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    Genetica 2

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    Dennise Cabrera
    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 que permite amplificar un fragmento de ADN de manera exponencial a través de ciclos repetidos de desnaturalización, templado y extensión. La PCR es una herramienta fundamental para identificar patógenos, realizar análisis genéticos y de investigación científica al permitir obtener grandes cantidades de ADN a partir de pequeñas muestras originales.

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    Dennise Cabrera
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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 que permite amplificar un fragmento de ADN de manera exponencial a través de ciclos repetidos de desnaturalización, templado y extensión. La PCR es una herramienta fundamental para identificar patógenos, realizar análisis genéticos y de investigación científica al permitir obtener grandes cantidades de ADN a partir de pequeñas muestras originales.

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 que permite amplificar un fragmento de ADN de manera exponencial a través de ciclos repetidos de desnaturalización, templado y extensión. La PCR es una herramienta fundamental para identificar patógenos, realizar análisis genéticos y de investigación científica al permitir obtener grandes cantidades de ADN a partir de pequeñas muestras originales.

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 que permite amplificar un fragmento de ADN de manera exponencial a través de ciclos repetidos de desnaturalización, templado y extensión. La PCR es una herramienta fundamental para identificar patógenos, realizar análisis genéticos y de investigación científica al permitir obtener grandes cantidades de ADN a partir de pequeñas muestras originales.

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    Amplificación del DNA (Ácido

    Desoxirribonucleico) por
    reacción en la cadena de
    polimerasa

    Coba Ruiz Enya


    Giadans Velásquez Valeria
    Pérez Martínez Ma Isabel
    Villa Aguilar Estefany
    Zacaula Aguilar Carlos Alonso
    INTRODUCCIÓN

    La reacción en cadena de la polimerasa,


    conocida como PCR por sus siglas en inglés
    (Polymerase Chain Reaction), es una técnica
    de biología molecular desarrollada en 1986
    por Kary Mullis.
    ¿Qué es la PCR?

    Algunas veces llamada "fotocopiado molecular" es la reacción


    en cadena de la polimerasa (PCR).
    Debido a que se necesitan considerables cantidades de una
    muestra de ADN para análisis moleculares y genéticos, los
    estudios de segmentos aislados de ADN son casi imposibles
    sin la amplificación por PCR
    ¿Para qué sirve la PCR?

    Ésta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su


    utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil
    identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias
    causantes de una enfermedad, identificar personas
    (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN
    amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han
    hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con
    el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para
    llevarla a cabo.
    Fundamento e importancia

    ● Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN


    polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de
    altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN
    recién formadas entre sí tras cada fase de replicación, despues deja
    que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.
    ● Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se
    desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario
    agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
    ● Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato
    llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de
    reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la
    reacción.
    Elementos básicos de una PCR

    ADN problema - ADN del individuo a estudio


    Taq polimerasa - enzima encargada de unir nucleótidos para sintetizar las
    moléculas de ADN a partir del molde del ADN del paciente
    Primers y oligonucleótidos - secuencias de aproximadamente 25 nucleótidos,
    diseñadas para ser específicas de las zonas iniciales y finales del fragmento de
    ADN que se quiere amplificar. Son necesarios, pues estos le dan la señal a la
    Taq polimerasa para que comience su función
    Desoxirribonucleótidos trifosfatados - adenina, timina, citosina y guanina
    Cloruro magnésico - MgCl2 es el cofactor necesario para la Taq polimerasa
    Cebadores: pedazos cortos cad. sencilla. Complementan bases para que el
    espacio entre ellos sea copiado
    IMPORTANCIA
    DEL CEBADOR

    1. Se unen en los extremos de

    reg. a copiar

    2. Unión al molde

    3. Extensión de polimerasa

    4. Copia
    PASOS PCR

    1. Desnaturalización

    Separar cadenas de ADN

    2. Templado

    Unirse a sec. complementarias en el molde ADN

    3. Extensión

    Síntesis de nuevas cadenas


    Desnaturalización

    ● Cadenas de ADN son calentadas y separadas a una


    temperatura de 95 °C
    ● Se rompen uniones
    Tipos de PCR

    ● PCR anidada: Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como
    molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera
    secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se
    hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial.

    ● PCR in situ: Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos
    generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un
    portaobjetos, se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación
    in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
    pequeñísimas de genoma .
    ● PCR múltiplex: En la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Consiste en
    combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar
    simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes.

    ● PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Se ultiliza ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una
    transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el
    desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
    ○ 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
    ○ 2o paso: aplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
    ○ 3er paso: PCR estándar.

    ● PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR):Reacción de PCR cuya principal característica es que permite
    cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad,
    muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión. Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos
    no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.
    Análisis del producto de amplificación después de
    realizar la PCR

    Secuenciación directa - consiste en la obtención de la secuencia nucleótido a


    nucleótido
    RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) - tras someter al amplicón a
    una digestión enzimática, se obtienen fragmentos de ADN de diferente
    tamaño. Se utilizan enzimas de restricción. En función de si esa secuencia se
    encuentra o no en nuestro amplicón, la enzima cortará o no el ADN.
    DESVENTAJAS
    ● Su síntesis requiere conocer la
    secuencia de DNA adyacente al DNA en
    cuestión
    ● La extrema sensibilidad de la PCR hace
    que sea susceptible a la contaminación
    del laboratorio
    ● Es difícil aplicarla a secuencias de más
    de unas kilobases de longitud, por lo
    cual no es útil para detectar delecciones
    más grandes
    BIBLIOGRAFÍA

    Nussbaum R.L, McInnes R.R y Willard H.F. Genética en Medicina. 7º edición. Elsevier: México.

    Antolín Sc, José RBJ. Manual CTO de Medicina y Cirugía: Inmunología; Genética. Madrid: CTO; 2018.

    Jorde L, Carey J, Bamshad M. Genética Médica. 4th ed. España: ELSEVIER; 2011. pp45-47

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