Examen Microbiológico de Productos

No Estériles. Parte I

Control microbiológico de los medicamentos – FB5096

Docente: Mg. Leonardo Humberto Mendoza Carbajal
e-mail: [email protected]
Facultad de Farmacia y Bioquímica
EXÁMENES MICROBIOLÓGICOS DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES

Parte I Parte IIA Parte IIB

• Pruebas de • Pruebas de
• Pruebas de recuento
microorganismos microorganismos
microbiano
• Pruebas de promoción específicos: E. coli, específicos: Pseudomonas
Salmonella. aeruginosa, S. aureus,
de crecimiento
• Promoción del Clostridium, Candida
• Prueba de productos
• Criterios de aceptación crecimiento albicans.
• Pruebas de productos • Pruebas de productos
• Límites de aceptabilidad
• Aptitud del método
 TEMARIO

1.Introducción
2.Pruebas de recuento microbiano: <61> USP
3.Prueba de promoción de crecimiento
4.Prueba de productos
5.Criterios de aceptación
6.Límites de aceptabilidad

3
LOGRO DE LA SESIÓN

Al finalizar la sesión el estudiante reconoce y

explica las principales pruebas aplicadas al
control microbiológico de productos
farmacéuticos no estériles.
REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA

¿Cuál de los dos productos debería ser estéril? ¿Por qué?

¿Qué significa ser un “producto farmacéutico estéril”?
¿Los productos farmacéuticos no estériles permitirían todo tipo de carga
bacteriana? ¿Por qué?
¿Qué ejemplos de productos no estériles conoces? ¿En que se aplican?
 1. Introducción

• La alteración de un producto no obligatoriamente estéril puede ser llevada a cabo por bacterias,
hongos y levaduras.

• Su desarrollo en la fase acuosa se pone de manifiesto por cambios de coloración, rancidez, cambio
en la consistencia, cambio de pH, separación de fases de una emulsión, enturbiamiento, aparición
de olores extraños, partículas o sedimento.

• Con el fin de obtener productos con una calidad higiénica aceptable, con niveles bajos de
microorganismos indicadores y ausencia de microorganismos patógenos, es imprescindible el
control microbiológico de todas las materias primas y del agua usada para fabricación y
como ingrediente también debe ser controlada.

• La correcta limpieza de áreas y equipos, las buenas prácticas higiénicas del personal un diseño
correcto de la formulación y del proceso de fabricación minimizan el riesgo de contaminación
microbiana
1. Introducción

¿De qué va a depender el número y

diversidad de microorganismos presentes en
un producto no estéril?
Factores intrínsecos a la formulación: drogas activas con acción antimicrobiana,
conservadores, pH, contenido de nutrientes, actividad acuosa, presión osmótica, potencial
de óxido-reducción y calidad higiénica de las materias primas empleadas, en especial las
de origen natural.

Factores extrínsecos: condiciones higiénicas durante la manufactura; contenido

microbiano del material de empaque.
 1. Introducción

¿A qué llamamos “producto no estéril”?

Los productos farmacéuticos no obligatoriamente estériles son los cuales sus vías de
administración son las siguientes:

Vía cutánea, gingival,

Vía
inhalatoria nasal, auricular,
(excepto parches Preparacion Preparaciones Aplicaciones
Soluciones transdérmicos Vía es acuosas no acuosas para Vía rectal sobre escaras,
(límites para un vaginal para uso ulceraciones o
Fisiológicas parche incluyendo la oral uso oral quemaduras
para
nebulizar) capa adhesiva y el
soporte)
 1. Introducción

• Mediante medios de cultivos óptimos se evalúa si la

muestra tiene gérmenes dentro de los límites
establecidos y que éstos no sean patógenos.

• Medio de cultivo óptimo: se encuentra libre de

gérmenes y aptos para que sean capaces de generar
el crecimiento de microorganismos si estos estuvieran
presenten en la muestra (Control de medios -
Pruebas de Promoción de crecimiento).

• Se prevee y evalúa si la ausencia de crecimiento en la

muestra corresponde a inactivantes que se
encuentren en la formulación (Pruebas de aptitud).
 2. Pruebas de recuento microbiano

• En general se acepta que pueden usarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo

métodos automatizados, siempre que haya sido demostrada su equivalencia con el método de
Farmacopea.

• El método de recuento en placa es el más recomendado como medida cuantitativa de

microorganismos en un producto, al momento de elegir el método de recuento hay que tener en
cuenta que el número más probable (NMP) es generalmente el método menos exacto para los
recuentos microbianos, sin embargo, para ciertos grupos de productos con una carga microbiana
muy baja, puede ser el método más apropiado.

• La elección de un método se debe basar en factores tales como la naturaleza del producto y el
límite requerido de microorganismos. Cualquiera que sea el método elegido debe permitir
efectuar el ensayo en una muestra de tamaño suficiente para evaluar la conformidad con las
especificaciones y debe establecerse la idoneidad del método elegido
2. Pruebas de recuento microbiano

A. Ensayo de fertilidad, idoneidad del método de recuento y controles negativos

Debe establecerse la capacidad del ensayo para detectar microorganismos en presencia

del producto a examinar y confirmarse la idoneidad de un método cada vez que se
introduzca alguna modificación en la realización del ensayo, o en el producto, que pueda
influir en los resultados.
B. Preparación de los microorganismos de ensayo

• Se recomienda utilizar suspensiones de cepas de ensayo de colecciones reconocidas

prepararlas como se indica a continuación.
• Es conveniente aplicar técnicas de mantenimiento de cultivo de lote de siembra
(sistemas de lote de siembra) de modo que los microorganismos viables utilizados
para la inoculación no hayan experimentado más de 5 pasajes a partir del lote de
siembra primario original.
2. Pruebas de recuento microbiano

Preparación de cepas de prueba

Controles negativos

Promoción del crecimiento de los medios

Aptitud del método de recuento en presencia del producto

2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Recomendaciones:
• Para la preparación de las suspensiones de microorganismos es conveniente
utilizar una solución de peptona-cloruro de sodio tamponada a pH 7,0 o un
tampón fosfato a pH 7,2.

• Para preparar la suspensión de esporas de A. brasiliensis puede añadirse al

tampón 0,05 por ciento de polisorbato 80. Utilizar las suspensiones antes de
que transcurran 2h o 24h si se conservan a 2-8°C.

• Como alternativa a la preparación y posterior dilución de una suspensión

reciente de células vegetativas de A. brasiliensis o B. subtilis, se prepara una
suspensión estable de esporas y a continuación se usa para la inoculación un
volumen apropiado de la misma.
2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Idoneidad del método de recuento

Ensayo de fertilidad en presencia del producto
Microorganismo Preparación de la
cepa de ensayo Recuento de Recuento de Recuento de Recuento de
microorganismos levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales mohos totales aerobios totales mohos totales

Agar-agar con Agar-agar con

Agar-agar con
hidrolizado de hidrolizado de hidrolizado de
Staphylococcus caseína y de soja y caseína y de
caseína y de soja o
aureus tal como: caldo con caldo con soja.NMP: caldo
ATCC 6538; NCIMB hidrolizado de - con hidrolizado de -
9518; CIP 4.83; hidrolizado de caseína y de soja caseína y de soja.
NBRC 13276 caseína y de soja ≤100UFC ≤100UFC
30-35°C
18-24h 30-35°C 30-35°C
≤ 3 días ≤ 3 días
2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Idoneidad del método de recuento

Ensayo de fertilidad
en presencia del producto
Preparación de
Microorganismo la cepa de Recuento de Recuento de Recuento de Recuento de
ensayo microorganismos levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales mohos totales aerobios totales mohos totales

Agar-agar con Agar-agar con

Agar-agar con hidrolizado de hidrolizado de
hidrolizado de caseína y de soja y caseína y de
Pseudomonas
caseína y de soja o caldo con soja.NMP: caldo con
aeruginosa tal como:
caldo con hidrolizado de hidrolizado de
ATCC 9027; NCIMB - -
hidrolizado de caseína y de soja caseína y de soja.
8626; CIP 82.118;
caseína y de soja
NBRC 13275
30-35°C ≤100UFC ≤100UFC
18-24h 30-35°C 30-35°C
≤ 3 días ≤ 3 días
2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Idoneidad del método de recuento

Ensayo de fertilidad en presencia del producto
Microorganismo Preparación de la
cepa de ensayo Recuento de Recuento de Recuento de Recuento de
microorganismos levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales mohos totales aerobios totales mohos totales

Agar-agar con Agar-agar con

Agar-agar con
hidrolizado de hidrolizado de hidrolizado de
caseína y de soja y caseína y de
Bacillus subtilis tal caseína y de soja o
como: ATCC 6633; caldo con caldo con soja.NMP: caldo
hidrolizado de - con hidrolizado de -
NCIMB 8054; CIP hidrolizado de caseína y de soja caseína y de soja.
52.62; NBRC 3134 caseína y de soja ≤100UFC ≤100UFC
30-35°C
18-24h 30-35°C 30-35°C
≤ 3 días ≤ 3 días
2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Idoneidad del método de recuento

Ensayo de fertilidad
en presencia del producto
Preparación de
Microorganismo la cepa de Recuento de Recuento de Recuento de Recuento de
ensayo microorganismos levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales mohos totales aerobios totales mohos totales

Agar-agar con
Agar-agar con
Agar glucosado Agar-agar con hidrolizado de Agar-agar con
Candida albicans glucosado de
de Sabouraud o hidrolizado de caseína y de soja. glucosado de
tal como: ATCC Sabouraud
caldo glucosado caseína y de soja ≤100UFC Sabouraud
10231; NCPF ≤100UFC
de Sabouraud ≤100UFC 30-35°C ≤100UFC
3179; IP 48.72; 20-25°C
20-25°C 30-35°C ≤ 5 días 20-25°C
NBRC 1594 ≤ 5 días
2-3 días ≤ 3 días ≤ 5 días
NMP: no aplicable
2. Pruebas de recuento microbiano Preparación de cepas de prueba

Idoneidad del método de recuento

Ensayo de fertilidad
en presencia del producto
Preparación de
Microorganismo la cepa de Recuento de Recuento de Recuento de Recuento de
ensayo microorganismos levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales mohos totales aerobios totales mohos totales

Agar-agar
Aspergillus Agar-agar Agar-agar con
Sabouraud Agar-agar con Agar-agar
brasiliensis tal Sabouraud – hidrolizado de
-dextrosa o agar- hidrolizado de Sabouraud –
como: ATCC dextrosa caseína y de soja.
agar con patata- caseína y de soja dextrosa
16404; IMI ≤100UFC
dextrosa
≤100UFC 30-35°C
49007; IP 20-25°C ≤100UFC ≤100UFC
20-25°C ≤ 5 días
1431.83; NBRC 5-7 días, o hasta 30-35°C 20-25°C
≤ 5 días
9455 buena ≤ 5 días ≤ 5 días
NMP: no aplicable
esporulación
2. Pruebas de recuento microbiano Control Negativo

• Para verificar las condiciones de trabajo resulta conveniente preparar un control negativo
utilizando el diluyente elegido en lugar de la preparación a examinar.

• No se debe observar ningún crecimiento de microorganismos. Un resultado no conforme en

el control negativo, requiere una investigación
 2. Pruebas de recuento microbiano Promoción del crecimiento de los medios

• Determina la susceptibilidad del medio de cultivo usando

las diferentes técnicas microbiológicas
• Debe ser realizada por cada lote de medio de cultivo
adquirido (deshidratado o preparado), y el medio
preparado por componentes
• Requerimientos:

a. El nuevo lote debe ser inoculado con una concentración

mínima conocida de microorganismos.
b. Los microorganismos usados deben ser los recomendados
en las Farmacopeas.
c. Los microorganismos utilizados no deben ser de un pase
mayor a cinco.
d. Los microorganismos deben ser derivados de colecciones
conocidas internacionalmente.
 2. Pruebas de recuento microbiano Promoción del crecimiento de los medios
Consideraciones:

• Se debe sembrar los medios de cultivo líquidos y las placas conteniendo medios de
cultivo sólidos para recuento (como máximo 100UFC) con los microorganismos
indicados.

• Para los medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor

superior a 2 del valor calculado para un inóculo normalizado. Para un inóculo recién
preparado, se debe observar un crecimiento de los microorganismos comparable al
obtenido con un lote de medio previamente controlado y aprobado.

• Los medios líquidos se pueden considerar adecuados si se observa un crecimiento

claramente visible de los microorganismos comparable al obtenido con un lote de
medio previamente controlado y aprobado
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

A. Preparación de las muestras

Productos hidrosolubles

• Disolver o diluir (generalmente se prepara una

dilución 1 en 10) el producto a examinar en
solución tamponada de peptona-cloruro de sodio
a pH 7,0, tampón fosfato a pH 7,2 o caldo con
hidrolizado de caseína y de soja.
• Si es necesario, ajustar a pH 6-8.
• Puede ser necesaria la preparación de
diluciones adicionales con el mismo diluyente
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

A. Preparación de las muestras

Productos de naturaleza no lipídica insolubles en

agua

• Disolver o diluir el producto a examinar (generalmente

se prepara una dilución 1 en10) en solución
tamponada de peptona-cloruro de sodio a pH7,0,
tampón de fosfato a pH7,2 o caldo con hidrolizado de
caseína y de soja.
• Para facilitar la suspensión de sustancias difícilmente
humectables, puede añadirse un agente tensioactivo,
tal como 1g/L de polisorbato 80.
• Si es necesario, ajustar a pH 6-8. Puede ser necesaria
la preparación de diluciones adicionales con el mismo
diluyente
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

A. Preparación de las muestras

Productos de naturaleza lipídica

• Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo,

esterilizado por filtración, o mezclarlo con la cantidad mínima
necesaria de polisorbato 80 estéril o de otro agente tensioactivo
estéril no inhibidor, calentar si es necesario a una temperatura no
superior a 40°C, o en casos excepcionales a una temperatura no
superior a 45°C.
• Mezclar cuidadosamente y, si es necesario, mantener a esa temperatura
en un baño de agua.
• Añadir una cantidad suficiente del diluyente elegido previamente
calentado para obtener una dilución 1 en 10 del producto original.
• Mezclar cuidadosamente mientras se mantiene la temperatura
durante el tiempo mínimo necesario para la formación de una
emulsión.
• Se pueden preparar diluciones1/10 adicionales utilizando el diluyente
elegido que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80
estéril u otro agente tensioactivo estéril no inhibidor.
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

A. Preparación de las muestras

Productos líquidos o sólidos en forma de

aerosol

• Transferir asépticamente el producto a un

aparato de filtración por membrana o a un
envase estéril.
• Utilizar para cada uno de los envases a
examinar, el contenido total o un número
definido de dosis.
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

A. Preparación de las muestras

Parches transdérmicos

• Retirar las cubiertas protectoras (capas antiadherentes) de

los parches transdérmicos.
• Colocarlos, con el lado adherente hacia arriba, sobre
bandejas de plástico o de vidrio estériles.
• Cubrir la superficie adherente con un material poroso estéril,
por ejemplo gasa estéril, para evitar que los parches se
peguen entre sí.
• Transferir los parches a un volumen adecuado del diluyente
elegido que contiene inactivadores, tales como polisorbato
80 y/o lecitina.
• Agitar enérgicamente la preparación durante al menos
30min
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

B. Inoculación y dilución

• Se añade inóculo de 100UFC como máximo a las muestras y control negativo.

• El volumen de la suspensión del inóculo no debe ser superior al 1% del volumen del producto
diluido.

• Demostración de recuperación microbiana a partir del producto es aceptable: ensayo sobre la

muestra preparada con el factor de dilución más bajo posible.

• Si esto no es posible debido a la actividad antimicrobiana o a la baja solubilidad, deben aplicarse

otros protocolos apropiados.

• Si no puede evitarse de otro modo la inhibición del crecimiento por la muestra, se puede proceder
a una neutralización, dilución o filtración, antes de la adición de la alícuota de la suspensión
microbiana.
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

C. Neutralización/eliminación de la actividad antimicrobiana

• Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra
preparada vs. el número de microorganismos recuperados de la preparación
control.

• En caso de inhibición del crecimiento: modificar el procedimiento a seguir para

el ensayo particular de recuento para garantizar la validez de los resultados.

• La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo,

• Un aumento del volumen del diluyente o del medio de cultivo
• La incorporación al diluyente de agentes neutralizantes específicos o generales
• Una filtración por membrana.
• Una combinación de las modificaciones anteriores.
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

C. Neutralización/eliminación de la actividad antimicrobiana: Agentes neutralizantes

• Estos agentes pueden utilizarse para neutralizar la actividad de los agentes
antimicrobianos añadiéndolos al diluyente elegido o al medio preferiblemente antes de
la esterilización.
• Si se utilizan, su eficacia y su ausencia de toxicidad para los microorganismos se deben
demostrar preparando un blanco con neutralizante y sin producto respectivamente.
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo

Filtración por Métodos de Número mas

membrana recuento en placa probable
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo

• Filtros: tamaño de poro nominal no superior a 0,45μm.

• Se debe utilizar una membrana filtrante para cada a. Filtración por membrana
microorganismo ensayado.

• Transferir a la membrana filtrante una cantidad adecuada de la

muestra preparada, filtrar inmediatamente y lavar la membrana
filtrante con un volumen apropiado de diluyente.

• Para la determinación del recuento de microorganismos

aerobios totales (RMAT), transferir la membrana filtrante a la
superficie del agar-agar con hidrolizado de caseína y de soja.

• Para la determinación del recuento de levaduras/mohos

combinados totales (RLMT), transferir la membrana a la superficie
del agar-agar glucosado de Sabouraud. Incubar las placas y
luego efectuar el recuento
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo

a. Filtración por membrana https://youtu.be/QcuYjK6Q7sc
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo b. Métodos de recuento

en placa

Método de vertido en placa Método de extensión en superficie

Placas Petri de 9cm de diámetro,

añadir a la placa 1mL de la
muestra preparada y 15-20mL de
agar-agar con hidrolizado de
caseína y de soja o agar-agar
glucosado de Sabouraud,
estando ambos medios a una
temperatura no superior a 45°C.
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo b. Métodos de recuento

en placa
Método de vertido en placa Método de extensión en superficie
Extender un volumen medido, no inferior a 0,1mL de la muestra preparada
como se ha descrito en I.5 sobre la superficie del medio
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo

c. Número mas probable
Número mas probable (NMP)

La precisión y la exactitud del método del NMP son

inferiores a las del método de filtración por membrana
ya las del método de recuento en placa. Se obtienen
resultados poco fiables particularmente en el recuento
de mohos.
 2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

D. Recuperación del producto en presencia del organismo

c. Número mas probable

https://youtu.be/p5TBOmFKVFo
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

E. Resultados e interpretación

• Cuando se verifica la idoneidad del método de filtración por membrana o del método de
recuento en placa, debe obtenerse un recuento medio de cualquiera de los organismos
de ensayo que no difiera en un factor superior a 2 del valor del control.

• Cuando se verifica la idoneidad del método del NMP, el valor calculado a partir del
inóculo debe estar entre los límites de confianza del 95 por ciento de los resultados
obtenidos con el control.

• Si los criterios anteriores no pueden ser cumplidos por uno o más de los
microorganismos ensayados con cualquiera de los métodos descritos: se utilizan para
examinar el producto el método y las condiciones de ensayo que permitan aproximarse
más a dichos criterios.
3. Prueba de productos Cantidad usada para la prueba

• Usar 10g o 10ml del producto • Se debe escoger la(s)

a examinar muestra(s) al azar a partir del
• Para líquidos o sólidos en material a granel o de los
forma de aerosol: muestrar 10 envases disponibles para la
envases. preparación
• Para parches transdérmicos:
muestrear 10 parches

• Cuando sustancias activas

están en muestras muy
pequeñas (menos de 1000 ml
o 1000 g): la cantidad
analizada debe ser 1% de la
partida.
3. Prueba de productos Examen del producto Mismos procedimientos que ya explicados
en aptitud del método

Filtración por Métodos de Número mas

membrana recuento en placa probable
3. Prueba de productos Interpretación de los resultados

Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) = # de UFCs usando

Agar digerido de Caseína-Soja.
Recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) = #
UFC empleando Agar Sabourad Dexrosa.

El criterio de aceptación en materia de calidad microbiológica, se interpreta

como sigue:

• 10¹ UFC: número máximo aceptable=20;

• 10² UFC: número máximo aceptable=200;
• 10³ UFC: número máximo aceptable=2000,
• Y así sucesivamente
 Límites de aceptabilidad para productos farmacéuticos no estériles (Farmacopea Europea)
Recuento de Recuento combinado de
Microorganismos específicos (1 g o
Vía de administración microorganismos aerobios hongos filamentosos y ml)
totales (UFC/g o ml) levaduras (UFC/g o ml)

Ausencia de Staphylococcus aureus,

Vía inhalatoria 10² 10¹ Pseudomonas aeruginosa, Gram
negativas tolerantes a la bilis

Vía oromucosal, cutánea,

Ausencia de Staphylococcus aureus,
gingival, nasal, auricular, 10² 10¹ Pseudomonas aeruginosa
parches transdérmicos
Ausencia de Staphylococcus aureus,
Vía vaginal 10² 10¹ Pseudomonas aeruginosa, Candida
albicans

Vía oral: preparaciones acuosas 10² 10¹ Ausencia de Escherichia coli

Vía oral: preparaciones no 10²

10³ Ausencia de Escherichia coli
acuosa

Vía rectal 10³ 10² -

Aplicaciones sobre escaras, Ausencia de gérmenes revivificables

ulceraciones o quemaduras
¿Preguntas?
¿qué aprendimos hoy?
2. Pruebas de recuento microbiano Aptitud del método de recuento en presencia del producto

Preparación de cepas de
Examen del producto
prueba

Controles negativos Filtración por Métodos de Número mas

membrana recuento en placa probable
Promoción del crecimiento
de los medios

Aptitud del método de

recuento en presencia del
producto
¡Muchas gracias!