“Métodos y Técnicas

de estudio
Bacteriológico”

Docente: Sarmiento Llatas Rene

• Medios de Cultivo:
 Medios de Cultivo para la identificación de Bacterias Gram Positivas: Agar
Nutritivo, Agar Sangre, Agar Chocolate y Agar Manitol Salado.
 Medios de Cultivo para la identificación de Bacterias Gran Negativas:
ENTEROBACTERIAS: Agar Mac Conkey, Agar Eosina Azul de Metileno,
Agar SS, Agar Triple Azúcar (TSI), Agar Lisina Hierro (LIA), Agar Citrato
de Simmons, Medio de Cultivo SIM, Caldo Urea.

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 “Medios de Cultivo”

1. Agar Nutritivo:
Uso: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento y
recuento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está
descripto en procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales
de importancia clínica y sanitaria.
Fundamento: Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el
extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes
para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre
ovina desfibrinada estéril para favorecer el crecimiento de microorganismos
exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualización de
las reacciones de hemólisis.
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Composición del Agar Nutritivo:

PLURIPEPTONA, EXTRACTO DE CARNE, CLORURO DE SODIO, AGAR,
PH 7.3 +/- 0.2.
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2: Agar Sangre:
USO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos
microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones
de hemólisis.
FUNDAMENTO: La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al
medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de
microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. El agregado de 5-
10 % sangre ovina desfibrinada estéril, promueve el desarrollo de bacterias
exigentes en sus requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las
reacciones de hemólisis.
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Interpretación de los Resultados:

Observar las características de las colonias. Para el medio de cultivo conteniendo
sangre, observar las reacciones de hemólisis:
*Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo de color
verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidación de la
hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el peróxido de
hidrógeno generado por los microorganismos.
*Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante
alrededor de la colonia en estudio.
*Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio de cultivo no
presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio
“Medios de Cultivo”
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3: Agar Chocolate:
Nombre: Agar Chocolate con Suplementos y hemoglobina.
Uso: Muestras de origen clínico que puedan contener bacterias con altos requerimientos
nutricionales, tales como Haemophilus y otros microorganismos fastidiosos.
Fundamento: El medio base Agar GC adicionado de 20% de hemoglobina y
suplementos nutritivos permite obtener desarrollos más rápidos y abundantes de
microorganismos fastidiosos con altos requerimientos nutricionales. La peptona aporta
péptidos de baja complejidad y mayor biodisponibilidad. El suplemento nutricional de
enriquecimiento es una fuente de cofactores, sales minerales y vitaminas esenciales para
el desarrollo de microorganismos fastidiosos. De esta forma, el Agar chocolate con
suplementos y hemoglobina permite una recuperación segura de bacterias tales como
Haemophilus, Neisserias, Streptococcus pneumoniae y otras de difícil crecimiento.
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Incubación:
Incubar por 24 a 48 horas entre 35º y 37ºC, en las condiciones de atmósfera que
prefiera según los microorganismos que espera aislar, idealmente en atmósfera de
CO2.
Tipos de Muestras a emplear:
Se pueden utilizar muestras clínicas como: orina, secreciones y otros fluidos
corporales, materiales biológicos diversos, muestras o cualquier otra muestra que
pueda contener microorganismos con capacidad de desarrollarse en este producto.
El laboratorio debe establecer criterios de recolección, rechazo y conservación de
las muestras, de acuerdo con su política de calidad.
“Medios de Cultivo”
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Dato: Carpenter y Morton describieron un medio mejorado para el aislamiento del

gonococo en 24 horas. La eficacia de este medio, Agar GC complementado con
hemoglobina y concentrado de levadura, se demostró en un estudio de doce medios
utilizados en la altura para el aislamiento de este microorganismo.
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4: Agar Manitol Salado:

USO:
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y
diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras.
FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína,
constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven
el desarrollo microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El
cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que
inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el
agar es el agente solidificante.
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Fundamento:
Se trata de un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y
diferencial debido a la capacidad de fermentación del manitol por los
microorganismos. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de
sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen
en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como
colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no
fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del
mismo color o púrpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento
de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos
farmacéuticos, cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.
“Medios de Cultivo”
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Interpretación de los Resultados:

-Microorganismos fermentadores de manitol: colonias de color amarillo rodeadas o
no de un halo amarillo.
-Microorganismos no fermentadores de manitol: colonias del color del medio, rojas
rodeadas o no de halo rojizo-púrpura.
“Medios de Cultivo”
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5: Agar Mac Conkey:

USO:
Es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la diferenciación de
Enterobacteriaceae y diversos otros bacilos gram negativos a partir de muestras clínicas.
FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares
y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la
flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa,
disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador
de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
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PREPARACIÓN: Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5

minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición 1 a 2 minutos hasta
disolver completamente. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Cálculos:
1 Litro de Agar MacConkey:
50 gramos de Agar en Polvo --------------------------------- 1 litro de H2O destilada
X gramos de Agar en Polvo ----------------------------------- 250 ml de H2O destilada
1L = 1000 ml
50 x 250 = X x 1000
12500 = X x 1000
12,5 gramos de Agar MC en polvo.
“Medios de Cultivo”
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CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO:

-Medio de cultivo deshidratado: color beige rosado, homogéneo, libre
deslizamiento.
-Medio de cultivo preparado: color rojizo púrpura.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
-Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadas rojizas. Puede
observarse halo de precipitación biliar.
-Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio,
incoloras.
“Medios de Cultivo”
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6: Agar SS o Agar Salmonella Shigella:

USO:
Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de
Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces,
alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.
FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los
nutrientes para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante
inhiben el desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la
mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es
el hidrato de carbono fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de
SH2 que se evidencia por la formación de sulfuro de hierro.
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FUNDAMENTO:
El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. Los
pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros
microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen adecuadamente en el
medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro
negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

Dato: Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la

muestra en Selenito Caldo
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CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO:

*Medio de cultivo deshidratado: color rosado, homogéneo, libre deslizamiento.
*Medio de cultivo preparado: color naranja ligeramente opalescente.
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
*Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadas o rojizas.
*Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio,
incoloras.
*Microorganismos productores de SH2 : colonias con centro negro.
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6: Agar Eosina Azul de Metileno:

USO:
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo
de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales.
Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
FUNDAMENTO:
Sirve para el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos
Gram negativos. Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el desarrollo
microbiano. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o
sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores
eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia
variedad de bacterias Gram positivas. El agar es el agente solidificante.
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FUNDAMENTO:
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico
brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con
periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
INCUBACIÓN:
En aerobiosis, a 33-37 °C durante 18-24 horas
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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

*Microorganismos fermentadores de lactosa y / o sacarosa: colonias de color
negro azulado o amarronado. Pueden tener centro oscuro y brillo metálico.
*Microorganismos no fermentadores de lactosa y sacarosa: colonias del color
del medio, incoloras.
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