MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS

Biología Molecular
Carrera de Especialidad en Micología y Parasitología
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Universidad Nacional de Rosario

Pamela Cribb - 2019

Introducción
 La extracción y purificación de ácidos nucleicos (AN) constituye la
primara etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y
de todas las técnicas de ADN recombinante.
 Los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos
purificados a partir de diversas fuentes para después realizar, por
ejemplo, análisis específicos mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR):
◦ Determinar la presencia de genes marcadores en Organismos
Genéticamente Modificados (GMO).
◦ Determinar la presencia de mutaciones asociadas a enfermedades
genéticas
◦ Detectar la presencia de ADN o ARN perteneciente a microorganismos o
virus
Es Importante Diferenciar dos Conceptos

Extracción: sacar los componentes desde un

compartimento celular:
◦ Lisis de las células que contienen a los AN
◦ Inactivación de nucleasas
◦ Clarificación: separación de los AN de los restos celulares
(debris).
Purificación: Separación de AN:
◦ de proteínas solubles
◦ de otros AN no deseados
◦ de Lípidos, carbohidratos
◦ de sales y otros compuestos orgánicos
El Problema…
Para muchas aplicaciones que involucran manipulación
de AN es necesario disponer de éstos en estado puro.

El desafío es separar los ácidos nucleicos deseados

desde una mezcla compleja, manteniendo su integridad.

 Que separamos y para que?

• Contaminantes: Proteínas, lípidos, carbohidratos, sales del medio,
iones, etc.
• Nucleasas que se liberan al lisar las células y que degradan los ácidos
nucléicos.
• Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en biología
molecular (enzimas de restricción, Taq polimerasa, ligasa, kinasa,etc. )
PURIFICACIÓN DE

ADN
En una purificación de ADN es esencial:

1. Maximizar la cantidad de ADN recuperado

2. Maximizar la calidad del ADN
3. Remover or inhibir nucleasas
4. Remover compuestos que puedan inhibir o interferir con
aplicaciones subsiguientes
5. Obtener la forma requerida de acuerdo al uso posterior
que se dará: doble hebra (ds) vs. simple hebra (ss),
genómico o plasmídico, fragmentos de ADN obtenidos
por restricción o PCR.
Cuanto ADN podemos recuperar?
Dependerá de:
 tipo de muestra/material biológico de partida
 cantidad de material de partida
 Número de copias de las moléculas de AN
 Cantidad de tejido
 tipo de ADN (genómico, plasmídico, mitocondrial)
 Condiciones en las que se encuentra el material de inicio
(fresco, congelado, fijado)
 Contaminantes e interferentes en el material biológico
 sistema de extracción y purificación usado
Cuanto ADN podemos recuperar?
 Una célula diploide contiene aprox 6 pg de ADN
 Un espermatozoide contine aprox 3 pg de ADN
 En un adulto hay, en promedio, 5 - 10 x 106 celulas por ml de sangre
→ 30 - 60 ng/ul de sangre.

PureLink™ Genomic DNA Purification Kit 

Material Amount DNA Yield
E. coli cells 1 x 109 5-15 µg
HeLa cells 1 X 106 5-10 µg
293F cells 1 x 106 2-6 µg
Huh-7 cells 2 x 106 3-10 µg
Mouse tail 0.5 cm 4-9 µg
Mouse 25 mg 5-8 µg
liver
Cuanto ADN necesitamos?
 Una reacción de PCR requiere aprox 1ng de ADN (dil
1/20 de 1 ul de sangre o 350 espermatozoides).
 Muchos kits comerciales de detección por PCR tienen
una sensibilidad menor a 1ng de ADN (100-250 pg).
 Para RFLP se requiere un mínimo de 50 ng de ADN ds
de alto peso molecular (aprox. 2 ul de sangre o 20000
espermatozoides intactos (3 pg/espermat.))
 Para ChIP, dependerá de las condiciones, el anticuerpo,
etc., pero aprox 10-50 ng
 Etapas básicas de un procedimiento general
para Extracción y Purificación de AN

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Lisis celular Durante todo el

deben ir procedimiento se
acompañadas de deben usar
medidas o soluciones y
agentes que materiales libre de
Clarificación nucleasas (en
inactiven
nucleasas general esterilizado),
celulares además de guantes

Purificación

Cualitativo: Cuantitativo:
electroforesis Análisis
espectroscopía UV
 Etapas básicas de un procedimiento general
para Extracción y Purificación de AN

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Lisis celular Durante todo el

deben ir procedimiento se
acompañadas de deben usar
medidas o soluciones y
agentes que materiales libre de
Clarificación nucleasas (en
inactiven
nucleasas general esterilizado),
celulares además de guantes

Purificación

Cualitativo: Cuantitativo:
electroforesis Análisis
espectroscopía UV
 1-Métodos de fragmentación y lisis celular
para la extracción de AN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para
romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza
requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).
Métodos físicos
•Homogenización mecánica •Bolitas de vidrio
•Homogenización en solución •Sonicación
•Molienda manual en mortero
Solos o combinados

Métodos químicos
• Detergentes
• Agentes caotrópicos: urea, tiourea, cloruro de guanidinio

Métodos enzimáticos
• Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de
peptidoglicano de la pared celular de bacterias
• Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras
• Proteasas: rompe enlaces peptídicos de proteínas de pared y membrana plasmática e
interacciones célula-célula.
Ruptura de células por medios físicos
Table 1. Techniques used for the physical disruption of cells.
Lysis Method Description Apparatus
Waring Blender Rotating blades grind and disperse cells and
Mechanical
Polytron tissues
Dounce
Homogenizer
Liquid Cell or tissue suspensions are sheared by
Potter-Elvehjem
Homogenization forcing them through a narrow space
Homogenizer
French Press
Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells
Freezer or dry Repeated cycles of freezing and thawing
Freeze/Thaw
ice/ethanol disrupt cells through ice crystal formation
Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen

Sonicador

Homogenizador
Homogenizador Dounce o Potter
mecánico - polytron
                                                        
Homogeneizadores mecánicos
•ideal para muestras difíciles de lisar: células con
paredes resistentes, tejidos, semillas
•movimiento rápido y bolitas de distinta forma y
tamaño
•procesa varias muestras a la vez
•lisis rápida y eficiente de tejidos y células
•permite purificación de DNA genómico, RNA, prots,
metabolitos y otras moléculas pequeñas
•Reproducibilidad
•aplicable a distintos tipos de muestras
•Distintas versiones de MP Bio Lysing Matrix Tubes y
kits de purificación FastPrep para lisar, moler y
homogeneizar muetras para extraer y purificar AN,
prots, metabolitos y otras moléculas pequeñas FastPrep®-24
Métodos para lisar células
Componentes de una
solución de lisis ATE N C I Ó N a
posibles e
h i b i do r es d
• in
Amortiguador de pH 7-8 (buffer) PCR
• Detergentes: SDS, Tritón X100: desestabilizan las membranas
biológicas liberando el contenido celular
• Acido Etilen diamino tetracetico (EDTA): Quelante de Mg2+ →
inhibe acción de nucleasas durante la extración/purificación.
• Agentes caotrópicos: sustancias que desorganizan la
estructura tridimensional de macromoléculas (proteínas, ADN, ARN) y
las desnaturaliza. Actúan sobre las interacciones intramoleculares no
covalentes (puentes de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y
las interacciones hidrofóbicas), desestabilizando la molécula.
ejemplos:  urea, tiourea, sales de guanidinio (cloruro o isotiocianato).
• Enzimas líticas (Lisozima, lyticasa, zymoliasa): favorecen la lisis de
paredes celulares o membranas

SDS Triton
 Etapas básicas de un procedimiento general
para Extracción y Purificación de AN

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Lisis celular Durante todo el

deben ir procedimiento se
acompañadas de deben usar
medidas o soluciones y
agentes que materiales libre de
Clarificación nucleasas (en
inactiven
nucleasas general esterilizado),
celulares además de guantes

Purificación

Cualitativo: Cuantitativo:
electroforesis Análisis
espectroscopía UV
2. Clarificación. Eliminación de restos
celulares (debris)

• Centifugación

• Filtración

• Método mixto: enzimas + centrifugación

• proteolizan un amplio rango de
proteínas nativas
Proteinasa K • más activas sobre prots
Pronasa desnaturalizadas por SDS o
calor
• ProtK activa a 65°
 Etapas básicas de un procedimiento general
para Extracción y Purificación de AN

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Lisis celular Durante todo el

deben ir procedimiento se
acompañadas de deben usar
medidas o soluciones y
agentes que materiales libre de
Clarificación nucleasas (en
inactiven
nucleasas general esterilizado),
celulares además de guantes

Purificación

Cualitativo: Cuantitativo:
electroforesis Análisis
espectroscopía UV
 3. Purificación
• Desproteinización con fenol, fenol:cloroformo y/o
cloroformo, que al desnaturalizar proteínas causa su
precipitación.
• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)
• Cromatografía
• De intercambio iónico
• De adsorción a sílica
• De filtración

• Sistemas comerciales basados en bolitas magnéticas

• Extracción de ADN desde un gel de agarosa
• Precipitación alcohólica de ADN
Extracción Fenólica de proteínas
fenol

Mezclar suavemente si se desea ADN genómico para evitar su ruptura

Agregar enzima RNasa para degradar el ARN de la fase acuosa
Extracción Fenólica de proteínas
Pros:
DNA relativamente puro
DNA de alto PM
ds DNA (OK para RFLP)

Contras:
Time consuming
Requiere muchos cambios de tubos: riesgo
contaminación
Involucra uso de compuestos peligrosos, olor
fuerte, requiere descarte especial
Precipitación de proteínas con sales
(“salting out”)
 Utiliza sales inorgánicas
 Utiliza reactivos bajos en toxicidad
 Permite visualizar el ADN.

Desventajas: Requiere una mayor cantidad de

muestra.
 Precipitación de proteínas con sales
(“salting out”)
1. Cell Lysis Buffer - lyse cell membrane, nuclei are intact, pellet
nuclei.
2. Resuspend nuclei in Protein Lysis Buffer containing a high
concentration of Proteinase K.
3. 1. membrane
Lyse nuclear Lisis Celular
and digest protein at 65 °C for 2 hours.
Temperature helps denature proteins, and Proteinase K auto digests
4.
2. Extracción
To remove proteinaceous material, LiCl is added to a final
concentration of 2.5 M,3.andPrecipitación
incubated on ice. Proteins precipitate
out and are pelleted by centrifugation.
5. 4. Resuspensión
DNA remains in solution. Transfer supernatant to a new tube, care
must be taken not to take any of protein pellet.
6. DNA is precipitated by the addition of room temperature
isopropanol. LiCl will not precipitate with DNA.
7. Precipitated DNA is washed with 70% ethanol, dried under vacuum
and resuspended in TE buffer.
Precipitación de proteínas con sales
(“salting out”)
LISIS CELULAR EXTRACCION
 Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojos).  SDS 10%: despolariza las proteinas
- Sucrosa  Perclorato de sodio 5M
- MgCl2 1M  NaCl 6M
- Triton x 100
 Buffer de lisis II: (lisis glóbulos blancos)
EDTA
NaCl

PRECIPITACION RESUSPENSION
 Isopropanol ó Etanol absoluto  Buffer T. E. ( Tris EDTA)
 Etanol al 70% lava el exceso de  agua
sales.
Precipitación de proteínas con sales
(“salting out”)
 Inorganic Isolation Methods
 Also called “salting out”.
 Uses low pH and high salt condition to selectively
precipitate proteins.
 DNA is left in solution (picture on far left).
 Precipitate out DNA with isoproproanol (middle and
right side pictures).
Solid Phase Isolation
 More rapid and effective
 Use solid matrix to bind the DNA.
 Wash away contaminants.
 Elute DNA from column
Solid Phase Isolation
The diagram below explains the
attractive properties of solid phase for
DNA and RNA.
Cromatografía de intercambio aniónico

DEAE (dietilamino etanol):

carga positiva
unido a una matriz de celulosa, Estructura química
sepharosa, etc del ADN:
carga negativa

Presente en algunos sistemas comerciales:

•QIAamp spin columns de QIAGEN,
•Chelex de BioRad.
Chelex Extraction (BioRad)
Chelex 100, Molecular Biology Grade resin from
BioRad is a highly pure, nuclease and ligase
inhibitor-free chelating resin, certified not to
interfere with downstream PCR
Chelex 100 is an ion exchange resin that is added
as a 5% solution (wt/vol).
chelating groups bind polyvalent metal ions such
as magnesium (Mg2+) → nucleases are
inactivated and the DNA is protected.
Complete removal of PCR inhibitors
Chelex Extraction (BioRad)
Chelex extraction
Pros:
 Rápido
 Usa un solo tubo: minimiza contaminaciones
 se puede usar para extraer ADN de tela
 Remueve inhibidores de PCR
 Los reactivos no son tóxicos

Contras:
 El ADN aislado es de simple hebra: sive para
PCR pero no para RFLPS.
Adsorción de ADN a partículas de sílica
ADN se une a altas
concentraciones Puente
de sal caotrópica catiónico ADN
(NaI)

ADN
ADN se eluye en
presencia de agua
Silica-Based Extraction
Pros:
Rápido
DNA de alta pureza

Contras:
transferencia entre tubos durante la
purificación: riesgo de contaminación
Magnetic Beads
Bolitas magnéticas unidas a anticuerpos
que unen DNA
También hay kits para purificar ARNm
con oligo dT unidos a las bolitas
magnéticas
 Magnetic Beads
Automated
version:
Magnetic Beads

Pros:
Very fast, may be automated
Highly purified DNA
Excellent for liquid blood

Contras:
Cannot be used directly on stain
◦ i.e. need to remove cells from stain substrate (cloth,
etc.)
Very expensive
 DNAzol
• ready-to-use reagent for the isolation of DNA
• genomic or viral DNA
• solid and liquid samples of
• human, animal and plant origin
• based on the use of a novel guanidine detergent lysing solution that
hydrolyzes RNA and promotes the selective precipitation of DNA from
the cell lysate.
• not toxic to the cells and the procedure does not require the use of
phenols.
• DNA can be obtained from a large number of samples of small or large
volume
• DNA yield varied from 310 to 1.827 ug/g
• biological sample is homogenized and lysed in DNAzol
• samples can be stored in DNAzol at room temperature for extended
periods of time
• DNA is then precipitated with ethanol, washed and dissolved in 8 mM
NaOH. Following pH adjustment, the DNA can be used immediately for
analysis or stored at 4ºC
• The entire isolation can be completed in 20-35 min
http://www.biocompare.com/Product-Reviews/40613-DNAzol-Reagents-From-Invitrogen/
 DNAzol
• a wide range of DNA molecules can be isolated including genomic DNA
and DNA fragments down to 100 bp in length.
• 70 - 100% of the DNA is typically recovered.
• Isolated DNA can be used for
• Southern analysis,
• dot blot hybridization,
• molecular cloning,
• polymerase chain reaction (PCR)
• other molecular biology applications without any additional
purification.
• There are 3 versions of DNAzol, each designed for optimal isolation
efficiency from a given sample type: blood, cells and tissue, plant.

Sample Type (General) Final Product Product Name

Cells Genomic DNA DNAzol® Reagent
Blood Genomic DNA DNAzol® BD Reagent
Plant samples Genomic DNA Plant DNAzol
® Reagent

http://www.biocompare.com/Product-Reviews/40613-DNAzol-Reagents-From-Invitrogen/
 Que kit de extracción de ADN es más adecuado?

Most versatile; able to

Process the largest Simple, sample lysis to
handle variety of sample
amount of tissue PCR in one well
types
  DNAzol® ChargeSwitch® gDNA PureLink® Genomic D
Recommendations Most cited and cost Mini Tissue Kit NA KitsTop seller
effective
Sample Types Cells, tissue Cells, blood Cells, tissue, blood,
bacteria
Protocol Time 10–30 min <45 min 15 min
Yield Up to 70 µg DNA Up to 50 ng DNA/well Up to 10 µg DNA
Starting Material 1–3 x 107 cells 1–2 x 104 cells 5 x 106 cells
Isolation Technology Organic extraction ChargeSwitch® Silica spin column
Chemistry, coated 8-well
or 96-well
High Throughput No Yes No (option available)
Compatible
High Throughput/ NA ChargeSwitch® Direct PureLink® 96 Genomic
Automation 96 Plates DNA Kit Plates

https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/dna-extraction/genomic-dna-extraction/cell-dna-extraction.html
Extracción y purificación del ADN
cromosomal de bacterias
 Sedimentación de las células de un cultivo .
 Resuspensión de las bacterias en buffer e incubación en
detergente (SDS), proteinasa K
 Extracción con fenol
 Precipitación de los ácidos nucleicos con EtOH/NaCl.
Sedimentación del ADN por centrifugación.
 Tratamiento con Ribonucleasa A.
 Precipitación del ADN con isopropanol o etanol.
 Resuspensión del ADN en agua, buffer o buffer con
EDTA.


Concentración del ADN:
Precipitación con Alcohol (Etanol)
Precicipitación con etanol (2 volúmenes), en
presencia de cantidades moderadas de cationes
monovalentes (Sales con Na+).
El precipitado se recupera por centrifugación
Para evitar que sales u otros solutos queden
atrapados en el precipitado de ADN, se lava con
etanol 70%
El ADN se redisuelve en agua o un buffer
adecuado como TE pH 7,5-8
Concentración del ADN:
Precipitación con Alcohol (Isopropanol)
 Isopropanol (0,7-1 volumen) puede usarse en lugar de
etanol (2 o 2,5 volumenes) para precipitar DNA.
 VENTAJA:
 menor volumen de líquido a centrifugar
 DESVENTAJAS:
 El Isopropanol es menos volatil y por lo tanto
más dificil de eliminar.
 Solutos como NaCl pueden quedar co-
precipitados con el ADN.
Concentración del ADN:
Filtración molecular

Microcon®100
Centrifugal Filter
Unit

 Excellent recovery of DNA samples (typically > 95%)

 Ideal for diluted DNA solutions (ng/mL to µg/mL range)
 Concentrating and purifying proteins, antibodies and nucleic acids
 Desalting and buffer exchange
 Removal of primers, linkers and unincorporated label
Separación de fragmentos de ADN
Electroforesis en gel de agarosa
• Electroforesis de la mezcla de fragmentos en un gel
de agarosa (preferentemente de bajo punto de
fusión)
• Solubilización de agarosa por Temperatura (~ 60 Cº)
• Eliminación agarosa y otros contaminantes
• Purificación del ADN por:
• Precipitación alcoholica
• Adsorción a sílica y
posterior elución

Sistemas o kits comerciales

Separación de fragmentos de ADN
desde un gel de agarosa
Gene clean

• Electroforesis de la mezcla de fragmentos en un gel

de agarosa (de bajo punto de fusión)
• Solubilización por Temperatura (~ 60 Cº)
• Purificación de ADN por adsorción en partículas de
Sílica, eliminando agarosa y otros contaminantes
 Separación de fragmentos de ADN
desde un gel de agarosa

2. Disolución de la agarosa y
3. Captura del ADN en la
1. Escisión de la desnaturalización de proteínas
membrana de sílica
banda del gel mediante un agente caotrópico o alta
contenida en la columna
concentración salina

4. Lavado con buffer etanólico: 5. Elución del ADN 6. ADN puro

elimina sales y otros contaminantes. con agua o buffer de listo para futuros usos
El ADN queda unido. baja fuerza iónica
Resuspensión y almacenamiento del ADN
BufferTE :10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA
pH levemente básico previene depurinación
EDTA quelante de Mg2+: ayuda a inactivar
DNasas
Puede guardarse a 4oC por períodos largos, pero
para almacenamiento prolongado en gral. se usa
-20oC
Evitar congelado-descongelado repetitivo, ya
que produce degradación.
 Etapas básicas de un procedimiento general
para Extracción y Purificación de AN

Disgregación o fragmentación del tejido

Estas etapas Lisis celular Durante todo el

deben ir procedimiento se
acompañadas de deben usar
medidas o soluciones y
agentes que materiales libre de
Clarificación nucleasas (en
inactiven
nucleasas general esterilizado),
celulares además de guantes

Purificación

Cualitativo: Cuantitativo:
electroforesis Análisis
espectroscopía UV
Análisis espectroscópico de AN y criterios de pureza

Espectro de Absorción UV del ADN: 260nm

Absorbancia

Longitud de onda
Espectro de Absorción UV de BSA: 280 nm
Absorbancia

Longitud de onda

•Relación Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminación

con proteínas
Determining Concentration
Formula
Concentration = 260 Reading *
Absorbance unit * Dilution factor
One optical density or absorbance unit at
260 nm is equal to
◦ 50 ug/mL for DNA
◦ 40 ug/mL for RNA.
Análisis espectroscópico de AN y criterios de pureza

•Todos los nucleótidos contribuyen a la Abs 260 nm:

nucleótidos libres, ssDNA, RNA, dsDNA → es
recomendable evaluar la pureza del DNA en un gel
•Relación Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 para DNA y ~ 2
para RNA (< sugiere contaminación con proteínas)
•Relación Abs230/Abs260 debe ser <0.5 (> sugiere
contaminación con fenol/CHCl o carbohidratos).
•Abs320 se debe a difracción de la luz por material
particulado en la muestra. Debería ser baja.
Análisis espectroscópico de AN y criterios de pureza
Relación Abs260/Abs230 ~ 2.0 -2.2
EDTA, CH, fenol: 230 nm Trizol: 230 nm y 270 nm

Guanidine HCl: 230 nm Guanidine isotiocianato: 260 nm

Factores que afectan el rendimiento, calidad
y pureza de los AN purificados

Cantidad de material de partida

◦ Número de copias de las moléculas de AN
◦ Cantidad de tejido
Condiciones en las que se encuentra el material
de inicio (fresco, congelado, fijado)
Contaminantes e interferentes en el material
biológico

Compromiso entre
rendimiento/calidad/pureza
Extracción de ADN plasmídico desde
bacterias: Método de Lisis alcalina
• Centrifugación del cultivo
• Resuspensión en solución amortiguadora de pH
+ EDTA.
• Lisis y desnaturalización alcalina
1. SDS, un detergente que disuelve lípidos de membrana.
Desnaturalizante de proteínas.
2. NaOH (pH >12):
1. Debilita la pared celular y libera el contenido de la
célula. Ayuda en la desnaturalización de proteínas.
2. Desnaturaliza el ADN. Las dos hebras del ADN
(cromosomal y plasmídico) se separan.
Extracción de ADN plasmídico desde
bacterias: Método de Lisis alcalina

 Neutralización en acetato de amonio pH ~ 5.

1. El ADN circular plasmídico se renaturaliza. El ADN

cromosomal, de alto peso molecular lineal permanece
desnaturalizado (ssDNA).

2. El ssDNA precipita ya que moléculas grandes de ssDNA son

insolubles en alta concentración de sales (5M). Co-
precipitación de membranas y debris celular.

3. La adición de KAc (o Na Ac) al SDS forma KDS, que es un

complejo insoluble (ayuda a la remoción de SDS de la
solución).
Extracción de ADN plasmídico: Método de
Lisis alcalina en columnas colmerciales
Electroforesis de ADN plasmídico

Velocidad de migración en geles de

agarosa:
Superenrollado >lineal>nickeado>
dímero>trímero>etc.
Tinción con Bromuro de etidio o Sybr
Green

 DNA is electrophoresed and stained.

 Left – Ethidium Bromide Right – Sybr Green
 The lane in the left side of the picture on the left is a
“ladder” which has fragments of known base pair (bp)
sizes. This allows determination of the size of isolated
fragments.
Extracción de ADN genómico desde Timo

Tejido de timo Adición de buffer

Adición de detergente
con EDTA

Adición de una sal

Molienda-lisis Tomar alícuota (NaCl) (salting out)
Extracción de ADN genómico desde Timo
ADN en
solucion
acuosa
Proteina
insoluble

Centrifugación

Adición de etanol ADN es insoluble en solución alcohólica

Extracción de ADN genómico desde Timo

Centrifugación

Sobrenadante Sedimento

Disolución en agua
Purificación de RNA
Requires STRICT precautions to avoid
sample degradation.
RNA especially labile.
Extracción y Purificación de ARN
ARN total o Sub-celular (citosólico y nuclear)

◦ Minimizar la actividad de RNAasas liberadas desde las células

lisadas durante el proceso de extracción
◦ La cantidad de RNasa depende del tipo de células
◦ Las RNAasas son muy resistentes (resisten Tº de ebullición,
autoclavado, desnaturalización con desnaturalizantes fuertes).
◦ Por lo tanto, en lo posible deben ser eliminadas, no sólo inhibidas:
 tratamiento del material de vidrio y de la soluciones,
 uso de guantes,
 ambiente libre de Rnasas.
 inhibidores de RNAasas
 desnaturalizantes fuertes (HCl Guanidina o isotiocianato de
guanidinina con agentes reductores).
Total RNA

80-90% of total RNA is ribosomal

RNA.
2.5-5% is messenger RNA
Extracción y Purificación de ARN total

 Lisis en presencia de agentes desnaturalizantes fuertes

de proteínas (Tiocianato de guanidina, fenol ácido) para
INACTIVACION DE RNasas
 Extracción con fenol ácido (pH 4.5)
 Precipitación con etanol
 Se obtiene mezcla de mRNA, rRNA y tRNA
 Purificación de mRNA mediante cromatografía de
afinidad a poli-dT

 Sistemas comerciales: Trizol (Invitrogen), QIAGEN,

etc.
 Extracción y Purificación de RNA total
1. Lisar/homogeneizar las células
2. Agregar Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico a la
muestra lisada
3. Centrifugar

4. Se separan las fases orgánica y acuosa

• Solventes orgánicos abajo
• Fase acuosa arriba(contiene RNA total )
• Restos Celulares y DNA genómico quedan
en la interfase entre las dos soluciones

5. Pasar la solución de RNA a un tubo limpio, precipitar RNA y lavar con etanol
6. Resuspender en agua libre de nucleasas
Purificación de RNA por afinidad
1. Lisar las células y centrifugar para
eliminar partículas grandes / residuos
celulares
2. Aplicar lisado (que contiene ácidos
nucleicos y contaminantes celulares) a
la columna con membrana de vidrio
3. Lavar con alcohol para eliminar los
contaminantes; los ácidos nucleicos se
adhieren a la membrana de vidrio
mientras que los contaminantes se lavan.
4. Tratar con la enzima DNasa para
eliminar el ADN contaminante.
5. Aplicar agua a la columna; El ARN
purificado se separa del vidrio y se
recoge en un tubo nuevo .
Purificación de poli-A mRNA
Solo el 2.5-5%
mRNA tienen colas de poli-A en el
extremo 3’
Sondas con Oligo(dT) pueden usarase
para purificar mRNA de otros RNAs
mRNA se eluye de matricz de oligo(dT)
usando H2O o buffer con baja sal
 Purificación de ADN
LISIS de MUESTRAS DE CELULAS O TEJIDOS
◦ interrupción mecánica,
◦ tratamiento químico o digestión enzimática
◦ Separar contaminantes
◦ Precipitar el ADN en una solución tampón adecuada.
Existenvarias técnicas utilizadas para purificar muestras de ADN genómico y
plásmido.
◦ Extracción usando un cosmótropo apropiado como el acetato de potasio
◦ Extracción con disolventes orgánicos y caótropos (sales de guanidio).
◦ Leche de vidrio / estrategias basadas en resina de sílice.
◦ Estrategias de intercambio aniónico. Estrategias basadas en hidroxiapatita
◦ Purificación de cloruro de cesio (CsCl)
◦ Técnicas de afinidad que utilizan resinas de afinidad de triple hélice y / o resina de sílice
modificada químicamente
Criterios para determinar el método de purificación más adecuado para su muestra
◦ Ácido nucleico diana
◦ Fuente de origen y material de partida.
◦ Resultados deseados
◦ Aplicacion downstream
Para hacer que el proceso consumiera menos tiempo, las compañías bioquímicas desarrollaron kits de
aislamiento genómico que se adaptarían a una amplia gama de aplicaciones. También hay una serie de
productos disponibles para el aislamiento, transformación y detección de plásmidos de alto rendimiento.
RFLP(Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción)
•Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia,
longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una
población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos

fragmentos de restricción.
•Los RFLP son marcadores genéticos del ADN y se pueden encontrar en
regiones que codifican proteínas o exones, en los intrones o en el ADN que

separa un gen de otro. Lo único que se necesita para que puedan ser

marcadores genéticos es que sean polimórficos teniendo más de un alelo.

•La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares
de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia

forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la

relación genética entre individuos.

RFLP(Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción)
ORGANIC EXTRACTION
PROCEDURE
Cell Lysis Buffer: lyse cell membrane, nuclei are
intact, pellet nuclei.
Resuspend nuclei, add Sodium Dodecly Sulfate
(SDS), Proteinase K. Lyse nuclear membrane and
digest protein.
ADN released into solution is extracted with phenol-
chloroform to remove proteinaceous material.
ADN is precipitated from the aqueous layer by the
additional of ice cold 95% ethanol and salt
Precipitated DNA is washed with 70% ethanol