PHA A Partir de Almidon

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
APLICACIÓN DE MICROORGANISMOS PARA LA ELABORACIÓN DE

BIOPLÁSTICOS A PARTIR DE ALMIDÓN RESIDUAL OBTENIDO DE
CASCARAS DE PAPA Y EVALUACIÓN DE SU BIODEGRADABILIDAD
Curso: INGENIERIA DE BIOPROCESOS
Profesor: Ing. Carmen Mabel Luna Chavez
Alumno: Miguel Ángel LLAVE ÁLVAREZ
LIMA , DICIEMBRE 2020

INTRODUCCIO
N
Los plásticos derivados del petróleo son esenciales en la vida diaria debido a sus
múltiples aplicaciones, uso del petróleo como materia prima para la producción de
plásticos no es sostenible, porque es un recurso no renovable y además contamina
el medio ambiente con la emisión de gases de invernadero como metano, sin
embargo han traido consigo serios problemas de contaminación.
El uso de Los poli-B-hidroxialcanoatos (PHA) se presentan como los candidatos
ideales para reemplazar los plásticos, El proceso de elaboración de elaboración de
los PHA es muy costoso, los costos de producción dependen del medio de cultivo,
proceso fermentativo y extracción del PHA .
Para ello se utilizaron residuos agrícolas como las cascaras de papa
(Solanum tuberosum), se demostraron que las bacterias halófilas son heterótrofos
capaces de utilizar diversos carbohidratos como fuente de carbono y acumular PHA,
El aislamiento de bacterias halófilas resistentes a condiciones ambientales extremas.
OBJETIVO GENERAL
 Determinar la concentración de almidón obtenido
de cascaras de Solanum tuberosum L. ¨papa¨ para
elaboración de bioplásticos usado en la
producción de polihidroxialcanoatos (PHA) por
bacterias halófilas nativas
 Determinar la evaluación de su biodegradabilidad’’
la biodegradación es un bioproceso
• es el resultado de los procesos de digestión, asimilación y
metabolización de un compuesto orgánico llevado a cabo por
bacterias, hongos, protozoos y otros organismos. En principio,
todo compuesto sintetizado biológicamente puede ser
descompuesto biológicamente. La biodegradación es un
proceso natural, ventajosa no sólo por permitir la eliminación de
compuestos nocivos impidiendo su concentración, sino que
además es indispensable para el reciclaje de los elementos en
la biosfera, permitiendo la restitución de elementos esenciales
en la formación y crecimiento de los organismos
¿ES UN BIOPROCESO?
• Es un bioproceso ya que se requiere de la aplicación de microorganismos para
transformar el almidón residual obtenido de cascaras de papa para la
elaboración de bioplásticos. Ya que en una etapa de la medición del
rendimiento se inoculo los microorganismos.
Polihidroxialcanoato (PHA)
Son poliésteres Lineales producidos en la naturaleza por la acción de bacterias por
fermentación de azúcar o lípidos. Su principal aplicación son la producción de bioplasticos Los
poli hidroxialcanoatos (PHA), se conocen más de 90 polímeros biodegradables o poliésteres de
ácidos alcanoicos insolubles en agua y sintetizados como material de reserva por algunos
microorganismos cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitación de
nitrógeno, fósforo, azufre, magnesio u oxígeno y con exceso de fuente de carbono.
Bacterias Halófilas
los microorganismos halófilos (microbios
amantes de la sal), son capaces de crecer en
soluciones salinas concentradas , Algunos
microorganismos halófilos (mayormente bacterias)
son específicamente denominados extremófilos ya
que viven en sustratos con altísimas
concentraciones de sales.
Solanum tuberosum L.
La papa (Solanum tuberosum L.) es el cuarto cultivo
alimenticio de mayor importancia a nivel mundial,
rico en carbohidratos, proteínas, minerales y
vitaminas, y de gran aporte para la nutrición.
condiciones que determinarán el desarrollo del proceso y la obtención de un
producto como son los bioplásticos a partir de almidón residual obtenido de
cascaras de papa
CONDICIONES PRINCIPLAES
Bacterias Halofilas
Es un proceso aerobio
células fueron llevadas a

fermentación
UPSTREAM Y DOWNSTREAM
UPSTREAM DOWNSTREAM
PROCESS Process PROCESSING
Muestreo
Aislamiento de los
microorganismos.
• Elección de • Centrifugación
Aislamiento y
caracterización de biorreactores • Acondicionami
los tipo tanque ento ( Lavado
microorganismos con sistema con solución
halófilos. discontinuo salina)
Sembrado de los
microorganismos.
Materiales y métodos
El trabajo de investigació n se ejecutó en dos fases.
• En la primera etapa , se realizó el aislamiento, detecció n y selecció n de bacterias
haló filas nativas productoras de PHA, utilizando un diseñ o no experimental.
• En la segunda etapa se determinó la concentració n de almidó n para la
producció n de PHA por una bacteria haló fila nativa seleccionada, utilizando un
diseñ o completamente aleatorio.
• con cuatro tratamientos y tres repeticiones, totalizando 12 unidades
experimentales. Los tratamientos correspondieron a la concentració n de almidó n
con cuatro niveles de 5, 10, 15 y 20 gL-1. También se consideró con una glucosa
(10 gL)
PARTE EXPERIMENTAL : 1era etapa
• Muestreo
Para aislar bacterias halófilas productoras de PHA se recolectaron aleatoriamente 35
muestras de agua en ocho salinas de los distritos de San José y Santa Rosa, región
Lambayeque Las muestras de agua en cantidad de 200 mL fueron recolectadas en frascos de
vidrio de boca ancha previamente esterilizados e identificados. Inmediatamente después, se
midió la concentración de NaCl de las muestras y se transportaron para su procesamiento
• Aislamiento de bacterias halófilas productoras de PHA

El aislamiento de las bacterias halófilas se realizó en las muestras enriquecidas y diluidas (10-
3) en solución salina 10 % p/v, tomando alícuotas (10-3) y sembrándolas en agar HM1 con
una concentración de NaCl similar al medio de enriquecimiento Después de la incubación a
30 °C, en aerobiosis, hasta observar el crecimiento de las colonias (1 a 15 días), éstas fueron
caracterizadas y agrupadas según su color, forma, tamaño y aspecto, seleccionando una
colonia representativa de cada grupo, que a su vez se cultivó en agar HM1 y se incubó a 30
°C, en aerobiosis, por tiempo suficiente para observar crecimiento, constituyendo los aislados
bacterianos que fueron guardados en refrigeración a 4 °C.
• DETECCIÓN Y SELECCIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE PHA
Para la detección de PHA cada aislado de bacteria halófila se sembró en 5 mL de

caldo HM2 con glucosa (10 g.L-1) como fuente de carbono y se incubó en estufa
a 30 °C, en agitación constante (125 rpm) hasta observar crecimiento la
presencia de gránulos negros o grisáceos en el interior de las células vegetativas
rosadas se consideró como positivo para la detección de PHA
• preparación del caldo de fermentación
CASCARA DE PAPA:
se deshidrataron a el material obtenido

Lavaron con agua Se enjuagaron con temperatura fue molido hasta
potable agua destilada ambiente (27 °C – 30 fracciones de 0,5 a 2
°C) por 72 horas mm.
PARTE EXPERIMENTAL : 2da etapa
• Determinación de la concentración de almidón

Uso del método espectrofotométrico por reacció n colorimétrica con yodo
segú n Lumbre y Potozen (2001).
Se observó una coloració n azul y se leyó la absorbancia en

espectrofotó metro a 600 nm.
Identificación del polímero PHA:
A temperatura ambiente se realizo un barrido en espectrofotó metro con luz

uv y un rango de 220 nm a 250 nm.
 pico má ximo de absorbancia a: 235 nm.

Con las concentraciones de la biomasa (x) y del producto (p) se calculo el coeficiente
de rendimiento del producto con relació n a la biomasa .
• Obtención de la Ecuación de la recta equivalente
Los valores obtenidos se analizaron mediante regresió n lineal
(y = 1,604 x - 0,6038) El valor de r2 = 0,999 producto de tres repeticiones
Se aceptó la ecuació n como un patró n de referencia para el cá lculo de la concentració n de

almidó n en cá scaras de papa,
Se determino que 1 gramo de cáscaras de papa contiene 0,39 gramos de almidón aprox.
Con este valor se calculó la cantidad de cá scaras de papa requerida para alcanzar las
diferentes concentraciones almidó n en el caldo de fermentació n
teniendo como base el caldo HM2 en donde se reemplazara la glucosa por cuatro
concentraciones de almidón (5, 10, 15, 20 g.L-1).
Detección de PHA
• las bacterias se cultivaron en 5 mL de caldo HM2 con 5, 10, 15 y 20 g.L-1 de almidó n.
• se incuban a 30 °C a 125 rpm (2 días).
• Determinació n del crecimiento por la turbidez en el medio de cultivo y el PHA por la presencia de
grá nulos en coloraciones con Sudan Negro B.
El aislado bacteriano con mayor turbidez y grá nulos de PHA fue identificado y seleccionado
para el proceso fermentativo.
Proceso fermentativo
16 biorreactores tipo tanque con sistema discontinuo y flujo de aire descendente,

conteniendo 225 mL de caldo de fermentació n con cuatro concentraciones de almidó n y
un control con glucosa se depositaron 25 mL de cada uno de los inó culos bacterianos y se
incubaron a 30 °C,
A partir de la inoculació n y cada 4 horas durante 52 horas, se tomaron muestras de 10

mL para cuantificar la biomasa y el PHA.
Tabla 1
Rendimiento Y (p/x) de polihidroxialcanoatos de bacterias halófilas en caldo HM2 con glucosa como
fuente de carbono
 La concentración máxima de PHA fue de 0,320 g/L con un rendimiento Y (p/x) de 0,889 g/g
 El 100 % de estas muestras fue positivo para el enriquecimiento y aislamiento de bacterias en un
tiempo que osciló entre 1 día (5 g/100 mL NaCl) hasta 18 días (30 g/100 mL NaCl).
 Se obtuvieron 203 aislados de bacterias halófilas y en el 38,92 % de las bacterias halófilas se
detectaron gránulos de PHA, en caldo con glucosa como fuente de carbono.
Cinética de crecimiento y producción de PHA de Halomonas sp. M4C1 con 5 (a), 10 (b), 15 (c) y 20 g.L-1 (d) de
almidón.
Se aprecia que la biomasa y el PHA se incrementaron hasta alcanzar un valor máximo y luego disminuyeron
gradualmente debido al agotamiento de la fuente de carbono externa y al uso de PHA acumulado como
fuente de energía.
ELABORACIÓN DEL BIOPLÁSTICO
Esta etapa tuvo dos objetivos, primero evaluar una metodología para elaborar bioplásticos para lo
cual se tomó como variantes la cantidad de glicerol y ácido acético, y segundo caracterizar el
bioplástico elaborado con la metodología escogida en la etapa anterior.
Materiales:
Se utilizó almidón de papa, glicerina, ácido acético, aceite vegetal como antiadherente, placas de
vidrio de 15x20 mm como molde de los bioplásticos, un agitador con calor térmico de la marca
ALEMAN para preparar el bioplástico, una estufa de secado de la marca MEMMERT y materiales
de laboratorio. El ácido acético utilizado tuvo una concentración de entre 3 al 5%, para esto se
utilizó vinagre de la marca Florida cuyos ingredientes son: vino, agua y antioxidante (E-223). La
acidez del vino se compone de distintos ácidos, entre ellos el ácido acético que es un ácido volátil,
Se elaboraron 6 tipos de bioplástico tomando como factores las cantidades de glicerina y ácido
acético ya que éstos proveen las características de elasticidad y resistencia del bioplástico. La
cantidad de agua y de almidón fueron de 60 mL y 10 g respectivamente. Se consideraron tres
repeticiones para cada ensayo. Se estableció el siguiente procedimiento para la elaboración
del bioplástico tomando como referencia a MIT (2012) y Sweeney (2008):
• Pesar 10 g de almidón y la cantidad de glicerina y ácido acético que correspondan al tipo de

muestra
• .Verter 60 ml de agua destilada en un vaso becker, agregar el almidón y mezclar.
• Agregar la glicerina y mezclar, luego agregar el ácido acético, continuar mezclando hasta
tener una solución homogénea.
• Colocar el vaso sobre el agitador térmico a 150°C y 500 RPM durante los seis primeros
minutos, posteriormente subir las revoluciones a 800 RPM durante dos minutos, finalmente
se dejó a 1400 RPM hasta que la muestra presente una consistencia gomosa
(aproximadamente cinco minutos, el tiempo varía dependiendo de la muestra).
• Untar una placa de vidrio con aceite e inmediatamente colocar la mezcla del bioplástico,
tratar de esparcir hasta dejar una capa uniforme de la mezcla.
• Colocar las placas en la estufa a 40°C durante 24 horas
ENSAYO DE BIODEGRADABILIDAD
Esta etapa tuvo como objetivo determinar el porcentaje de

biodegradación del bioplástico elaborado en la etapa anterior. El ensayo
de biodegradación para el bioplástico elaborado en la etapa anterior se
desarrolló en base a la norma ISO 17556. Se utilizó compost como
medio de degradación con la finalidad de acelerar el proceso de
degradación y poder observar un mejor comportamiento en los tres
meses de evaluación. Se consideró un control positivo (filtro de
celulosa), un control negativo (polietileno de baja densidad) y un
blanco. Se realizó una repetición para cada muestra, la distribución fue
la siguiente: - 2 frascos para el bioplástico de almidón. - 2 frascos para la
celulosa. - 2 frascos para el polietileno de baja densidad. - 2 frascos para
el blanco
Esquema de la obtención del almidón para la elaboración del bioplastico
CONCLUSIONES
• La producción de PHA por Halomonas sp. M4C1 se demostró en cuatro concentraciones de almidón
de cáscaras de papa, alcanzando un Y (p/x) de 0,143 g/g
• Es posible mejorar el proceso fermentativo (uso de microorganismos mas eficientes y fuentes de
carbono mas baratas)
• Al utilizar almidón como fuente de carbono no solo se obtiene un producto, además se aprovecha
un residuo orgánico.
• Se logró elaborar bioplásticos a nivel de laboratorio a partir de residuos de Solanum tuberosum ssp.
tuberosum var. ´Yungay` usados para freír así como evaluar su biodegradabilidad tomando como
referencia la Norma ISO 17556:2012.
• La metodología para elaborar el bioplástico más resistente está compuesto por 5 ml de glicerina, 3
ml de ácido acético, 10 g de almidón, 60 ml de agua destilada y se elabora a 150°C. El
comportamiento mecánico del bioplástico se vio más afectado por la variación de ácido acético que
por la variación de glicerol. Dicho material alcanza un esfuerzo máximo de 1.47 MPa y una
elongación máxima de 19.99% en el ensayo de tracción; además el ensayo de espectrofotometría
mostraron la formación de enlaces característicos de los bioplásticos.

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células fueron llevadas a

• Aislamiento de bacterias halófilas productoras de PHA

Para la detección de PHA cada aislado de bacteria halófila se sembró en 5 mL de

se deshidrataron a el material obtenido

• Determinación de la concentración de almidón

Se observó una coloració n azul y se leyó la absorbancia en

Identificación del polímero PHA:

A temperatura ambiente se realizo un barrido en espectrofotó metro con luz

(y = 1,604 x - 0,6038) El valor de r2 = 0,999 producto de tres repeticiones

Se aceptó la ecuació n como un patró n de referencia para el cá lculo de la concentració n de

16 biorreactores tipo tanque con sistema discontinuo y flujo de aire descendente,

A partir de la inoculació n y cada 4 horas durante 52 horas, se tomaron muestras de 10

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