).
Figure 10. Biodégradation des copolymères d’acide lactique/glycolique (PLGA).
2.3.2.1 Synthèse des polymères d’acide lactique et/ou glycolique

Les deux principales voies de synthèse pour l’obtention de ce type de polyesters sont la
polycondensation et la polymérisation par ouverture de cycle des lactones cycliques issues de deux
monomères. Cependant, la technique par polymérisation (Figure 11) est la plus souvent utilisée
parce que des polymères de masse moléculaire supérieure à 10.000 g /mol peuvent être obtenus
tandis que par polycondensation, les masses obtenues sont très faibles < 5.000 g / mol (Brannon-
Peppas and Vert, 2000).
39
Figure 11. Synthèse de PLGA par ouverture de cycle à partir des lactones cycliques des monomères
De par leur solubilité dans une large variété de solvants organiques et leur possibilité d’être
extrudés sous différentes formes, plusieurs systèmes de délivrance de principes actifs tels que des
implants, des microparticules, des nanoparticules, des films et des pellets ont été fabriqués avec ces
polymères. Cependant, la compréhension préalable des propriétés physico-chimiques des polymères
est très importante lorsqu’un système à libération prolongée doit être conçu (Brannon-Peppas and
Vert, 2000; Jain, 2000). Un large spectre de performances peut être obtenu avec ces polymères, en
fonction de la stéréochimie et du rapport des monomères, de la masse moléculaire, du degré de
ramification et de la cristallinité (Park, 1995).
Les premiers travaux concernant ces polymères ont été réalisés avec les polymères de PLA plutôt
qu’avec les co-polymères de PLGA notamment en raison de la faible disponibilité du monomère
glycolique (Lewis, 1990). L’acide lactique possède un carbone asymétrique (carbone-α) ce qui
signifie qu’il peut exister soit sous la forme L (lévogyre) soit sous la forme D (dextrogyre). De ce
fait, les polymères correspondants peuvent être D-PLA, L-PLA ou DL-PLA (mélange racémique)
40
(Yang et al., 2001). Puisque l’acide L-lactique est naturel et endogène, le L-PLA est considéré
comme le plus biocompatible des polyesters (Uhrich et al., 1999). Le L-PLA est également un
matériau semi-cristallin (§ 35% de cristallinité, dû au haut degré de régularité de ses chaînes), avec
une température de transition vitreuse (Tg) d’environ 65°C et une température de fusion (Tf) entre
170 et 180°C. En revanche, le DL-PLA avec une distribution plus aléatoire des stéréoisomères est
amorphe et avec une Tg qui varie en fonction de sa masse moléculaire (Yang et al., 2001). C’est
pourquoi, la vitesse de dégradation du DL-PLA est plus élevée que celle du L-PLA. En outre,
puisque le PGA ne possède pas le groupement méthyle porté par le PLA, il est plus cristallin (Jain,
2000; Tice and Cowsar, 1984) (35-75% de cristallinité) (Yang et al., 2001) avec une Tg entre 25-
65°C et une Tf entre 185 – 225°C. Les PLGA préparés à partir de L-PLA et PGA sont cristallins
tandis que ceux issus de D,L-PLA et PGA sont amorphes (Jain, 2000).
2.3.2.2 Dégradation et érosion des polymères d’acide lactique et/ou glycolique

Le terme « dégradation » a un sens plus chimique et consiste en un clivage des chaînes
polymériques conduisant à l’obtention d’unités plus petites telles que les oligomères et les
monomères. Par contre, « l’érosion » fait référence à la perte physique (diffusion) du matériau
(oligomères et monomères) quittant la masse initiale de polymère suite à la dégradation. Tous les
polymères biodégradables partagent la propriété d’être érodés après s’être dégradés (Göpferich,
1996).
La dégradation des polyesters aliphatiques en contact avec des tissus vivants ou des fluides
corporels possédant des enzymes est vue, de façon générale, comme le résultat d’une hydrolyse
abiotique des liaisons ester (Brannon-Peppas and Vert, 2000). En effet, comme ces polymères ne
sont pas naturels, le système enzymatique ne participe pas de façon importante, au moins dans les
étapes initiales, à la dégradation des polyesters. C’est pourquoi, ils sont principalement dégradés par
simple hydrolyse chimique (Vert, 2005). En effet, lorsqu’un système de libération de principes
41
actifs à base de ces polymères est mis en contact avec un milieu aqueux, l’eau pénètre dans le
système induisant l’hydrolyse des liaisons esters. Chaque hydrolyse d’une liaison ester génère un
nouveau groupe carboxyle terminal qui peut à son tour catalyser l’hydrolyse d’autres groupes
esters ; il s’agit d’un phénomène appelé « autocatalyse» (Grizzi et al., 1995; Pitt et al., 1981;
Siepmann et al., 2005). De ce fait, un microenvironnement acide au sein de ces systèmes a été
constaté (Fu et al., 2000). Ceci explique que l’absorption d’eau est un paramètre critique dans la
biodégradation de ces polymères. Ensuite, les macromolécules partiellement dégradées restent
insolubles dans l’environnement aqueux et la dégradation continue de façon homogène. Néanmoins,
une fois que la masse moléculaire des macromolécules partiellement dégradées soit devenue
suffisamment faible pour permettre la solubilisation des oligomères dans le milieu aqueux
environnant, ceux-ci diffusent dans la masse en se déplaçant lentement vers et hors de la surface
tout en continuant à se dégrader. Ce processus impliquant des phénomènes de diffusion, de réaction
chimique et de solubilisation conduit à une différence entre les vitesses de dégradation à la surface
et à l’intérieur de la matrice de libération. En effet, les oligomères quittent la surface du système de
libération avant qu’ils soient complètement dégradés contrairement à ceux issus de la dégradation
interne. Ainsi, l’effet catalytique à la surface est faible en comparaison avec celui subi à l’intérieur.
La perte des chaînes oligomériques à partir de la matrice de libération entraîne « l’érosion » de cette
dernière (Brannon-Peppas and Vert, 2000; Vert, 2005).
Les poly(esters) subissent donc une érosion dans la masse (« bulk erosion ») (homogène) résultant
d’une vitesse de dégradation des chaînes polymériques plus faible par rapport à la vitesse de
pénétration de l’eau à l’intérieur de la matrice. Dans ce type d’érosion, la matrice entière subit la
perte de masse de façon homogène et donc, la taille de la matrice reste constante durant un temps
considérable. Par contre, lorsque la vitesse de dégradation du polymère est plus importante par
rapport à la vitesse de diffusion de l’eau à intérieur de la matrice, l’érosion a lieu à la surface
42
(« surface erosion ») (hétérogène) et la matrice devient plus réduite au cours du temps bien qu’elle
conserve sa forme (Göpferich, 1996; Shah et al., 1992) (Figure 12). Les systèmes à base de
poly(ortho-esters) ou poly(anhydrides) subissent ce type d’érosion dû au fait qu’ils possèdent des
liaisons chimiques plus sensibles à l’hydrolyse (Arifin et al., 2006; Göpferich, 1996, 1997; Uhrich
et al., 1999).
Figure 12. Changements physiques subis dans une matrice polymérique suite à une dégradation dans la masse ou à la
surface (Burkersroda et al., 2002)
Suite à l’érosion de la matrice, des structures poreuses peuvent être obtenues notamment lorsque
des polymères amorphes ont été utilisés (Shah et al., 1992), ce qui n’est pas le cas avec les
polymères cristallins, pour lesquels la cristallisation des produits de dégradation suite à leur
dégradation empêche la formation des pores (Brannon-Peppas and Vert, 2000). La porosité acquise
par le système de libération lors de son érosion peut être mise en évidence par des méthodes comme
la porosimétrie au mercure (Göpferich, 1996) ou la microscopie électronique à balayage (MEB)
(Shah et al., 1992). Le processus d’érosion peut également être suivi par la diminution de la masse
molaire du polymère (Pitt et al., 1981) ou par la perte gravimétrique de l’échantillon étudié
(Göpferich, 1996).
43
Plusieurs facteurs peuvent affecter la dégradation du système de libération et donc la libération du

principe actif. Parmi eux, les plus importants sont la composition chimique de la matrice, la masse
molaire du polymère, la morphologie et la taille de la matrice et logiquement, la nature du milieu
dans lequel la dégradation a lieu (pH, enzymes…) (Brannon-Peppas and Vert, 2000). Certains de
ces facteurs ont une influence sur le processus sans doute le plus critique pour la dégradation des
polyesters à savoir la pénétration d’eau dans la matrice (Göpferich, 1996; Pitt and Shah, 1995).
La composition chimique du polymère détermine les deux propriétés fondamentales pour sa
dégradation que sont la cristallinité et l’hydrophobicité. En effet, plus la cristallinité et
l’hydrophobicité du polymère augmentent, moins sa vitesse de dégradation est importante. D’un
point de vue chimique, la dégradation du polymère doit être comprise comme un phénomène
complexe et multifactoriel. Par exemple, le monomère glycolique est plus hydrophile que le
monomère lactique, porteur d’un groupement méthyle exerçant un effet stérique sur la molécule
d’eau et gênant ainsi son approche. Toutefois, malgré le degré de cristallinité plus faible des
homopolymères de PLA par rapport à ceux de PGA, les premiers sont plus lentement dégradés
(Uhrich et al., 1999). Ainsi, comme le PLA est plus hydrophobe que le PGA, les copolymères de
PLGA à teneur élevée en PLA sont moins hydrophiles, absorbent moins d’eau et donc sont
dégradés plus lentement (Jain, 2000). De plus, l’hydrolyse des régions amorphes du polymère est
plus rapide que celle des régions cristallines (Huang, 2005). C’est pourquoi, différents temps de
dégradation peuvent être obtenus avec les copolymères de PLGA simplement en modifiant le
rapport lactique/glycolique (Frank et al., 2005; Park, 1995; Yang et al., 2001). La cristallinité des
PLGA dépend du type et du rapport molaire des monomères dans les chaînes du copolymère. C’est
pourquoi, les PLGA de rapport lactique : glycolique (50:50) sont dégradés plus rapidement que
ceux contenant des proportions plus élevées d’un des deux monomères (Brannon-Peppas and Vert,
2000) (Figure 13). Ces copolymères sont actuellement les plus utilisés pour des applications
biomédicales telles que la libération prolongée de principes actifs (Huang, 2005)
44
Demi-vie chez le rat des implants à base des homopolymères de PLA et PGA et de leurs copolymères de
Figure 13.
PLGA (Miller et al., 1977).
Les extrémités des chaînes polymériques peuvent également affecter l’hydrophilie des polymères et
ce, quelle que soit leur composition de base (PLA, PGA ou PLGA). En effet, en modifiant ces
terminaisons par des procédés chimiques comme l’estérification du groupement acide carboxylique,
des polymères plus hydrophobes sont obtenus. Ces dérivés plus hydrophobes, sont dégradés moins
vite, induisant une vitesse de libération moins importante des principes actifs qu’ils contiennent
(Chhabra et al., 2007; Tracy et al., 1999).
En ce qui concerne la masse molaire des polymères utilisés pour la fabrication des systèmes à
libération prolongée, il a été observé que plus la masse molaire augmentait, moins la vitesse de
dégradation était importante (Jaraswekin et al., 2007; Zolnik and Burgess, 2008). Ce comportement
est le résultat d’une différence dans les g et en conséquence des volumes libres entre les chaînes
T
des polymères (Freiberg and Zhu, 2004). En effet, pour une température donnée, moins la g d’un T
polymère est importante, plus le volume libre entre ses chaînes est grand et plus le taux de
pénétration d’eau dans le système et sa dégradation sont élevés. L’eau diminue la g des polymères
T
45
en raison de son rôle de plastifiant (Blasi et al., 2005) ce qui a pour conséquence d’augmenter leur
vitesse de dégradation.
La vitesse de dégradation des polyesters augmente parallèlement avec une augmentation de la taille
du système de libération. Ce comportement est le résultat d’un effet autocatalytique plus important
dans les systèmes de plus grande taille. En effet, plus la taille du système est élevée, plus le temps
nécessaire pour que les produits de dégradation acides quittent le système sera long et plus ils
auront du temps pour exercer leur effet catalytique sur l’hydrolyse des groupements esters (Figure
14). En revanche, pour des systèmes de même taille, plus la porosité est élevée et moins la vitesse
de dégradation est importante. En effet, lorsque la porosité du système augmente, les produits de
dégradation acides quittent plus facilement le système réduisant ainsi leur effet catalytique sur la
dégradation (Dunne et al., 2000; Grizzi et al., 1995; Klose et al., 2006; Klose et al., 2008; Siepmann
et al., 2005; Vert, 2005)
Figure 14. Importance de la taille sur l’effet « autocalytique » lors de la dégradation de microparticles à base des
polyesters d’acide lactique et/ou glycolique. Les régions sombres au centre des cercles représentent le micro-pH acide à
l’intérieur du système (région claire: pH neutre ; région foncée: pH faible) (Klose et al., 2008).
En ce qui concerne l’effet de la nature du milieu dans lequel la dégradation a lieu, il a été observé
que, de façon générale, la vitesse de dégradation des systèmes à base de polyesters est plus
46
importante in vivo qu’in vitro, ce qui entraîne également une libération plus rapide du principe actif
(Tracy et al., 1999; Zolnik and Burgess, 2008).
2.3.2.3 Mécanisme de libération des principes actifs à partir des polymères d’acide lactique et/ou
glycolique
La libération des principes actifs à partir des systèmes polymériques biodégradables à base de
polyesters, destinés à la voie parentérale, se fait par deux phénomènes principaux; i) la diffusion des
principes actifs dans les matrices plus ou moins dégradées et ii) la dégradation des polymères
(Arifin et al., 2006). La dégradation joue un rôle fondamental dans la libération prolongée des
principes actifs à partir de ces systèmes. De ce fait, l’érosion n’est pas le seul processus qui
contribue au contrôle de la libération du principe actif. En effet, une fois que l’eau a pénétré à
l’intérieur du système de libération, la solubilisation du principe actif ainsi que le clivage des
groupements esters va avoir lieu. En même temps, le principe actif va diffuser vers l’extérieur du
système selon un gradient de concentration. La diffusion du principe actif peut avoir lieu par
plusieurs mécanismes tels que i) la diffusion à travers de la matrice polymérique, ii) la diffusion à
travers des pores remplis d’eau, iii) ou encore la diffusion à travers le réseau macromoléculaire et
les cavités remplies d’eau en parallèle et/ou en séquence. Contrairement aux systèmes contrôlés
seulement par diffusion, dans ces systèmes le processus de diffusion au cours du temps peut être
compensé par une perméabilité/porosité plus importante du système en cours d’érosion. Ceci peut
être mis en évidence soit par une libération constante du principe actif ou par une augmentation de
la libération de ce dernier (Faisant et al., 2002).
Plusieurs modèles mathématiques ont été développés afin d’expliquer la libération des principes
actifs à partir des systèmes contrôlés par érosion. Ils peuvent être classés en deux catégories : i) les
modèles empiriques qui font l’hypothèse d’une cinétique d’ordre zéro pour tout le processus de
libération du principe actif et ii) les modèles qui prennent en compte les phénomènes physico-
47
chimiques tels que le processus de transfert de masse par diffusion et /ou par réactions chimiques.
Le processus de transfert de masse par diffusion est souvent décrit par la deuxième loi de diffusion
de Fick (Faisant et al., 2002).
D’autres facteurs environnementaux ou intrinsèques au système de délivrance peuvent aussi

modifier la libération du principe actif in vivo par voie parentérale. On peut par exemple citer a) les
barrières physiologiques naturelles s’opposant à la diffusion du principe actif telles que la viscosité
liée aux fluides biologiques ou au tissu conjonctif) b) le partage du principe actif au niveau du site
d’application, comme par exemple dans le tissu adipeux c) le volume des fluides présents au site
d’injection ou encore d) les mouvements musculaires dans le cas de la voie intramusculaire. Les
facteurs dépendants du système de libération peuvent être 1) la dégradation enzymatique pour les
polymères qui y sont sensibles 2) l’adsorption des protéines et 3) la phagocytose et / ou la
possibilité d’une réaction inflammatoire induite par le système de libération (Zolnik and Burgess,
2008).
2.3.3 Systèmes implantables biodégradables

Les systèmes implantables peuvent être classés selon qu’ils sont élaborés industriellement pour être
administrés chez le patient (systèmes préformés) ou qu’ils sont formés in situ lors de leur
administration (systèmes in situ). Dans les deux cas, ce sont les mêmes types de systèmes de
délivrance à savoir, les implants monolithiques et les microparticules (systèmes multiparticulaires).
2.3.3.1 Systèmes préformés

Les systèmes préformés ont été les premiers à être développés dans le cadre de l’usage des
polyesters biodégradables pour l’élaboration de systèmes à libération prolongée destinés à la voie
parentérale.
48
2.3.3.1.1 Implants monolithiques

Les implants monolithiques sont des systèmes de délivrance de médicaments, solides, pour
l’application soit intramusculaire, soit sous-cutanée. Ces systèmes sont administrés par procédures
chirurgicales ou via des dispositifs biomédicaux appropriés tels que des pistolets ou des aiguilles de
gros calibre (trocart) (Jain, 2000; Shively et al., 1995; Szymanski, 1971) (Figure 15).
Figure 15. Dispositifs pour l’administration d’implants. Pistolet Ralgro Gun (Intervet Schering-Plough) (gauche) et
trocart KangYou Hangzhou Kangyou Medical Equipment Co., Ltd.).
(
Ainsi, même s’ils ne sont pas retirés à la fin du traitement, la douleur et la gêne ressentie par les
patients lors de l’administration de ces systèmes représentent sans doute leurs principaux
désavantages (Jain, 2000; Shah et al., 1993). Pour la fabrication des implants biodégradables, le
principe actif est mélangé avec le diluant (polymère) et éventuellement avec les autres adjuvants de
formulation, pour être ensuite soumis à des procédés tels que l’extrusion par fusion (« melt
extrusion ») (Bhardwaj and Blanchard, 1997; Zhang et al., 1994), le moulage par injection
(« injection molding ») (Lim et al., 2008; Sundback et al., 2003), la compression directe (Bodmeier
and Chen, 1989b), la formation de films suite à l’évaporation du solvant des solutions de polymère
(Mauduit et al., 1993) ou encore le filage de fibres (« fiber spinning ») (Eenink et al., 1987; Lim et
al., 2008; Schakenraad et al., 1988; Van de Witte et al., 1993). Ainsi, des implants de toutes tailles
49
et formes tels que des extrudés cylindriques, des comprimés, des films, des fibres pleines ou
perforées, peuvent être obtenus à partir de ces polymères (Brannon-Peppas and Vert, 2000).
Dans le domaine vétérinaire, ces systèmes représentent une alternative importante aux implants
« non biodégradables » (Winzenburg et al., 2004). Cependant, la plupart des implants sur le marché
des produits pour la santé animale sont encore réalisés à base de matériaux non biodégradables avec
les désavantages que leur utilisation entraîne. Parmi eux, les implants pour le contrôle du cycle
ovarien ou pour le traitement des ectoparasites sont les plus répandus. Des implants cylindriques
tels que Compusode (17β-estradiol), Syncro MateB (norgestomet), Ralgro (zeranol) et
Synovex (testostérone + estradiol) sont parmi les plus cités dans la littérature (Matschke et al.,
2002). En revanche, des implants biodégradables tels que Profact£ Depot et Zoladex£ (Table 1) sont
plus fréquemment utilisés dans le secteur pharmaceutique dédié à la santé humaine.
2.3.3.1.2 Microparticules
C’est dans le cas des systèmes multiparticulaires pour la formulation de médicaments à libération
prolongée, à base des polyesters de l’acide lactique et glycolique, que le plus de travaux ont été
réalisés (Brannon-Peppas and Vert, 2000) (Tableau 1). Le terme « microparticules » est utilisé dans
le contexte galénique pour décrire des systèmes particulaires sphériques, de diamètre entre 1 et
1000 µm, utilisés pour transporter des principes actifs. Cependant, d’un point de vue pratique, des
tailles entre 1 et 250 µm sont recommandées pour l’administration sous-cutanée et intramusculaire
(Couvreur and Puisieux, 1993; Matschke et al., 2002). En fonction de leur architecture, les
microparticles peuvent être, soit des microsphères, soit des microcapsules. Les premières sont des
structures polymériques pleines alors que les deuxièmes consistent en un cœur de nature différente
de la paroi polymérique qui l’entoure. Dans les deux systèmes, le principe actif peut se trouver aussi
bien à l’état dispersé qu’à l’état dissous.
50
Une large variété de principes actifs, sans tenir compte de leur masse moléculaire, solubilité ou
activité thérapeutique, a été incorporée dans des microparticules à base de PLA et /ou de PLGA. A
titre d’exemple on peut citer l’encapsulation d’oligonucleotides (De Rosa et al., 2002; Freytag et al.,
2000), de peptides (Okada, 1997; Woo et al., 2001), de protéines (Jiang et al., 2002),
glycosaminoglycanes (Javot et al., 2009), ou encore de petites molécules, soit hydrophobes
(Bodmeier and Chen, 1989a), soit hydrophiles (Hombreiro Pérez et al., 2000).
En effet, les microparticules représentent une alternative importante aux problèmes associés à
l’administration des implants par des procédures chirurgicales (Jain, 2000). Grâce à leur faible
taille, les microparticules peuvent être administrées avec des seringues équipées d’aiguilles
conventionnelles (Park et al., 2005), après mise en suspension dans un diluant adéquat. Cependant,
un des inconvénients lié à l’utilisation des microparticules est le fait qu’une fois administrées, elles
ne peuvent plus être retirées du patient. D’autre part, les procédés de fabrication des microparticules
sont souvent complexes et coûteux. Le suivi de multiples opérations pharmaceutiques tels que
l’émulsification, la filtration ou la centrifugation, la lyophilisation et la stérilisation par radiations γ
ou β font que leur préparation est réputée, à juste titre, difficile (Matschke et al., 2002). Enfin, ils
utilisent souvent des solvants toxiques difficiles à éliminer et qui peuvent également affecter la
stabilité des principes actifs (Shah et al., 1993).
Plusieurs méthodes pour la préparation de microparticules ont été développées, sachant que la
plupart d’entre elle sont fondées sur des procédés d’extraction ou d’évaporation (Brannon-Peppas,
1995). Parmi elles, les méthodes d’émulsion (simple ou multiple) et évaporation/extraction du
solvant, de séchage par dispersion (« spray drying ») et de séparation des phases (coacervation) sont
les plus souvent utilisées (Brannon-Peppas and Vert, 2000; Freitas et al., 2005; Matschke et al.,
2002; Park et al., 2005) (Figure 16) (Mundargi et al., 2008) et sont donc les techniques que nous
51
discuterons par la suite. Le choix de la méthode dépend des caractéristiques du polymère, du

principe actif, du site d’action du principe actif et de la durée envisagée de l’action thérapeutique
(Park et al., 2005). Néanmoins, il y a un certain nombre de pré-requis pour toutes ces méthodes, à
savoir ; i) la stabilité chimique et l’activité thérapeutique du principe actif doivent être conservées
tout au long du processus de fabrication, ii) le taux d’encapsulation ainsi que le rendement doivent
être suffisamment élevés pour que la production soit possible, iii) le profil de libération du principe
actif à partir des microparticules doit être reproductible et sans une forte libération initiale
(« burst ») iv) le processus doit aboutir à des microparticules sous la forme d’une poudre
d’écoulement libre et sans agrégation ou adhésion, afin qu’elles puissent être facilement suspendues
dans le véhicule avant leur administration, et v) la taille des microparticules doit permettre
l’administration par la voie parentérale en utilisant un système d’aiguille et seringue
conventionnelles.
Figure 16. Méthodes les plus utilisées pour l’obtention de microparticules (Mundargi et al., 2008).
52
2.3.3.1.2.1 Obtention par émulsion et évaporation/extraction de solvant

La méthode d’évaporation de solvant a été largement utilisée pour l’obtention de microparticules à
base de PLA ou de PLGA. En fonction des étapes suivies, cette méthode peut permettre
l’encapsulation de principes actifs soit hydrophiles soit lipophiles (McGinity and O'Donnell, 1997).
La méthode la plus facile à mettre en œuvre est celle dite de la simple émulsion (O/W) ; les autres
méthodes dérivent de celle-ci et comprennent la méthode du co-solvant (co-solvant - O/W) et/ou la
technique d’émulsion huile dans l’huile (O/O). Une autre méthode dite par émulsion double (eau
dans l’huile dans l’eau, W/O/W) est aussi parmi les méthodes d’évaporation-extraction de solvant
les plus utilisées.
2.3.3.1.2.1.1 Simple émulsion (O/W)

La préparation de microparticules par cette méthode comprend les cinq étapes fondamentales,
décrites Figure 17: i) le polymère et le principe actif sont tout d’abord dissous dans un solvant
organique volatil et insoluble dans l’eau, ii) une émulsification est réalisée par agitation de cette
solution organique (phase interne) dans un large volume de phase externe aqueuse contenant un
tensioactif approprié tel que l’alcool polyvinylique (PVA) pour l’obtention d’une émulsion huile
dans l’eau (O/W), iii) l’élimination du solvant organique est effectuée par évaporation et/ou
extraction. L’évaporation du solvant peut être réalisée par agitation mécanique de l’émulsion (O/W)
avec ou sans l’application de vide et l’extraction par l’ajout de cette première émulsion à un volume
important d’eau afin d’augmenter la diffusion du solvant organique vers le milieu extérieur.
L’évaporation et / ou l’extraction du solvant induisent la mise en contact directe du polymère avec
la phase aqueuse où il est insoluble, ce qui entraîne la précipitation du polymère qui à son tour
englobe le principe actif conduisant ainsi à la formation de microparticles solides. iv) les
microparticles sont recueillies par filtration ou par centrifugation et v) un séchage des
53
microparticules est alors effectué dans des conditions appropriées ou par lyophilisation (Freitas et
al., 2005; Jain, 2000; McGinity and O'Donnell, 1997).
PLGA o PLA
Principe actif
Solvant organique volatile
PVA
Aqueuse
Emulsification (O / W) Évaporation du solvant
Ȗ ou ȕ
Filtration MPs Lyophilisation Stérilisation
Figure 17. Principales étapes suivies lors de la préparation de microparticules biodégradables par la méthode
d’émulsion (O /W) / évaporation de solvant.
La méthode d’évaporation de solvant est similaire à celle d’extraction de solvant puisque, dans le
cas de la première méthode, le solvant doit tout d’abord diffuser vers la phase aqueuse externe avant
d’être éliminé du système par évaporation. La vitesse d’élimination du solvant par extraction
dépend du type de solvant, de la phase externe et de sa température, du rapport phase interne/phase
externe et des propriétés physico-chimiques du polymère (Jain, 2000). Récemment, la description
détaillée de la cinétique des processus d’extraction/évaporation du solvant lors de la formation de
microparticules de PLGA a été publiée (Katou et al., 2008; Rosca et al., 2004). L’évaporation
complète du solvant peut pendre entre 8 voire 10 h dans certain cas (Brannon-Peppas and Vert,
2000). L’augmentation de la vitesse d’évaporation du solvant, et donc de l’obtention des
microparticles, peut être obtenue par l’évaporation du solvant sous vide et/ou l’augmentation de la
température (Brannon-Peppas and Vert, 2000). Cependant, l’évaporation trop rapide du solvant peut
54
entraîner l’explosion des gouttelettes de solvant à l’intérieur des microparticules en formation, ce

qui a pour effet l’obtention de microparticules poreuses. Puisque l’élimination du solvant par la
méthode d’extraction est plus rapide que par évaporation, toutes conditions égales par ailleurs, les
microparticules obtenues par extraction sont généralement plus poreuses (Jain, 2000).
Les principaux facteurs qui déterminent la taille et la distribution de tailles des particules ainsi que
le taux d’encapsulation du principe actif sont ; i) la nature et la solubilité du principe actif à
encapsuler ii) le type de solvant, iii) la concentration du polymère dans la phase organique, iv) le
pourcentage et le type de tensioactif et v) la vitesse d’agitation. Cette méthode est plus appropriée
pour l’incorporation de principes actifs qui sont solubles dans les solvants organiques où le
polymère est soluble lui aussi (Bodmeier and McGinity, 1987; Brannon-Peppas and Vert, 2000;
McGinity and O'Donnell, 1997). C’est pourquoi des principes actifs hydrophobes tels que
chlorpromazine (Suzuki and Price, 1985), prednisolone (Smith and Hunneyball, 1986),
hydrocortisone (Cavalier et al., 1986), cisplatine (Verrijk et al., 1992), 5- fluorouracile (Boisdron-
Celle et al., 1995), lidocaïne (Lalla and Sapna, 1993) et progestérone (Cowsar et al., 1985) entre
autres ont été encapsulés par cette méthode. Les solvants les plus utilisés dans la procédure de
simple émulsion sont le dichlorométhane, l’acétone, l’acétonitrile, le méthanol, l’acétate d’éthyle, le
chloroforme ou encore le tétrachlorure de carbone (Brannon-Peppas and Vert, 2000). Cependant, la
toxicité de ces solvants représente un des obstacles majeurs de cette méthode (EMEA, 1997). Les
tensioactifs les plus couramment utilisés sont l’alcool polyvinylique, la méthylcellulose, la gélatine,
la polyvinylpyrrolidone et le Tween£ 20 à une concentration entre 0,1 et 1,0 % m/v (Brannon-
Peppas and Vert, 2000).
L’influence de quelques facteurs sur les caractéristiques des microparticules de nifédipine, un

inhibiteur de flux calcique, a été étudiée (Sansdrap and Moes, 1993). Ainsi, il a été observé que la
55
taille des microparticules diminuait de 28,5 à 12,9 µm pour une augmentation de la concentration
du tensioactif (hydroxypropylméthylcellulose) de 0,4 à 2,4% (m/v), ce qui permettait une meilleure
stabilisation de l’émulsion. De la même façon, la taille des microparticules s’est révélée plus faible
lorsque la vitesse d’émulsification était plus grande. Ceci s'explique par le fait qu’en augmentant la
vitesse d’agitation, les forces de cisaillement deviennent plus importantes, ce qui permet une plus
grande dispersion et division de la phase organique. Une diminution de la taille des microparticules
a été également obtenue lorsque le volume de la phase organique a été augmenté, ce qui diminue la
viscosité du système. Le taux d’encapsulation du principe actif dans les microparticules est
fortement dépendant des propriétés physico-chimiques du solvant utilisé (Bodmeier and McGinity,
1988) ; en particulier, leur non miscibilité dans l’eau est une caractéristique très importante. C’est
pourquoi, des solvants de solubilité très élevée dans l’eau tels que le dimethyl sulfoxide, l’acétone
ou l’éthanol ne permettent pas l’obtention de microparticules mais conduisent à des agglomérats de
polymère à cause de leur diffusion très rapide vers la phase externe. Cependant, pour des solvants
de faible solubilité dans l’eau, plus la solubilité dans l’eau est élevée et plus la vitesse de
précipitation du polymère est importante, conduisant ainsi à une augmentation de l’incorporation du
principe actif dans les microparticules. En revanche, lorsque le solvant diffuse très lentement vers la
phase externe aqueuse, les globules dispersés de phase organique restent liquides pendant beaucoup
plus longtemps, ce qui entraîne une diffusion plus importante du principe actif vers le milieu
extérieur et donc un plus faible taux d’incorporation (Bodmeier and McGinity, 1988).
La méthode d’émulsion simple (évaporation ou extraction de solvant) n’est cependant pas adéquate
pour l’incorporation de principes actifs hydrophiles principalement par les raisons suivantes : 1) le
principe actif ne peut pas être dissous dans le solvant organique et 2) pendant le processus
d’émulsification, le principe actif peut rapidement diffuser vers le phase externe aqueuse en raison
de son caractère hydrophile ce qui entraîne une perte importante du principe actif et donc un très
56
faible taux d’incorporation dans les microparticules. Pour surmonter ce problème, plusieurs
variations de la méthode d’émulsion simple (O/W) ont été développées (Li et al., 2008) telles que i)
l’addition de solvants hydrosolubles aux solutions polymériques des solvants très peu solubles dans
l’eau, afin de pouvoir dissoudre les principes actifs hydrophiles dans la phase organique, ce qui
entraîne une augmentation de leur taux d’incorporation dans les microparticules (Méthode du co-
solvant - O/W) (Luan et al., 2006; Woo et al., 2001)
2.3.3.1.2.1.2 Double émulsion (W/O/W)

Dans cette méthode, tout d’abord une solution aqueuse du principe actif (parfois contenant un agent
de viscosité) est tout d’abord émulsifiée sous forte agitation avec une solution du polymère dans un
solvant organique non-miscible à l’eau tel que le chlorure de méthylène. De ce fait, une première
émulsion W/O qui deviendra, à la fin du processus, le cœur central des microparticules est obtenue.
Ensuite, cette première émulsion est dispersée sous agitation dans un large volume d’une phase
aqueuse externe contenant un tensioactif hydrophile tel que le PVA pour obtenir une émulsion
multiple W/O/W (eau-dans-huile-dans-eau). En effet, la phase organique qui sépare la phase
aqueuse interne de l’externe, agit comme une barrière qui empêche la fuite du principe actif vers le
milieu extérieur, ce qui contribue à l’encapsulation du principe actif. Les étapes suivantes du
processus sont les mêmes que pour la méthode d’émulsion simple. Ainsi, l’élimination du solvant
étant réalisée par évaporation et/ ou extraction, les microparticules sont recueillies par filtration ou
centrifugation. Finalement, elles sont soumises au séchage jusqu’à l’obtention d’une poudre de libre
écoulement. Cette méthode est très utile pour l’encapsulation de principes actifs très hydrophiles
tels que protéines (Conway and Oya Alpar, 1996), peptides (Herrmann and Bodmeier, 1995; Okada,
1997), vaccins (Alonso et al., 1994) et petites molécules (Erden and Celebi, 1996; Hombreiro Pérez
et al., 2000). Le produit pharmaceutique peut-être le plus célèbre, préparé par cette méthode est
l’Enantone £ Depot (Okada, 1997; Okada et al., 1987) (Tableau 1). Ce produit contient comme
57
principe actif l’acétate de leuprolide, un analogue de l’hormone de libération de la lutéinostimuline

(LH-RH) pour le traitement prolongé de l’endométriose et/ou du cancer de la prostate. En effet, en
fonction du polymère employé pour la fabrication des microparticules, PLGA ou PLA, la libération
du principe actif peut être respectivement prolongée de 1 à 3 mois.
2.3.3.1.2.2 Obtention par séparation de phases (coacervation)
Le terme coacervation a été utilisé pour la première fois par Bungenburg de Jong and Kruyt pour
décrire le phénomène de séparation des phases dans les systèmes colloïdaux (Süheyla Kas and
Ôner, 2000). Ce processus consiste à diminuer la solubilité d’un polymère en solution, par l’ajout
d’un troisième composant. Le matériau issu de la séparation initiale du polymère juste avant sa
précipitation est appelé le coacervat. La déposition du coacervat autour du principe actif dispersé ou
solubilisé dans le liquide en équilibre conduit à des capsules embryonnaires. Enfin, la propagation
et la poursuite de la coalescence des particules du coacervat forment des microcapsules (Nihant et
al., 1995). La partie intérieure de la microcapsule contenant le principe actif est appelée « le cœur »
et le matériel polymérique constituant la partie extérieure est appelé « paroi ». Le cœur des
microcapsules peut exister sous différentes configurations telles que liquide, solide, gaz,
suspension, émulsion. Le phénomène de séparation des phases/coacervation peut être induit par
différents facteurs tels que le changement de température, l’addition d’un non-solvant, l’addition de
sels, l’addition d’un polymère incompatible ou encore par des interactions polymère - polymère.
Les polymères PLA, PGA et PLGA ont été utilisés comme matériaux des parois pour la préparation
de microcapsules. Dans ce cas, c’est l’ajout d’un non-solvant du polymère sur leurs solutions
organiques qui induit leur séparation (Süheyla Kas and Ôner, 2000). Ainsi, des principes actifs très
hydrophiles tels que peptides (Blanco-Prieto et al., 2004), protéines (Nihant et al., 1995) et vaccins
(Johansen et al., 2000) mais aussi hydrophobes tels que les stéroïdes (Leelarasamee et al., 1986;
Leelarasamee et al., 1988) peuvent être incorporés dans des capsules à base des ces polymères en
58
utilisant cette méthode de séparation. En effet, une fois le polymère dissous dans un solvant
organique, le principe actif peut être rajouté soit sous la forme d’une solution aqueuse afin de
former une émulsion W/O (molécules hydrophiles) soit dispersé ou dissous dans la même solution
du polymère (molécules hydrophobes). Lorsque le non-solvant est ajouté, sous agitation faible, à ce
système polymère-principe actif-solvant, il extrait au fur et à mesure le solvant induisant la
coacervation du polymère ce qui entraîne l’encapsulation du principe actif. Ce système est alors
transféré dans un large volume d’un autre non-solvant organique afin de durcir les microcapsules.
Ces dernières sont ensuite recueillies par filtration ou centrifugation, lavées et séchées (Jain, 2000).
Parmi les solvants des polymères, utilisés par cette méthode, on peut citer le chlorure de méthylène,
l’acétonitrile et l’acétate d’éthyle. Parmi les huiles utilisées initialement comme non- solvant, il y a
l’huile de silicone, les huiles végétales, la paraffine liquide, le polybutadiène de faible masse
moléculaire et les polymères méthacryliques liquides. Comme deuxièmes non-solvants on peut citer
l’hexane, l’heptane et l’éther de pétrole.
Plusieurs facteurs tels que la vitesse d’addition du non-solvant, la concentration et la masse molaire
du polymère, la vitesse de dispersion de la phase aqueuse, le rapport phase aqueuse/phase
organique, la nature du non-solvant, la température de coacervation et le comportement rhéologique
du système déterminent les caractéristiques des microcapsules obtenues (Nihant et al., 1995;
Thomasin et al., 1998)
2.3.3.1.2.3 Obtention par séchage par dispersion (« spray drying »)
Le séchage par dispersion peut être défini comme le processus de transformation d’un matériel sous
la forme d’un liquide à un autre sous l’état particulaire et sec (Rattes and Oliveira, 2007). Ce
processus est réalisé par atomisation, le plus souvent à l’aide d’air comprimé, d’une solution du
polymère contenant le principe actif (dissous ou suspendu), dans une chambre remplie en air sec et
chaud. Une fois dispersé sous forme de gouttelettes, le liquide pénètre dans la chambre alimentée en
59
air chaud et l’évaporation immédiate du solvant induit la précipitation du polymère qui à son tour
incorpore le principe actif. L’architecture des microparticules obtenues par cette méthode dépend
fondamentalement de l’état initial du principe actif dans le liquide à nébuliser. Si le principe actif se
trouve dissous ou dispersé dans la solution du polymère, des microsphères sont obtenues (Kissel et
al., 2006). En revanche, des microcapsules sont obtenues quand le liquide nébulisé consiste en une
émulsion principe actif/polymère. Le processus d’obtention de microparticules par cette méthode
peut être résumé en 4 étapes ; a) atomisation du liquide, b) mélange du nébulisât avec l’air chaud, c)
évaporation du solvant et d) séparation du produit. (Kissel et al., 2006).
Malgré les très hautes températures utilisées, le séchage par atomisation a été utilisé pour
l’obtention de microparticules contenant des substances sensibles telles que des peptides (Blanco-
Prieto et al., 2004; Witschi and Doelker, 1998), des vaccins (Johansen et al., 2000), des vitamines,
des parfums, et des huiles essentielles (Kissel et al., 2006) en raison de la haute vitesse
d’évaporation des solvants (Rattes and Oliveira, 2007). Le premier principe actif à avoir été
encapsulé par cette méthode en utilisant le PLA a été la bromocriptine. Ensuite, , un médicament
destiné au traitement du cancer sous le nom Parlodel LAR  (Sandoz Pharma), d’administration
parentérale, a été développé à base de polyesters en étoile de poly(D,L-lactique-co-glycolique-D-
glucose) permettant lors de son injection, la libération prolongée de la bromocriptine pendant un
mois (Bodmer et al., 1992; Kissel et al., 1991). D’autres principes actifs tels que la progestérone, la
théophylline (Bodmeier and Chen, 1988) et le captopril (Volland et al., 1994) ont été
respectivement incorporés dans des microparticules à base de PLA et PLGA en utilisant cette
méthode.
Bien que le séchage par dispersion soit une méthode rapide, relativement simple à mettre en œuvre
au niveau industriel, et « universelle » dans le sens où des principes actifs lipophiles autant que
60
hydrophiles peuvent être encapsulés (Bodmeier and Chen, 1988), certains inconvénients tels que les
pertes de produit à cause d’une adhésion aux parois de l’appareillage et de son l’agglomération
doivent être pris en compte (Broadhead et al., 1992). Parmi les paramètres et facteurs qui
déterminent la qualité du produit, on peut citer le type de solvant, la température d’entrée et de
sortie de l’air de séchage et la viscosité de la solution à nébuliser (Ré, 1998).
2.3.3.2 Systèmes in situ

Les méthodes traditionnelles pour la préparation des implants et des microparticules à libération
prolongée à base des polyesters de l’acide lactique et / ou glycolique, possèdent un certain nombre
d’inconvénients qui rendent difficile leur fabrication et/ou leur utilisation (sections 1.4.2.1.1 et
1.4.2.1.2.) . Afin de surmonter quelques-uns de ces problèmes, de nouvelles méthodes pour
l’obtention de systèmes se formant spontanément au site d’application (in situ) ont été développées
(Dunn et al., 1990). Ces systèmes sont également appelés dans la littérature « dépôts de formation
in-situ » et leur administration peut être réalisée par la voie intramusculaire ou sous-cutanée
(Matschke et al., 2002). En fonction des mécanismes participant à la formation des dépôts, ils
peuvent être classés ainsi (Figure 18); i) pâtes thermoplastiques, ii) systèmes polymériques de
réticulation in situ , iii) systèmes de gélification induite par la température, iv) cubosomes in situ et
v) systèmes in situ par précipitation du polymère. Jusqu’à présent, la plupart de ces systèmes ont été
utilisés pour la formation d’implants monolithiques (ISI).
2.3.3.2.1 Implants in situ (ISI)
2.3.3.2.1.1 Pâtes thermoplastiques

Les pâtes thérmoplastiques sont des dépôts semi-solides obtenus suite au refroidissement induit par
la température corporelle, d’un système polymérique injecté à l’état fondu (Dunn and Tipton, 1997;
Packhaeuser et al., 2004). Ces systèmes sont caractérisés par un point de fusion faible, généralement
61
entre 25-65°C et des viscosités intrinsèques entre 0,05 et 0,8 dL/g. Ici, le principe actif est incorporé
dans le polymère fondu par simple agitation sans l’ajout d’un solvant. Leur facilité à être injectés à
l’état fondu peut s’expliquer par la faible masse molaire et la faible g des polymères utilisés pour
T
leur préparation. Cependant quelques inconvénients liés à l’utilisation de ces systèmes, (notamment
lorsque la température d’application dépasse les 60°C), sont la douleur intense, la probabilité de
nécrose et de cicatrices suite à leur injection. C’est pourquoi, des polymères de faible masse molaire
sont plus recommandés (Hatefi and Amsden, 2002). Une formulation sous cette forme d’implant en
utilisant le polymère thermoplastique triblock de poly(D,L-lactique)-block-poly(éthylène glycol)-
block-poly(D,L-lactique) a été ainsi développée pour la libération prolongée de Taxol après
administration intra-tumorale (Zhang et al., 1996).
2.3.3.2.1.2 Systèmes polymériques de réticulation in situ
La réticulation in situ des polymères peut donner lieu soit à des systèmes polymériques soit à des
gels. Plusieurs facteurs tels que ; i) la chaleur (thermosets), ii) l’absorption de photons et iii) les
interactions ioniques entre cations et polymères anioniques, peuvent induire la réticulation des
polymères.
2.3.3.2.1.2.1 Thermosets
Les polymères appelés « thermosets » peuvent s’écouler et être moulés tout suite après fabrication;
cependant, une fois chauffés, ils conservent leur forme finale (Dunn et al., 1994; Dunn et al., 1997).
Ce durcissement (« curing ») est dû à la formation de réticulations covalentes entre les chaînes du
polymère entraînant la formation d’un réseau macromoléculaire. Cet état n’est pas réversible et le
réchauffage ultérieur du polymère, n’induit que sa dégradation. Le durcissement est normalement
initié chimiquement par le chauffage. Cependant, cette méthode présente certaines limites et des
effets indésirables qui la rendent difficile à mettre en œuvre. En particulier, les conditions de
réaction pour les applications in vivo sont assez strictes : un étroit intervalle de températures
62
physiologiques dans laquelle elle est acceptable, les spécifications de toxicité des monomères et / ou
des solvants, un environnement riche en humidité et oxygène, le besoin d’une injection rapide, et
des vitesses de réticulation appropriées conditionnent par exemple la réticulation (Hatefi and
Amsden, 2002). Des copolymères d’acide DL-lactique ou L-lactique avec ε-caprolactone ont été
utilisés pour la préparation d’un « thermoset » comme implant prostatique pour la libération
prolongée des principes actifs. Ce système est liquide en dehors du corps et peut être facilement
injecté (système d’aiguille et seringue). Une fois à l’intérieur du corps, il durcit (Dunn et al., 1994).
63
Systèmes biodégradables injectables de formation « in-situ »
Pâtes thermoplastiques Systèmes de Systèmes de gélification Cubosomes in situ Systèmes de

réticulation in situ in situ par température précipitation in situ
Thermosets Induite par le pH
Gels Par extraction

photo-réticulés du solvant
Gels
Ion-réticulés
Figure 18. Classification des dépôts in situ en fonction des mécanismes participant dans leur formation.
2.3.3.2.1.2.2 Gels ion – réticulés

La réticulation des solutions polymériques pour former des gels, peut aussi être induite par des ions
de charge opposée à celle du polymère. Ce type de réticulation a été décrite spécialement pour des
polymères tels que les alginates/(Ca++) et les chitosans/(PO4≡) (Berger et al., 2004; Packhaeuser et
al., 2004), lesquels sont biocompatibles mais non-biodégradables. Cependant, les concentrations
physiologiques de ces contres ions in vivo (IM ou SC), ne sont pas suffisamment importantes pour
permettre la réticulation de ces systèmes dans les conditions in situ (Packhaeuser et al., 2004),
excepté dans l’œil où la concentration de calcium atteint environ 0,008% (Hatefi and Amsden,
2002).
2.3.3.2.1.3 Systèmes de gélification in situ par température

Certains polymères subissent des transitions sol/gel à la suite de modifications de la température
environnementale. Cette propriété a permis l’utilisation de ces polymères pour la préparation de
systèmes in situ . Comme les solutions aqueuses de ces polymères possèdent une faible viscosité,
elles peuvent, à l’image des formes pharmaceutiques liquides conventionnelles, être facilement
manipulées au niveau industriel pour les opérations de mélange, stérilisation et remplissage.
Cependant, lorsque ces solutions sont injectées dans le corps, elles subissent une transition sol-gel
due au changement de température (Ruel-Gariépy and Leroux, 2004). Ainsi, les principes actifs
dissous initialement dans la solution du polymère, sont retenus dans la nouvelle structure, d’où ils
seront libérés selon plusieurs mécanismes physico-chimiques tels que la diffusion, la solubilisation
et la dégradation du polymère (Ghahremankhani et al., 2007). Il existe différents polymères qui
subissent ce type de transition sol-gel, intéressants pour la formulation des systèmes in situ . Parmi
eux, les copolymères tri-bloc de poly(oxyde d’éthylène) (PEO) et poly(oxyde de propylène) (PPO),
PEO-PPO-PEO (Pluronics£ ou Poloxamers£) sont très utilisés et leurs propriétés de gélification on
65
été bien étudiées (Linse and Malmsten, 1992). Etant le moins toxique des Pluronics£, le Pluronic£
F127 a été largement utilisé dans des études de libération de principes actifs. Cependant, les
copolymères de PEG (polyéthylène glycol)/PLGA sont encore plus intéressants en raison de leur
biocompatibilité et biodégradabilité. Ainsi, des copolymères tri-bloc de PLGA-PEG-PLGA ont été
utilisés pour la fabrication d’implants parentéraux par gélification thermique in situ pour délivrer de
façon prolongée de la calcitonine (Ghahremankhani et al., 2007).
2.3.3.2.1.4 Cubosomes in situ

Les « cubosomes » ou « organogels » sont des phases cristallines liquides, formées par l’assemblage
spontané, de lipides amphiphiles polaires insolubles dans l’eau. En effet, lorsque ces composés sont
mis en contact avec l’eau, leur gonflement induit la formation d’une phase cristalline cubique
tridimensionnelle en bicouche et séparée par des canaux aqueux (Figure 19) (Shah et al., 2001). Les
caractéristiques de cette structure dépendent des propriétés structurales des lipides, de la
température, de la nature du principe actif incorporé et de la teneur en eau dans le système
(Engstrom and Engstrom, 1992). Ces systèmes sont gélatineux et très visqueux, d’où leur utilisation
dans la formation de dépôts in situ afin d’obtenir la libération prolongée des principes actifs
hydrophiles ainsi que lipophiles (Shah et al., 2001). Parmi les lipides amphiphiles les plus utilisés
jusqu’à présent dans la préparation des cubosomes, on peut citer les esters de glycérol des acides
gras tels que le monooléate de glycérol, le monopalmitostéarate de glycérol et le monolinoléate de
glycérol (Hatefi and Amsden, 2002). L’utilisation de ces composés est intéressante car ils sont
considérés comme non toxiques, biocompatibles et biodégradables par les lipases endogènes de
l’organisme.
Plusieurs types de principes actifs hydrophiles tels que des oligonucléotides (Ahmed et al., 2010) et
des peptides (Lee and Kellaway, 2000), de principes actifs amphiphiles comme le maléate de
chlorpheniramine (Chang and Bodmeier, 1997) et de principes actifs lipophiles tels que le
66
lévonorgestrel et l’éthinyl estradiol (Gao et al., 1995a; Gao et al., 1995b) ont été incorporés dans ces
systèmes . La libération des principes actifs lipophiles à partir de ces systèmes dépend aussi de leur
solubilité dans la phase cubique. Récemment, des formulations de monoglycérides de faible
viscosité ont été développées en utilisant des co-solvants solubles dans l’eau tels que l’éthanol, le
polyéthylène glycol 300, la 2-pyrrolidone et le DMSO, afin d’améliorer l’injectabilité de ces
systèmes (Ahmed et al., 2010).
Figure 19. Structure cubique tridimensionnelle de la phase cristalline glycerilmonooleate – eau (Shah et al., 2001).
2.3.3.2.1.5 Systèmes in situ par précipitation

D’autres méthodes pour l’obtention de dépôts in situ sont fondées sur les phénomènes de
précipitation. Ce phénomène peut être induit par différents facteurs tels que ; i) un changement du
pH ou ii) l’extraction du solvant dans lequel le polymère ou la substance constituant la matrice sont
dissous.
2.3.3.2.1.5.1 Systèmes par précipitation pH dépendante

L’obtention d’un gel suite à la précipitation d’un polymère par un changement de pH, constitue une
autre méthode pour l’obtention de dépôts in situ. Ce phénomène a lieu notamment lorsque le
67
polymère possède des groupements acides ou basiques faibles. Ainsi, si le polymère possède des
groupements acides faibles, il sera plus hydraté pour des valeurs de pH basiques où sa charge
négative prédomine. En revanche, pour des valeurs de pH faibles, le groupement acide ne sera plus
ionisé et la solubilité du polymère diminuera entraînant sa précipitation. Cependant, la plupart des
travaux utilisant cette méthode, ont été réalisés avec des polymères biocompatibles mais non
biodégradables tels que le chitosane et les méthacrylates (Siegel and Firestone, 1988) et qui ne sont
pas autorisés pour la voie parentérale, ni par la FDA, ni par l’EMEA.
2.3.3.2.1.5.2 Systèmes par précipitation-extraction dépendante

En fonction de la nature de la matrice responsable de la libération prolongée du principe actif, ces
systèmes peuvent être classés comme des systèmes non-polymériques ou polymériques.
2.3.3.2.1.5.2.1 Systèmes non polymériques

Le système non-polymérique se formant in situ par précipitation décrit dans la littérature, utilise
l’acétate isobutyrate de saccharose (SAIB), un composé biodégradable et insoluble dans l’eau
(Tipton and Richard, 1998). La lipophilicité de SAIB (Figure 20) est due à l’estérification de tous
les groupements –OH saccharose, un disaccharide très soluble dans l’eau.
Figure 20. Structure chimique de l’acétate isobutirate de Saccharose (SAIB) (Okumu et al., 2002).
68
Ce composé non cristallin et hautement visqueux, est couramment utilisé comme agent émulsifiant,
stabilisant ou directement en tant qu’additif dans l’industrie alimentaire humaine (Matschke et al.,
2002). La plateforme brevetée utilisant cette technologie est appelée SABER Delivery System
(Durect Corporation, USA). Dans ce système, le SAIB est dissous dans un solvant organique
soluble dans l’eau tel que le DMSO, l’éthanol, la NMP, la 2-pyrrolidone ou le benzoate de benzyle
dans lequel le principe actif est également dissous ou suspendu. L’un des avantages de ce système
est la faible viscosité des solutions de SAIB les rendant facilement injectables (Hatefi and Amsden,
2002). Lors de l’injection de ce système, le solvant hydrosoluble diffuse vers le milieu environnant
aqueux induisant la précipitation du SAIB et la formation d’un dépôt très visqueux contenant le
principe actif. Une fois formé, le système permet la libération du principe actif de façon prolongée
en fonction de certains paramètres tels que la solubilité du principe actif dans le solvant, sa
concentration et sa solubilité dans la matrice SAIB. La libération du principe actif peut aussi être
modulée par l’ajout d’un excipient tel que le PLGA, qui modifie la diffusivité du principe actif dans
le SAIB. Le système SABER a été utilisé pour l’administration de principes actifs tels que des
protéines, des peptides et des petites molécules (Okumu et al., 2002). Des produits vétérinaires
basés sur ce système sont actuellement développés par Thorn Bioscience LLC. Par exemple, ils ont
utilisé le SAIB chez la jument et chez le porc pour la libération de desloréline, un puissant analogue
de l’hormone de libération de la gonadotrophine (GnRH), afin d’induire et de contrôler le moment
de l’ovulation, avant une insémination artificielle. Parmi les autres produits en développement dans
le même domaine figure le SABER Mate B (Bovine) pour la libération contrôlée de l’acétate de
desloréline dans le cadre du protocole de traitement Ovsynch® (GnRH/PGF2α/GnRH) qui apporte
une synchronisation du développement folliculaire, de la régression lutéale (progésterone) et de
l’ovulation, permettant ainsi l'insémination dans les 12 à 24 h après la fin du protocole (Rathbone
and Martinez, 2002). Cependant, le SAIB n’a pas encore été autorisé pour une utilisation
parentérale (Hatefi and Amsden, 2002).
69
2.3.3.2.1.5.2.2 Systèmes polymériques

Le concept de formation d’implants polymériques par la méthode de précipitation du polymère in
situ par extraction de solvant développé en 1990 (Dunn et al., 1990, 1998), a été utilisé dans le
domaine humain et vétérinaire pour la formulation de certains produits pharmaceutiques (tableau 1).
Dans cette méthode, un polymère biodégradable insoluble dans l’eau tels que l’acide poly(D,L-
lactique) ou le poly(D,L-lactique-co-glycolique), est dissous dans un solvant organique
biocompatible où le principe actif est aussi solubilisé ou suspendu. Lorsque cette formulation est
injectée dans le corps (IM ou SC), le solvant organique diffuse vers le milieu physiologique aqueux,
tandis que l’eau pénètre dans la solution polymérique. Ce phénomène conduit à une séparation de
phases et à la précipitation du polymère aboutissant à la formation d’un implant in situ et à
l’incorporation du principe actif au sein de la matrice formée. Puisque les implants injectables sont
administrés à l’état liquide, il existe un temps de latence (« lag time ») entre le moment de
l’injection et la formation de l’implant solide. Pendant ce temps, le solvant biocompatible diffuse
emportant avec lui le principe actif ce qui entraîne une forte libération initiale du principe actif
(« burst ») plus élevée que dans le cas des implants préformés (section 1.4.2.1) (Shively et al., 1995)
Cette technologie a été utilisée pour la libération prolongée de différentes molécules : des protéines
(Brodbeck et al., 1999; Eliaz and Kost, 2000; Eliaz et al., 2000; Lambert and Peck, 1995), des
antagonistes de la LHRH (Ravivarapu et al., 2000; Sartor, 2003), des anticancéreux (Havlicek et al.,
2009), des antagonistes d’opiacés, des facteurs de croissance, des anti-inflammatoires (Shah et al.,
1993; Shively et al., 1995), de l’ADN (Eliaz and Szoka Jr, 2002) et des antibiotiques (Steinberg and
Friedman, 1999).
Toute une variété de solvants biocompatibles tels que la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP), le

propylène glycol, l’acétone, le diméthylsulfoxyde (DMSO), la 2-pyrrolidone (2P), la triacétine (TA)
70
(Hatefi and Amsden, 2002), le benzoate de benzyle (BB), le glycofurol (Eliaz et al., 2000; Matschke
et al., 2002), le benzoate d’éthyle (Brodbeck et al., 1999), le citrate de triéthyle, le PEG 400
(polyéthylène glycol), l’acétate d’éthyle (Dong et al., 2006), l’alcool benzylique et le carbonate de
propylène (Rungseevijitprapa et al., 2008) ont été utilisés dans la formulation de ces systèmes. Pour
être applicable à la voie parentérale, le solvant doit être non seulement biocompatible et non toxique
(Matschke et al., 2002), mais aussi dans le cas des implants in situ , permettre une bonne
solubilisation du polymère afin d’obtenir des solutions concentrées (>100 mg/mL) permettant un
taux élevé d’incorporation du principe actif dans le dépôt et sa libération prolongée (Shively et al.,
1995). En outre, le solvant doit permettre l’obtention de solutions polymériques de viscosité
facilement injectables en utilisant une seringue conventionnelle (Rungseevijitprapa and Bodmeier,
2009). Enfin, le solvant ne doit pas compromettre la stabilité du polymère ni celle du principe actif
(Dong et al., 2006; Ravivarapu et al., 2000).
En ce qui concerne la toxicité des solvants, les normes de l’EMEA basées sur les directives ICH
(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use) (Q3C Impuretés : solvants résiduels), reprennent les niveaux
limites résiduels d’exposition autorisés chez l’Homme. Cette norme classe les solvants organiques
par rapport à leur degré de toxicité dans 3 groupes, à savoir :
- la Classe 1 : comprend les solvants toxiques, qui doivent être évités car ils sont carcinogènes ou
suspectés de l’être et qui sont dangereux pour l’environnement,
- la Classe 2 : comprend les solvants dont l’usage doit être limité bien que leur toxicité soit
réversible
- et enfin, la Classe 3 : regroupe les solvants avec un faible potentiel de toxicité et dont l’exposition
journalière autorisée (PDE : permitted daily exposure) est ≥ 50 mg / jour (EMEA, 1998).
71
La NMP, le DMSO et le PEG 400 sont déjà utilisés dans des produits commerciaux destinés à la
voie parentérale chez l’Homme (Strickley, 2004). Le NMP et le DMSO sont des solvants classés
dans les groupes 2 et 3 mais avec des PDE très similaires, 48 et 50 mg/jour, respectivement. Leurs
LD50 IV chez le rat sont 2,4 g/kg (NMP) et 5,2 g/kg (DMSO). Dans une étude sur le macaque
Rhésus (Macaca mullata), où ces deux solvants ont été utilisés à 60%, pour des formulations
d’implants in situ à base du copolymère DL-lactique/ε-caprolactone administrées par les voies IM
et SC, les résultats histologiques et de comportement ont montré une bonne tolérance des animaux à
ces solvants (Royals et al., 1999). Une autre étude de myotoxicité des implants de PLA et PLGA
(40%), formulés à base de NMP, DMSO ou 2-pyrrolidone, a montré l’ordre de toxicité suivant pour
ces solvants : NMP>DMSO>2-pyrrolidone. En effet, la quantité de créatine kinase libérée, à partir
du muscle squelettique de rat isolé, un indicateur de dommage tissulaire, a été la plus grande pour
les formulations à base de NMP (Kranz et al., 2001). Une étude similaire utilisant des solvants
moyennement solubles dans l’eau, a montré l’ordre suivant de myotoxicité: alcool
benzylique>citrate de triéthyle>triacétine>carbonate de propylène>acétate d’éthyle
(Rungseevijitprapa et al., 2008). Le glycérol formal et le propylène glycol sont utilisés dans la
formulation d’un produit vétérinaire à base d’ivermectine (Ivomec 1% ; SC). Dans le même
domaine, la NMP est utilisée pour la formulation du Nuflor Swine (IM) contenant l’antibiotique
florfénicol. La 2-pyrrolidone (Soluphor P ; BASF) fait partie des solvants fréquemment utilisés
dans les formulations vétérinaires injectables à libération prolongée d’oxytétracycline (BASF,
1991). La triacétine et le citrate de triéthyle sont utilisés pour la fabrication de formes
pharmaceutiques orales et sont généralement considérés comme sûrs (GRAS : Generally
Recognized As Safe). La triacétine est considérée comme un nutriment parentéral potentiel et a été
utilisée dans ce but chez le rat (Bailey et al., 1992) et chez le chien (Bleiberg et al., 1993). Le
glycofurol a été utilisé comme solvant dans des produits injectables à une concentration pouvant
72
atteindre 50% v/v (Eliaz and Kost, 2000). De même, le benzoate de benzyle peut être utilisé pour la
voie parentérale à des concentrations pouvant aller jusqu’à 46% (v/v) (Rowe et al., 2006). Enfin,
l’acétate d’éthyle, solvant de Classe 3, peut également être utilisé pour la fabrication de ces
implants (Dong et al., 2006).
En fonction de la solubilité dans l’eau du solvant biocompatible, la libération du principe actif à

partir des implants peut être plus ou moins rapide. De ce fait, plusieurs types de systèmes ont été
développés en utilisant la méthode de précipitation du polymère in situ par extraction du solvant. Le
premier est le système ou Technologie Atrigel (Atrix laboratories) développé à partir du brevet
de Dunn et collaborateurs en 1990 (Dunn et al., 1990, 1998). Cette technologie utilise des solvants
organiques de solubilité dans l’eau supérieure à 7 %. Jusqu’à présent, deux produits
pharmaceutiques commercialisés utilisent la technologie Atrigel. Le plus connu est Eligard
(Atrix laboratories, Fort Collins, USA), contenant l’acétate de leuprolide, un agoniste de la LHRH,
utilisé pour le traitement du cancer de la prostate. Dans ce système, le principe actif (7,5, 22,5 ou 30
mg) et le polymère (PLGA 75/25) (≈40%) sont dissous dans le solvant hydrophile NMP (Sartor,
2003). Ce système permet l’inhibition de la production de testostérone chez le chien pendant
environ 91 jours (Packhaeuser et al., 2004). Par ailleurs, il existe aussi la spécialité Atridox (Atrix
laboratories, Fort Collins, USA) utilisé pour la libération prolongée de l’hyclate de doxycicline dans
le traitement de la maladie périodontale chez l’homme (Steinberg and Friedman, 1999). Ce produit
contient une solution de PLA (36.7%) dans la NMP (63.3%) où le principe actif (42.5 mg) est
dissous juste avant injection chez le patient. Lors de l’injection, le polymère précipite ce qui
entraîne la formation d’un dépôt in situ à partir duquel la libération du principe actif est prolongée
pendant 7 jours. Une formulation similaire de doxicycline commercialisée sous le nom de
Doxirobe est également utilisée pour le traitement de la maladie periodontale chez le chien (Atrix
laboratories, Fort Collins, USA).
73
D’autres solvants miscibles à l’eau, autres que la NMP, peuvent être utilisés pour la formulation de
ces systèmes in situ . De façon générale, les solvants avec un paramètre de solubilité d’Hildebrand
(HLB) compris entre 9 et 13 (cal/cm3)1/2 permettent une solubilisation adéquate des polymères
(Shively et al., 1995) (Atrix Laboratories, Canada). Ainsi, des solvants tels que le DMSO, l’acétate
d’éthyle, l’acétone (Lambert and Peck, 1995) (Pfizer), la 2-pyrrolidone, le propylène glycol, le
carbonate de propylène (Dunn et al., 1997) et le glycofurol (Eliaz and Kost, 1997; Eliaz and Kost,
2000; Eliaz et al., 2000) ont été utilisés pour la formulation de ces systèmes.
Un des problèmes des systèmes in situ est la libération initiale rapide du principe actif, notamment
lorsque des solvants d’une relativement haute solubilité dans l’eau sont utilisés (Ruel-Gariépy and
Leroux, 2004). D’autre part, lors de l’injection des solutions polymériques, les formes finales des
implants obtenues ne sont pas couramment reproductibles, ce qui peut entraîner différents profils de
libération pour une même formulation (Bodmeier, 1998). Ceci peut être notamment dangereux dans
le cas de principes actifs à faible indice thérapeutique tels que les anticancéreux (5-fluorouracile),
les anticonvulsivants (carbamazépine), ou encore des hormones comme l’hormone de croissance
humaine (Wang et al., 2004). En effet, dans les formulations in situ , le burst est un phénomène
principalement contrôlé par la dynamique d’inversion des phases qui est d’ailleurs un processus
complexe. Puisque, avec les solvants hydrophiles, la diffusion du solvant vers le milieu
physiologique (efflux) est rapide et que l’affinité de l’eau pour la phase polymérique est importante
elle aussi (influx), la diffusion du principe actif vers le milieu extérieur est favorisée (Graham et al.,
1999). La grande vitesse à laquelle ce phénomène a lieu, induit la formation d’implants contenant
de nombreux pores digités qui communiquent entre eux depuis l’intérieur vers la surface du
système, constituant un réseau qui favorise la diffusion du principe actif vers l’extérieur du dépôt
(Brodbeck et al., 1999). Certains paramètres ralentissant cette dynamique d’inversion des phases
contribuent à la réduction du « burst » des formulations. Ainsi, l’ajout de solvants lipophiles aux
74
solutions du polymère dans des solvants hydrophiles diminue l’affinité de l’eau pour la phase
polymérique (Matschke et al., 2002). Par exemple, Graham et col. ont démontré une réduction
significative de la libération initiale de lysozyme, lorsque la triacétine (lipophile) a été rajoutée à
des solutions de PLGA dans la NMP (hydrophile) (Graham et al., 1999). De façon similaire, le
mélange glycofurol (hydrophile) / triacétine (lipophile) a également été utilisé pour atténuer
l’ « effet burst » des formulations (Chern and Zingerman, 1999) (Merck).
Une autre technologie développée afin de diminuer le « burst » des systèmes in situ , est celle
appelée Dépôt Alzamer (Alza corporation, Canada) (Brodbeck et al., 2000). Ce système est un
peu plus complexe. Il est constitué d’un polymère biodégradable, d’un solvant peu soluble dans
l’eau (< 7%) et de microparticules préalablement formulées et qui contiennent le principe actif
(Chen and Junnarkar, 2008). Parmi les solvants utilisés dans cette technologie peuvent être cités le
benzoate de benzyle (Brodbeck et al., 2000), le benzoate d’éthyle (Brodbeck et al., 1999), la
triacétine, le citrate de triéthyle (Shah et al., 1993) et l’alcool benzylique (Chhabra et al., 2007). En
utilisant ces solvants, la dynamique d’inversion de phases est ralentie de façon importante en raison
d’une faible incorporation d’eau dans la phase polymérique et d’une faible diffusion du solvant vers
le milieu extérieur. Ceci est mis en évidence par une diminution de la vitesse de précipitation du
polymère, ce qui conduit par ailleurs à l’obtention d’implants moins poreux par opposition à ceux
issus de l’utilisation de solvants hydrophiles. Ici, la structure des implants obtenus est assimilable
plutôt à celle d’une « éponge » ou les pores ne communiquent pas entre eux, ce qui oblige le
principe actif à diffuser avec le solvant à travers la matrice polymérique. Tout ceci conduit à une
faible diffusion du principe actif et donc à un faible « burst ». Dans ce système, le principe actif
peut être mis en suspension dans le solvant à des concentrations supérieures à celle de sa saturation
dans l’eau, permettant ainsi l’obtention de cinétiques de libération d’ordre zéro (Brodbeck et al.,
2000). Ainsi, cette technologie est utilisée pour la formulation de systèmes in situ contenant des
75
principes actifs tels que des protéines, des peptides mais aussi de petites molécules (Chen and
Junnarkar, 2008). On peut citer à titre d’exemple, l’utilisation de la triacétine et du benzoate
d’éthyle pour la réduction significative du « burst » dans la libération de lysozyme à partir
d’implants de PLGA initialement formulés avec la NMP (Brodbeck et al., 1999) et des travaux
comparant l’influence des mécanismes de formation des dépôts de PLGA avec la NMP, la triacétine
et le benzoate de benzyle comme solvants, sur la cinétique de libération du métochlopramide (Wang
et al., 2004).
Différents paramètres autres que le solvant, peuvent également aboutir à une réduction du « burst »
ou contribuer à moduler la libération du principe actif à partir des systèmes in situ . Une équation
simple mettant en rapport ces paramètres avec la quantité de principe actif libéré au cours du temps
a été proposée (Shah et al., 1993) ;
Qt = (a1, a2, b, c, d)
f
(Qt) étant la quantité de principe actif libéré au temps t, (a1) le rapport lactique/glycolique dans le
polymère, (a2) la masse moléculaire du polymère, (b) la concentration du polymère, (c) la
concentration d’un additif (hydrophile ou lipophile) et (d) la concentration du principe actif. De
nombreux travaux mettant en évidence l’effet de ces variables sur la libération de principes actifs
ont été publiés. Ainsi, la libération initiale d’une protéine récepteur du facteur de nécrose tumorale
(TNFα), à partir d’implants de PLGA formulés en glycofurol, a été ralentie en modifiant plusieurs
paramètres liés au polymère comme une augmentation de sa concentration, de sa masse moléculaire
et du rapport d’acide lactique / acide lactique dans le copolymère. La première modification agit
plutôt par une augmentation de la viscosité alors que les deux dernières le font par une
augmentation de l’hydrophobicité de la solution polymérique qui induit une précipitation plus
rapide du polymère. En revanche, une importante augmentation de la libération de la protéine a été
76
observée par une élévation de sa concentration dans la solution polymérique de 3 à 10%. En effet,
en augmentant la concentration, la force de diffusion de la protéine pour quitter le système est plus
élevée, ce qui favorise sa libération. D’autre part, quand la concentration de la protéine suspendue
augmente, sa solubilisation et sa diffusion vers l’extérieur créent une matrice plus poreuse et de plus
faible tortuosité qui accélère la vitesse de dégradation du polymère et la libération de la protéine
(Eliaz and Kost, 2000). L’état physique, dissous ou suspendu, du principe actif a aussi un effet sur
la vitesse de libération. En général, la vitesse de libération augmente lorsque le principe actif est
suspendu (Körber and Bodmeier, 2008; Shah et al., 1993). Ceci peut s’expliquer par le fait qu’un
principe actif en suspension, comme expliqué précédemment, crée un réseau poreux lorsque il est
solubilisé par l’eau, ce qui contribue à sa libération rapide. En revanche, le principe actif dissous,
subissant un phénomène de partage entre l’eau et le système polymère/solvant, a une vitesse de
diffusion plus faible. En outre, il a été observé que les additifs qui augmentent le taux
d’incorporation d’eau dans la solution polymérique tels que le mannitol, le chlorure de sodium
(Shah et al., 1993) et la polyvinylpyrrolidone (Graham et al., 1999), favorisent la libération du
principe actif, tandis que ceux qui la rendent plus hydrophobe comme c’est le cas des triglycérides
de chaîne moyenne, la diminuent. Ainsi, une augmentation de la vitesse de libération de la
myoglobine à partir d’implants formés à l’injection d’une solution de PLGA dans la triacétine a été
obtenue par l’adition de mannitol alors qu’une réduction a été constatée par celle de miglyol 812
(triglycéride de chaîne moyenne) (Shah et al., 1993). Les implants in situ (ISI) possèdent des
avantages sur les systèmes implantables préformés, mais ils présentent plusieurs inconvénients liés
à la haute viscosité des solutions polymériques les rendant difficiles à injecter, à la libération rapide
du principe actif en raison du temps de latence entre l’injection et la formation du système (« lag
time ») et à la toxicité éventuelle des solvants utilisés (Kranz and Bodmeier, 2008).
77
2.3.3.3 Microparticules in situ (ISM)
En réponse aux problèmes associés à l’utilisation des microparticules préformées et des implants in
situ , de nouvelles méthodologies pour l’obtention de microparticules in situ (ISM) ont été
développées. De façon générale, les ISM peuvent être obtenues par deux mécanismes : la
coacervation ou l’extraction de solvant.
2.3.3.3.1 ISM par coacervation

Cette méthode consiste en une dispersion stable de microglobules (‘pré-microsphères’ ou
‘microsphères embryonnaires’) de PLGA dans une phase dispersante appropriée. Lors de son
injection dans le corps, le milieu physiologique aqueux induit le durcissement des microglobules
sous la forme de microparticules et le principe actif est incorporé dans la matrice solide formée. Le
principe actif est ensuite libéré de façon prolongée à partir des microsphères. Cette méthode a été
initialement conçue pour la libération prolongée de peptides et de protéines (Jain et al., 2000). Dans
la préparation de ce système Jain et al. ont préparé tout d’abord une solution de PLGA dans la
triacétine à la quelle une solution de Tween£ 80 dans du PEG 400 contenant une protéine modèle
(cytocrome c) a été ajoutée constituant ainsi une première phase huileuse. Cette phase huileuse 1 est
ajoutée goutte à goutte, sous agitation continue à une deuxième phase huileuse constituée de
Miglyol£ 812 et du Span£ 80, ce qui entraîne la séparation « coacervation » du PLGA et la
formation des microglobules de PLGA contenant la protéine. Cette préparation est décrite comme
possédant une viscosité permettant son injection chez le patient. L’injection de ce système induit le
durcissement des microparticules de PLGA contenant le principe actif comme décrit précédemment
(Jain, 2000).
L’influence de plusieurs paramètres sur le taux d’encapsulation et la vitesse de libération in vitro du

cytochrome c à partir de ce système ont été étudiées. Ainsi, il a été observé que le taux
78
d’encapsulation de la protéine augmentait en diminuant la concentration de PEG 400 dans la phase

huileuse 2 et en augmentant la concentration du principe actif. La vitesse de libération du
cytochrome c augmente avec son taux d’incorporation dans les microsphères et avec la proportion
de mannitol (Jain et al., 2000).
2.3.3.3.2 ISM par extraction de solvant

Dans cette méthode, une phase polymérique semblable à celle utilisée pour la fabrication des ISI et
contenant le principe actif (suspendu ou dissous), est émulsifiée, juste avant injection, avec une
autre phase soit organique (par exemple une huile végétale) (ISM-O/O), soit aqueuse (par exemple
de l’eau) (ISM-O/W) à l’aide d’un système de va-et-vient constitué de deux seringues contenant
chacune une phase et reliées par un connecteur. L’émulsification a lieu, par le passage répété de
chacune des phases d’une seringue à l’autre à travers le connecteur (faible en diamètre). Chaque
aller-retour du système constitue un cycle d’émulsification et la vitesse d’émulsification est
exprimée en nombre de cycles par seconde (c/s) (Figure 21).
Phase interne Phase externe

(Polymère + Solvant + PA) (aqueuse ou huileuse)
Plusieurs cycles d’émulsification va-et-vient
Figure 21. Dispositif utilisé pour l’émulsification de phases avant l’injection chez le patient.
79
Lors de l’injection de cette émulsion, le système entre en contact avec l’environnement aqueux des
fluides physiologiques, ce qui entraîne la diffusion du solvant organique de la phase polymérique
(phase interne) vers le milieu aqueux environnant, conduisant ainsi à la précipitation du polymère
sous la forme de microparticules où le principe actif est retenu (Bodmeier, 1998; Kranz and
Bodmeier, 2007) (Figure 22).
Les solvants utilisés pour la préparation des ISI par précipitation du polymère, peuvent être utilisés
pour la préparation des phases polymériques (internes) des ISM. Cependant, en fonction de leur
solubilité dans l’eau, ils sont employés soit pour des ISM-O/O (solvants hydrophiles) soit pour des
ISM-O/W (solvants hydrophobes). De ce fait, le solvant choisi doit être insoluble dans la phase
externe de l’émulsion afin de garantir l’existence des deux phases. En ce qui concerne la phase
externe des ISM-O/O, les huiles végétales le plus couramment utilisées sont l’huile d’arachide,
l’huile de sésame et l’huile de soja auxquelles un tensioactif hydrophobe (ex. Span 80) et des
stabilisants de l’émulsion (ex. monostéarate d’aluminium) peuvent être incorporés (Luan and
Bodmeier, 2006a). Dans les ISM-O/W, la phase externe consiste habituellement en une solution
aqueuse d’un tensioactif hydrophile (ex. Tween 80, Lutrol 68) (Im-Emsap, 2002).
Figure 22. Phénomène d’inversion de phases lors de l’obtention de ISM ; (A) Injection de l’émulsion (O/O) ou (O/W)
dans le milieu aqueux ou les tissus (B) diffusion du solvant biocompatible et vers le milieu extérieur (C) précipitation
des ISM. ( ) phase polymérique interne, ( ) phase externe, ( ) ISM, ( ) milieu aqueux extérieur.
80
Plusieurs paramètres tels que le type de polymère (Luan and Bodmeier, 2006b), la vitesse
d’émulsification, la concentration du polymère et celle du principe actif dans la phase polymérique,
le rapport phase polymérique/phase externe, la concentration du tensioactif et la présence d’additifs
déterminent la vitesse de libération des principes actifs à partir de ces systèmes (Luan and
Bodmeier, 2006a).
Ainsi, les ISM possèdent une plus faible toxicité et sont aussi plus facilement injectables que les ISI
(Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009). Ceci s’explique par la biocompatibilité des huiles
végétales utilisées qui également déterminent une viscosité de la préparation plus faible que celle de
la phase polymérique. La myotoxicité des ISM (ISM-O/W ou ISM-O/O) a été étudiée sur le muscle
isolé de rat (Kranz et al., 2001; Rungseevijitprapa et al., 2008). Dans ces études, une moindre
toxicité des ISM a été constatée par rapport aux ISI et aux solvants biocompatibles purs. D’autre
part, la méthode de préparation des microparticules in situ est plus simple que les méthodes
classiques de préparation de microparticules. Par exemple, en ce qui concerne la stérilisation, le
produit peut être fabriqué dans des conditions aseptiques en rajoutant une filtration finale. Sinon,
une stérilisation finale par rayons gamma peut aussi être réalisée (Kranz and Bodmeier, 2007).
2.4 Caractérisation physicochimique et comportement des polymères en solution
La capacité d’un solvant pour dissoudre un polymère, est une caractéristique très importante
lorsqu’il est utilisé pour la préparation de systèmes de libération prolongée de principes actifs selon
les méthodes décrites précédemment. Cette capacité est notamment déterminée par la force des
interactions (affinités) mises en jeu, lorsque des couples solvant/polymère entrent en contact. De ce
fait, la caractérisation des interactions solvant/polymère détermine, dans quelle mesure ou dans
quelles situations, ces couples peuvent être utilisés pour un objectif galénique spécifique. Par
exemple, ces interactions sont responsables de certaines propriétés physico-chimiques des solutions
81
polymériques telles que la viscosité et la rhéologie. Ces propriétés ont un rôle très important sur les
caractéristiques des systèmes de libération réalisés, telles que la forme et la taille mais aussi sur des
autres reliées au principe actif comme le taux d’incorporation et la vitesse de libération. Ainsi, des
paramètres de solubilité ont été utilisés pour caractériser ces interactions.
2.4.1 Paramètres de solubilité

Les paramètres de solubilité ont été largement utilisés pour mieux comprendre le comportement des
polymères en solutions organiques (Barton, 1991). En effet, ces outils physico-chimiques ont eu une
importance majeure dans la détermination de la qualité des solvants vis-à-vis des polymères
biodégradables utilisés pour la préparation de systèmes de libération de principes actifs tels que les
microparticules (Bodmeier and McGinity, 1988), les nanoparticules (Legrand et al., 2007) ou les
systèmes in situ (Kranz and Bodmeier, 2008; Shively et al., 1995).
Dans un premier temps, le paramètre de solubilité d’Hildebrand (į) a été utilisé pour prédire la
solubilité des polymères dans différents solvants. Ce paramètre relie l’énergie de vaporisation
(densité d’énergie cohésive) d’un liquide avec sa capacité pour dissoudre un soluté, par exemple un
polymère :
į = (E/V)1/2 = [(¨H - RT)/V]1/2
où E représente l’énergie de vaporisation du solvant, V le volume molaire du solvant pure, ¨H la

chaleur de vaporisation, R la constante des gaz parfaits et T la température absolue. Ce paramètre
(į) est très utile dans la prédiction de relations de solubilité. L’énergie de vaporisation d’un liquide
est un indicatif du degré de forces de Van der Waals qui maintient les molécules du solvant
ensemble. Ce sont ces forces que doit également vaincre un soluté pour se dissoudre dans le solvant.
82
D’un point de vue thermodynamique, l’énergie de mélange de la solubilisation du polymère doit

être égale à zéro ou négative pour que le processus se déroule spontanément. Le changement
d’énergie du processus est décris par :
¨GM=¨HM - T¨SM
où ¨GM représente l’énergie libre de Gibbs de mélange, ¨HM la chaleur de mélange, T la

température absolue et ¨SM le changement d’entropie du processus de mélange. La chaleur de
mélange peut être exprimée en termes de fractions volumiques du solvant et du polymère
(Hildebrand and Scott, 1962) ainsi:
¨HM = φ1φ2V (į1-į2)
où φ1 et φ2 correspondent aux fractions volumiques du solvant et du polymère et V au volume

molaire du mélange. De ce fait, le processus de solubilisation du polymère est favorisé pour des
faibles volumes et pour des faibles différences dans les paramètres de solubilité du couple
solvant/polymère. De ce fait, il est également attendu que des solvants possédant des paramètres de
solubilité similaires peuvent dissoudre de la même façon un même polymère. Cependant, puisque la
théorie d’Hildebrand ne prend pas en compte les différents types d’associations entre les molécules
qui déterminent les forces de Van der Waals, telles que les liaisons d’hydrogène et les interactions
polaires, cette hypothèse n’est pas toujours valable et ce paramètre est seulement applicable aux
solutions régulières, c'est-à-dire les solutions dans lesquelles les interactions polymère/solvant sont
négligeables (comme les solutions diluées) (Hansen, 2007).
83
Un autre concept plus précis de paramètre de solubilité, conçoit l’énergie totale de vaporisation (į)
(Hildebrand) d’un solvant, comme la somme de plusieurs parties individuelles, à savoir; i) les
interactions atomiques non polaires (įd), ii) les interactions moléculaires permanentes dipole-
permanent dipôle (įp) et les liaisons moléculaires d’hydrogène (įH). Ces éléments sont appelés les
paramètres de solubilité de Hansen (HSP) (Hansen, 1967) ;
į = (įd2 + įp2 + įh2)1/2
Puisque, des matériaux présentant des valeurs de HSP semblables ont une affinité importante entre
eux, la valeur du paramètre ¨į (calculé selon la formule suivante) est souvent utilisée pour
déterminer leur niveau d’affinité :
¨į = [(įs - įp)2d + (įs - įp)2p + (įs - įp) 2h]1/2
où įs et įp sont les paramètres partiels de solubilité du solvant et du polymère respectivement. De ce

fait, plus le ¨į est faible, plus l’affinité et la solubilité sont importantes.
Ces paramètres ont été utilisés pour caractériser d’un point de vue qualitatif, différents matériaux
tels que des polymères (Schenderlein et al., 2004), des plastifiants, des tensioactifs et des principes
actifs (Hansen, 2004). Par exemple, le paramètre de solubilité d’Hildebrand a été utilisé pour
prédire la solubilité du PLA et du PLGA dans différents solvants organiques (Lambert and Peck,
1995; Shively et al., 1995). Ainsi, une solubilité maximale de ces polymères a été trouvée pour des
valeurs du paramètre de solubilité d’Hildebrand (į) comprises entre 9-11 (Lambert and Peck, 1995)
ou 9-12,3 (cal/cm3)1/2 (Shively et al., 1995). De plus, le taux d’incorporation de différents principes
actifs fortement hydrophobes, dans des micelles à base d’un copolyester d’ε-caprolactone et de
84
carbonate de trymethylène, a été déterminé par simulation et comparaison mathématiques des

paramètres de solubilité, donc de l’interaction entre les principes actifs et le polymère (Dwan'Isa et
al., 2005).
2.4.2 Viscosité des polymères en solution

La viscosité (dynamique et cinématique) des solutions polymériques est une propriété physico-
chimique fortement dépendante des interactions polymère-solvant. Ces interactions dépendent à la
fois de propriétés du polymère tels que sa nature, sa masse moléculaire, sa concentration et sa
conformation mais aussi du type de solvant (Teraoka, 2002) .
Figure 23. Régimes de concentration des solutions polymériques (Teraoka, 2002).
Comme le montre la figure 23, les interactions polymère-solvant changent en fonction de la

concentration du polymère dans le solvant. Dans des solutions diluées, les chaînes du polymère sont
séparées entre elles restant plus ou moins indépendantes. Ainsi, les chaînes polymériques
interagissent principalement avec les molécules du solvant. Cependant, pour une certaine valeur de
concentration (C*) les chaînes du polymère commencent à s’enchevêtrer entre elles ce qui
augmente les interactions polymère/polymère. Pour des concentrations C >> C*, les chaînes du
85
polymère sont superposées et enchevêtrées, et le système passe d’un régime dilué à un régime semi-
dilué pour lequel une augmentation importante de la viscosité a lieu (Teraoka, 2002).
Dans un régime dilué, la viscosité η de la solution polymérique est presque celle du solvant pur η0.
Ainsi, si l’on considère que le solvant et la solution possèdent la même densité (ρ) et que
l’écoulement libre de la solution pendant un temps (t) subit un régime linéaire, la viscosité relative
ηr de la solution peut être déterminée par :
ηr = η / η0 =ρt / ρ0t0 = t / t0
à partir du rapport des temps d’écoulement obtenus par viscosimétrie capillaire pour la solution
dilué (t) et pour le solvant (t0).
La viscosité spécifique ηs des solutions est reliée à la viscosité relative par l’expression ηs = ηr -1.
La valeur de l’intercepte des courbes ηsp / C en fonction de la concentration du polymère permet
l’obtention de la viscosité intrinsèque [η] de la solution selon la relation de Huggins (Huggins,
1942) :
ηsp / C = [η] + k’[η]2C
La viscosité intrinsèque est un indicatif de la taille et de la forme des polymères en solution et de ce

fait, elle reflète la capacité d’un polymère en solution à augmenter la viscosité de la solution (Pan
and Cheng, 2000).
Pour un polymère donné, il existe des solvants qui le dissolvent bien (appelés « bons solvants ») et
ceux qui le dissolvent plus difficilement (appelés « mauvais solvants ») (Teraoka, 2002). Ainsi,
86
lorsqu’un polymère est dissous dans un « bon solvant », les chaînes du polymère sont hautement
entourées par le solvant (étendues), empêchant ainsi les contacts polymère / polymère, ce qui
entraîne l’obtention d’une plus grande viscosité intrinsèque et d’une faible valeur de C* ([η] = 1 /
C*). En revanche, dans un « mauvais solvant » les interactions polymère / polymère sont plus
importantes que les interactions polymère / solvant. De ce fait, la configuration du polymère est
plutôt enroulée et contractée conduisant ainsi à une faible viscosité intrinsèque (Alfrey, 1947).
Cependant, pour un régime concentré C**, la viscosité des solutions polymériques est plus élevée
dans un « mauvais solvant » que dans un « bon solvant ». Ceci s'explique par une augmentation des
interactions polymère / polymère dans les « mauvais solvants » qui entraînent la formation
d’agrégats et ainsi une viscosité plus élevée. Au contraire, dans les « bons solvants », même si la
concentration est élevée, les interactions polymère / solvant prédominent sur les interactions
polymère / polymère conduisant à une viscosité plus faible.
Ainsi, différentes études de viscosimétrie ont été réalisées afin d’expliquer le comportement des
PLA et PLGA dans la fabrication de microparticules (Bodmeier and McGinity, 1988),
nanoparticules (Legrand et al., 2007) et des systèmes in situ (Kranz and Bodmeier, 2008).
87
3. TRAVAIL EXPERIMENTAL
88
3. Travail expérimental
3 TRAVAIL EXPERIMENTAL
3.1 Objectifs
L’objectif de ce travail a été de développer et de comparer des systèmes parentéraux,
biodégradables, conçus pour la libération prolongée d’une molécule lipophile antiparasitaire :
l’ivermectine. Les systèmes choisis à savoir; des microparticules préformées obtenues par la
méthode classique de simple émulsion - évaporation de solvant, des implants in situ (ISI) et des
microparticules in situ (ISM), ont été préparés en utilisant les polyesters de l’acide lactique et/ou
glycolique. De façon plus précise, les objectifs majeurs de ce travail ont consisté en:
a) La caractérisation physico-chimique de chacun des systèmes réalisés.

b) L’étude des facteurs permettant la modulation de la libération du principe actif in vitro
c) L’évaluation de la performance biopharmaceutique des formulations par des essais in vivo
89
3.2 Microparticules biodégradables pour la libération prolongée d’ivermectine et destinées

à la voie parentérale: caractérisation inet effet de quelques variables de
vitro
formulation
RESUME
Cette première étude expérimentale, publiée dans Journal of Microencapsulation, rapporte nos
premiers essais d’encapsulation de la molécule par la technique classiquement utilisée d’émulsion
simple – évaporation de solvant. Si d’autres auteurs avaient évoqué la possibilité d’encapsuler
l’IVM dans des microparticules de polymère (Miller et al., 1998, 1999), c’est plutôt dans un souci
d’optimisation des formulations et de détermination des paramètres physicochimiques critiques que
s’inscrit ce travail de caractérisation in vitro. Trois polyester biocompatibles ont été utilisés : des
polymères et copolymères d’acide lactique (PLA) et glycolique (PLGA) présentant des
groupements terminaux différents (ester pour le PLGA S et le PLA S et acide libre pour le PLGA
H). Le but était ici d’observer l’influence de ces polymères d’hydrophobie variable et de vitesse de
dégradation variable, sur l’encapsulation et la libération de l’IVM. L’impact d’un polymère ajouté
au procédé et connu pour former des pores, la polyvinylpyrrolidone (PVP), a été également étudié.
Ainsi les paramètres physico-chimiques des différentes microparticules préformées ont été
comparés: i) les particules présentaient une taille avoisinant 40 µm et permettaient d’encapsuler
environ 90%, quelque soit la nature du polymère utilisé, ii) les études réalisées en diffraction aux
rayons X et les analyses par calorimétrie différentielle ont montré que l’IVM se présentait à l’état
amorphe ou en dispersion moléculaire dans la matrice polymérique, iii) des profils de libération in
vitro bi- ou triphasique ont été obtenus en fonction du polymère utilisé. Par exemple, un profil
triphasique a été observé pour les formulations à base de polymères estérifiés (PLA S et PLGA S),
avec une libération plus importante pour le PLGA S (47% à 15 jours) que pour le PLA S (28% à 15
jours) lié à son caractère plus hydrophile. En revanche, le PLGA H a conduit à l’obtention d’un
profil biphasique avec une libération initiale très importante (38% dès les 24 premières heures) pour
90
atteindre 98 % au dixième jour. Ce polymère plus « hydrophile » que les deux précédents par la
présence de groupement carboxyle libre, permet une pénétration de l’eau plus importante dans la
matrice de polymère et ainsi une diffusion d’IVM vers le milieu extérieur plus aisée. Les
observations en microscopie électronique ont montré que l’ajout de PVP entraînait l’apparition de
pores à la surface des microparticules, permettant ainsi d’expliquer la libération de l’IVM plus
importante constatée pour ces formulations. Ainsi, la libération de l’IVM in vitro à partir de
microparticules de polymère peut être modulée par les caractéristiques des polymères et en
modifiant l’influx d’eau au sein des particules. Ce travail représente donc un point de départ
intéressant à la mise au point de formulation délivrant de l’IVM de façon prolongée, pour une
application vétérinaire.
91
Journal of Microencapsulation (2010)
Ivermectin-loaded microparticles for parenteral sustained release:

“in-vitro” characterization and effect of some formulation variables
J.A. Camargoa, A. Sapina, D. Dalozb, P. Maincenta
a
Nancy Université, Faculty of Pharmacy, Laboratory of Pharmaceutical Technology, 5, rue A. Lebrun, BP 80403,
54001 Nancy Cedex, France
b
Nancy Université, Ecole des Mines de Nancy, Laboratoire de Science et Génie des Matériaux et Métallurgie
(LSG2M), Parc de Saurupt CS 14 234, 54042 Nancy Cedex, France
* Correspondence:
Professor Philippe Maincent
Faculty of Pharmacy
Nancy University
5 rue Albert Lebrun
54000 Nancy, France
Phone: + 33 (3) 83 68 22 97
Fax: + 33 (3) 83 69 23 01
E-mail: [email protected]
92
Abstract
Ivermectin (IVM) is a BCS II drug with potent antiparasitic activity in veterinary applications. In
this study, poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) and poly(DL-lactide) (PLA) Ivermectin-loaded
microparticles were prepared by the simple emulsion (O/W) solvent evaporation method in order to
obtain sustained release formulations for parenteral applications. The effects of polymer end-groups
(ester or free acid) and the addition of the hydrophilic polyvinylpyrrolidone polymer (PVP) in in-
vitro drug release profiles were also studied. X-ray diffraction (XRD) and differential scanning
calorimetry (DSC) analysis showed that IVM was present in an amorphous state or as a molecular
dispersion within the polymers or theirs mixtures with PVP and that a PVP-drug complex was
formed. Drug entrapment efficiency in the microparticles (>90%) was independent of the polymer
composition, the end groups and the presence of PVP. However, microscopic (SEM) observations
showed that addition of PVP led to more porous microparticles accompanied by increased rates of
drug release.
Keywords: Ivermectin, sustained release, microparticles, PLGA, PLA
93
1. Introduction
Ivermectin (IVM) is a macrocyclic lactone with a potent antiparasitic activity which has been used
successfully since the 80s (Omura, 2008) in livestock, pets and even in humans (Bassissi et al.,
2006) at a therapeutic dose of 200 µg / kg. In veterinary medicine, it has proved to be very useful
for the control of endo-and ectoparasites such as nematodes, fleas, flies, ticks and mites, which has
a great impact in the animal health market. For example, the infestation of dairy cows with
ectoparasites leads to loss of weight and reduced milk production and thus affects productivity.
Ectoparasites also cause skin diseases in pet animals (Winzenburg et al., 2004). The oral
bioavailability of IVM is very low, mainly due to its poor water solubility (Class II - BCS) (Takano
et al., 2006), its binding to organic material in the intestine (Gokbulut et al., 2006) and its secretion
by the P-glycoprotein present in the intestinal epithelium (Gonzalez Canga et al., 2009). As a result,
IVM is administered subcutaneously to maximize its bioavailability by avoiding gastrointestinal
barriers and the hepatic first past effect. Nevertheless, its repeated and often indiscriminate use has
lead to treatment failures and the appearance of resistance in some animal species. In the light of
this and the fact that the efficacy of IVM, like all antiparasitic drugs, is mainly dependent on the
duration in which the concentration above the toxic threshold for the target parasite (Hennessy,
1997), this drug is a potential candidate for formulation in parenteral controlled delivery systems.
Microparticulate parenteral delivery systems for controlled drug release have gained importance in
recent years (Freiberg and Zhu, 2004). They can act as “intelligent” devices to maximise the drug
availability and provide appropriate therapeutic levels throughout treatment. Furthermore, patient
compliance and comfort are improved and side effects reduced because of a smaller number of
injections. Several types of synthetic and natural materials have been used to prepare microparticles
for controlled drug release. Until now, materials such as silicone, polyurethane, ethylene
vinylacetate copolymers which are inexpensive, biocompatible and biologically inert and that have
94
received regulatory approval have been used to manufacture the majority of veterinary drug
delivery systems. Nevertheless, in recent years the interest in biodegradable polymers as systems of
controlled and prolonged drug delivery for veterinary applications has grown in importance. The
reason is that delivery systems based on biodegradable polymers do not require removal from the
animals at the end of the treatment period (Brannon-Peppas, 1995; Sun et al., 2004) since they are
degraded into metabolites that can be readily excreted from the body (Winzenburg et al., 2004).
Among these polymers, the synthetic polyesters poly(lactic acid) (PLA) and poly(lactic-co-glycolic
acid) (PLGA) have been the materials of choice because of their recognized biodegradability and
biocompatibility (Brannon-Peppas, 1995; Shive and Anderson, 1997; Uhrich et al., 1999). With
these materials, polymer degradation and the resulting profiles of controlled drug release up to days,
weeks or months (Mundargi et al., 2008) can be modified as a function of the polymer composition
(Frank et al., 2005), crystallinity (Brannon-Peppas, 1995; Uhrich et al., 1999), molecular weight
(Jaraswekin et al., 2007) and the terminal functional groups (i.e. ester or free-acid) (Chhabra et al.,
2007; Tracy et al., 1999). However, drug properties (Frank et al., 2005; Klose et al., 2008) and
physical device characteristics such as shape (Klose et al., 2008), porosity and size (Dunne et al.,
2000; Herrmann and Bodmeier, 1995; Klose et al., 2006) have also an important role in determining
the way in which drug is released. Appropriate controlled release profiles can also be obtained by
modifying the topological (porosity) and physicochemical (hydrophilicity) properties of the
microparticles with excipients such as polyvinylpyrrolidone (PVP), medium chain triglyceride
(MCT) (Luan and Bodmeier, 2006), D-mannitol, bovine serum albumin (BSA) and polyethylene
glycol (PEG) (Kim et al., 2000). PLGA microparticles loaded with IVM have already been prepared
but the authors principally focused on in vivo studies (Clark et al., 2004; Miller et al., 1999; Miller
et al., 1998) without giving special attention to formulation factors that could affect drug release in
order to create more rational parenteral dosage forms.
95
Thus, the objective of this study was to produce and characterize sustained release formulations of
IVM based on PLA and PLGA microparticles obtained by the simple emulsion (O / W) solvent
evaporation method. The effect of some variables such as polymer composition, polymer end
groups (ester or free-acid) and the addition of a pore former (PVP) on the release of IVM “in vitro”
and on the properties of the microparticles was studied
96
2. Materials and Methods
2.1. Materials
The following chemicals were used as received: Poly (DL-lactide) (PLA; Resomer® R 203 S, end-
capped, iv 0.31 dL/g), poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA 50:50; Resomer® RG 502 H,
uncapped, iv 0.18 dL/g and Resomer® RG 502 S, end-capped, iv 0.20 dL/g) (Boehringer Ingelheim,
Ingelheim, Germany), methylene chloride, sodium hydroxide, orthophosphoric acid, potassium
dihydrogen phosphate (VWR Prolabo, Fontenay Sous Bois, France), polyvinylpyrrolidone (PVP)
(Kollidon® 17 PF endotoxin-free, BASF AG, Ludwigshafen, Germany). Ivermectine (IVM),
polyethylene glycol sorbitan monooleate (Tween® 80, HLB: 14.9), polyvinyl alcohol (PVA, Mw
30.000 Da, 88 % hydrolyzed) (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France). Acetonitrile (Carlo Erba-
SDS, Val de Reuil, France). Deionized water was obtained using an ELGA system (PURELAB™
Option, Le Plessis Robinson, France).
2.2 Methods
2.2.1 Microparticle preparation
Drug-loaded, PLGA and PLA-based microparticles were prepared by the simple emulsion (O/W)
solvent evaporation method. Briefly, 250 mg of PLGA or PLA, 80 mg of IVM and 50 mg of
Kollidon K-17PF (when used) were dissolved in methylene chloride (10 mL). This organic solution
(internal phase) was emulsified into 1 L of 0.1% w/v PVA aqueous solution (external phase) under
stirring using an agitator (Polystat®, FISHER Scientific Bioblock, Illkirch, France) at 1600 rpm.
Solvent evaporation was achieved by stirring for a further 2 h at the same rate. The solid
microparticles were separated by filtration under vacuum and dried for 2 days at room temperature
until the water content was less than 1 % (Karl-Fisher).
97
2.2.2 Particle size analysis

The samples were suspended in an aqueous solution of 1% (w/v) Tween® 80 under vortex agitation
and microparticle size was determined by laser diffraction using a granulometer (Mastersizer X®,
Malvern, Instruments, Worcestershine, UK) equipped with Mastersizer X® V2.18 software (n=3).
2.2.3 Scanning electron microscopy

Scanning electron microscopy (SEM) was carried out using a Quanta (Quanta 600 Feg, FEI
Company, Lyon, France) operating between 1.5 – 4.5 kV under nitrogen atmosphere to observe the
morphology and the surface structure of the dry microparticles.
2.2.4 Differential scanning calorimetry

The glass transition temperature (Tg) of the polymers was analysed by differential scanning
calorimetry (DSC) using a calorimeter (DSC Q10®, TA Instruments, Guyancourt, France).
Accurately weighed samples of approximately 5-7 mg were put in aluminium pans (Al-crucibes, 40
µL), first cooled to -10 °C and then heated up to +190°C at a constant rate of 10 °C / min under a
nitrogen atmosphere. The Tg was determined during the second heating run.
2.2.5 X-ray diffraction

X-ray powder diffraction (XRD) measurements were carried out with a Philips PW 1830 X-ray
generator with a copper anode (Cu KĮ radiation, Ȝ = 0.154418 nm, 40 kV, 20 mA) fixed with a
Philips PW 1710 diffractometer (Philips Industrial & Electron-acoustic Systems Division, Almelo,
The Netherlands). The scattered radiation was measured with a vertical goniometer (Philips PW
1820) (Philips Industrial & Electron-acoustic Systems Division, Almelo, The Netherlands). The
scanning rate used was 0.02° 2ș s-1 over the range of 4-40° 2ș.
98
2.2.6 Determination of Ivermectin loading

The IVM loading within PLGA or PLA microparticles was determined by dissolving accurately
weighed amounts (approximately 30 mg) of microparticles in an appropriate volume of acetonitrile
to fall within the linearity concentration range of the HPLC method. The concentration of the IVM
in this solution was determined using the modified HPLC method developed by Liu (Liu et al.,
2006). Thus, 80 µL of the filtered solution were injected in a Shimadzu liquid chromatograph (SCL-
10A VP, Croissy Beabourg, France). The analysis was performed by RP-HPLC at 243 nm using a
C18 Uptisphere® column (120 Å, ODB-C18, 5 µm; 3 x 150 mm, Interchim, Montluçon, France),
mobile phase acetonitrile:water (75:25, v/v), flow rate 1.0 mL/min, temperature 35 °C (n = 3). The
method was linear between 0.3 to 100 µg/mL (R2 > 0.99). The results were analysed with Class-
VP® software (Shimadzu, Croissy Beabourg, France). The percentage encapsulation was calculated
as (100 % x actual drug loading / theoretical drug loading).
2.2.7 Ivermectin solubility

Ivermectin is a very lipophilic drug (Log P = 3.217) with water solubility of only about 4 µg/mL. In
order to verify that sink conditions were achieved for the in-vitro release studies, an excess amount
of ivermectin was placed in 10 mL phosphate buffer pH 7.4 containing 2% Tween 80 (n=2). The
samples were shaken for 48 hours at 25 °C in a horizontal magnetic agitator Variomag® (Poly 15,
VWR Prolabo, Fontenay Sous Bois, France). The saturated drug solution was centrifuged at 15000
g for 20 minutes at room temperature (Biofuge Statos, Prolabo, Nogent sur Marne, France), filtered
through 0.2 µm nitrocellulose filters and then assayed after appropriate dilution as described above
(section 2.2.6). The method was linear between 4 to 100 µg/mL (R2 > 0.99) and specific for this
dissolution medium.
99
2.2.8 In- vitro drug release studies

The in-vitro release studies were carried out by suspending a weighed amount of microparticles
(approximately 50 mg) in 20 mL of phosphate buffer pH 7.4 with 2% of Tween 80, using 50 mL
flasks (n=3). Sodium azide 0.05 % (w/v) was added as a preservative. The flasks were incubated for
15 days at 37 °C under magnetic stirring at 200 rpm in an incubation shaker (Polystat®, FISHER
Scientific Bioblock, Illkirch, France). At predetermined time intervals 1.5 mL samples were
withdrawn, replaced with fresh medium and filtered through 0.45 µm nitrocellulose membranes.
The IVM concentration in the filtrate was determined by RP-HPLC analysis at 243 nm (as
described in section 2.2.6). However, since IVM is only stable for 33 hours in the release medium
(data not shown), the release medium was replaced after 24 hours in order to prevent any
degradation. The microparticles remaining after 24 hours were recovered by filtration through a
0.45 µm filter and dried for 48 hours at room temperature. The amount of IVM remaining in the
microparticles (non released IVM) was determined by RP-HPLC as described previously (section
2.2.6). Furthermore, the amount of IVM in the suspended microparticles at the beginning of the
experiment allowed an accurate mass balance to be calculated.
2.2.9 Statistical analysis

The results were expressed as mean values ± S.D. A pairwise comparison by the Mann–Whitney
test was used to determine the statistical significance of the differences. In all cases, P < 0.05 was
considered to be significant.
100
3. Results and discussion

3.1 Ivermectin entrapment, shape and size of the microparticles
The microparticles obtained for all formulations had a spherical shape as shown in SEM
microphotograph (Figure 1).
Fig. 1: Scanning electron micrograph of PLGA S-based microparticles containing ivermectin.
The drug entrapment efficiency in microparticles was high (>90% w/w) (Table 1) and varied
linearly with IVM content between 20 – 80 mg as demonstrated in Figure 2 for PLGA S
microparticles. Similar results were obtained for PLGA H and PLA S (data not shown).
Table 1: The influence of PVP on ivermectin encapsulation and microparticle size. Data are shown as mean ± S.D.
(n=3)
Without PVP With PVP
Polymer End group Entrapment (%w/w) Size (µm) Entrapment (%w/w) Size (µm)
PLGA (50:50) H Acid free 91.9 ± 1.4 36.8 ± 2.6 94.9 ± 2.6 45.1 ± 4.5
PLGA (50:50) S Ester 90.0 ± 4.4 36.3 ± 0.8 95.4 ± 4.4 36.4 ± 4.5
PLA S Ester 94.6 ± 5.8 37.6 ± 2.7 97.9 ± 1.5 37.6 ± 3.2
101
Thus, it was possible to obtain PLGA or PLA IVM-loaded microparticles with drug loadings
between 7% (20 mg IVM/ 270 mg microparticles) and 24% (80 mg IVM/ 330 mg microparticles).
From a therapeutic point of view, taking into account the wide range of animal species needing to
be treated with antiparasitics, this result seems very interesting for the flexibility in formulation that
it predicts. In addition, the possibility of high drug entrapment would allow a small amount of
particles to be administered in order to reach the therapeutic dose. For our experiments, the
microparticles with the highest drug loading (24 %) were selected. The high IVM entrapment
efficiency into the microparticles (90.0 – 94.6% w/w) was independent of the polymer composition
(PLGA or PLA) and the PLGA end-groups (ester or free-acid) (Table 1). Therefore, the “apolar”
backbone of the polymer rather than its end-groups seems to determine the amount of IVM
entrapment within the microparticles.
On the other hand, several other factors probably also contributed to this high drug entrapment such
as the high lipophilicity of IVM (Log P = 3.22) (Loffler and Ternes, 2003) leading to a high affinity
to the “apolar” polymer, the very low water solubility of IVM (about 4 µg/mL) and the high
solubility of IVM in methylene chloride (about 300 mg/mL) that leads to low diffusivity in water.
Thus, during the emulsification process, most of the IVM remains in the organic phase with the
polymer until the microparticles have solidified. A small loss of IVM may occur when methylene
chloride diffuses towards the external phase. Indeed, other authors have already shown that the
solvent evaporation method is the most successful and simplest one for drugs that are insoluble in
the aqueous medium where they cannot easily diffuse (McGinity and O'Donnell, 1997; Wischke
and Schwendeman, 2008). Furthermore, the use of methylene chloride as a solvent increases drug
entrapment because of its low water solubility (1.96%, w/w) (Bodmeier and McGinity, 1988).
102
100
90
80 y = 0.9249x + 0.6576
Loaded IVM (mg)

2
70 R = 0.9938
60
50
40
30
20
10
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
IVM (mg)
Fig. 2: Amount of IVM loaded into PLGA S microparticles as a function of added drug. Data are shown as mean ± S.D.
(n=3)
The addition of PVP (Kollidon 17 PF) to the formulations did not significantly modify the drug
entrapment or the size of microparticles. Indeed, the microparticle size ranged between 36.3 –
45.1µm (with PVP) and 36.3 – 37.6µm (without PVP); with the largest microparticles being
obtained with PLGA H/ PVP (Table 1). Although PVP is a highly water- soluble polymer, it is also
soluble in several organic solvents such as methylene chloride, ethanol and chloroform. This
property might have led to the formation of a three component system (IVM, polymer and PVP)
with high affinity of each component for the others, which co-precipitated upon contact with the
aqueous external phase and led to microparticle formation after methylene chloride evaporation. It
can be assumed that IVM, polymer and PVP interactions would increase as their concentrations in
the organic phase increased during the evaporation process. This could explain why there were no
significant microparticles size changes, because such a highly cohesive system was formed by the
components. This phenomenon may also contribute to the high drug entrapment into the
microparticles.
3.2 In-vitro drug release from microparticles

The solubility of IVM in the release medium was found to be 4.94 ± 0.01 mg/mL. Thus, “sink”
conditions were respected in the in-vitro release tests. As it can be seen in Figure 3, which shows
103
microparticles without PVP, the release profiles from capped PLGA S and PLA S polymers were
almost superposed and characterized by a triphasic pattern. This comprised a very low initial release
until 24 hours (4.2 and 4.4%, respectively), followed by a slow drug release until 5 days (18.2 and
15.7%, respectively) and a plateau between 5-10 days where practically no release was observed.
Then, over the next 10-15 days, an increase in the drug release was observed, which was greater for
PLGA S (47.0%) than for PLA S (28.5%) microparticles. This difference in the release final
patterns can be attributed to the different polymer composition. Since PLGA is relatively more
“hydrophilic” due to the glycolic residues, a faster degradation rate would be expected. In contrast,
PLA degradation is slower because its methyl moiety hinders hydrolytic attack. However, this kind
of tri-phasic patterns especially characteristic of PLGA, is often not desirable for therapeutic
purposes. For example, as it was explained above, in antiparasitic therapy a sufficiently high drug
concentration to kill the target parasite has to be reached and maintained throughout the treatment in
order to insure its efficacy. Therefore, a plateau without drug release can lead to the reappearance of
the infection in the animals. For these two polymers (PLGA S and PLA S), the in-vitro patterns
were not statistically different (P < 0.05) until day 10. This can probably be explained by the strong
polymer-drug interactions and also be due to the fact that IVM is a very lipophilic drug, acting as an
impermeabilization agent and hindering water diffusion into the particles. The high drug loading in
the microparticles (24%) means this effect would be important. Indeed, it has been observed that
high initial drug loading can affect release patterns in a way that depends on the physico-chemical
properties of the drugs. In this way, water-soluble drugs can facilitate water diffusion by producing
porous systems during the drug leaching. On the other hand, lipophilic drugs can prevent water
penetration, thus slowing down polymer degradation (Klose et al., 2008). Furthermore, if there is a
strong drug-polymer interaction, this might also have led to slower drug release (Wischke and
Schwendeman, 2008). Thus, after day 10, IVM release could be a result of water diffusion and
microparticle erosion (depletion).
104
100
Ivermectin released (%)

80
60
40
20
0
0 5 10 15
Time (Days)
IVM Powder PLGA H + PVP PLGA S + PVP PLA S + PVP

PLGA H PLGA S PLA S
Fig. 3:IVM release profile from PVP-free and PVP-containing microparticles as a function of the polymer composition
and end groups. Experiments were performed in phosphate buffer pH 7.4 containing 2% Tween 80. Data are shown as
mean ± S.D. (n=3)
In contrast with microparticles made of PLGA S and PLA S, those made with the more hydrophilic
uncapped PLGA H showed a biphasic pattern characterized by a higher initial release (first day,
38.0%), followed by a continuous IVM release reaching 77.6% and 98.7% after 5 and 10 days,
respectively. This important difference can be explained by the relative hydrophilicity of this
polymer as a result of different end-groups. Indeed, water uptake by PLGA H, bearing a terminal
carboxyl group, is much greater than that of polymers such as PLGA S and PLA S with a terminal
ester group that renders them more hydrophobic. Thus, the higher is the water penetration into the
microparticles, the higher the IVM diffusion towards the release medium and the higher the
polymer degradation rate. Furthermore, it has been shown that terminal carboxyl groups have a
catalytic effect on PLGA hydrolysis, leading to a faster degradation rate (Siepmann et al., 2005;
Uhrich et al., 1999).
When 13 % PVP was added to the formulations, a large increase in drug release was observed for
all the polymers tested (Figure 3). Moreover, three well-differentiated and statistically different (P <
0.05) drug release patterns were obtained for the three different polyesters. At 24 hours, PLGA H
105
microparticles displayed an almost two-fold higher initial IVM release (68.70 % vs 38.0%) than
PVP-free microparticles and 100% release was achieved in only 5 days, which was a significant
reduction in the drug release time. This high burst drug release is often undesirable because of
possible toxic effects in the patient. Furthermore, if the drug is completely released in only a few
hours, no sustained release will take place and the therapy will not be successful (Hasan et al.,
2007). In the same manner, PLGA S PVP-containing microparticles showed a different drug release
pattern. In this case, a biphasic pattern characterized by a higher burst: 38.4% compared with 4.2%
without PVP, followed by a higher and linear continuous IVM release reaching (59.4% compared
with 18.2%), (71.5% compared with 20.7%) and (81.1% compared with 47.0%) after 5, 10 and 15,
days respectively. Thus, instead of the triphasic pattern observed for microparticles without PVP,
the presence of PVP led to a sustained release of IVM. Obviously, this kind of in-vitro profile is
more likely to be effective in chronic diseases such as parasite infestations because -continuous
delivery of drug is provided. A similar increase in the release rate was observed with PLA S PVP-
containing microparticles; but in this case a triphasic pattern was still observed but with the plateau
in drug release occurring earlier, at 1-5 days instead of at 5-10 days. Furthermore, the third phase of
increased drug release was also earlier, between 5-10 days as opposed to 10-15 days when PVP was
not added to the formulation. All these changes are in accordance with our initial hypothesis about
the role of PVP. Since it is well known that water diffusion into PLGA or PLA-based microparticles
is much faster than the subsequent polymer hydrolysis (bulk degradation) (Klose et al., 2008), it is
believed that water penetration may increase the rate of polymer degradation. Therefore, PVP, a
hydrophilic polymer recognized as a pore-former, is frequently used to improve bioavailability of
poorly water-soluble drugs and to counteract the possible negative effect of a high drug loading in
the water uptake. Figure 4 A and B shows SEM images of the surface of PVP-free and PVP-
containing microparticles. Interesting, the microparticle surface had a characteristic hexagonal
pattern (Fig. 4A), which was particularly evident when PVP was not added (Fig. 4B-left). However,
106
there no reports in the literature of this type surface conformation in PLA or PLGA microparticles.
Therefore, this patterning could be the result of a particular organization of the IVM at the
microparticle surface. However, this pattern disappeared (Fig. 4B-right) and a porous surface was
obtained when more hydrophilic microparticles was made by addition of PVP. Additional
observations of broken microparticles showed a porous internal structure (image not shown)
indicating that the “nanoscopic holes” present in the microparticle surface (Fig 4B-right) could have
extended toward the interior of the particles, thus facilitating drug release. This porous structure
could be attributed to faster polymer precipitation during the preparation process due to the higher
water solubility in the organic phase. The solubility of water in methylene chloride has been found
to be only 0.2%, w/w (Wischke and Schwendeman, 2008). However, the presence of the
hydrophilic PVP within the polymeric phase might lead to faster water influx into the polymer
solution leading to faster polymer precipitation and more a porous microstructure. Clearly, the
increased porosity would lead to increased water penetration into the microparticles during in-vitro
drug release experiments, facilitating polymer degradation and subsequent diffusion of IVM into
the release medium. Thus, release rate of IVM from microparticles depended on the porosity,
polymer degradation rate, polymer composition and the nature of the end-groups. Thus, the release
rate for IVM increased with the relative hydrophilicity of the polymer (i.e. PLGA H > PLGA S >
PLA S) and with the microparticle porosity (with PVP > without PVP). Therefore, water diffusion
into the microparticles was shown to be an accelerating factor for drug release. Other substances
such as medium chain triglycerides (MCT) (Luan and Bodmeier, 2006), D-mannitol, bovine serum
albumin (BSA) and polyethylene glycol (PEG) (Kim et al., 2000) are all recognized as having pore-
forming properties and are therefore able to increase drug release.
107
Scanning electron micrographs of microparticles without and with 13% PVP K17 (A) and porous surface of
Fig. 4:
PVP-containing microparticles (B).
As well as forming pores, PVP increases the hydrophilicity of the microparticles, leading to their
better wettability when in contact with aqueous medium. In fact, PVP has often been used to
increase the bioavailability of poorly water-soluble drugs due to its ability to form water-soluble
drug-PVP complexes (solid solutions or dispersions) (Kubin et al., 2008; Palmieri et al., 2002).
Thus, if such an IVM-PVP complex had been formed during polymer precipitation, it could have
had higher water solubility leading to higher rate of IVM dissolution and release from
microparticles. The analysis of the physical state of the drug within the microparticles by XRD and
108
DSC (Figure 5; A-E and section 3.3, below) confirms the hypothesis of a complex between IVM
and PVP.
3.3 Physical state of the drug in the microparticles

In order to evaluate the physical state of the IVM in microparticles and its potential interactions
with the additives, XRD and DSC studies were carried out on both PVP-containing and PVP-free
microparticles. These two techniques are frequently used in to determine the physical properties of
solids since they provide useful information about the degree of crystallinity (XRD, DSC) and
structural relaxation properties such as Tg (DSC) (Yu, 2001).
Figure 5 shows thermograms of co-precipitates of IVM with different proportions of PVP, without
any polymer. When IVM and PVP were dissolved in methylene chloride at ratios between 3:0 - 3:1
(A-C) followed by solvent elimination, an endothermic peak for IVM was always observed from
the resulting powder. The intensity of the peak decreased as the PVP content increased. However, at
an IVM: PVP ratio of 3:1.5, which is the same ratio as that in the formulations, the IVM peak
disappeared and only the PVP Tg transition event was observed (D). In contrast, when IVM and
PVP were simply physically mixed at the same ratio (3:1.5), the IVM fusion peak was still observed
in the thermogram (E). This result clearly demonstrates a solvent-mediated effect on IVM-PVP
interaction during microparticle manufacture. This allows us to conclude that in the PVP-containing
formulations, a PVP-drug complex was formed and that this could also be responsible for higher
solubility of IVM in aqueous medium and thereby accelerate release from PLGA and PLA
microparticles.
109
Fig. 5.DSC thermograms of different IVM:PVP (Kollidon® 17PF) co-precipitates obtained from methylene chloride
(A) Pure IVM, (B) 3: 0.5, (C) 3: 1, (D) 3: 1.5, (E) Kollidon® 17PF and (F) 3:1.5 physical mixture
Figure 6 shows the diffraction pattern for pure IVM (A). The 2-Theta diffraction peaks indicate the
crystalline state of the drug. On the other hand, the absence of diffraction peaks in the spectrum of
PVP K-17 indicates its amorphous state (B). PLGA S PVP-free microparticles without IVM
showed a characteristic pattern with no diffraction peaks indicating the amorphous state of PLGA S
(C). This result demonstrates that no modification in the crystallinity of the polymer was induced by
its precipitation during the manufacturing process. Indeed, similar diffractograms were observed
when PLGA H and PLA S were used alone (data not shown). Finally, the diffractograms of IVM-
loaded PVP-free (D) and PVP-containing (E) PLGA S microparticles also showed patterns
characterized by the absence of diffraction peaks. This indicates that the encapsulated IVM was
always present in an amorphous state or in the form of a solid solution with the polymer alone or
mixed with PVP. Since very small crystals may not be detected by XRD (Yu, 2001), these
observations were confirmed by DSC. Table 2 summarizes the thermal properties of the samples.
110
Table 2: Thermal properties of drug, polymers and microparticles obtained by DSC. The Tg values were recorded
during the second heating cycle.
IVM Microparticles
Sample Pure materials
PVP-free PVP-containing
IVM Tm: 159.1 °C N.D N.D
PVP 17PF Tg: 139.6 °C N.D N.D
Tg: 48.9 °C
PLGA H Tg: 43.3 °C Tg: 42.6 °C
Tg: 128.6 °C
Tg: 45.1 °C
PLGA S Tg: 35.5 °C Tg: 44.2 °C
Tg: 139.3 °C
Tg: 52.1 °C
PLA S Tg: 47.9 °C Tg: 52.8 °C
Tg: 130.0 °C
The thermogram of IVM powder showed a sharp endothermal peak at 159.1 °C, corresponding to
its melting point (Tm) and confirming that the drug was in a crystalline state. In contrast, the
thermograms of PLGA H, PLGA S, PLA S and PVP K17 showed a transition event (Tg) at 43.3°C,
35.5°C, 47.9°C and 139.6°C respectively, indicating their amorphous states (Hausberger and
DeLuca, 1995). When IVM was incorporated into PVP-free or PVP-containing microparticles, the
endothermal peak corresponding to IVM disappeared completely and only Tg values from polymer
and PVP (when added) were observed. In general, polymer and PVP Tg values did not change
significantly after microparticle manufacture. The absence of the melting peak of the drug in the
microparticle thermograms has been frequently interpreted as the drug being either dissolved or
molecularly dispersed within the polymer matrix (Benoit et al., 1986; Panyam et al., 2004). Despite
the observation that polymer in a rubbery state might dissolve dispersed crystals of drug and mask
possible fusion peaks (Bodmeier and Chen, 1989), our SEM and XRD analysis did not show any
evidence of a crystalline state in the formulations. Finally, although PVP did not change the
amorphous state of IVM in the microparticles, it led to more porous and possibly more hydrophilic
structures, increasing the rate of drug release.
111
: X-ray diffractograms of ivermectin powder (A), PVP K17 (B), unloaded PVP-free PLGA S microparticles (C),
Fig. 6
IVM loaded PVP-free PLGA S microparticles (D) and IVM loaded PVP-containing PLGA S microparticles (E).
112
4. Conclusions
Several different sustained release patterns for IVM were obtained from microparticles prepared
from polymers with different compositions. However, the release of IVM was also dependent on the
water penetration process. Thus, increasing microparticle permeability by addition of PVP, led to
drug release that was controlled by the nature of the polymer and its end groups. Therefore, IVM
release from PLGA and PLA microparticles can be modulated both by modifying the water influx
into microparticles and by the polymer properties. This work is an important starting point for
obtaining appropriate sustained release formulations of IVM for veterinary applications.
113
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117
3.3 Implants injectables de formation à base de PLA pour la libération contrôlée

in situ
d’un principe actif BCS classe II: sélection du solvent à partir d’une caractérisation
physico-chimique.
RESUME
Des implants de formation in situ (ISI) réalisés à partir de polymères biodégradables tels que le
poly(D,L-lactique) (PLA) et de solvants biocompatibles, sont utilisés pour l’obtention de
formulations pour la libération prolongée de principes actifs. L’objectif de ce travail a été d’étudier
l’effet de solvants biocompatibles, différents de part leurs propriétés physico-chimiques, sur la
libération d’ivermectine (IVM), un principe actif antiparasitaire (classé BCS II), à partir d’implants
in situ de PLA. Les solvants évalués ont été la N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), la 2-pyrrolidone
(2P), la triacetine (TA) et le benzoate de benzyle (BB). Les paramètres de solubilité d’Hansen des
solvants ont été utilisés pour expliquer les interactions polymère/solvant conduisant à des
comportements rhéologiques différents. La stabilité du polymère et du principe actif dans les
solvants ont été respectivement évaluées par chromatographie d’exclusion par taille et
chromatographie liquide d’haute performance. Les deux facteurs principaux qui ont influencé la
vitesse de libération de l’IVM ont été la solubilité du solvant dans l’eau et la viscosité des solutions
polymériques. De façon générale, la vitesse de libération de l’IVM diminuait lorsque la solubilité du
solvant dans l’eau augmentait et la viscosité diminuait selon l’ordre suivant NMP>2P>TA>BB. La
microscopie électronique a permis d’observer une relation entre la vitesse de libération de l’IVM et
la porosité des implants. La libération était plus élevée lorsque la porosité des implants augmentait.
Enfin, la stabilité du principe actif et du polymère dans les solvants a subi le même comportement
général, augmentant lorsque les affinités entre le polymère et le solvant diminuaient et lorsque la
teneur en eau des solvants était plus faible.
Mots-clés: Ivermectine, libération prolongée, implants de formation in situ, biocompatible, PLA
118
À soumettre
Injectable PLA-based in situ forming implants for control release of a BCS class
II drug: solvent selection from a physico-chemical characterization
J.A. Camargo1, A. Sapin1, C. Nouvel2, D. Daloz3, M. Leonard2, J.-L. Six2, P. Maincent1
1
Nancy University, EA 3452, Faculty of Pharmacy, Laboratory of Pharmaceutical Technology, 5, rue A. Lebrun, BP
80403, 54001 Nancy Cedex, France
2
Nancy University, ENSIC Group, Laboratory of Physical Chemistry of Macromolecules (LCPM), UMR CNRS-INPL
7568, 1 rue Grandville, 54000 Nancy, France
3
Nancy University, School of Mines, Institut Jean-Lamour (SI2M),UMR 7198 CNRS-Nancy, Parc de Saurupt CS 14
234, 54042 Nancy Cedex, France
* Correspondence:
Professor Philippe Maincent
Faculty of Pharmacy
Nancy University
5 rue Albert Lebrun
54000 Nancy, France
Phone: + 33 (3) 83 68 22 97
Fax: + 33 (3) 83 69 23 01
E-mail: [email protected]
119
Abstract
In situ forming implants (ISI) prepared from biodegradable polymers like poly(DL-lactide) (PLA)
and biocompatible solvents, are used to obtain sustained drug release formulations for parenteral
administration. The aim of this work was to study the effect of several biocompatible solvents with
different physico-chemical properties, on the release of ivermectin (IVM), an antiparasitic BCS II
drug, from in situ forming PLA-based implants. Evaluated solvents were N-methyl-2-pyrrolidone
(NMP), 2-pyrrolidone (2P), triacetine (TA) and benzyl benzoate (BB). The Hansen’s solubility
parameters of solvents were used to explain polymer/solvent interactions leading to different
rheological behaviours. The stability of the polymer and drug in the solvents were also evaluated by
size exclusion and high liquid performance chromatography, respectively. The two major factors
determining the rate of IVM release from ISI were water solvent solubility and viscosity of the
polymeric solutions. In general, it increased with increasing water solvent solubility and decreasing
viscosity according to the following order NMP>2P>TA>BB. The scanning electron microscopy
led to observe a relationship between the rate of IVM release and the surface porosity of implants,
being higher as implants porosity increased. Finally, drug and polymer stability in solvents followed
the same general behaviour, increasing as much as polymer-solvent affinities and water content in
solvents decreased. IVM degradation was accelerated by the polymer but the drug did not affect
PLA stability.
Keywords: Ivermectin, sustained release, in situ forming implants, biocompatible, PLA
120
1. Introduction
The in situ forming implants (ISI) based on polymer precipitation, conceived originally by (Dunn et
al., 1990), appeared as an interesting alternative to overcome the disadvantages of the conventional
methods to prepare pre-formed implantable microparticles used to obtain drug sustained release.
Among these disadvantages are complicated manufacturing processes, toxicity of the solvents,
difficult scale-up and irreproducible product (Hatefi and Amsden, 2002; Jain, 2000; Shah et al.,
1993). On the contrary, ISI consist simply of a water insoluble biodegradable polymer dissolved in
a biocompatible organic solvent where the drug is dissolved or dispersed, thus making its
fabrication easier. Upon injection of the polymeric solutions into the body, the organic solvent
diffuses toward the surrounding aqueous environment as a function of its water solubility and water
penetrates into the polymer solution. This water induced phase separation process lead to polymer
precipitation and therefore an implant is formed in situ entrapping the drug. Thus, during implant
formation, the drug release is controlled by the properties and interactions between polymer,
solvent, and drug used (Deadman et al., 2007; Ravivarapu et al., 2000). Nevertheless, solvent
selection is one of the most important factors to take into account since drug release, injectability
and stability of drug and polymer are basically determined for it (Wang et al., 2003). Therefore,
several organic solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), 2-
pyrrolidone (2P), triacetine (TA) and benzyl benzoate (BB) have been used in an attempt to
minimize the burst (fast initial release) of drugs. Two of the principal developed platforms that use
solvents with different physico-chemical properties are i) Atrigel (Atrix Laboratories) that
consists in poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) dissolved in N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)
which is a very water soluble solvent (Packhaeuser et al., 2004; Ravivarapu et al., 2000) and ii) the
Alzamer£ depot (Alza corporation) consisting in PLGA in the low water soluble solvent benzyl
benzoate (BB) (Rathbone et al., 2008). Hence, since solvents in these systems have different water
solubilities, it leads to different dynamics of phase inversion and of course to different drug release
121
patterns. Thus, solvent selection appears as a different way to modulate drug release rather than
increasing or decreasing the polymer concentration. On the other hand, solvent selection could be
also a strategy to overcome degradation issues of polymer or drug in solvents, avoiding other more
expensive or complex solutions such as the preparation of the product in two-parts (syringes) to
protects drug or polymer of the contact with the solvent (Ravivarapu et al., 2000) or the addition of
additives to the formulations.
An interesting drug to be formulated in ISI to sustain release is the antiparasitic Class II in the
biopharmaceutic classification system (BCS) (Takano et al., 2006), ivermectin (IVM). First,
because of the human or animal parasitic infestations that must be treated for a long time (several
months) which needs drug delivery systems avoiding repeated and indiscriminate administration
that might lead to efficacy loss in the therapy. In addition, because of low drug oral bioavailability
(Takano et al., 2006), binding to organic material in the intestine (Gokbulut et al., 2006) and
secretion by the P-glycoprotein present in the intestinal epithelium (Gonzalez Canga et al., 2009),
the oral administration of ivermectine is a challenge.
The objective of this study was to investigate the effect of using biocompatible solvents with
different physico-chemical properties on the release of IVM, from PLA-based ISI. In addition, the
stability of the drug and PLA in the selected solvents was also investigated. PLA was selected as a
polymer, because of its excellent biocompatibility, biodegradability and due to the fact that it is
approved by the United States Food and Drug Administration (FDA) for parenteral drug delivery
(Anderson and Shive, 1997; Jain, 2000; Legrand et al., 2007; Matschke et al., 2002)
122
2. Materials and Methods
2.1. Materials
The following chemicals were used as received: Poly (DL-lactide) (PLA; Resomer® R 203 S, end-
capped, iv 0.31 dL/g) (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany), N-methyl-2-pyrrolidone
(NMP) (VWR Prolabo, Fontenay Sous Bois, France), glycerol triacetate 99% (Triacetine) (TA), 2-
pyrrolidone 99% (2P), benzyl benzoate (BB) (Alfa Aesar GmbH, Karlshruhe, Germany),
ivermectin, sodium dodecyl sulphate (SDS), tetrahydrofurane (THF) (Sigma, Saint Quentin
Fallavier, France), acetonitrile (Carlo Erba-SDS, Val de Reuil, France). Deionized water was
obtained using an ELGA system (PURELAB™ Option, Le Plessis Robinson, France).
2.2 Methods
2.2.1 Ivermectin’s solubility in solvents
In order to know the IVM solubility in the biocompatible solvents 2P, NMP, TA and BB, an excess
amount of ivermectin was placed in 2 mL of each solvent and then the samples were shaken for 48
hours at 25 °C in a horizontal magnetic stirrer Variomag® (Poly 15, VWR Prolabo, Fontenay Sous
Bois, France) (n=3). The resulting suspension was centrifuged at 15000 g for 20 minutes at 25°C
(Biofuge Statos, Prolabo, Nogent sur Marne, France) and the supernatant filtered through 0.2 µm
nitrocellulose filters. The concentration of the IVM in the filtrated solutions was determined by
using the modified method of phase reverse high performance liquid chromatography (RP-HPLC)
developed by (Liu et al., 2006). Thus, 80 µL of the filtered solution were injected in a liquid
chromatograph SCL-10A VP (Shimadzu Croissy Beabourg, France). The analysis was performed at
243 nm using a C18 Uptisphere® column (120 Å, ODB-C18, 5 µm; 3 x 150 mm, Interchim,
Montluçon, France), mobile phase was acetonitrile : water (75 : 25, v/v), flow rate 1.0 mL/min,
temperature 35 °C (n=3). The method was linear between 0.3 to 100 µg/mL (R2 > 0.99) and this is a
stability indicating HPLC assay.
123
2.2.2 Preparation of drug-containing polymeric solutions

Thirty percent PLA solution (w/w, based on the amount of solvent and polymer) were prepared by
dissolving 1.80 g of PLA in 4.20 g of solvent (2P, NMP, NMP:TA (50:50, v/v), TA or BB) at 50 ±
5 °C under continuous stirring until complete polymer solubilization. Then, solutions were cooled
to room temperature and the drug (3.9 mg) was added and solubilized by gentle agitation. The IVM
concentration in polymeric solutions was determined by RP-HPLC as described previously (n=3)
(section 2.2.1).
2.2.3 Drug stability in the solutions

Approximately 2 g of polymer-free or polymer-containing IVM solutions in the different
biocompatible solvents (2P, NMP, NMP:TA (50:50), TA or BB), were placed in glass vials, sealed
and kept at 25°C ± 2 °C and 37°C ± 2°C during three months in order to evaluate the IVM stability.
Every month, samples from each vial were taken and assayed by RP-HPLC to determine IVM
content (n=3).
2.2.4 Viscosity measurements

The viscosities of diluted PLA solutions (0.1-6.0 g/dL) in NMP, 2P, TA and BB were obtained at
37°C by using a capillary viscometer Viscologic£ TI-1 (SemaTech, Chemin de Terron, France)
equipped with an Ostwald biology cell (0,46 mm) (n=5). The relative viscosity was calculated as
ηrel = η/η0 = tcorrected/t0corrected where η and η0 the viscosities of the polymer solutions and the
solvents and t and t0 the corrected flow times of the polymer solutions and the solvents. The
intrinsic viscosities [η] of the previous solutions were obtained from the intercept of the curves ηsp /
C versus polymer concentration according to the linear Huggins relation (Huggins, 1942) (Eq. 1).
ηsp / C = [η] + k’[η]2C (1)
124
where [η] and k’ are the intrinsic viscosity an the interaction constant, respectively. [η] was
obtained by extrapolating the ηsp / C value to zero concentration. The viscosities of the concentrated
solutions of PLA (30% w/w) were obtained by using an Advanced Rheometer£ AR 2000 (TA
Instruments , Guyancourt, France) was used. The measures were performed in triplicate at 37°C ±
0.5 °C using a plate/cone (40 mm diameter, 2° ș) system.
2.2.5 Polymer stability in the solutions by size exclusion chromatography (SEC)

Approximately 2 g of IVM-free or IVM-containing polymer in solvent solutions (section 2.2.2 and
2.2.3) were stocked at 25°C ± 2 °C and 37°C ± 2°C over 3 months in order to verify the polymer
stability. At the beginning and at the end of the experiments, samples of each solution were taken
and the average molecular weight (Mw) of the polymer was evaluated by size exclusion
chromatography (SEC) to verify any possible degradation. For the SEC analysis, solutions at 10 g /
L in polymer from each sample were prepared in THF. Then, 100 µL of the filtered solution were
injected in a SEC apparatus Merck-Hitachi equipped with a pump L-6200A (Merck-Hitachi,
Nogent sur Marne, France). The analysis was realized by using a 2x PLgel 5µm Mixed-D column
(100 Å, polystyrene/divinylbenzene, 5 µm; 300 x 7.5 mm, Polymer Laboratories, Les Ulis, France),
mobile phase THF (100%), flow rate 0.7 mL/min and column temperature 25 °C. Detection was
performed with a multi-angle laser light scattering (MALLS) detector miniDAWN™ (Wyatt
Technology Corporation, Toulouse, France) at a laser wavelength of 690 nm and with a differential
refractive index detector (RID) Watters 410 (Millipore, Milford, USA).
2.2.6 Scanning electron microscopy

Scanning electron microscopy (SEM) was carried out using a scanning electron microscope Philips
XL 30S FEG (FEI Company, Lyon, France) operating between 1.5 – 4.5 kV under nitrogen
atmosphere to observe the surface structure of the dry implants.
125
2.2.7 In vitro drug release studies

In vitro release studies were carried out by injecting approximately 250 mg of the polymer-free or
polymer-containing IVM solutions, into sealed test tubes filled with 5 mL water containing 0.25 %
SDS, by using a 1 mL syringe with a 21G needle. The systems were incubated during 96 h
(polymer-free) or 30 days (polymer-containing), at 37 °C in an incubation shaker Memmert®
(Fischer Scientific, Illkirch, France) operated at 75 rpm. During the first 96 hours (polymer-free),
1.5 mL samples were withdrawn at pre-determined time intervals, filtered through 0.45 µm
nitrocellulose membranes and assayed by RP-HPLC at 243 nm (section 2.2.1). As after this time
IVM was not stable, the complete medium was withdrawn and replaced by a fresh one at each
sampling points. Then, the amount of IVM remaining in the implants (IVM not released) was
determined by dissolving the recovered implants in acetonitrile and measuring the IVM
concentration in the solutions by RP-HPLC analysis (section 2.2.1).
2.2.8 Statistical analysis

The results were expressed as mean values ± S.D. A pairwise comparison by the Mann–Whitney
test was used to determine the statistical significance of the differences. In all cases, P < 0.05 was
considered to be significant.
126
3. Results and discussion
3.1 Drug/polymer behaviour in studied solvents

Several types of biocompatible solvents have been used to prepare in situ implants (ISI) from
PLGA and PLA polymers (Brodbeck et al., 1999; Graham et al., 1999; Kranz and Bodmeier, 2008;
Shively et al., 1995). In this study, the selected solvents were N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), 2-
pyrrolidone (2P), triacetine (TA) and benzyl benzoate (BB) which have different physico-chemical
properties such as viscosity, water solubility and partition coefficient (Table 1). In addition, they are
considered as relatively safe to be used as excipients in human or veterinary parenteral products
(Dong et al., 2006; Kranz et al., 2001; Royals et al., 1999).
Table 1 : Some physico-chemical properties of biocompatible solvents
Water IVM solubility PLA

Solvent
Viscosity
ƕC (mPa.s)*
solubility Log P (mg/mL) solubility
20
(mg/mL)
N-methyl-2-pyrrolidone 1.89 ± 0.15 1000 - 0.46 > 500 +++
2-pyrrolidone 14.66 ± 0.13 1000 - 0.71 > 500 ++
Triacetine 19.70 ± 0.54 64 + 0.25 75 +
Benzyl benzoate 8.67 ± 0.30 Insoluble + 3.97 83 +
* From (Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009)
As it can be observed in table 1, IVM solubility was higher in the more water soluble solvents like
NMP and 2P than in less water soluble solvents, TA and BB. It was an interesting result, because
the usual rule “like dissolves like” could not be applied to IVM, a lipophilic drug (Log P = +3.22)
(Loffler and Ternes, 2003). In practice, IVM and polymer solutions in solvents were prepared faster
with NMP and 2P than TA and BB (Fig.1). The larger time (45 min) taken by TA to completely
dissolve the drug might be due to its very high viscosity.
127
50
45
40 NMP
35 NMP:TA(50:50)
T im e (M in u tes)
30 2P
TA
25
TA;BB (50:50)
20 BB
15
10
5
0
NMP NMP:TA(50:50) 2P TA TA;BB (50:50) BB
solvents
Fig. 1 : Time required for complete IVM solubilization in several solvents.
Polymer solubility in solvents followed the same solubility pattern than the drug. Nevertheless,
some specific interactions may play an important role in this behaviour. Thus, Hildebrand’s one-
component solubility parameter (į) (Eq. 2) has been used to predict polymer solubility in different
solvents. This parameter relates the energy of vaporization (cohesive energy density) of a liquid
with its capacity to dissolve a solute.
į = (E/V)1/2 (2)
where, E is the energy of solvent evaporation and V the molar volume of the pure solvent. Table 2
shows the Hildebrand’s parameter for some solvents. Thus, (Lambert and Peck, 1995; Shively et al.,
1995) determined that solvents with į between 9-10 or 9-12.3 cal/cm3, led to maximal solubility of
PLA. However, this result does not explain why a solvent like 2-pyrrolidone (į=14.7) was able to
dissolve the polymer better than TA (į=11.6).
128
Table 2: Hildebrand’s and Hansen’s parameters of the tested solvents
Hildebrand Hansen’s solubility parameters ¨į

Solvent V (cal / cm3) ½ (MPa1/2)b Solvent / PLA
(cm3 / mol)b į įd įp įh (MPa1/2)
N-methyl-2-pyrrolidone 96.5 11.3 18.0 12.3 7.2 5.2
2-pyrrolidone 76.4 14.7 19.4 17.4 11.3 7.9
Triacetin 188.2 11.6 16.5 4.5 9.1 5.9
Benzyl benzoate 191.2 8.2a 20.0 5.1 5.2 8.3
PLAc N.D 11.4 17.6 9.7 11.7 0
Water 18.0 23.4 15.5 16.0 42.3 31.3
a
Obtained mathematically from į = (E/V)1/2 using ǻHVap = 12.8 Kcal/mol (Hon et al., 1976)
b
From (Hansen, 2007)
c
From (Legrand et al., 2007)
In order to understand better the polymer or drug / solvent interactions, the Hansen’s
multicomponent solubility parameters (HSP) (Hansen, 1967) were used. These most detailed
parameters predict the solubility of substances by dividing the total solubility parameter (energy of
vaporization-Hildebrand), į, into contributions from non-polar (atomic) dispersions interactions, įd,
permanent dipole-permanent dipole (molecular) interactions, įp, and hydrogen (molecular) bonding
įH (Eq.3);
į = įd2 + įp2 + įh2 (3)
Since materials with similar HSP have high affinity for each other, a stronger interaction of drug
and polymer toward solvents with a greater solubility could be assumed. Thus, the comparison ¨į
(Eq.4) between solvent and solute (polymer or drug) is often used to evaluate their affinity level.
¨į = [(įs - įp)2d + (įs - įp)2p + (įs - įp) 2h]1/2 (4)
129
where įs and įp are the partial solubility parameters of solvent and polymer respectively. Normally,
the lower ¨į, the higher is the affinity and the solubilization. Table 2 showed that polymer/solvent
affinity increased in the following order NMP>TA>2P>BB. This result could not explain the
greater solubility of polymer or IVM in 2P than TA. Therefore, the mentioned ranking must be
taken with care from a practical point of view. For example, TA polymeric solutions were more
difficult to prepare than 2P ones, despite these results showing that the first has a higher affinity for
PLA than the second one. Indeed, there is also other solvent parameters playing an important role in
the solvent/solute interactions, as for instance the molar volume of the solvent (Vm). In fact, it has
already been observed that smaller molar volumes solvents are better and more aggressive from a
thermodynamic point of view, i.e. penetrating more rapidly in the polymers chains than those with
larger molar volumes even though they have identical HSP. So, molar volume can be an important
fourth parameter in affinity correlations (Hansen, 2007). It could explain better why smaller
molecular volume solvents like NMP (96.5) and 2P (76.4) dissolved better drug and polymer
whereas the larger ones, TA (188.2) and BB (191.2), dissolved them slower and in less quantity. In
addition, since PLA contains a methyl group, this might have hindered the polymer’s solvation by
solvents having larger and bulky molar volumes like TA and BB. Taking into account this analysis
the most appropriated affinity ranking is NMP>2P>TA>BB.
3.2 Drug and polymer stability studies

In order to know more about polymer and drug/solvent interactions, stability studies were carried
out. Thus, as it can be seen in Figure 2, drug stability showed a similar behaviour in polymer-free or
polymer-containing solvent solutions. As expected, the IVM stability in solvents and polymeric
solutions decreased with increasing storage temperature because the catalytic effect. It decreased in
the following order: TA>BB>NMP>2P. Indeed, 2P and NMP have been described as solvents
degrading faster leuprolide acetate, a hydrophilic drug, than triacetine (Dong et al., 2006). In
130
addition, it did appear that IVM degradation increased directly with increasing water content in
solvents. Table 3 shows the water content value for the studied solvents at the beginning of the
study. Therefore, water content in solvents could be an important factor catalyzing drug
degradation. Furthermore, the higher drug degradation in 2P and NMP could be facilitated for a
stronger solvent/drug interaction due to their smaller molecular sizes as described above. Finally,
2P could also have degraded more the drug than NMP because the first is a polar protic (H) whereas
the second is a polar aprotic solvent. Polar protic solvents acts like H+ donors, increasing the acidic
environment and the hydrolysis of the ester groups of the IVM.
: Stability of IVM in PLA-free (left) and PLA-containing (right) solutions in different biocompatible solvents at
Fig. 2
25°C and 37°C. Data are shown as mean ± S.D. (n=3)
131
Table 3 : Water content of biocompatible organic solvents. Data are shown as mean ± S.D. (n=3)
Water content
Solvent
(%)
2-pyrrolidone 0.38 ± 0.03

N-methyl-2-pyrrolidone 0.32 ± 0.02
Triacetine 0.27 ± 0.03
Benzyl benzoate 0.19 ± 0.03
On the other hand, the IVM degradation increased when it was in presence of the polymer. Its faster
degradation could be due to a more acidic environment because of PLA degradation as shown in
Figure 3. PLA degradation increased with the same factors than drug one. Thus, similarly to the
drug, polymer stability decreased with increasing storage temperature, water content of the solvent
and it was the lowest in solvents having higher molecular sizes (volume), TA and BB (Fig. 3) which
have a lower interaction for the polymer. However, opposite to polymer-containing IVM solutions
where polymer increased the rate of drug degradation, IVM did not affect polymer degradation. In
fact, IVM is a non ionisable drug and when compared with polymer, its concentration in the
formulation was very low.
25 °C 37 °C
2,2E+04 2,2E+04
1,7E+04 1,7E+04
P o ly m e r M w
P o ly m e r M w
2P 2P
1,2E+04 NMP 1,2E+04 NMP
BB BB
6,5E+03 TA TA
6,5E+03
1,5E+03 1,5E+03
0 3 0 3
Time (months) Time (months)
Fig. 3 : Evolution of the PLA Mw in IVM-containing solutions as a function of the organic solvent and the temperature
132
3.3 Viscosity studies

Viscosity studies were carried out to correlate them with solubility and drug release results. As
shown in Figure 4A, the relative viscosity of diluted polymer solutions increased with increasing
polymer concentration. In addition, it increased differently as a function of the solvent:
NMP>NMP:TA(50:50)>TA≅BB>2P. It was probably due to the fact that in diluted solutions,
viscosity increases as a function of the hydrodynamic volume of polymer chains being higher as
solvent quality increases. In fact, when a polymer is dissolved in an energetically unfavorable
solvent e.g. “poor solvent”, polymer-polymer interactions become more important than solvent-
polymer ones, leading to a more curled and contracted shape and consequently to a lower viscosity
of the solution. On the contrary, if the polymer is dissolved in an energetically more favorable
solvent e.g. “good solvent”, the chains of the polymer will be highly surrounded by the solvent
hindering polymer-polymer contacts. Hence, uncurled configurations will be favoured leading to
higher viscosity (Alfrey, 1947). In this regard, solvent quality increased in the same manner that
relative viscosity. This observation was confirmed by the obtained intrinsic viscosity [η] data from
the Huggins correlation as showed in table 4 since in general, intrinsic viscosity is higher in “good
solvents” than “poor solvents”.
Table 4: Intrinsic viscosities [η] as a function of the solvent used at 37 °C
Solvent [η ]
mL/g
2P 13.2
BB 16.6
TA 17.2
NMP: TA (50:50) 18.0
NMP 18.6
133
On the contrary, in concentrated polymer solutions, viscosity increased almost inversely than in
diluted polymer solutions. The increasing order was, TA>BB≅2P>NMP:TA(50:50)>NMP as
showed in Figure 4B.

A

12
10 NMP
R e la tiv e v is c o s ity
BB
8 TA
2P
6
NMP:TA(1:1)
4

2

0
0.0 0.1 0.5 1.0 1.5 2.5 3.0 6.0

Concentration (g / dL)

B

10,00
TA
2P
NMP:TA (1:1)
NMP
BB

viscosity (Pa.s)
1,000
0,1000
1,000E-3 0,01000 0,1000 1,000 10,00 100,0
shear stress (Pa)
Fig. 4: Effect of the solvent type on the cinematic viscosity of diluted PLA solutions (A) and on the dynamic viscosity
of 30% PLA solutions (B) as a function of the solvent
134
This can be explained as follows: when in a “poor solvent” the polymer concentration is high, as in
ISI formulations, aggregates are formed as a result of increased polymer-polymer interactions
leading to increase in the viscosity of the solutions. Inversely, since in “good solvents” polymer-
solvent interactions predominate over polymer-polymer ones, the viscosity of the solutions is lower.
These results are in agreement with those showing that NMP was a better solvent of PLA than 2P in
the formulation of leuprolide PLA-based in situ forming implants (Kranz and Bodmeier, 2008).
Thus, viscosities of concentrated solutions must be taken with care with regard to the injectability of
the formulations. Indeed, solutions with higher viscosities require higher injection forces
(Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009). Thus, it was observed in the drug release tests (section
3.3) that NMP polymeric solutions were more easily injected than those of TA, BB or 2P. However,
when NMP and TA were mixed in a 50:50 ratio, the injectability of the blend was improved when
compared with pure TA solutions.
3.3 In-vitro drug release from solvents and in situ implants

In order to correlate the physico-chemical results with the process of drug release “in vitro”, IVM
release studies from polymer-free and polymer-containing IVM solutions were performed. In the
first case, the experiments were carried out with the aim to know the net effect of the solvents in
drug release. IVM release increased with increasing solvent water solubility
NMP(A)>2P(B)>NMP:TA(50:50)(C)>NMP:TA(30:70)(D)>TA(E)>BB(F) showing that drug
release was controlled by solvent diffusion (Fig. 5-left).
Very water soluble solvents (NMP and 2P) led to a stronger “burst” (initial release) of IVM whereas
less water soluble solvents (TA and BB) lead to slower rate of the drug release. In addition, drug
release was inversely related with the size of a white depot present in the bottom of the test tubes
135
(Fig. 5-right). Thus, the higher the solvent water solubility, the greater the drug release and the
smaller the size of the depot. The depot presence indicated that solvent diffusion in the medium was
limited for its water solubility, which led also to lower drug release. However, depot size decreased
gradually during the in vitro test because of solvent diffusion toward the release medium which led
to increased drug release.

100
NMP
80
2P
ivermectine released (%)
NMP:TA (50:50)
NMP:TA (30:70)
60 TA
BB
40
20
0
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
Time (h)
Fig. : IVM release from PLA-free IVM solutions as a function of the solvent used. Left: obtained profiles.
5
Experiments were performed in SDS 0.25% water solution. Data are shown as mean ± S.D. (n=3). Right: appearance of
the release media 1 h after injection of the IVM solutions. Drug solutions were injected in the following order: (A)
NMP, (B) 2P, (C) NMP:TA (50:50), (D) NMP:TA (30:70), (E) TA and (F) BB.
As seen before, IVM release from solvent solutions could be modulated by mixing a high water
soluble solvent (NMP) with a less soluble one (TA). For example, when NMP and TA were mixed
in equal parts, an important “burst” reduction in the IVM release was obtained when compared with
the pure NMP. Thus, whereas at 48h NMP and TA released 100 ± 3.58% and 16 ± 2.7% of drug
respectively, the mixture of NMP:TA (50:50) released 64 ± 6.93% of drug. Hence, three statistically
different (P < 0.05) drug release profiles were obtained. However, when NMP and TA were mixed
in a (30:70) ratio, the obtained drug release profile was similar (not statistically different) to the TA
one, indicating this last controlled IVM release and that NMP effect was practically eliminated.
Finally, if the analysis of this behaviour is done in an inverse way, it is possible to say that adding a
very water soluble solvent like NMP into a solution of the drug in a less soluble solvent like TA, an
136
increased drug release could be obtained. Other used alternatives to obtain the same effects from
PLGA-based implants have been to add hydrophilic e.g. mannitol or hydrophobic e.g. miglyol 812
(a medium chain triglyceride) excipients to increase or decrease drug release, respectively (Shah et
al., 1993).
The previous results allowed to selecting various solvents leading to different IVM release profiles
from PLA-containing in situ implants. Some authors have observed that implant kinetic formation
and drug release from these systems were controlled by solvent properties like water solubility
(Brodbeck et al., 1999; Graham et al., 1999).

70
60
NMP
2P
50 NMP:TA (50:50)
ivermectine released (%)
TA
BB
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Time (days)

Fig. 6 : IVM release from PLA (30%) in situ forming implants (ISI) as a function of the solvent used. Left: release
profiles. ISI were formed by injecting the polymeric solutions in SDS 0.25% water solution. Data are shown as mean ±
S.D. (n=3). Right: appearance of the ISI after injection of the polymeric solutions. Drug-containing polymeric solutions
were injected in the following order: (A) NMP, (B) 2P, (C) NMP:TA (50:50), (D) TA and (E) BB
Thus, it was logical that solvents releasing differently the drug would have an impact on drug
release profiles from ISI. Hence, PLA (30%)-containing ISI made of NMP, NMP:TA (50:50), TA
or BB, were tested over 1 month in terms of IVM release (Fig. 6-left).
Drug release from ISI followed the same general pattern than those obtained from polymer-free
solutions. However an important burst reduction was observed principally due to the higher
137
viscosity of the polymer solutions. Indeed, increasing the viscosity of the solutions led to slower
rate of solvent and drug diffusion (see viscosity studies). Upon injection of the polymeric solutions
in the aqueous medium, the solvent diffuses toward the external medium (efflux process) whereas
water penetrates into the polymeric solution (influx process). Thus, during the dynamic process
efflux/influx, polymer concentration increases gradually until polymer solubility is overcomes and
its precipitation takes place (phase inversion). This process has been named nonsolvent induced
phase separation (NIPS) since that water is a nonsolvent for the polymer thus inducing its
precipitation (Wang et al., 2004).
The principal factors governing this complex phase inversion dynamic has been well described
(Brodbeck et al., 1999; Graham et al., 1999): among them, the most important are polymer
concentration (Shively et al., 1995) and solvent water solubility (Wang et al., 2004). In our
experiments, PLA concentration remained constant (30%) and only the type of solvent was
modified. However, since different viscosities in polymeric solutions were obtained as a result of
different solvent-polymer interactions (see solubility studies), it became another variable allowing a
reduction in burst IVM release from ISI. Therefore, in addition to water solvent solubility, viscosity
of the polymeric solutions is another factor affecting the phase inversion dynamic. Nevertheless,
water solvent solubility was the most important parameter determining the rate of the implant
formation and drug release. Thus, Figure 6-right shows that solvents with higher water solubility
were those having higher rate of implant formation (white precipitate on the bottom of the test
tubes). The precipitated mass decreased as follows: NMP>2P>NMP:TA(50:50)>TA>BB. As
discussed in the solubility studies, NMP (¨į=5.2) was a better solvent for the polymer than 2P
(¨į=7.9) regardless of their similar water solubilities. In this regard, 2P implant had to be formed
faster than NMP one, because less water was needed to desolvate the polymer from the solvent
(Shively et al., 1995). However, NMP precipitated was first formed possibly because of the lower
138
viscosity of the solution leading to faster solvent diffusion and consequently faster polymer
precipitation. This hypothesis is supported by the longer shape obtained in the NMP implant which
was possibly originated from a faster solvent diffusion allowing to earlier implant formation. On the
contrary, 2P implant formation took place principally when the bulk of the polymeric solution
reached the bottom of the test tube. On the other hand, PLA solutions made from “poor” solvents of
the polymer (TA and BB), which have lower water solubilities and higher viscosities, behaved as a
slow inversion phase systems and therefore they remained as solutions for a longer time before
polymers started to precipitate. Hence, since solvent diffusion was very slow in these systems, drug
release was also limited. Finally, the fact that drug and polymer had similar solubility behaviour in
solvents seems to be an interesting way to controlling burst and duration of IVM release. So, it
could be possible that drug and polymers have precipitated together into implants once the solvent
has diffused. It fact, a similar phenomenon was already observed “in-vitro” and “in-vivo” by
electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) during the formation of PLGA-based implants
formulated in NMP containing the lipophilic molecule Tempolbenzoate (Log P = +2.46) (Kempe et
al., 2008). Thus, as in implants made from more water soluble solvents a higher quantity of water is
absorbed during the formation process, IVM (Log P = +3.22) in implants, could has been dispersed
rather than dissolved, whereas in poor water soluble solvents it could has been rather dissolved. A
similar phenomenon could be also responsible of a higher drug release observed from implant made
of more hydrophilic solvents (NMP and 2P). For example, it was found that lysozyme and
theophyline release from ISI was the greater when they were dispersed in the polymeric solution in
comparison when they were dissolved (Körber and Bodmeier, 2008; Shah et al., 1993).
Finally, the observations about IVM release from PLA-based ISI were in good agreement with the
porosity surface of the implants observed by scanning electron microscopy (Fig. 7).
139
Fig. 7:Scanning electron micrographs of PLA (30%) in situ implants surface. Implants were prepared from (A) NMP
(B) 2P and (C) TA
ISI made from high water soluble solvents, which diffuse faster than less water soluble ones, led to
more porous and hand fragile microstructures. It is an important observation since once the
membrane of the implants at its surface is formed, drug release is principally controlled by polymer
degradation which is directly depending on the water penetrating into implants (Siepmann and
140
Gopferich, 2001). Thus, more porous implants were possibly those degrading faster the polymer,
leading to faster drug release. On the contrary, less porous implants which degraded more slowly
the polymer led to more prolonged IVM release patterns. Interestingly, since BB implants absorb
little quantity of water, they became highly viscous polymeric solutions (gels) after drying,
indicating that the process of implant formation was reversible. Thus, it was not possible to observe
BB implants by SEM.
141
4. Conclusions
The “in vitro” IVM release from ISI prepared from solvents with different physico-chemical
characteristics was evaluated. Hence, solvent selection was an important way to modify drug
release. In other words, the strategy of increasing or decreasing the concentration of a polymer to
modify the drug release (e.g. burst) from ISI is not mandatory. Another solvent or co-solvent system
could be enough or even less expensive from an industrial point of view. This is especially
important when drug and polymer stability problems have been detected as it was the case for IVM
and PLA in 2P or NMP. In addition, this type of strategy could be an alternative to avoid additives
(e.g. antioxidants) in formulations making them less complex. Nevertheless, as discussed before,
injectability features must also be taken into account due to the viscosity changes induced by the
different polymer/solvent interactions.
142
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146
3.4 Systèmes biodégradables d’administration parentérale pour la libération prolongée

d’ivermectine: comparaison et
in vitro in vivo
1. Introduction
Depuis sa découverte, l’Ivermectine (IVM) a été formulée de différentes manières et sous
différentes formes pharmaceutiques classiques (comprimés, solutions, pâtes) et innovantes afin de
combattre les parasitoses vétérinaires. Les formulations classiques présentent l’inconvénient majeur
de devoir être administrées régulièrement afin d’assurer leur efficacité thérapeutique. Ainsi, de
nouveaux systèmes de libération « intelligents » tels que des liposomes (Bassissi et al., 2006), des
implants de silicone (Maeda et al., 2003) et des microparticules biodégradables à base de protéines
de maïs (Liu et al., 2005) ou de polyesters synthétiques (Clark et al., 2004; Miller et al., 1999;
Miller et al., 1998) ont été développés afin d’augmenter le temps de libération de la molécule.
Dans les chapitres précédents, le développement et la caractérisation physico-chimique de deux

types de formulation, à base à base de polyesters de l’acide lactique (D,L-PLA), délivrant de l’IVM
ont été exposés. Il s’agissait de systèmes préformés (microparticules formulées par la méthode
d’émulsion simple - évaporation de solvant (SE)) et d’implants monolithiques formés in situ lors de
leur administration (implants in situ (ISI)). L’étude de la libération de l’IVM à partir de ces formes
dans un milieu aqueux a permis de mettre en exergue quelques mécanismes de libération.
Dans cette partie, le développement de microparticules in situ par extraction de solvant est décrit.
Une phase polymérique semblable à celle utilisée pour la fabrication des ISI et contenant le principe
actif (suspendu ou dissous), est émulsifiée, juste avant injection, avec une autre phase soit
organique (par exemple une huile végétale) (ISM-O/O), soit aqueuse (par exemple de l’eau) (ISM-
O/W). Lors de l’injection de cette émulsion, le système entre en contact avec l’environnement
aqueux des fluides physiologiques, ce qui entraîne la diffusion du solvant organique de la phase
147
polymérique (phase interne) vers le milieu aqueux environnant, conduisant ainsi à la précipitation
du polymère sous la forme de microparticules où le principe actif est retenu (Bodmeier, 1998;
Kranz and Bodmeier, 2007). Ainsi, la nature du solvant organique intervient dans la libération du
principe actif délivré. Toute une variété de solvants biocompatibles dont la N-méthyl-2-
pyrrolidone (NMP) et la triacétine (TA), (solvants utilisés dans cette étude), a permis l’obtention de
systèmes in situ libérant différents principes actifs tels que l’albumine sérique bovine - FITC,
l’acétate de leuprolide, la lidocaïne (Hatefi and Amsden, 2002), la théophylline et
l’hydrochlorothiazide (Shah et al., 1993).
La comparaison in vitro et in vivo des trois systèmes parentéraux biodégradables proposés pour
libérer de façon prolongée l’IVM, est décrite dans cette partie. Cette comparaison des dispositifs
repose sur la cinétique de libération in vitro du principe actif (suivie pendant 30 jours) et la
libération in vivo, suite à l’administration sous-cutanée des formulations chez le rat à une dose
d’IVM de 500 µg / kg. L’objectif est ici :
- d’étudier plus avant les propriétés physicochimiques des ISM en fonction du solvant utilisé
et de les comparer aux deux autres systèmes proposés.
- d’observer la morphologie des systèmes in situ après un mois dans les tissus.
- de corréler les résultats in vitro avec ceux obtenus in vivo.
2. Matériel et Méthodes
2.1 Préparation des microparticules d’IVM par émulsion simple / évaporation du solvant
La procédure de formulation des microparticules par émulsion simple / évaporation de solvant
utilisée dans cette étude in vivo est identique à celle décrite dans le chapitre 1 (Camargo et al.,
2010). Le protocole de formulation est le suivant : une solution de 80 mg d’ivermectine (IVM ;
148
Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) et 250 mg de polymère poly (D,L-lactide) (PLA; Resomer®
R 203 S, end-capped, iv 0.31 dL/g ; Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Allemagne) dans 10 mL de
dichlorométhane (VWR Prolabo, Fontenay Sous Bois, France) a été ajoutée sous agitation (1600
r.p.m, mélangeur Polystat®, FISHER Scientific Bioblock, Illkirch, France) dans 1000 mL d’une
solution aqueuse d’alcool polyvinylique (PVA , Mw 30.000 Da, 88 % hydrolysé ; Sigma, Saint
Quentin Fallavier, France) à 0,1 %. L’émulsion « huile dans eau » (O/W) obtenue a été agitée
pendant 2 heures à la même vitesse afin d’éliminer le solvant volatil. Les microparticules obtenues
ont été ensuite récupérées par filtration sous vide (Pompe VacuuBrand®, GmbH, Wertheim,
Allemagne) sur une membrane de nitrocellulose (porosité 0,45 ȝm, 47 mm de diamètre, Porafil®
Macherey-Nagel, Neuman-Neander, Düren, Allemagne) et séchées à température ambiante jusqu’à
l’obtention d’une humidité résiduelle de 1 % environ (déterminée par la méthode de Karl-Fisher).
Des particules avoisinant 40 µm ont été ainsi obtenues (Mastersizer X®, Malvern - Instruments,
Worcestershine, UK)
2.2 Préparation des implants in situ (ISI)

La même procédure de formulation que celle décrite précédemment (chapitre 3.3) a été réalisée
pour cette étude. Des solutions de PLA 30% (m/m, par rapport à la quantité de solvant) ont été
préparées dans différents solvants (1,80 g de PLA R 203 S dans 4,20 g de solvant ) : le triacétate de
glycérol 99% (Triacétine ;TA), la 2-pyrrolidone 99% (2P), le benzoate de benzyle (BB) (Alfa Aesar
GmbH, Karlshruhe, Germany) et la N-methyl-2-pyrrolidone (NMP ; VWR Prolabo, Fontenay Sous
Bois, France). Ces solutions ont été obtenues sous agitation magnétique en continu à 50 ± 5 °C
jusqu’à complète solubilisation du polymère. Ensuite, elles ont été refroidies à température
ambiante et 3,9 mg d’IVM ont été ajoutés et solubilisés par agitation douce. Ces solutions de
viscosités variables (TA>BB>2P>NMP) permettront la formation d’implants monolithiques une
149
fois l’injection dans les tissus suite à la diffusion du solvant et à la précipitation consécutive du
polymère.
2.3 Préparation des microparticules in situ (ISM)

Les ISM ont été préparées par émulsification initiale de deux solutions. La première est constituée
de 400 mg d’une phase polymérique obtenue par solubilisation de 1,80 g de PLA R 203 S (30 %
w/w, par rapport à la quantité de solvant) et de 3,9 mg d’IVM dans 4,20 g de 2P (pour les systèmes
ISM-O/O) ou de TA (pour les systèmes ISM-O/W). La deuxième solution correspond i) pour les
systèmes ISM-O/O, à 400 mg d’une phase huileuse obtenue par suspension de 20 mg de
monostéarate d’aluminium (2 % m / m) et solubilisation de 20 mg de Span® 80 (2 % m / m) dans
1,96 g d’huile d’arachide ii) pour les systèmes ISM-O/W, à 400 mg d’une solution aqueuse 1% de
Pluronic® F68 saturée en TA.
Les deux phases ainsi préparées ont été placées séparément dans des seringues de 1 mL (BD
Plastipack™, S. Augustin del Guadalix, Madrid, Espagne). Elles ont ensuite été émulsionnées
(Emulsion « huile dans huile » O/O ou « huile dans eau » O/W) en faisant passer 50 fois le contenu
d’une des seringues vers l’autre (système de va-et-vient) à une vitesse de 2 cycles / seconde à
travers un connecteur en polypropylène (PP) de 1,5 mm de diamètre interne. L’émulsion ainsi
obtenue sera ensuite injectée et le solvant diffusera dans le milieu aqueux environnant entraînant la
précipitation du polymère.
2.4 Etude de la libération d’IVM in vitro

Pour les microparticules obtenues par émulsion simple, environ 20 mg, ont été suspendus dans un
tube à essai, dans 5 mL d’une solution aqueuse de SDS 0,25 % à 37°C. Pour les systèmes in situ
(ISI ou ISM), environ 400 mg, de solution polymérique pour le ISI ou d’émulsion (O/O ou O/W)
150
pour les ISM, ont été injectés en utilisant une seringue de 1 mL couplée à une aguille 21G dans des
tubes contenant le même milieu de libération que celui décrit précédemment (SDS 0,25% à 37°C).
Les systèmes (hermétiquement clos) ont été agités à une vitesse de 75 r.p.m pendant 1 mois dans un
bain-marie agité Memmert® (Fischer Scientific, Illkirch, France). Pendant les premières 96 heures,
des échantillons de 1,5 mL on été prélevés à des intervalles de temps prédéfinis (et remplacés par du
milieu frais) filtrés à travers des membranes de nitrocellulose de 0,45 µm et dosés pour déterminer
la quantité d’IVM libérée. Puisque l’IVM n’est stable que 96 h dans le milieu de libération, le
milieu complet a été prélevé après cette période puis remplacé par du milieu frais. La quantité
d’IVM libérée a été mesurée par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) en phase
inverse comme décrit dans le chapitre 3.2 (Camargo et al., 2010). Pour toutes les formulations
évaluées, trois tests ont été réalisés.
2.5 Etudes in vivo

Les expériences in vivo ont été réalisées sur de rats adultes Wistar mâles RjHan:WI® (âgés de 4
mois environ et pesant 400 ± 50 g ; Janvier, Route des Chênes Secs, France) selon les
recommandations de la norme française pour les expérimentations chez l’animal. Pendant leur
séjour à l’animalerie et les expérimentations, les individus ont été identifiés, divisés par groupes et
séparés dans des cages où de l’eau et de la nourriture leur ont été fournies à volonté. Une dose de
500 µg / kg d’IVM, présentée sous la forme des différents systèmes (solution commerciale,
microparticules par émulsion simple, implant et microparticules in situ) a été administrée en sous-
cutanée à l’aide d’une seringue comme décrit précédemment dans le chapitre 2.2.4, en région
dorsale basse.
- une solution diluée dans le même solvant que la solution commerciale (mélange 60/40
propylène glycol /glycérol formal), de concentration correspondante à une dose de 500
µg /kg d’Ivomec 1% a été administrée à un groupe de rats.
151
- Pour les formulations à base de microparticules préparées par la méthode d’émulsion simple,
une quantité de microparticules suffisante pour l’obtention d’une dose d’IVM de 500 µg /
kg, a été mise en suspension dans 400 µL d’une solution aqueuse isotonique stérile
constituée de carboxyméthylcellulose sodique (0,5% (m/v)), Tween® 80 (0,5% (m/v)) et
mannitol USP 96% (5,0% (m/v)).
- Pour les systèmes in situ, environ 400 µL de solution polymérique ou d’émulsion (O/O ou
O/W) préparée extemporanément et contenant IVM (500 µg / kg) ont été injectés.
Suite à l’injection des formulations d’IVM, des échantillons de sang de 400 µL ont été prélevés au
niveau de la veine caudale des individus non anesthésiés à différents temps (30 minutes, 1, 2, 4, 6,
8, 24, 48, 72, 96 h et 7, 9, 11, 15 et 30 jours). Les échantillons ont été récupérés dans des tubes
citratés afin d’éviter la coagulation. Ils ont été ensuite centrifugés à 10 000 g pendant 10 minutes et
le plasma a été récupéré et stockés à -30°C pour son analyse ultérieure et la détermination de la
concentration d’IVM par CLHP.
Dans un souci éthique, des sous-groupes d’animaux (n=3 par temps de prélèvement, pour un même
type de formulation) ont été constitués afin d’assurer un volume de sang prélevé inférieur à 3 mL en
15 jours, volume maximal autorisé par les autorités compétentes (OVF, 2004).
2.6 Détermination par CLHP de la concentration d’IVM dans le plasma :

La concentration d’IVM dans les échantillons de plasma des rats a été déterminée après extraction
du principe actif. Pour cela, 100 µL de plasma et 500 µL de méthanol HPLC (à – 30°C) ont été
mélangés au vortex pendant 1 minute afin de précipiter tout d’abord les protéines du plasma.
L’extraction a été ensuite réalisée par incubation du système à – 30°C pendant 15 minutes. La phase
organique a été alors séparée par centrifugation (16 000 g ; 4°C ; pendant 15 minutes) puis
152
récupérée et évaporée par chauffage à 45°C ± 5°C sous flux d’azote gazeux (Prieto et al., 2003).
Pour l’analyse chromatographique, les résidus d’évaporation ont été préalablement redissous au
vortex pendant 2 minutes dans 150 µL d’un mélange (1 :1, v/v) constitué de N-méthylimidazole
(NMI ; 99% ; Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) et d’acétonitrile (ACN ; Carlo Erba-SDS, Val
de Reuil, France). L’analyse des extraits par CLHP a été réalisée en phase inverse avec détection
spectrofluorométrique du dérivé fluorescent du principe actif. Une aliquote de 50 µL de cette
solution a été ensuite dérivée directement dans le système CLHP selon la méthode précédemment
décrite (De Montigny et al., 1990), par l’addition automatique de 80 µL d’un mélange (1 : 2, v/v)
constitué d’ACN et d’anhydride trifluoroacétique (ATA). Après 2 minutes (temps nécessaire à la
dérivatisation (<30 s d’après la littérature), 80 µL de la solution dérivée ont été automatiquement
injectés dans le système chromatographique. L’élution et la détection du dérivé fluorescent ont été
réalisés dans un chromatographe liquide Shimadzu (SCL-10A VP, Croissy Beabourg, France) en
utilisant une colonne Uptisphere® (120 Å, ODB-C18, 5 µm ; 3 x 150 mm, Interchim, Montluçon,
France), avec une phase mobile composée d’ACN, de méthanol et d’acide acétique (solution
aqueuse 0,2%, v /v) en proportion 52 :45 :3, circulant à un débit de 1,5 mL/min et à 35°C. La
détection a été réalisée à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission respectives de 365 et 475
nm. La méthode a été validée en terme de spécificité vis-à-vis de l’IVM, de linéarité (entre 2 et 100
ng / mL (R2 > 0.99)) et présente un taux de récupération de 85,5 ± 10 %.
La concentration d’IVM dans le plasma a ainsi été déterminée et la biodisponibilité relative (F) des
formulations administrées (par rapport à la solution diluée d’Ivomec 1% administrée à une dose de
500 µg /kg) a été calculée par rapport aux aires sous la courbe (AUC) des graphiques concentration
/ temps obtenus par la méthode linéaire des trapèzes pour les différentes formulations testées.
153
2.7 Microscopie électronique à balayage

Afin de vérifier la formation et l’aspect des microparticules in situ lors de l’injection chez le rat, des
animaux recevant ces formulations ont été sacrifiés 1mois après l’administration de 3mL de
pentobarbital sodique 60 mg / mL (CEVA Santé Animal, Libourne, France) injectée en
intracardiaque à l’animal préalablement anesthésié (anesthésie gazeuse à l’isoflurane). Une autopsie
au site d’injection a été réalisée. Des photographies (Samsung L201) avant résection ont été
effectuées, et des échantillons de tissu au niveau de l’injection ont été prélevés, puis incubés à 37°C
dans une solution de trypsine-EDTA (0,5 g/L de trypsine et 0,2 g/L d’EDTA, Invitrogen SARL,
Cergy Pontoise, France) pendant 30 minutes afin d’éliminer un maximum de matériel biologique
environnant les particules. Les échantillons ainsi traités ont été ensuite séchés jusqu’à l’obtention
d’une humidité résiduelle d’environ 1% (Karl-Fisher). Enfin, les observations par microscopie
électronique à balayage (MEB) ont été réalisées en utilisant un microscope Philips XL 30S FEG
(FEI Company, Lyon, France) utilisé entre 1,5 et 4,5 kV sous atmosphère d’azote.
2.8 Analyse statistique

Les résultats obtenus ont été exprimés comme les moyennes ± écart type. Une comparaison par
pairs par la méthode de Mann–Whitney a été utilisée afin de déterminer le niveau statistique des
différences. Dans tous les cas, P < 0,05 a été considéré comme étant différent.
3. Résultats et discussion
Trois types de systèmes particulaires à base de PLA et délivrant de l’IVM ont été formulés dans
cette étude :
- les microparticules par émulsion simple (ES-MP), systèmes préformés caractérisés du point
de vue physico-chimique dans une précédente étude (Camargo et al., 2010)
154
- les implants monolithiques de formation in situ (ISI) dont le développement a été décrit dans
le chapitre 2 (Dunn et al., 1990)
- les microparticules in situ (ISM), systèmes émulsionnés de la forme précédemment citée
(Bodmeier, 1998).
Les implants et les microparticules in situ sont des systèmes injectés sous forme de solution
polymérique ou d’émulsion contenant une phase polymérique qui va précipiter au moment de
l’injection, lors de la fuite du solvant organique vers le milieu aqueux (solution aqueuse ou tissu).
La nature du solvant utilisé va donc conditionner la libération du principe actif contenu dans ces
systèmes. Deux solvants ont été choisis dans cette étude pour la préparation des formes in situ, pour
leur solubilité variable dans l’eau : la NMP, dont la solubilité dans l’eau est élevée (1000 mg/mL) et
la TA, de faible solubilité (64 mg/mL). Ces deux solvants ont permis l’obtention d’implants (ISI-
NMP et ISI-TA) et de microparticules (ISM-NMP-O/O et ISM-TA-O/W), les dernières
correspondant à un système émulsionné issu des premiers. La première partie du processus de
formation des ISM consiste à émulsionner les phases externe (huile ou eau) et interne (solution
polymérique contenant le principe actif), ce qui entraîne la formation de gouttelettes soit O/O ou
O/W. C’est pourquoi, les paramètres dépendant du solvant biocompatible utilisé tels que sa
solubilité dans l’eau et sa viscosité ainsi que l’affinité du principe actif pour chacune des deux
phases, jouent un rôle très important dans la vitesse de libération du principe actif lorsque ces
émulsions sont injectées dans un milieu aqueux.
3.1 Etude de la libération in vitro de l’IVM à partir des différents systèmes particulaires
La solution aqueuse de SDS 0,25% utilisée comme milieu de dissolution dans les études de
libération in vitro, permettait une solubilisation suffisante de l’IVM assurant ainsi l’obtention des
conditions « sink » pendant le test de dissolution. De plus, ce milieu s’est révélé assez discriminant
entre les formulations testées.
155
La libération in vitro d’IVM à partir des différentes formulations évaluées est présentée dans la
figure 1. Ainsi, la vitesse de libération de la solution commerciale Ivomec 1% a été la plus rapide
avec un effet « burst » (libération initiale rapide) important atteignant le 100 % d’IVM libérée dès la
première heure. Ce produit correspond a une solution d’IVM formulée dans un mélange en
proportion 60/40 de propylène glycol et de glycérol formal, solvants solubles dans l’eau (Lifschitz
et al., 2007). De ce fait, le mécanisme de libération du principe actif suite à l’injection de cette
solution, correspond à la précipitation du principe actif due à l’extraction des solvants vers le milieu
aqueux environnant puis la solubilisation progressive des cristaux d’IVM à partir du dépôt formé
dans la solution de SDS 0,25%. Cependant, la présence de ces solvants, très solubles dans l’eau,
favorise également la rapide solubilisation du principe actif dans le milieu aqueux.
100
90 Ivomec
80 ES-MP
ISI-NMP
70
Ivermectine libérée (%)
ISI-TA
ISM-NMP-O/O
60
ISM-TA-O/W
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (J)
Figure 1 : Cinétiques de libération d’IVM in vitro pour différents systèmes de libération (jusqu’à 30 jours). Les
données représentent la moyenne ± l’écart type (n=3).
Contrairement au comportement de l’Ivomec, les systèmes préparés à base de PLA ont présenté
une libération d’IVM beaucoup plus lente. En effet, la haute concentration de PLA dissoute dans le
solvant (30%) contribue à une réduction du « burst » de la formulation par rapport à l’Ivomec, due
à une réduction de la vitesse de diffusion du solvant vers le milieu extérieur.
156
Les profils de libération obtenus pour chacune des formulations testées sont tous caractérisés par
une libération initiale rapide du principe actif, suivie d’une libération plus lente et soutenue.
Cependant, la vitesse de libération (quantité d’IVM libérée à chaque temps) d’IVM à partir de ces
systèmes diminue dans l’ordre suivant : ISM-NMP-O/O > ISI-NMP > ISM-TA-O/W > ES-MP >
ISI-TA. L’IVM est donc libérée plus aisément des formulations à base de NMP. Différents
phénomènes peuvent expliquer cela :
- La haute solubilité dans l’eau de la NMP (1000 mg/mL) conduisant à sa diffusion rapide
vers le milieu aqueux de dissolution et par la même, la diffusion rapide vers le milieu
aqueux de l’IVM peut principalement expliquer ce résultat.
- Ce phénomène est aussi favorisé par la faible viscosité relative du solvant (1.89 mPa.s)
(Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009).
- Enfin, puisque les systèmes obtenus, ISI ou ISM, en utilisant des solvants très hydrophiles
comme la NMP sont très poreux, leur dégradation peut avoir lieu plus rapidement (Brodbeck
et al., 1999; Kranz and Bodmeier, 2008). En effet, plus la porosité d’un système est élevée,
plus la pénétration d’eau à l’intérieur du système est importante et plus il est vite dégradé.
Ceci pourrait expliquer la libération rapide de l’IVM à partir de ces systèmes après leur
formation (complète précipitation du polymère).
De plus, les ISM à base de NMP libère de façon plus rapide l’IVM que les ISI-NMP. Puisque
l’émulsion injectée est un système finement divisé (microglobules), elle possède d’une part, une
surface de contact plus grande par rapport à chacune des phases (donc à la structure monolithique
des implants), ce qui augmente son exposition au milieu de libération. D’autre part, le fait que
l’IVM soit une molécule fortement lipophile (Log P : +3,22) (Loffler and Ternes, 2003) et que la
NMP soit complètement miscible à l’huile d’arachide, induiraient également un partage du principe
157
actif entre la phase externe et interne, augmentant ainsi l’exposition du principe actif au milieu de
libération. Ce phénomène a été déjà observé pour des ISM-O/O fabriquées en utilisant le couple
NMP/huile d’arachide pour la libération d’acétate de leuprolide (Im-Emsap, 2002).
Les profils de libération des systèmes in situ à base de TA présentent un effet « burst » et un plateau
plus faibles que ceux des formulations à base de NMP. Quatre facteurs principaux expliqueraient ce
phénomène : i) la faible solubilité dans l’eau de la TA (64 mg/mL) empêche la fuite du principe
actif avec le solvant une fois que ce dernier diffuse dans le milieu de dissolution, ii) la faible
solubilité de la TA dans la phase externe aqueuse entraîne un faible partage phase externe/phase
interne, iii) la viscosité élevée de la TA (19.70 mPa.s) (Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009) et
de la solution polymérique ralentissent la vitesse de diffusion du solvant biocompatible vers le
milieu extérieur et iv) la faible solubilité de l’IVM dans la phase externe en raison de sa
lipophilicité élevée.
Les ISM-TA-O/W présentent également une surface spécifique plus importante que les ISI-TA
libérant ainsi l’IVM de façon plus rapide, comme évoqué précédemment pour les formes à base de
NMP. De même, bien qu’étant des systèmes solides préformés, les microparticules préparées par la
méthode d’émulsion simple/évaporation de solvant présentent une surface spécifique plus grande
entraînant ainsi leur plus grande exposition au milieu de libération. Dans ce type de particules
préformées, l’effet « burst » observé a été attribué au principe actif présent en surface et qui est
libéré immédiatement au moment de la mise en suspension des microparticules dans le milieu de
libération (Hasan et al., 2007). Il est également à noter que la faible porosité de ces microparticules
et la forte interaction entre le polymère et le principe actif due à leurs fortes lipophilicités (Camargo
et al., 2010) peuvent expliquer la faible libération d’IVM à partir des systèmes préformés.
158
Les résultats précédents présentent un intérêt particulier car la plupart d’études publiées, étudiant la
cinétique de libération in vitro de principes actifs à partir des ISM, ont été réalisées sur des
formulations ISM-O/O et des principes actifs hydrophiles tels que l’acétate de leuprolide, le
chlorhydrate de bupivacaine, le chlorhydrate de diltiazem ou l’acétate de busereline (Kranz and
Bodmeier, 2007, 2008; Luan and Bodmeier, 2006a, b). Puisque les principes actifs hydrophobes
nécessitant une amélioration de leur biodisponibilité et une libération prolongée sont de plus en plus
nombreux (Wischke and Schwendeman, 2008), la compréhension du comportement de ces
principes actifs dans les systèmes injectables de formation in situ est important. Ainsi, une
comparaison de la vitesse de libération d’IVM, in vitro et in vivo, à partir d’ISI issus de l’utilisation
des solvants de différentes hydrophilicités et des ISM-(O/O ou O/W) était fortement envisagée afin
de mieux caractériser les formulations. De ce fait, des essais pharmacocinétiques chez le rat ont été
réalisés avec les formulations précédemment testées in vitro.
3.2 Etude de la libération in vivo de l’IVM à partir des différents systèmes

Les résultats des différents groupes d’animaux sont reportés dans la Figure 2, où les écart-types ne
sont pas mentionnés pour plus de lisibilité. De façon intéressante, la libération (notamment le burst)
des formulations in vivo a été similaire à celui observé in vitro. Ainsi, la libération initiale d’IVM à
partir de chacun des systèmes, représenté par son Tmax plasmatique (tableau 1), a montré une
diminution de ce paramètre dans l’ordre suivant: Ivomec>ISM-NMP-O/O>ISI-NMP>ISM-TA-
O/W>ISI-TA>MP-ES. Ces résultats confirment les observations d’autres chercheurs montrant une
influence du véhicule utilisé dans la formulation de l’IVM sur la biodisponibilité du principe actif
(Lifschitz et al., 2007; Lifschitz et al., 1999).
159
140
120
Concentration plasmatique d'IVM (ng / mL)

Ivomec
100 MP-ES
ISI-NMP
ISI-TA
80
ISM-NMP-O/O
ISM-TA-O/W
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Temps (J)
Figure 2 :Profils plasmatiques d’IVM obtenus suite à l’administration sous-cutanée de différentes formulations. La
dose administrée a été de 500 µg IVM / kg
La biodisponibilité relative (F) des formulations administrées, a été calculée par rapport à l’aire
sous la courbe d’une solution diluée d’Ivomec 1% à une dose de 500 µg /kg. La concentration
d’IVM dans le plasma de rats ayant reçu les différentes formulations a été déterminée par CLHP.
Après détermination de l’aire sous la courbe (AUC) des graphes concentration / temps, par la
méthode linéaire des trapèzes, les biodisponibilités relatives ont été calculées par rapport aux AUC
de chacune des formulations testées.
Le profil de libération in vivo de l’Ivomec est caractérisé par un fort pic plasmatique (Cmax: 123,22
± 2,31 ng/mL) à 8h (Tmax) (tableau 1). Cependant, suite à l’apparition du pic de concentration
maximale, la concentration d’IVM diminue rapidement jusqu’à devenir très faible au bout de 30
jours (< 5ng/mL). En effet, il a été déjà observé une plus grande biodisponibilité pour l’IVM
administrée par la voie parentérale lorsqu’elle est dissoute dans des solvants hydrophiles que dans
des solvants non hydrophiles (Gonzalez Canga et al., 2009) comme ce le cas de l’Ivomec.
160
Tableau 2. Paramètres pharmacocinétiques d’IVM pour des différents types de formulations injectées chez le rat.
Paramètre pharmacocinétique
Formulation Tmax (h) Cmax (ng/mL) AUC0-7j (ng j/mL) F7j (%)
Ivomec 8 123,22 ± 2,31 (a) 354,51 100
MP-ES 48 29,92 ± 3,27 (c) 137,42 38,76
ISI-NMP 24 57,82 ± 5,76 194,38 54,83
ISI-TA 48 38,94 ± 7,32 161,49 45,55
ISM-NMP-O/O 24 78,85 ± 4,57 (b) 207,29 58,47
ISM-NMP-O/W 24 47,77 ± 7,21 (b) 142,82 40,29
(a)
Statistiquement différente des autres formulations (P < 0.05%).
(b)
Statistiquement différente d’ISI-NMP (P < 0.05%)
(c)
Non Statistiquement différente d’ISI-TA (P < 0.05%)
Puisque l’efficacité d’une molécule antiparasitaire telle que l’IVM, dépend principalement du temps
d’exposition du parasite à sa concentration toxique, des niveaux plasmatiques appropriés du
principe actif sont souhaitables afin de fournir au patient un traitement adéquat. Si la concentration
plasmatique du principe actif est trop importante, des effets indésirables graves, liés à la toxicité de
la molécule peuvent survenir suite à l’administration du médicament. En revanche, si la
concentration est trop faible pour être toxique pour le parasite, le traitement ne sera pas efficace, le
parasite pourra facilement s’installer chez son hôte et des problèmes de résistance à la molécule
antiparasitaire peuvent aussi apparaître. C’est pourquoi, pour être efficace dans un traitement à long
terme, la solution d’Ivomec 1% doit être administrée régulièrement (tous les 7-14 jours) chez les
bovins et les ovins (Merial, 2010).
En regard des paramètres pharmacocinétiques, les formulations réalisées à partir du polymère

biodégradable PLA ont eu pour conséquence une prolongation et une meilleure maîtrise de la
libération d’IVM. Ces formulations présentent en effet, un plus faible effet « burst » (plus faible
Cmax par rapport à l’Ivomec) avec une réduction de 36% (pour les ISM-O/O), 53,07% (pour les
ISI-NMP), 61,23% (pour les ISM-O/W), 68,39% (pour les ISI-TA) et 75,71 (pour les MP-ES) ce
161
qui pourrait aller dans le sens d’une libération plus prolongée du principe actif. De plus, le fait
d’avoir des Tmax décalés (par rapport à l’Ivomec) (8 h), notamment dans le cas des formulations
plus visqueuses (ISI-TA) (48h) ou solides (MP-ES) (48h) montrerait également une prolongation de
la libération de l’IVM à partir de ces systèmes. Les études statistiques ont permis une différentiation
entre certaines formulations particulièrement au niveau de la Cmax (tableau 1). Toutes les
formulations ont eu un comportement statistiquement différent de celui d’Ivomec (Cmax: 123,22 ±
2,31 ng / mL). Les microparticules préparées par la méthode d’émulsion simple / évaporation de
solvant et les ISI-TA ont présenté particulièrement les plus faibles Cmax, 29,92 ± 3,27 et 38,94 ±
7,32 ng / mL, respectivement. Ce comportement peut être important lors du contrôle des effets
indésirables issus d’un burst important. Par contre, les formulations ISM-NMP-O/O (Cmax: 78,85 ±
4,57 ng / mL), ISI-NMP (Cmax: 57,82 ± 5,76 ng / mL), ISM-NMP-O/W (Cmax: 47,77 ± 7,21 ng / mL)
pourraient induire des effets indésirables plus importants même si plus faibles que l’Ivomec.
Cependant, puisque que la LD50 d’IVM chez le rat suite à une administration sous-cutanée a été
déterminée comme étant d’environ 51,5 mg/kg, ce qui représente un marge de sécurité d’environ
200 fois la dose thérapeutique (Dadarkar et al., 2007), aucun des effets toxiques décrit chez le rat
tels que ataxie, ptoses et diminution de l’activité (Edwards, 2003) n’a été observé lors des test in
vivo des formulations. L’importance du contrôle du burst des formulations pourrait être plus
remarquable chez le chien ou des effets toxiques issus du traitement avec des lactones
macrocycliques sont souvent reportés (FDA, 2003). En particulier, le contrôle de la libération
initiale d’IVM peut être un facteur très important lorsque des chiens de race colley doivent être
traites avec l’IVM (Collie-Online, 2010). En effet, certains colleys exprimant une mutation de 4-pb
(paire de base) dans le gène mdr1 codant pour la glycoprotéine-P, présentent des effets
neurotoxiques graves tels que hyper-salivation, ataxie, cécité, coma et mort à cause d’une
accumulation d’IVM au niveau du cerveau. Ces effets sont mis en évidence à des doses 200 fois
162
plus faibles que celles nécessaires pour induire la même toxicité chez les chiens normaux (Edwards,
2003).
Les formulations de faible libération initiale pourraient également garantir une libération plus
prolongée du principe actif. Cependant, si la dégradation du système de libération devient très faible
(par exemple à cause de sa faible porosité), pour permettre la libération du principe actif, le système
pourrait ne pas suffisamment protéger contre le parasite cible. En effet, en fonction du parasite et de
l’hôte à traiter, les concentrations plasmatiques toxiques nécessaires pour le combattre sont
différentes et mal établies jusqu’à présent pour la plupart des espèces traitées. Cependant, il
semblerait que des concentrations plasmatiques d’IVM entre 0,5 et 1 ng/mL seraient suffisantes
pour combattre de façon optimale la plupart des nématodes gastro-intestinaux et pulmonaires
(Lifschitz et al., 1999). Ainsi, les ISM-O/W présentant un burst moyenne pourraient être une
alternative intéressante afin de trouver un compromis entre la protection contre le parasite et la
toxicité chez l’animal hôte.
D’autre part, les AUC plus faibles des formulations testées par rapport à l’Ivomec(354,51 ng j/mL)
montrent également une prolongation de la libération d’IVM. Ceci est aussi mis en évidence par les
biodisponibilités relatives (F) correspondantes. Ainsi, la formulation présentant l’AUC la plus faible
a été celle des MP-ES (AUC: 137,42 ng j/mL ; F: 38,76%). Comme discuté précédemment, le fait
d’être des systèmes solides lors de leur administration, affaiblirait l’effet burst de ces systèmes en
comparaison avec les systèmes in situ. En revanche, les ISM-NMP-O/O (207,29 ng j/mL; F:
58,47%) et les ISI-NMP (194,38 ng j/mL; F: 54,83), présentant les AUC plus élevées, libérant ainsi
une quantité plus importante de leur charge en IVM dans la partie initiale, pourraient avoir une
libération moins prolongée du principe actif, ce qui représenterait un problème par rapport au cahier
de charge fixé initialement de diminuer le nombre d’administrations.
163
3.3 Observation des particules en microscopie électronique à balayage:

Un mois après l’administration des différents systèmes in situ, certains animaux ont été sacrifiés et
une autopsie a été pratiquée. L’observation des tissus environnants le site d’injection des ISM (Fig.
3) et des ISI n’a pas montré de signes de lésions ou d’inflammation. Ces observations uniquement
macroscopiques, sont en concordance avec des études ayant montré la faible toxicité des ISM dans
les muscle isolé de rat (Kranz et al., 2001; Rungseevijitprapa et al., 2008).
SI
Figure 3 : Photographie du site d’injection d’ISM un mois après administration sous-cutanée.

La zone en pointillée notée « SI » délimite le site d’injection dans lequel sont retrouvées la majorité des particules
formées dans les tissus. Les flèches indiquent des agglomérats de microparticules autour desquels le tissu s’est organisé.
« T » indique le tissu environnant. Aucunes différences de teinte, aucun signe d’irritation n’ont été observés.
Des observations en microscopie électronique à balayage ont permis de mettre en évidence, pour la
première fois à notre connaissance, la formation des microparticules in situ dans les tissus, suite à
l’injection in vivo des émulsions O/O ou O/W. Les photographies reportées dans la littérature
jusqu’à présent sont issus des essais de formation in vitro (Kranz and Bodmeier, 2007). Des
microparticules parfaitement sphériques ont ainsi été obtenues (Fig. 4, A-B). Malgré le traitement
des tissus prélevés par une solution de trypsine-EDTA, les photographies ont montré des ISM
enrobées par les tissus environnants (Fig. 4A). Cette organisation des tissus autour des particules
pourrait éventuellement interférer avec la libération de l’IVM en ralentissant sa diffusion vers le
164
milieu extérieur. Néanmoins, des microparticules libres (non enrobées) (Fig. 4B) ont été observées
et leur surface lisse a été ainsi mise en évidence ainsi qu’une certaine hétérogénéité de taille.
A)
B)
Figure 4. Observation en microscopie électronique d’ISM extraites des tissus traités à la trypsine-EDTA, un mois après
administration sous-cutanée. ISM enrobées par les tissus de l’endroit d’injection (A) et « libres » montrant leur surface
lisse (b).
165
4. Conclusions
Plusieurs systèmes biodégradables pour la libération prolongée d’IVM ont été proposés et leur
capacité à libérer le principe actif in vitro et in vivo a été testée. Cette étude a montré une
concordance des résultats obtenus in vitro et in vivo et l’importance du choix du solvant utilisé dans
les systèmes in situ. Une maîtrise de la libération et une libération prolongée ont été mises en
évidence. Les systèmes in situ représentent donc une alternative pour les traitements à long terme
des parasitoses chez l’animal. La facilité de la préparation et d’administration des ISM ainsi que
leur bonne performance et la relative uniformité des microparticules obtenues suite à leur
administration, font de ces microparticules des systèmes très intéressants pour l’obtention de
systèmes à libération prolongée. Néanmoins, les profils pharmacocinétiques obtenus avec ces
systèmes doivent encore être validés par des essais d’efficacité in vivo sur le parasite cible,
confirmant l’activité thérapeutique de l’IVM ainsi formulée et l’efficacité des doses délivrées par de
tels systèmes.
166
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170
4. DISCUSSION GENERALE
4. Discussion générale
4 DISCUSSION GENERALE
4.1 Contexte
L’ivermectine (IVM) est une des molécules antiparasitaires les plus efficaces utilisées dans le
domaine vétérinaire. Elle appartient à la classe II du système de classification biopharmaceutique
(Amidon et al., 1995). Cependant, les problèmes de biodisponibilité orale que présente cette
molécule ont conduit à son administration par voie parentérale. Les quelques formes injectables
permettant la libération prolongée d’IVM disponibles sur le marché, correspondent à des solutions
concentrées conduisant à une précipitation du principe actif au site d’application suite à la diffusion
du solvant. Cependant, ces formulations présentent des problèmes tels que l’irritation au site
d’administration ainsi qu’une forte libération initiale. De plus, ce type de formulation ne permet la
libération du principe actif que pendant quelques jours d’où la nécessité d’une administration
répétée. Cette problématique ainsi que la nécessité de compter de plus en plus sur des produits plus
sûrs, performants et élaborés par des méthodes de fabrication facilement industrialisables, sont à la
base des objectifs proposés dans ce travail de recherche.
4.2 Conception des systèmes de libération
Afin d’obtenir des systèmes parentéraux permettant la libération prolongée de l’IVM tout en étant
en même temps biodégradables et biocompatibles, les polymères de l’acide lactique et/ou
glycolique (PLA et PLGA) ont été choisis comme matériaux permettant le contrôle de la libération
du principe actif. Ces polymères ont été déjà utilisés pour l’obtention de produits parentéraux à
libération prolongée pour de nombreux principes actifs lipophiles et font l’objet de formes
commercialisées ce qui représente un avantage notamment concernant leur sécurité d’emploi ainsi
que la littérature scientifique disponible. La sécurité largement étudiée et démontrée de ces
polymères représente une garantie face aux problèmes indésirables pouvant être liées aux adjuvants
172
de formulation. De plus, la faible dose à laquelle le principe actif agit (200-500 µg/kg) constitue
également un avantage, vu la large plage d’espèces animales qui peuvent être ciblées par les
formulations développées. Enfin, le choix de méthodes de fabrication simples et facilement
industrialisables tels que les ISI et les ISM est privilégié pour des raisons économiques. Ainsi, une
méthodologie comparative de la méthode classique de préparation de microparticules dite par
émulsion et évaporation de solvant par rapport aux méthodes plus simples (ISI et ISM) a été choisie
afin de mettre en évidence les avantages de ces deux dernières méthodes.
4.3 Etudes de préformulation et formulation
Pour le développement des systèmes parentéraux à libération prolongée, une analyse du rapport
entre les propriétés physico-chimiques du principe actif et les méthodes de préparation a été réalisée
(Fig. 18) ;
Log P Stabilité des

solutions
Solubilité dans
Point de solvants
fusion organiques
Thermostabilité Solubilité
dans l’eau
Figure 24. Principales propriétés physico-chimiques d’IVM à prendre en compte pour la formulation
173
La connaissance des propriétés physico-chimiques précédentes a conduit au choix des méthodes de

fabrication mais a également permis la meilleure compréhension des interactions du principe actif
avec les adjuvants utilisés dans chacune des méthodes. Ainsi, la méthode d’émulsion simple -
évaporation du solvant a été choisie comme méthode de fabrication classique pour les
microparticules chargées en IVM (chapitre 3.2) car elle est connue pour permettre généralement une
encapsulation optimale des principes actifs hydrophobes (Wischke and Schwendeman, 2008). De
même, la forte interaction entre l’IVM et les polymères utilisés pour la fabrication de ces particules,
liée à leur lipophilie similaire, a été mise en évidence par les essais de caractérisation physique :
DSC (Dubernet, 1995), et DRX (Hausberger and DeLuca, 1995), taux d’encapsulation et test de
libération in vitro . Ainsi, la faible libération du principe actif à partir de ces particules et le taux
d’encapsulation élevé, ont été expliqués par la forte affinité entre le principe actif (log =3,22) et
P
les polymères, mais aussi par la faible porosité des microparticules observée par microscopie
électronique à balayage (SEM). De plus, la connaissance des caractéristiques physico-chimiques
des polymères choisis pour les études a permis d’expliquer les comportements observés pendant les
tests de libération d’IVM. En effet, trois types de polyesters biodégradables ont été choisis pour les
études; un PLGA (H) avec sa terminaison acide libre (-COOH) (non end-capped), et un PLGA et un
PLA (S) avec leur terminaisons acides estérifiées (-COOR) (end-capped). En raison des différentes
compositions chimiques, des temps de dégradation variables selon les polymères, une libération
également différente du principe actif était attendue. Cette hypothèse a été confirmée par les tests de
libération du principe actif in vitro . Dans un premier temps, la très faible solubilité dans l’eau de
l’IVM a été à l’origine du milieu de libération choisi pour les tests de dissolution à savoir tampon
phosphate pH 7,4 contenant le tensioactif Tween 80 à 2% m/v. Ce milieu permet en effet d’assurer
des conditions « sink » pour la libération du principe actif. Dans les conditions « sink », la libération
du principe actif n’est plus dépendante de sa solubilité dans le milieu considéré mais reflète alors le
réel comportement de la forme pharmaceutique considérée. Un milieu de libération contenant du
174
SDS à 0,25% s’est également révélé intéressant pour les tests de libération d’IVM. En effet, l’ajout
de tensioactifs aux milieux de libération pour les tests de dissolution de molécules très hydrophobes
permet l’obtention des conditions « sink » mais aussi, l’observation nette des effets de matrice (e.x.
polymères).
Les microparticules réalisées par la méthode classique de simple émulsion - évaporation de solvant
ont été une référence pour les études suivantes de formulation des systèmes in situ (ISI et ISM).
Cependant, s’agissant des systèmes administrés à l’état liquide, solutions (ISI) ou émulsions (ISM),
la connaissance d’autres paramétres physico-chimiques est également importante afin de formuler
plus rationellement ces systèmes de libération. En effet, dans le cas des systèmes préformés tels que
les microparticules réalisées par la méthode d’émulsion simple, le durcissement du système de
libération est réalisé avant qu’une quelconque libération du principe actif soit effective, in vitro ou
in vivo . Autrement dit, le temps de latence (« lag time ») nécessaire pour que la solution
polymérique de la phase interne (O/W) puisse être transformée en microparticule, a lieu avant que
la libération s’exerce. Ainsi, le temps de latence, n’affecte pas, au moins directement, la libération
du principe actif. En revanche, quand il s’agit de systèmes de formation in situ , le problème devient
plus complexe, et il est nécessaire que les microparticules soient formées le plus rapidement
possible. La dynamique de la formation de ces systèmes, est fortement liée aux propriétés physico-
chimiques des solvants biocompatibles et des polymères utilisés et notamment aux interactions du
couple solvant / polymère. Ainsi, lors du chapitre 3.3, les études ont été focalisées sur la meilleure
compréhension de ce phénomène et de son impact sur la libération de l’IVM. Puisque dans les ISM,
la phase interne est une solution polymérique (ISI), les expériences ont été réalisées sur des ISI en
partant du principe que la connaissance de ces systèmes était fondamentale pour mieux comprendre
les ISM.
175
C’est pourquoi l’influence des propriétés physico-chimiques des solvants biocompatibles utilisés et
du comportement des polymères dans ces solvants, sur la vitesse de libération du principe actif, a
été l’un des sujets d’étude principaux. Le tableau 19 résume les facteurs fondamentaux déterminant
la libération d’IVM à partir des ISI. En effet, des propriétés telles que la solubilité dans l’eau des
solvants et la viscosité des solutions polymériques ont été très utiles pour mieux comprendre les
différences observées dans les profils de libération d’IVM.
Tableau 3. Propriétés physico-chimiques modifiant la libération d’IVM à partir des ISI
Propriété Effet induit

Temps de latence « Burst »
Solubilité aqueuse du solvant ↓ avec la solubilité ↑ avec la solubilité
Viscosité du solvant ↑ avec la viscosité ↓ avec la viscosité
Viscosité solution polymérique ↑ avec la viscosité ↓ avec la viscosité
Concentration du polymère ↑ avec la concentration ↓ avec la concentration
Les propriétés des solutions polymériques ont été étudiées en termes d’interactions
polymère/solvant à l’aide des paramètres de solubilité de Hansen (HSP). Ainsi, il a été observé que
l’utilisation de « bons » solvants des polymères tels que la NMP et la 2P dont les interactions
solvant/polymère sont plus fortes, conduisaient à l’obtention de solutions de plus faible viscosité
que celles obtenues avec les « mauvais » solvants pour lesquels les interactions polymère/polymère
sont plus importantes. Les mauvais solvants des polymères, tels que la TA et le BB, ont été
également caractérisés par des faibles solubilités dans l’eau ce qui représente toutefois une
alternative intéressante pour contrôler la libération initiale de l’IVM. Ainsi, le chapitre 3.3 expose
une méthode de « screening » afin de mieux choisir un solvant ou un système de solvants
permettant l’obtention du profil de libération souhaité. Dans cette étude, le polymère PLA a été
choisi car les résultats des expériences préliminaires ont démontré une plus faible libération du
principe actif à partir des implants réalisés en utilisant ce polymère (Fig. 25).
176
PLGA H
100
PLGA S

PLA S
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (J)
PLGA H
100
PLGA S
PLA S
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temsp (J)
C
PLGA H
100
PLGA S
PLA S
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temsp (J)
Figure 25.Profils de libération d’IVM à partir d’ISI réalisés en utilisant trois polyesters et trois solvants différents ; (A)
NMP, (B) 2P et (C) TA.
En effet, d’un point de vue théorique, le PLA était le polymère le plus intéressant car sa vitesse de
dégradation plus faible permettait de prolonger le temps de libération de l’antiparasitaire. Comme
discuté dans les chapitres précédents, l’efficacité d’un traitement antiparasitaire dépend du temps
177
pendant lequel le parasite est exposé à la dose toxique. Ainsi, une libération trop importante du
principe actif peut entraîner des effets toxiques pour le patient et compromettre le temps de
libération prolongée à partir du système de libération. En revanche, une trop faible libération peut
conduire à l’inefficacité du traitement et à l’apparition de résistances à l’antiparasitaire.
Le temps de libération du principe actif à partir du système de libération est aussi critique d’un
point de vue économique étant donné des problèmes de prix auxquels sont soumis les produits
vétérinaires et le coût des matières premières telles que les polyesters de l’acide lactique et / ou
glycolique. Ainsi, l’obtention de conditions de formulation permettant un bon rapport durée
d’action, concentration toxique pour le parasite et prix est fortement désirée.
Au cours du chapitre 3.3, la stabilité des solutions des polymères et du principe actif dans les
solvants biocompatibles a été également abordée. La stabilité des solutions polymériques est un
aspect très important dans la formulation des ISI. En effet, la combinaison
solvant/polymère/principe actif doit non seulement fournir un profil de libération approprié vis-à-
vis des imperatifs thérapeutiques et des prix, mais aussi garantir la stabilité du produit. Ainsi, il a été
observé une dégradation plus élevée, autant des polymères que du principe actif, dans les solvants
présentant le « burst » le plus important à savoir, la NMP et la 2P. De ce fait, ces solvants ne
constituaient pas des solvants de choix pour la libération d’IVM à partir des ISI. Par contre, la TA et
le BB, étant moins hydrophiles et possédant des interactions moins fortes avec l’IVM et les
polymères, ont abouti à des ensembles solvant/polymère/principe actif plus stables. Cependant, lors
des tests de dissolution, l’injection de ces derniers systèmes s’est révélée plus difficile en raison de
leur plus grande viscosité. Compte tenu de la simplicité de préparation et des profils de libération
obtenus avec les ISI par rapport à ceux des microparticules obtenues par la méthode d’émulsion
simple / évaporation de solvant, ces systèmes nous paraissent plus intéressants pour la libération
178
prolongée d’IVM. Cependant, comme discuté précédemment, les solutions polymériques les plus
intéressantes du point de vue du profil de libération (à base de TA et de BB) ont été celles pour
lesquelles l’injectabilité a été la plus faible.
100
NMP
2P
ivermectine libérée (%)
80 TA
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (J)
100
NMP
2P
80 TA
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (J)
100
NMP
2P
80 TA
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (J)
Profils de libération d’IVM à partir d’ISM réalisés en utilisant trois solvants et trois polymères différents ;
Figure 26.
(A) PLGA H, (B) PLGA S et (C) PLA S.
179
C’est pour cette raison que nous nous sommes tournés vers les ISM, connues pour être des systèmes
plus facilement injectables dont les études de caractérisation ont été décrites dans la dernière partie
des travaux experimentaux (chapitre 3.4). Ainsi, les tests in vitro de libération d’IVM à partir des
ISM-O/O réalisées avec des solvants hydrophiles tels que la NMP et la 2P, et des ISM-O/W
réalisées à partir de la TA ont montré des résultats intéressants (Fig. 26). Les polymères PLA S,
PLGA H et PLGA S ont été testés afin d’observer l’effet du polymère sur la vitesse de libération
d’IVM. L’impact de la méthode de préparation des ISM a également été observé.
De façon similaire au comportement des ISI, l’IVM a été libérée plus rapidement à partir des ISM
réalisées avec les solvants les plus hydrophiles. Cependant, la plus grande surface spécifique des
ISM conduit à une libération initiale d’IVM plus élevée par rapport aux ISI. Bien qu’un peu plus
élevé, le « burst » des ISM-O/W a été similaire à celui des ISI réalisés en utilisant la TA comme
solvant biocompatible. De ce fait, les ISM-O/W se sont révélées très intéressantes pour plusieurs
raisons industrielles et thérapeutiques telles que: i) la facilité de préparation, ii) la facilité
d’injection, iii) le faible « burst » et iv) la libération prolongée. En revanche, les ISM-O/O ne
représentent pas une bonne alternative car ces systèmes ne favorisent pas l’incorporation du
principe actif dans les microparticules en raison des caractères lipophiles autant du principe actif
que de la phase externe (huile végétale). Comme il a été expliqué dans le chapitre 3.3, la solubilité
de l’IVM dans la TA est relativement faible (75 mg/mL) par rapport à celle dans la NMP (> 500
mg/mL). Cependant, en raison de son Log , l’affinité de l’IVM pour la phase externe des ISM-
P
O/W est moins importante que celle dans les ISM-O/O où la phase externe est huileuse. De ce fait,
ces derniers systèmes ont été utilés notamment pour l’encapsulation de principes actifs hydrophiles
donc avec une faible affinité par la phase externe (Im-Emsap, 2002).
180
4.4 Toxicité cellulaire
Comme cela a été décrit dans l’étude bibliographique, la toxicité des solvants biocompatibles
utilisés dans la préparation des systèmes in situ est un aspect très important à prendre en compte
lors de la formulation de ces systèmes. Ainsi, la toxicité des solvants que nous avons sélectionnés a
été testée sur des macrophages alvéolaires de rat (souche NR8383) à l’aide d’un test MTT (Figure
30) de façon à vérifier les résultats décrit dans la littérature et étudier la cytotoxicité des solvants
utilisés dans les formulations développées.
120
100
80
Viabilité, %
60
40
20
0
Blanc NMP TA 2P NaCl 0,9%
Solvants
Figure 27. Toxicité des solvants biocompatibles utilisés dans les formulations sur des macrophages alvéolaires
in situ
de rat NR8383 par la méthode du MTT. Les données correspondent à la moyenne ± écart type. ( =8).
n
Puisque les macrophages sont des cellules médiatrices de la réponse inflammatoire lorsque
l’organisme est soumis à des agents toxiques (Laskin, 2009), leur niveau de résistance aux agents
xénobiotiques tels que les solvants peut être considéré comme un indicatif de toxicité. Ainsi,
l’hypothèse était que, plus la viabilité des macrophages en présence des solvants est importante,
moins le solvant était toxique. Le test MTT est un essai colorimétrique relativement simple
mesurant l’activité déshydrogénase mitochondriale. En effet, les déshydrogénases mitochondriales
des cellules vivantes clivent l’anneau tétrazolium du bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tétrazolium induisant la formation de cristaux pourpres de formazan insolubles dans l’eau.
La quantité de précipité formé est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes (mais également
181
à l'activité métabolique de chaque cellule). Ainsi, la mesure spectrophotométrique à 550 nm de la

couleur développée (suite à la solubilisation des cristaux de formazan dans le DMSO), permet de
connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. D’après les résultats
du test, les trois solvants se sont révélés cytotoxiques envers les macrophages. En effet, des
pourcentages de viabilité avoisinant pour les trois solvants testés les 10% ont été observés. Des
résultats dans le même sens ont été obtenus lors de tests de myotoxicité de ces solvants. La NMP a
montré une myotoxicité plus importante que la 2P (Kranz et al., 2001). En revanche, la myotoxicité
de la TA par rapport à celle de solvants hydrophiles n’a pas été encore reportée dans la littérature.
Ces résultats doivent être analysés attentivement car ils représentent la toxicité des solvants purs.
Lorsque les solvants sont utilisés dans la formulation d’ISI ou d’ISM, la concentration et donc la
toxicité due aux solvants sont plus faibles (Rungseevijitprapa et al., 2008).
4.5 Etudes in vivo
4.5.1 Libération in vivo et biodiponibilité
Les principaux résultats des tests effectués chez le rat sont résumés dans le chapitre 4. En ce qui
concerne la libération du principe actif, le modèle animal a répondu d’une façon similaire aux
conditions in vitro . Notamment, l’effet « burst » observé in vitro pour les formulations testées a été
retrouvé d’une façon relativement claire d’après les tests statistiques. En même temps, les
paramètres pharmacocinétiques étudiés ont montré l’effet prolongé (notamment dans le cas des
formulations à base de PLA S réalisées avec la TA) dans la libération de l’IVM. Bien que les
paramètres pharmacocinétiques représentent une bonne approche pour connaître la biodisponibilité
d’un principe actif, il n’existe pas de relation directe entre ces paramètres et l’effet thérapeutique,
notamment dans le cas des parasitoses où différentes souches ou variétés du parasite doivent être
éradiquées.
182
De ce fait, des études d’efficacité doivent être encore réalisées afin de vérifier si les formulations
proposées dans ce travail, dont la libération de l’IVM a été la plus prolongée, possèdent l’effet
antiparasitaire souhaité. Ceci pourrait, par exemple, être étudié de la façon suivante : dans le cas du
traitement du « ver du cœur » chez le chien, en utilisant des microparticules de PLGA chargées en
IVM, l’efficacité du traitement antiparasitaire pourrait être mesurée par comparaison, après
nécropsie des animaux, du nombre de vers du cœur trouvés dans les individus traités par rapport au
groupe contrôle (non traité et infesté) (Clark et al., 2004). Le pourcentage d’efficacité serait alors
été déterminé par la formule suivante :
% efficacité = [[(Nb de vers groupe contrôle) – (Nb de vers groupe traité)]/ Nb de vers groupe contrôle)]*100%
4.5.2 Douleur et injectabilité des formes proposées

La douleur générée chez les animaux lors de l’administration des formulations, a été variable en
fonction des solvants et du système de libération injecté. De façon générale, les solvants purs ont
généré une douleur plus forte chez les animaux par rapport aux ISI, qui eux même ont généré une
plus forte douleur que les ISM. La douleur ressentie par les animaux a été la plus élevée lorsque le
solvant le plus hydrosoluble (NMP) a été utilisé. Ce comportement peut être lié au « burst » des
formulations tel que décrit dans la dernière partie des travaux expérimentaux. En effet, étant plus
soluble dans l’eau donc diffusant plus rapidement vers les tissus environnant le site d’injection, la
concentration de NMP dans ces tissus est plus importante, d’où une probabilité plus élevée
d’endommager les tissus. Le tableau 4 présente un classement de la douleur induite par l’injection
des formulations, réalisé suite aux simples observations du comportement des animaux durant les
expérimentations (système qualitatif).
183
Tableau 4. Niveaux de douleur observés chez les rats lors de l’administration des différentes formulations
Formulation Douleur
MP-ES +
ISI-NMP +++
ISI-TA ++
ISM-NMP-O/O ++
ISM-NMP-O/W ++
+ (Faible) ; ++ (Modérée) ; +++ (Forte)
D’après des résultats de toxicité cellulaire et de douleur apparente suite à l’injection des
formulations, la NMP est un solvant présentant une toxicité plus élevée et qui nous parait donc
moins intéressant pour la formulation des systèmes in situ par rapport à la TA. En revanche, en ce
qui concerne l’injectabilité des formulations, il a été observé une meilleure injectabilité des
formulations proposées à base de NMP (« bons » solvant) par rapport à celles à base de TA
(« mauvais » solvant), notamment dans le cas des ISI. Par contre, lorsque les ISM ont été formulées,
la différence apparente a été très faible car les deux formulations ISM-O/O et ISM-O/W ont
présenté pratiquement la même injectabilité. Ceci peut être expliqué par l’effet des phases externes
des émulsions, lesquelles déterminent dans une grande mesure, la viscosité des formulations (Kranz
and Bodmeier, 2007).
Tableau 5. Injectabilité apparente des formulations chez le rat
Formulation Injectabilité
MP-ES +++
ISI-NMP ++
ISI-TA +
ISM-NMP-O/O +++
ISM-NMP-O/W +++
+++ (Bonne) ; ++ (Moyenne) ; + (Mauvaise)
184
Bien que des méthodes quantitatives plus précises, pour déterminer l’injectabilité des formulations,
ont été déjà développées (Rungseevijitprapa and Bodmeier, 2009), le tableau précédent (tableau 4)
résume les observations issues des expérimentations in vivo réalisées.
4.6 Perspectives
En ce qui concerne la formulation des systèmes in situ , ce travail peut être poursuivi par l’utilisation
de PLA de plus faible masse molaire qui diminuerait la viscosité des formulations améliorant ainsi
leur injectabilité et le processus de fabrication. Ceci peut être spécialement intéressant dans le cas
des ISI réalisés à partir des « mauvais » solvants des polyesters tels que la TA où l’IVM s’est
montrée très stable. Puisque la réduction de la viscosité des phases polymériques (ISM) peut
entraîner une augmentation du « burst » des formulations (notamment dans le cas des ISM-O/W), il
pourrait être possible de corriger ce problème par une augmentation du rapport phase externe/phase
interne. Ce changement entraînerait également une réduction du coût de la formulation. L’addition
de stabilisants tels que des antioxydants, améliorant la stabilité de l’IVM, peut être un aspect
intéressant à étudier afin de prolonger le temps de péremption des formulations plus attractives tels
que les ISM-O/W.
Par rapport à la performance des formulations in vivo , des essais d’efficacité antiparasitaire
pourraient être envisagés avec les formulations les plus intéressantes. A ce propos, la mise en place
d’un modèle de parasitose chez le rat (qui n’a pas été encore décrit à notre connaissance) pourrait
permettre une évaluation préliminaire et le « screening » des formulations avant de les tester chez
l’animal cible. De même, afin de réduire le nombre d’études à réaliser sur l’animal, le
développement d’un test d’efficacité accéléré contre le parasite in vitro , peut toutefois être une
alternative innovante, moins coûteuse et rapide. Enfin, pour les formulations d’ISM-O/W l’ajout
d’un anesthésique locale (par exemple procaïne) dans la phase externe aqueuse, pourrait se révéler
185
intéressant afin de soulager de la douleur induite par le solvant, améliorant ainsi le confort du
patient.
186
5. CONCLUSION
5. Conclusion
5 CONCLUSION
Dans ce travail, trois systèmes parentéraux biodégradables pour la libération prolongée

d’ivermectine, un principe actif antiparasitaire faiblement biodisponible par la voie orale (BCS-
Classe II), ont été préparés, testés et comparés in vitro et in vivo . Les méthodes de formulation
utilisées ont compris: i) celle classique, dite par émulsion simple - évaporation de solvant,
couramment utilisée pour l’incorporation de principes actifs lipophiles et ii) deux plus nouvelles,
permettant la formation d’implants et de microparticules in situ . Pour chacune de ces préparations,
une caractérisation physicochimiques poussée et une évaluation chez l’animal des principaux
paramètres pharmacocinétiques ont été réalisées. Au regard des résultats, les trois méthodes ont
permis de moduler la libération du principe actif en fonction du polymère utilisé. La libération la
plus prolongée a été obtenue pour les formes à base des polymères les plus hydrophobes selon
l’ordre suivant : PLGA H>PLGA S>PLA S.
Dans le cas des microparticules obtenues par la méthode d’émulsion simple - évaporation de
solvant, la libération du principe actif a été ralentie par la faible porosité obtenue et par la forte
interaction entre les polymères et le principe actif. Cependant, il a été démontré que la libération du
principe actif peut être accélérée par l’ajout de PVP, agent formateur de pores et rendant la matrice
des microparticules « plus hydrophile ». De plus, la formation d’un complexe IVM:PVP, plus
hydrophile que le principe actif seul, a été également proposé comme étant à l’origine de la
libération plus rapide constatée du principe actif à partir de ces systèmes.
En ce qui concerne les systèmes in situ , une étude systématique a été réalisée sur différents solvants
pour déterminer quelles étaient les caractéristiques physicochimiques à prendre en compte pour ce
type de formulation et pour moduler la vitesse de libération d’IVM. Une méthodologie de
« screening » a été utilisée pour sélectionner les solvants. Les systèmes les plus appropriés pour la
5. Conclusion
formulation d’IVM ont été ceux formulés à base de TA, compte tenu de la stabilité du principe actif
dans ce solvant, de sa faible libération initiale et de la prolongation plus élevée de sa libération. Les
inconvénients d’injectabilité reliés aux viscosités importantes des ISI à base de TA ont été
surmontés par la formulation du principe actif sous la forme d’ISM-O/W. La formation de ces
systèmes dans les tissus, plus facilement injectables et permettant une libération prolongée du
principe actif, a été constatée chez le rat par des images de microscopie éléctronique à balayage. La
faisabilité de formation et l’innocuité apparente évaluée par les observations des tissus environnants
au site de l’injection, font de ces systèmes une alternative très intéressants aux microparticules
obtenues par émulsion simple - évaporation de solvant.
La pertinence des résultats issus des tests de libération d’IVM in vitro et in vivo doit être confrontée
à des tests d’efficacité vis-à-vis d’un parasite cible type Dirofilaria immitis, prouvant ainsi la
conservation de l’activité de l’IVM à la suite de la formulation et la libération du principe actif à des
doses thérapeutiques.
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Systèmes injectables biodégradables pour la libération prolongée d’ivermectine
Des systèmes injectables de formation ont été utilisés dans les dernières années pour l’obtention de formulations
in situ
de préparation facile et permettant la libération prolongée de principes actifs. Ces systèmes utilisant des solvants
biocompatibles et des polymères biodégradables sont des liquides (solutions ou émulsions) qui une fois injectés dans
l’organisme donnent lieu à des implants (ISI) ou à des microparticules (ISM) solides. La formation de ces systèmes est
induite par la précipitation du polymère à partir des solutions polymériques qu’ils contiennent lors du contact avec les
fluides corporaux aqueux. Dans ce travail, des ISI et des ISM, réalisés à partir des polymères de l’acide lactique et/ou
glycolique (PLA et PLGA) et des différents solvants biocompatibles, pour la libération prolongée d’ivermectine (IVM),
un principe actif antiparasitaire faiblement biodisponible par la voie orale, ont été développés. Les profils de libération
du principe actif in vitro etin vivo à partir de ces systèmes, ont été comparés avec ceux obtenus à partir de
microparticules réalisées par la méthode classique dite d’émulsion simple - évaporation de solvant ; il s’agit d’une
technique aux multiples étapes, à coût élevé et dont l’utilisation de solvants toxiques la font difficilement
industrialisable. La libération du principe actif à partir des microparticules obtenues par émulsion simple/évaporation du
solvant a été influencée par la forte interaction du principe actif avec les polymères mais aussi par la porosité. Dans le
cas des systèmes in situ , la vitesse de libération d’IVM a été conditionnée par la solubilité dans l’eau du solvant
biocompatible sélectionné et par les interactions solvant/polymère. Pour les ISM, des paramètres tels que la nature de la
phase externe, aqueuse (ISM-O/W) ou huileuse (ISM-O/O), la solubilité dans l’eau du solvant de la phase interne,
l’affinité entre les phases et l’affinité de l’IVM pour chacune des phases, ont déterminé la vitesse de libération du
principe actif. La bonne stabilité ainsi que les profils de libération plus prolongés et présentant une faible libération
initiale du principe actifin vivo et in vitro, ont montré que les ISI et les ISM réalisés à partir de solvants biocompatibles
de faible solubilité dans l’eau tels que la triacetine sont les plus indiqués pour l’encapsulation d’IVM par rapport à ceux
plus solubles dans l’eau comme la N-methyl-2-pyrrolidone et la 2-pyrrolidone. Ces systèmes représentent donc une
alternative intéressante par rapport aux formulations conventionnelles d’IVM.
Mots-clés : In situ, ISI, ISM, libération prolongée, biocompatible, biodégradable, ivermectine, HSP
Injectable biodegradable systems for ivermectine sustained release

In situ forming injectable systems have been used in the past years to obtain sustained drug release formulations which
are easy to prepare. These systems using biocompatible solvents and biodegradable polymers are liquids (solutions or
emulsions) that upon injection on the body lead to solid implants (ISI) or microparticles (ISM). These systems are
formed in contact with water body fluids by polymer precipitation from the polymeric solution. In this work, ISI and
ISM made from lactide and/or glycolide polymers (PLA and PLGA) and different biocompatible solvents were
performed to obtain sustained release of ivermectin (IVM), an antiparasitic drug with a low oral bioavailability. In vitro
and in vivo drug release profiles from these systems were compared with those from microparticles obtained by the
classical simple emulsion/solvent evaporation method, which is difficult to propose in industry because of its multiple
steps, high cost and the solvent toxicity. Drug release from simple emulsion/solvent evaporation microparticles was
affected by the strong polymer/drug interactions and porosity. Concerning to forming systems, the rate of IVM
in situ
release was dependent on solvent water solubility and solvent/polymer interactions. The nature of the external phase,
water (ISM-O/W) or oil (ISM-O/O), the water solubility of the solvent in the internal phase, phase affinity and
IVM/phase affinity determined drug release from ISM. The good stability, the and
in vitro sustained release and
in vivo
the low burst effect of IVM, indicated that ISI and ISM formulated from low hydrosoluble biocompatible solvents such
as triacetin are more appropriated to IVM formulation instead of those based on more hydrophilic solvent (N-methyl-2-
pyrrolidone and 2-pyrrolidone). These systems are an interesting alternative to conventional IVM formulations.
Key words: In situ, ISI, ISM, sustained release, biocompatible, biodegradable, ivermectin, HSP
EA 3452 – Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie, Faculté de Pharmacie de Nancy

5, Rue Albert LEBRUN BP 80403 – 54001 NANCY Cedex 01

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Systèmes injectables biodégradables pour la libération

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE

Par Javier-Andrés CAMARGO

SYSTEMES INJECTABLES BIODEGRADABLES POUR LA LIBERATION

Soutenue le 05 Novembre 2010

EA 3452 – Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie, Faculté de Pharmacie de Nancy

Je voudrais particulièrement remercier le Pr.Dr. Roland BODMEIER, référent scientifique

Je remercie également le Dr. Vassilios KALSATOSE, le Dr. Florence GUIMBERTEAU et

Je voudrais aussi exprimer ma gratitude au Pr.Dr. Isabelle LARTAUD, au Pr.Dr. Pierre

Je tiens à remercier le Pr.Dr. Milaslava RABIŠKOVÁ pour ses conseils scientifiques et

Je voudrais remercier les secrétaires du laboratoire, Melle Pascale CARNET et Mme

Tableau 1 Quelques produits commerciaux à libération prolongée d’administration parentérale à

Figure 1. Marché vétérinaire mondial par région en 2008.................................................................20

ISM : Microparticules « in situ »

Dans le domaine vétérinaire, la pharmacothérapie des parasitoses a une importance majeure en

Ainsi, dans le domaine vétérinaire, le développement de médicaments antiparasitaires injectables à

32,3% Europe de l'est

Figure 1. Marché vétérinaire mondial par région en 2008.

Figure 2. Marché vétérinaire mondial par segment thérapeutique en 2008.

2.1.2 Défis et considérations dans le développement des produits vétérinaires

matériaux biodégradables pour la formulation des implants et la possibilité de réaliser leur

2.2 Parasitoses et Ivermectine

Figure 3. Cycle de vie du « ver du cœur » (AHS, 2010).

2.2.2 Chimiothérapie des parasitoses

2.2.2.1 Les lactones macrocycliques (avermectines)

L’ivermectine (IVM) a été la première lactone macrocyclique découverte et la première à être

Figure 5. Structure chimique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009).

L’ IVM bloque la neurotransmission en interférant avec la synapse neuromusculaire (Figure 6). En

Figure 6. Mécanisme d’action des avermectines (dont l’ivermectine) (Omura, 2008).

formulation affectent fortement la pharmacocinétique de l’ IVM. La biodisponibilité la plus grande

Figure 7. Pharmacocinétique de l’ivermectine (Gonzalez Canga et al., 2009).

2.2.2.2 Optimisation galénique des traitements parasitaires

2.3 Les différentes possibilités d’optimisations galéniques

2.3.1 Le système de classification biopharmaceutique (BCS)

Figure 8. Représentation du système de classification biopharmaceutique (BCS) (Pouton, 2006).

2.3.2 Polymères biodégradables pour la libération prolongée des principes actifs

Produit Laboratoire Forme Principe actif

En effet, leurs excellentes propriétés de biocompatibilité et de biodégradabilité (Anderson and

Figure 10. Biodégradation des copolymères d’acide lactique/glycolique (PLGA).

2.3.2.1 Synthèse des polymères d’acide lactique et/ou glycolique

2.3.2.2 Dégradation et érosion des polymères d’acide lactique et/ou glycolique

Plusieurs facteurs peuvent affecter la dégradation du système de libération et donc la libération du

PLGA (Miller et al., 1977).

D’autres facteurs environnementaux ou intrinsèques au système de délivrance peuvent aussi

2.3.3 Systèmes implantables biodégradables

2.3.3.1 Systèmes préformés

2.3.3.1.1 Implants monolithiques

discuterons par la suite. Le choix de la méthode dépend des caractéristiques du polymère, du

2.3.3.1.2.1 Obtention par émulsion et évaporation/extraction de solvant

2.3.3.1.2.1.1 Simple émulsion (O/W)

Emulsification (O / W) Évaporation du solvant

Filtration MPs Lyophilisation Stérilisation