Carrera de Medicina Humana

BIOLOGIA CELULAR
Extracción de ADN

Sesión 24
2023-2
Resultados de aprendizaje de la sesión

Al final de la sesión el estudiante:

• Comprenderá los fundamentos y la importancia

de la extracción de ADN, como una herramienta

para el desarrollo de diferentes técnicas

moleculares.

SEMANA 3: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÍA CELULAR 2021

 Reflexión de la experiencia

La extraccióndel ADN es el primer paso en la revolución

biotecnológica que permitió crear una vacuna luego de

una semana de análisis por computadora.

SEMANA 3: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÍA CELULAR 2021

¿En los casos de medicina
forense, a partir de qué
muestras se puede extraer
ADN?
 IMPORTANCIA
La extracción de ADN es la base para los estudios en biología molecular.

RFLP

OGM

Extracción de PCR
ANÁLISIS
ADN FILOGENÉTICOS

Identificación de patógenos
Identificación de mutaciones
DIAGNÓSTICO
en el ADN humano
MOLECULAR SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2023 -2
IMPORTANCIA

SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2023 -2

 TIPOS DE EXTRACCIÓN
Extracción Extracción con
Kits comercial
tradicional (Pocas etapas)
(Varias etapas)
 ¿Qué método de extracción es mejor?
No existe un método de extracción único para todas las
muestras, el método depende de:
o Material biológico a estudiar.
o Tejido disponible seleccionado y estado de
conservación.
o La técnica molecular que se empleará posteriormente.
o Infraestructura del laboratorio.
o Recursos económicos.
o Tiempo para obtener los resultados.
 L A R E N E G O S E C O R P

Etapas generales para la extración

COLECTA DE MUESTRA
Procedimientos
Lade ADN
colecta de la muestra
Método esde extracción
independiente
convencional del tipodede
HOMOGENIZACIÓN
Etapas esenciales de un DEL TEJIDO de
procedimiento
ADNextracción
más
extracción utilizados
a utilizar (convencional o kit comercial).
• LISIS
de ADN a partir
CELULAR de un
ALMACENAMIENTO DE LA HOMOGENIZACIÓN
HOMOGENIZACIÓN MECÁNICA
QUÍMICA
Una colecta y• manejo apropiado de la muestra
DE permite obtener
MUESTRA (ÓPCIONAL) homogenizado SEPARACIÓN PROTEÍNAS
ADN integro y sin contaminantes, los cuales podrían afectar la
• Extracción orgánicaY
debe(fenol-cloroformo)
acciónLa
demuestra
Puede
las realizarse
enzimas
LÍPIDOS
mantenerse
mediante:
durante a temperaturas
la reacción de PCR.altas
• en
• presencia de: AD
No orgánico (proteinasa
Trituración K y sal)
HOMOGENIZACIÓN DE LA • Maximizar
PRECIPITACIÓN
1. GENERALES la recuperación deDEADN N
MUESTRA • ETAPAS
•
Extracción de Chelex
Nitrógeno PARA
(resina
líquido LA
de EXTRACIÓN
intercambio ADN
iónico)
Cada tejido
• DetergentesDEL EDISOLUCIÓN
tiene sus propias DEL características y
• •2. Homogeneizadores
Papelsiempre
FTA Eliminar
ADN
será inhibidores
necesario
(Colección, conocerlas y aislamiento)
almacenamiento
• Proteasas
EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN CON KITS • Basado •3. •Método
PURIFICACIÓN
Eliminar
enSonicación
sílice por nucleasas
o inhibir Kit comercial
TRADICIONAL COMERCIAL • Agentes caotrópicos
4. •Maximiza
LISIS CELULAR
la calidad del ADN
• UNIÓN DEL ADN A UNA MATRIZ
El EDTA, se puede aplicar en las soluciones de
• SEPARACIÓN
ANÁLISIS DE ADN
El métodolisis,
utilizado
para
puede
formar
ser
DE dependiente
PROTEÍNAS Yde la
complejos con los iones
muestra, de LÍPIDOS
la técnica
Mg+2, e inhibir oa las
de DNasas.
preferencia del analista.
• ELUCIÓN DEL ADN
 EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN CON
TRADICIONAL KITS COMERCIALES
Método Extracción en columnas de sílica y/o
Método dede Salting-Out
Fenol-Cloroformo Método de columna de centrifugación
microesferas magnéticos

ETAPAS GENERALES PARA LA EXTRACIÓN DE ADN ETAPAS GENERALES PARA LA EXTRACIÓN DE ADN

Después
Después de de
añadir
la la mezclacelular,
lisis de fenol las
cloroformo, se forman
proteínas serándos fases: Se utilizan columnnas (spin columns) con membranas de
orgánica y acuosa.
precipitadas utilizando sales (salting-out) y separadas por sílice capaces de unirse especificamente al ADN. Luego de
La fase superior acuosa contiene al ADN. la unión, se eliminan todas las sustancias no ligadas por
centrifugación.
centrifugación.
Automatización en la extracción de
ácidos nucleicos

MagNA Pure 96 Instrument

High-throughput robotic workstation
BioRobot Universal System for fully automated purification of
nucleic acids from up to 96 samples.
96-well format
For in vitro diagnostic use.
SEMANA 10: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021
¿Cuánto ADN podemos extraer?

• Células diploides —> 6 pg de ADN

• Esperma —> 3 pg de ADN
• Glóbulos blancos (5-10 x 106 /mL sangre) —> 30 a 60 ng

¿Cuánto ADN necesitamos?

• PCR —> 1 ng de ADN (monocatenario o bicatenario)

• Equivalencia: de 1/20 de 1 uL de sangre, o 350 espermatozoides
Cómo evaluar la calidad del material extraído
• Electroforesis en gel

Marcador de 1 Kb (Promega, G5711) con fragmentos de ADN que van desde 250 pb hasta 10 Kbp. Las muestras
de gDNA varían desde gDNA de HMW de muy buena calidad con muy poca degradación o contaminación de
RNA (Imagen 10) hasta gDNA extremadamente degradado (Imagen 1).

https://genomics.ed.ac.uk/resources/sample-
Integremos lo aprendido

N°
INTEGRAMOS LO APRENDIDO

• ¿Qué aprendimos hoy?

• ¿A partir de qué células se extrae
el ADN en sangre humana?

SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021

 APLIQUEMOS LO APRENDIDO

Actividad Virtual
Extraer de ADN por método convencional de una muestra de epitelio bucal

https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Reconocer en el vídeo las etapas de extracción de ADN por método con Kit
https://www.youtube.com/watch?v=S7mQSWbLk7o&list=PL5k
l3a0fCKXzsmzB6RA8v1Bs4UWoP-G-S

SEMANA 10: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021

 Extracción de ADN usando kit extracción
Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit #K0721

LISIS - UNION LAVADO - ELUCION CUANTIFICACIÓN

1. Agregue 400 μL de solución de lisis y 20 μL de solución de proteinasa K a 200 μL de sangre completa, mezcle bien mediante agitación vorticial o pipeteo para
obtener una suspensión uniforme.
2 Incube la muestra a 56 °C mientras se agita ocasionalmente en vórtex o use un baño de agua con agitador, una plataforma oscilante o un termomezclador.
3. Agregue 200 μL de etanol (96-100 %) y mezcle pipeteando o agitando en el vórtex.

Solución de lisis Proteinasa K

10 min

ALCOHOL 96
%
 LISIS - UNION LAVADO - ELUCION
4 Transfiera el lisado a una columna de purificación de ADN genómico GeneJET insertada en un tubo de colector. Centrifugar. Deseche el tubo de recolección que
contiene la solución de flujo continuo. Coloque la columna de purificación de ADN genómico GeneJET en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.

1 min a 6000 X g

N°
 LAVADO - ELUCION

5. Agregue 500 μL de Buffer de lavado I (con etanol agregado). Centrifugar durante 1 min a 8000 x g. Deseche el flujo continuo y vuelva a colocar la columna de
purificación en el tubo de recolección.
BUFFER DE LAVADO I BUFFER DE LAVADO II

1 min a 8000 X g 3 min a 12000 X g

6. Agregue 500 μL de Buffer de lavado II (con etanol agregado) a la columna de purificación de ADN genómico GeneJET. Centrifugar durante 3 min a máxima velocidad (≥12000 x g). N°
Deseche el tubo de recolección que contiene la solución de flujo continuo y transfiera la columna de purificación de ADN genómico GeneJET a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml (no
incluido).
 LAVADO - ELUCION

7. Añada 200 μl de tampón de elución al centro de la membrana de la columna de purificación de ADN genómico GeneJET para eluir el ADN genómico. Incubar
durante 2 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 min a 8000 x g.

2 min 1 min 8000 x g

N°
8. Deseche la columna de purificación. Utilice el ADN purificado inmediatamente en aplicaciones posteriores o guárdelo a -20 °C.
 Extracción de ADN usando kit extracción
Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit #K0721

CUANTIFICACIÓN
Extracción de ADN usando kit extracción
• Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit #K0721
 24

Actividad Asincrónica
 ACTIVIDAD ASINCRÓNICA

Vídeo: Extracción de ADN

https://www.youtube.com/watch?v=cyst4EDDwAk

https://www.youtube.com/watch?v=aHO981sff-M
 26

Referencias
Bibliográficas
 Referencias bibliográficas

• Karp G. (2011). Biología Celular y Molecular: Conceptos y experimentos. (8va ed.).

Editorial Mc Graw Hill Interamericana.