Chapitre 4 : Lexocytose. Rgulation calcique de la neurotransmission.

I. Introduction : un peu dhistorique. La neurotransmission seffectue au niveau de synapse (= zone de communication entre 2 neurones ou entre un neurone et un muscle par exemple). Phnomne lectriques et chimiques. Concept de transmetteurs : Lexprience qui a permis de mettre en vidence la transmission chimique = exprience dOtto Loewi.

Utilise 2 curs diffrents baignant dans cuve de liquide physiologique. 1 cur innerv par son nerf vague 1 cur isol de son nerf vague Ces 2 curs sont raccords laide dune pompe. Le 2me cur est perfus par le liquide physiologique provenant du 1er cur. Thoriquement : On pense que le messager est libr dans le liquide physiologique 1 et est transmis dans le liquide physiologique 2 puis dans le cur 2 grce aux pompes. Observations : Stimulation du nerf vague ralentissement de frquence cardiaque. On observe galement un ralentissement de la frquence cardiaque du 2me cur. Prsence dun messager diffusible libr au niveau dune synapse. La libration dun NT dune stimulation prsynaptique peut tre suive quau travers de son effet post-synaptique. A retenir galement : il existe des synapses lectriques. II. La synapse : vidences pour une libration quantique : lexocytose. Les NT sont stocks dans des vsicules synaptiques et sont librs par exocytose. Cd par fusion de petits compartiments membranaires (vsicules ou granules) avec la membrane plasmique.

Quelles sont les vidences ? * Evidence fonctionnelle : libration quantale. = libration par quanta (1 quanta = 1 vsicule). Enregistrement de potentiel de plaque motrice (PPM) = variation de potentiel enregistr au niveau de la terminaison post-synaptique au niveau dune jonction neuromusculaire. Cet enregistrement = reflet de la libration du NT. Au niveau de la plaque motrice : Actylcholine avec un rcepteur nicotinique. On stimule le motoneurone lectriquement, on enregistre une grande variation de potentiel = un PPM sur lequel vient se greffer un PA. Cest le reflet de lAch qui a t libre suite la stimulation. Lorsque lAch se fixe sur son rcepteur le canal souvre (car rcepteur canal) dpolarisation. + il y a dAch, + lamplitude de PPM est important. Lamplitude de PPM est proportionnelle la quantit dAch libr. Aprs stimulation des fibres motrices. Enregistrement de variations de potentiel de grande amplitude (ppm suivi de PA). Schma 1. En condition de repos, on enregistre ce quil se passe au niveau post-synaptique. Si on plante llectrode dans la plaque motrice, on enregistre de petites variations de potentiel que lon a appel : potentiel de plaque motrice miniature (PPMminiature). On observe donc des variations de potentiel mme sans stimulation d de lAch qui est libr de manire spontane. Si jloigne llectrode denregistrement on enregistre plu rien. Les PPM sont trop petits pour atteindre le seuil et ne dclenche pas de PA les variations de potentiel se dissipent et ne peuvent pas tre enregistres. La plupart des PPMminiature (PPMM) ont presque tous la mme amplitude phnomne unitaire. Ces phnomnes obissent la loi du tout ou rien. Chacun des PPMM ont la mme amplitude car une vsicule a presque toujours la mme taille. Reflte le signal engendr par la libration de NT. Libration d1 quanta dAch. Un PPM a une amplitude qui est gale un multiple stricte de lamplitude PPMm.

PPM = n * PPMM n = nombre de vsicules. Quelle est la quantit dAch dans une vsicule ? Comment faire pour mesurer la quantit de molcules de NT/vsicule ? On utilise la microiontophorse. Une lectrode dans laquelle on met une concentration connue dAch (ou dun autre NT). Cette lectrode est ouverte, on lapproche de la terminaison post synaptique o il y a les rcepteurs nicotiniques. On a valu que : 1 quantum dACh = 1 paquet denviron 10 000 molcules. Environ 500 mmole.L-1 dACh dans une vsicule. Ex : Applique Ach 100mM schma 2. On fait passer un courant lectrique dans llectrode et lAch est libre et va se fixer sur ses rcepteurs. Quel est lamplitude du PPMM lorsque lAch est libre spontanment ? On compare le rsultat obtenu avec une courbe exprimental ralise par microiontophorse. Conclusion, on a valu que : 1 quantum dACh = 1 paquet denviron 10 000 molcules. Environ 500 mmole.L-1 dACh dans une vsicule. Les tudes au microscope lectronique ont fourni la notion de quanta un support morphologique : preuves de la libration vsiculaire. 1re preuve : Dans une terminaison post-synaptique, il y a toujours des vsicules de mme taille environ. La synapse est remplie de vsicules synaptiques. A la jonction neuromusculaire, les vsicules synaptiques salignent au niveau de zones actives pr-synaptiques, prtes fusionner.

2me vidence : On voit les vsicules (ou granules) fusionner sur la membrane plasmique. (On observe des figures en omga).

3me vidence : Techniques de cryofracture. On plonge un chantillon dans un milieu trs froid (trs brutalement) et on casse lchantillon. Souvent lchantillon se casse entre les 2 feuillets (endroit le + fragile). Permet de voir les feuillets de la membrane.

E = ectoplasmique P = protoplaste On observe des trous lendroit o il y avait des protines. Et on observe des protines de profusion = qui dpassent. On observe galement un alignement de particules lorsque la synapse nest pas stimule. Aprs stimulation lectrique toujours alignement de particules + il y a des trous dans la membrane appels puits (ou pores de fusion). Ces puits correspondent aux pores forms lors de la fusion des vsicules. schma 3.

III.Exocytose constitutive vs exocytose constitutive.

On distingue 2 types dexocytose :

 constitutive = due des vsicules se formant depuis le rseau transgolgien. Elles sont adresses vers la membrane plasmique. Ce qui caractrise cette voie cest quelle seffectue gnralement vitesse constante. Comme cest un processus permanant, on nobserve pas de stock de ces vsicules. A pour fonction principalement : le renouvellement des constituants membranaires et le renouvellement de la matrice extracellulaire. La vitesse dexocytose nest pas rgule. Ce processus est rgul uniquement pas la vitesse de synthse protique. Mcanisme universel. Rgule = des vsicules bourgeonnent du rseau transgolgien. On trouve des stocks de vsicule. Les stocks se trouvent dans la zone active pour une synapse. Ces stocks vont attendre un signal (ex : fixation dune hormone sur un rcepteur membranaire). Rgulation de lexocytose et donc de la vitesse de libration par des messagers intracellulaires. Mcanismes non universel, il est commun diffrents types de cellules : - Neurones NT - Endocrines hormones peptidiques - Exocrines libration denzymes digestives - Mastocytes histamine

Au cours de lexocytose, les vsicules bourgeonnent depuis le rseau transgolgien, notamment grce la prsence de protines coatamres (coat 1, coat 2 et clathrine), on obtient des vsicules immatures = vsicules de grande taille o le matriel interne est peu condens. Au fur et mesure de la migration vers la membrane, il y a un phnomne de maturation avec condensation du matriel transport. Il y a galement une maturation biochimique. Ce sont ces vsicules matures qui vont pouvoir fusionner aves la membrane plasmique et pas les autres.

Polarisation des mcanismes de lexocytose : Les mcanismes dexocytose peuvent tre polariss. B. On induit lexocytose elle se produit partout dans la cellule. C. Lexocytose nest dclenche que du ct de lagent stimulant. Exocytose polarise mme sur une cellule non polarise. Il peut aussi y avoir une polarisation morphologique. Ex : cellules pithliales. Quest ce qui fait que les vsicules sont orientes vers le ple apical ou vers le ple basolatral ?

Des squences protiques, dans les membranes des vsicules, permettent denvoyer certaines vsicules spcifiquement vers le ple apical ou vers le ple basolatral. Ex : Signaux : prsence dune tyrosine et / ou prsence de leucines dtermine lorientation vers le ple basolatral. Au niveau apical, les vsicules cibles vers le ple apical contiennent des protines ancrage GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol). Le groupement GPI permet la protine de sancrer la membrane. Les vsicules contenant ces groupements GPI sont orientes vers la membrane apicale.

Vers la membrane basolatrale : signaux dans la terminaison cytoplasmique. 1) signal contenant 1 tyrosine et 2) 2 leucines adjacentes. Ces acides amins sont reconnus par des protines coatamres qui les assemblent dans des vsicules de transport au niveau du rseau trans Golgi. Trafic membranaire dans la synapse :

Corps cellulaire + synapse (coup pour meilleure visualisation). Des vsicules se forment et vont tre orientes vers la membrane plasmique. A partir du rseau transgolgien, on peut avoir des mcanismes dexocytose constitutive et des mcanismes dexocytose rgule (pour les neuropeptides et non les NT). Les vsicules qui permettent la libration de NT proviennent des endosomes. Ces endosomes permettent le bourgeonnement de vsicules synaptiques. Dans un 1 er temps, les vsicules sont vides. Puis elles sont remplies et vont pouvoir alors fusionner par exocytose. Maturation = remplissage par des NT. Lors de lexocytose : on incorpore un bout de mb supplmentaire, en permanence, un phnomne dendocytose compense. Car sinon la surface de la membrane plasmique ne ferait quaugmenter de taille. On obtient une vsicule dendocytose qui : - peut tre oriente vers les endosomes - ou peut tre directement rutilis en tant rempli de NT permet rutilisation rapide de vsicules. IV. Couplage stimulation-neurotransmission (stimulation-scrtion) : Rle du calcium Le calcium est le second messager essentiel la neurotransmission. 1er messager = hormone 2nd messager = Ca2+, IP3 Pour quune molcule soit considre comme un messager, il faut : En prsence du 1er messager, la concentration du 2nd messager doit augmenter de manire importante. La molcule doit agir spcifiquement sur des cibles et induit une rponse physiologique. Que faut-il une molcule pour tre un (bon !) second messager ? Elle doit agir sur un rcepteur/senseur/effecteur.

 Site de fixation coupl un lment de rponse. Rponse physiologique (contraction, scrtion) Sa concentration doit changer de manire significative en rponse un autre signal. Systme pour cration et destruction du message. Niveau du second messager doit changer en rponse un stimulus naturel et ceci avant et pendant que la cellule rpond. Calmoduline senseur Ca2+. Protine kinase A senseur AMPc.

V. Le calcium comme second messager. Le calcium peut rentrer par des canaux ioniques et est capable de dclencher lexocytose. Mais lexocytose est dpendant du cytosquelette et le calcium intervient sur de nombreuses protines du cytosquelette. Le calcium agit diffrents niveaux.

Exocytose et 2nd messagers : Le calcium stimule la scrtion rgule. On peut changer la concentration en calcium lextrieur de la cellule. Comment peut-on aller contrler la concentration en calcium lintrieur de la cellule ? On peut utiliser un dtergent doux qui va faire des petits trous dans la membrane = permabilisation de cellule. Le calcium peut alors entrer. On peut alors contrler les concentrations internes et externes de calcium. Permet de maintenir la concentration en calcium dans les cellules une valeur connue. Principe de permabilisation. On peut contrler la taille des molcules que lon veut faire entrer selon la grosseur des trous dans la membrane. A une concentration physiologique de repos trs dadrnaline est libre. Si entre de + de calcium entre de bcp dadrnaline. La scrtion hormonale est associe des variations de calcium.

Scrtion dinsuline par les ilots de Langerhans. Quand la concentration en glc plasmique est leve, la concentration dinsuline est leve. La scrtion dinsuline suit parfaitement les oscillations de calcium. Un stimulus (glucose) est capable dinduire laugmentation de calcium (cytosol) qui est capable de stimuler la scrtion (insuline) ou la neurotransmission. Quest ce qui fait que ces cellules ont une scrtion calcium dpendante ? Ce sont des cellules excitables cd quelles prsentent des PA. Ces PA sont associs une entre de calcium. Les canaux qui participent la dpolarisation sont des canaux calciques voltages dpendants. Lentre de calcium permet de stimuler la scrtion hormonale. Si lon bloque ces canaux calciques, on bloque les PA de manire rversible et on bloque la scrtion. Le calcium et la transmission synaptique : Ce qui caractrise le bouton synaptique : il y a des canaux calciques voltages dpendants. Si on mesure les PA, ils sont bcp + longs que ceux de laxone. 1re phase due un canal sodique et 2me phase due un canal calcique. Lorsquon stimule la terminaison prsynaptique (arrive dun PA), le PA sodique permet louverture de canaux calciques voltages dpendants. A ce moment l, le calcium entre dans le bouton et stimule lexocytose. Dlai entre entre de calcium et exocytose = 0,1 msec. Il y a donc trs peu dtapes biochimiques entre ces 2 phnomnes.

Structure gnrale des canaux calciques voltage-dpendants : Ne sera pas lexam ! Un canal calcique est caractrise par sa SU port 1. Cest elle qui donne les principales proprits du canal. Il y a 3 grandes familles de canaux calciques voltages dpendants : Les canaux calciques de type L permettent la scrtion hormonale. (entre de clacium longue). Les canaux de types P, Q, N et R (= canaux prsynaptiques) permettent la libration des NT. Ils participent la neurotransmission. Les canaux de types T ont des fonctions de canaux PaceMaker. (entre de calcium transitoire). La zone active synaptique : site de libration prsynaptique :

Les vsicules se rapprochent de la zone active. Au niveau prsynaptique : structure ou les vsicules sont condenses au mme endroit = zone active et au mme endroit on a les canaux calciques voltages dpendants. Lorsque le PA arrive et que le Ca passe par ces canaux les 1res cibles du calcium sont les protines vsiculaires. Lensemble canaux calcique/vsicules synaptiques forment un microdomaine. Pdt un PA, la concentration en calcium passe de 10-7 mol/L 10-4 mol/L. Donc localement la concentration en calcium va augmenter dun facteur 1 000 au moins. Caractristique du senseur calcique = (il se trouve sur la membrane vsiculaire) il a une faible affinit pour le calcium. Donc sil la vsicule est un petit peu + loin du canal le senseur calcique nest pas activ. Cette faible affinit a pour avantage que les vsicules stimules sont celles qui st trs prs du canal. Ciblage entre un canal donn et une vsicule donne. Une vsicule proximit dun canal calcique peut tre libre par un seul PA. Par contre, une bouffe de PA sera ncessaire pour librer les vsicules les plus loignes ou les vsicules les plus grosses (neuropeptide).

VI.Le cycle synaptique et lexocytose.

Les vsicules synaptiques ont 3 origines : - Golgi - Endosomes - Membrane plasmique Le cycle synaptique dmarre dun compartiment intracellulaire. 1re tape : Bourgeonnement (du golgi ou des endosomes). Ce bourgeonnement cr des vsicules vides. 2. Stockage = Remplissage des vsicules synaptiques avec le NT. 3. Transit vers la membrane = tape de recrutement des vsicules. 4. Les vsicules arrivent prs de la membrane plasmique, il y a interaction physique/molculaire entre membrane vsiculaire et membrane plasmique = arrimage (=amarrage, accostage ou docking). 5. Interaction physique se resserre. Les interactions molculaire : augmentation de la force dinteraction entre les protines = tape damorage. Etape de maturation des vsicules. Cette tape ncessite des phosphorylations, donc ATP indispensable. 6. Quand le stimulus ultime intervient (augmentation de Ca2+), les 2 compartiments membranaires fusionnent = tape de fusion membranaire / exocytose. Libration des NT. 7. La cellule va tre capable de recycler des fractions de membrane plasmique = endocytose. Ces vsicules sont alors vides. Elles ont plusieurs destins possibles en fonction de ltat des protines se trouvant la surface des vsicules. - Si les protines de surfaces de la vsicule sont en bon tat. Ces vsicules peuvent tre reremplis de NT et reservir dans un cycle court. - Lorsque les protines la surface ont t dgrades, les vsicules peuvent tre envoyes vers les endosomes. Les endosomes vont servir faire le tri entre des fractions membranaires qui vont tre envoyes vers les lysozomes et les fractions membranaires qui pourront nouveau faire le bourgeonnement cycle synpatique. Cycle lent dure environ 1min. Ltape dexocytose ne prend que 0,1 msec tape centrale mais la + courte.

Au niveau dun bouton prsynaptique, il y a plusieurs populations de vsicules : - transit - prte fusionner avec la membrane - sont prtes fusionner avec les membranes Lorsquun stimulus intervient une entre de Ca2+, passage des diffrentes vsicules dune tape une autre. VII. Les mcanismes molculaires de lexocytose. 1. Les protines et leur localisation. Ces protines se trouvent dans : Mb vsiculaire, mb plasmique et cytoplasme. Vsicules : protines associes de manire stable = protines qui ont des compartiments transmembranaires. Dans membrane vsiculaire (vsicule = 50nm de diamtre). Syntaxin : rle fondamental dans exocytose. Stockage des NT : ncessite 2 protines = un transporteur de NT et une pompe protons. La pompe protons gnre un gradient de protons qui est utilis pour stocker des NT. Vsicules : protines associes transitoirement. Synapsin, CaMKII = CaM Kinase de type II et Myosine V. Ces 3 protines permettent linteraction avec les filaments dactine. Ce sont des protines qui interagissent de manire dfinitive avec les vsicules. Au niveau daxones et de dendrites, on peut observer le dplacement de vsicules le long de filaments du cytosquelette. Possible grce des moteurs molculaires. Protine qui participe la formation dun manteau sur les vsicules : Clathrine Protines adaptatrice : Adaptrines De plus, tjrs dans membrane vsiculaire : synaptobrevin et synaptotagmine Au niveau de la membrane plasmique : syntaxine, SNAP-25 et canaux calciques Protines cytosoliques : NSF et SNAP et Munc18.

NSF et SNAP : ce sont ces protines qui ont t dcouvertes en 1er. NeM : N-thyl malimide = cette molcule bloque lexocytose. Ils ont cherch la protine sensible au NeM. 1er candidat = NSF (Nem sensitive fusion protein). 2me candidat = protines SNAP (protine dattachement du NSF soluble) Ils ont isols ces protines membranaires et les ont appels SNAPreceptor = SNARE. Les SNARE sont des rcpeteur SNAP. Mais SNAP25 nest pas une SNAP (elle porte juste ce nom cause de son action = synaptosomalassociated protein). 2. Le cytosquelette. Lorsquon observe des coupes microscopiques de boutons prsynaptiques, on observe des vsicules. Certaines sont recouvertes dun manteau et dautres non. Les endosomes bourgeonnent. La formation du manteau protique permet le bourgeonnement. 1. Bourgeonnement manteau protique de Clathrine. Puis Scission (sparation vsicule de lendosome) : une protine forme un tranglement = Dynamine. Clathrine = les protines de clathrine ont une forme de triskel et sassocient ensemble formation de pentagone rgulier. Entraine une courbure de la membrane et la membrane se trouve pige au centre de cette structure. La vsicule se trouve au centre de cette association de Clathrine. La clathrine interagit avec des protines adaptatrices = les Adaptines qui interagissent elles mme avec des protines transmembranaires = rcepteurs. La dynamine est une GTPase. Permet sparation de la vsicule de lendosome. Il y a ensuite perte du manteau (grce des enzymes) car il ne sert quau bourgeonnement. On trouve donc des vsicules lisses qui vont pouvoir tre endocytes. 2. Etape de recrutement. (diapo46) Essentiellement filaments dactine et cytosquelette en sont responsables. Des toxines du cytosquelette modifient/altrent lexocytose. En stabilisant le cytosquelette inhibe libration de NT. Agents dpolymrisants stimulent la libration de NT.

Laugmentation du Ca2+ est capable de modifier le cytosquelette entraine une dpolymrisation des filaments dactine. 2 modles de fonctionnement impliquent ce rle de barrire (diapo 48) :

Les vsicules sont attaches au cytosquelette (= filaments dactine) par lintermdiaire de la synapsine (p). Lorsque la synapsine est non phosphoryle, elle est situe au niveau de la vsicule et permet linteraction vsicules/actine. Lorsque la synapsine est phosphoryle, elle se dtache (ou libre) des vsicules. Lorsque du calcium entre dans la terminaison prsynaptique, il active des kinases sensibles au calcium = CaMkinase II. (Calcium-calmoduline dependent Kinase). Donc phosphorylation de la synapsine et libration de la synapsine de vsicules. Mais un certain nombre dtude montrent le contraire :s. Gnralement, ces effets aberrants sont observs haute concentration de toxine. Lactine ne serait donc pas quun rseau passif.

Rle de la myosine Va :

Elle permet aux vsicules de se dplacer le long de microfilaments dactine. Interaction actine/myosine. La myosine se dplace le long du filament dactine pour arriver au niveau de la membrane plasmique et pouvoir fusionner avec cette membrane.

En ralit les 2 modles coexistent : - modle de rail : progression le long dun filament dactine. - barrire : emprisonne les vsicules qui forment un rseau.

Arrimage : 2 tapes darrimage : - permet faible interaction avec la membrane plasmique Exocyste. - interaction plus forte avec la membrane plasmique SNARE 2 complexes molculaires : - exocyste : en bleu - SNARE : form de protine SNARE

Lorsque le complexe exocyste se former, ce stade, larrimage est rversible. Les vsicules peuvent se dtacher de la membrane plasmique. Une fois que le complexe SNARE est form, cela devient relativement irrversible. Arrimage : Formation de lexocyste : rapprochement de la vsicule, grce au rapprochement des SU.

Le complexe SNARE ncessite un rapprochement suffisant des 2 compartiments membranaires (fait par exocyste). Ces complexes SNARE participent tout le trafic intracellulaire. Toutes les interactions membranaires ncessitent des protines SNARE. La spcificit du trafic intracellulaire est assure par le sous type de SNARE utilis. Mcanisme universel dans la cellule, lchelle de lvolution. Ubiquitaire car prsent dans toutes nos cellules. Pr se former, un complexe SNARE ncessite 3 protines SNAREs : - 1 SNARE dans le compartiment donneur (vsicule) = v-SNARE = synaptobrvine. - 2 SNAREs dans le compartiment accepteur (cible) = membrane plasmique. Ces 2 protines sont des t-SNAREs = syntaxine + SNAP 25.

Lorsque ce complexe est form, il peut y avoir fusion entre les diffrents compartiments. La formation de ce complexe permet la spcificit des vsicules vers la membrane plasmique. Le complexe interagit avec des molcules cytosolubles. Les protines SNARE sassocient avec des protines cytosolubles NSF et SNAP.*

Amorage : Le complexe SNARE devient de + en + resserr augmentation de la force dinteraction entre t-SNARE et v-SNARE. Comment seffectue linteraction t-SNARE/v-SNARE ? Les 4 hlices alpha senroulent les unes autour des autres et lenroulement commence des extrmits. Les super-hlices se resserre de + en + comme une fermeture claire et donc la vsicule se rapproche de la membrane. Un effet mcanique tire donc sur la vsicule = effet de traction. Des mcanismes de phosphorylation des protines SNAREs permettent le super-enroulement des hlices. Le calcium est capable dactiver les protines kinases qui phosphorylent les protines SNAREs. La vsicule se rapproche de la membrane plasmique.

Interaction physique molculaire entre canaux calciques et p SNAREs. Il existe de vrais microdomaines calciques. La synaptotagmine est active augmente encore + linteraction protique entre les protines SNARE. Lorsque le calcium est fix la synaptotagmine, elle a alors une affinit forte avec les phospholipides membranaires et donc avec la membrane plasmqiue. La vsicule se rapproche donc de la membrane plasmique. Les molcules deau entre les 2 membranes (vsicule et plasmiques) sont expulss. Les 2 feuillets membranaires et cytoplasmiques fusionnent et le NT est expuls. La fusion : mcanisme protique ou lipidique ? On ne sait pas. On suppose que cest un mcanisme de type protique.