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    Unidad 3 - Replicación Adn

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    Unidad 3 – Replicación Adn

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    UNIDAD 3 –

    REPLICACIÓN ADN
    MICROBIOLOGÍA
    ODONTOLOGÍA
    •La replicación es una
    función esencial del
    material genético y debe ser
    ejecutada con precisión si,
    tras la división celular, se ha
    de mantener la continuidad
    genética entre células.
    Tipos de
    replicación
    TÉRMINOS
    BÁSICOS
    • Replicón: unidad del genoma en
    la que se replica el ADN. Cada uno
    contiene un origen para el inicio
    de la replicación.
    • Origen: una secuencia de ADN en
    la que se inicia la replicación.
    • Término: Un segmento de ADN en
    el que termina la replicación.
    ORIGEN DE
    LA
    REPLICACIÓN

    • En procariotas es
    un único origen. El
    primero conocido
    es la región OriC
    descubierta en E.
    coli
    • En eucariotas son
    varios orígenes.
    ORIGEN PROCARIOTA

    • El origen es el sitio
    OriC.
    • Para iniciar forma
    un complejo de
    proteínas.
    • Puede ser metilado.
    HORQUILLA DE REPLICACIÓN

    Requiere OriC activa


    un regiones
    complejo de
    de DnaA, repeticione
    DnaB, s de 9 y 13
    DnaC, HU, pb.
    girasa
    DnaA sey
    SSB
    activa en Se
    presencia requieren
    de ATP. enzimas
    girasas y
    helicasas.
    Otras enzimas
    involucradas
    Helicasas: rompen las
    cadenas
    Topoisomerasas:
    desenrrollan las cadenas
    Proteinas de unión a
    cadena simple (SSB):
    mantienen separadas las
    cadenas.
    ORIGEN DE
    REPLICACIÓN
    EN
    EUCARIOTAS

    • Tiene múltiples orígenes.


    • Sucede en la fase S de la
    interfase.
    • Replicones pequeños,
    aprox 40 kb en levaduras
    y 100 kb en animales.
    • la región más conocida
    es la ARS (secuencia de
    replicación autónoma)
    reconocida en levaduras.
    ORIGEN
    REPLICACIÓN
    LEVADURAS

    •Los orígenes en
    Saccharomyces
    cerevisiae son
    secuencias A-T cortas
    que tienen una
    secuencia esencial de
    11 pb.
    Complejo ORC
    • Es un complejo de 6 proteínas
    Orc1-Orc6
    • Orc1: se une primero en la fase
    G1
    • Orc2-5: se unen fuertemente
    • Orc6: se une de manera débil.

    • Las proteínas CDK/ciclinas Cdc6


    y Cdt1 ayudan a la iniciación
    Dna
    polimeras • Las ADN polimerasas son enzimas

    a (celulares o virales) que intervienen en


    el proceso de replicación del ADN.
    Llevan a cabo la síntesis de la nueva
    cadena de ADN emparejando los
    desoxirribonucleótidos trifosfato
    (dNTP) con los desoxirribonucleótidos
    complementarios correspondientes del
    ADN molde.
    Actividad de las ADN
    Polimerasas
    Endonuclea Exonucleas
    sa a
    Polimerasas Procariotas

    Enzima Gen Función

    I polA Enzima de reparación mayor, exonucleasa


    3’-5’ y 5’-3’
    II polB Restablecimiento de la reparación,
    exonucleasa 3’-5’
    III polC Replicasa, exonucleasa 3’-5’

    IV dinB Reparación de ADN

    V umuD’2C Reparación de ADN


    Polimerasas
    eucariotas
    INICIO DE LA
    REPLICACIÓN

    • Enzima Pol III en


    procariotas.
    • Enzima α, δ y ε
    en eucariotas.
    • Cadena 3’-5’ Principal / lider
    Elongación • Cadena 5’-3’ Secundaria / retrasada

    de la cadena • Elongación semicontinua (Fragmentos de


    Okazaki)
    • Para completar la síntesis de la hebra retardada
    deben unirse los fragmentos de Okazaki. Requiere
    MADURACIÓN la eliminación de los cebadores, la elongación del
    fragmento adyacente para rellenar con DNA el
    FRAGMENTOS hueco dejado por cada RNA cebador y la unión o

    DE OKAZAKI empalme de los extremos resultantes para dar una


    hebra continua.
    PCR
    • La Reacción en Cadena de la
    Polimerasa (PCR) es una técnica de
    biología molecular utilizada para
    amplificar secuencias específicas de
    ADN. Fue desarrollada por Kary Mullis
    en 1983 y ha revolucionado la
    investigación genética, médica y
    microbiológica.
    • Imita de manera artificial lo que sucede
    en el proceso de replicación del ADN.
    Componentes
    • ADN Molde: El ADN que contiene la secuencia
    objetivo que se desea amplificar.
    • Cebadores (Primers): Secuencias cortas de
    nucleótidos (oligonucleótidos) que son
    complementarias a las regiones flanqueantes del
    fragmento de ADN objetivo. Se requieren dos
    cebadores: uno para cada cadena de ADN.
    • Cebador Forward: Se une a la cadena molde de ADN
    en la región 3' de la secuencia objetivo.
    • Cebador Reverse: Se une a la cadena
    complementaria de ADN en la región 5' de la
    secuencia objetivo.
    • Nucleótidos (dNTPs):Los bloques de
    construcción del ADN, que incluyen dATP,
    dTTP, dCTP y dGTP. Son necesarios para
    la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
    • Polimerasa Taq: Enzima derivada de la
    bacteria Thermus aquaticus, que es
    termoestable y capaz de sintetizar ADN a
    altas temperaturas. La Taq polimerasa es
    responsable de extender los cebadores y
    sintetizar las nuevas cadenas de ADN.
    adyuvantes
    • Cloruro de Magnesio (MgCl2): El
    MgCl2 es un componente esencial del
    buffer de reacción. Los iones de
    magnesio (Mg^2+) actúan como
    cofactores para la Taq polimerasa,
    facilitando la correcta unión de los
    dNTPs al ADN molde. La
    concentración de MgCl2 puede
    afectar la especificidad y eficiencia
    de la PCR. Demasiado MgCl2 puede
    aumentar la actividad no específica,
    mientras que muy poco MgCl2 puede
    reducir la eficiencia de la
    amplificación.
    • Dimetilsulfóxido (DMSO): El DMSO se
    utiliza a menudo como aditivo en la PCR
    para mejorar la amplificación de
    secuencias difíciles o ricas en GC. El
    DMSO ayuda a desnaturalizar las
    estructuras secundarias del ADN que
    pueden formarse en regiones ricas en GC,
    permitiendo una mejor unión de los
    cebadores y una síntesis más eficiente del
    ADN. Generalmente, se utiliza en
    concentraciones del 5-10%.
    • Desnaturalización: Separar las dos cadenas
    de ADN de doble hebra, convirtiéndolas en
    cadenas simples para que los cebadores
    Ciclos de puedan unirse.
    • Temperatura: 94-98°C.
    la PCR • Duración: 20-30 segundos.
    • Alineación / Hibridación
    (Annealing): Permitir que los
    cebadores se unan (hibriden) a
    sus secuencias complementarias
    en el ADN molde.
    • Temperatura: 50-65°C (depende
    de la secuencia y longitud de los
    cebadores).
    • Duración: 20-40 segundos.
    • Extensión (Elongación): La Taq
    polimerasa extiende los cebadores,
    sintetizando nuevas cadenas de ADN
    complementarias a las cadenas molde.
    • Temperatura: 72°C (temperatura
    óptima para la polimerasa Taq).
    • Duración: 30-60 segundos
    (dependiendo de la longitud del
    fragmento de ADN).
    Preparación MIx
    • ADN molde: 1-10 ng (dependiendo de la
    disponibilidad y pureza).
    • Cebadores: 0.1-0.5 µM cada uno.
    • dNTPs: 200 µM cada uno.
    • Buffer de reacción: 1X.
    • Cloruro de magnesio (MgCl2): 1.5-2.5 mM
    (puede variar según el protocolo
    específico).
    • Dimetilsulfóxido (DMSO): 5-10% (opcional,
    dependiendo de la secuencia del ADN
    molde).
    • Polimerasa Taq: 0.5-2.5 unidades.
    Ciclado PCR

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