CROMATOGRAFIA DE

LIQUIDOS

Samir A. Ojeda Lizarazo

Cromatografía de Líquidos

• En el inicio de la cromatografía de • Para diferenciar estos

líquidos (LC), ésta se llevaba a cabo procedimientos más nuevos de los
en columnas de vidrio con métodos originales de flujo por
diámetros de 10 a 50 mm. Las gravedad se empleó en un principio
longitudes rellenas de la columna la denominación de cromatografía
eran de 50 a 500 cm de partículas de líquidos de alta resolución (HPLC,
sólidas cubiertas con un líquido por sus siglas en inglés). En la
adsorbido que formaba la fase actualidad, toda la cromatografía de
estacionaria, En las primeras etapas líquidos se efectúa con flujo
de desarrollo de la cromatografía de presurizado y se utilizan las siglas LC
líquidos, los científicos se dieron o HPLC sin distinción.
cuenta de que podían conseguir
aumentar en forma notable la
eficiencia de la columna al disminuir
el tamaño de las partículas del
empaque
Ventajas
• La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más
ampliamente utilizada. Las razones de su popularidad son su
sensibilidad,
• su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas
• su idoneidad para automatizarla
• su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles
• su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria,
muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Ensanchamiento de banda extracolumna en
cromatografía de líquido
• En la cromatografía de líquidos a veces tiene lugar un ensanchamiento
de banda significativo fuera del relleno de la columna propiamente
dicho. Este ensanchamiento de banda extracolumna se presenta
cuando el soluto se transporta a través de tubos abiertos como los que
se utilizan en los sistemas de inyección, en la región de los detectores y
en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El
ensanchamiento proviene de diferencias en las tasas de flujo de las
capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y de las capas del
centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se
mueve con más rapidez que la periférica
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
• Recipientes para la fase móvil y • No es necesario que los
sistemas para el tratamiento del desgasificadores y los filtros
solvente sean partes integrantes de los
sistemas de HPLC como se
Un aparato moderno para muestra en la figura 28.3. Por
cromatografía de líquidos está ejemplo, una forma conveniente
equipado con uno o más de tratar los solventes antes de
recipientes de vidrio, cada uno de introducirlos en el recipiente,
los cuales contiene 500 mL o más consiste en hacerlos pasar al
de un solvente. A menudo están vacío a través de un filtro
equipados con un sistema para millipore. Este tratamiento
eliminar los gases disueltos y el elimina los gases y la materia en
polvo de los líquidos. Los gases suspensión.
disueltos ocasionan flujos
inestables
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
• Los instrumentos modernos para la cromatografía de líquidos de
alta resolución están equipados a menudo con válvulas de
alimentación que introducen los solventes desde dos o más
recipientes a una velocidad que varía en forma continua (figura
28.3). La relación de volumen de los solventes se puede modificar
lineal o exponencialmente con el tiempo
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
• Sistemas de bombeo
• Entre los requisitos para las bombas en cromatografía de líquidos está
1) la generación de presiones de hasta 6000 psi (lb/in.2) o 414 bares
• 2) salida libre de pulsos
• 3) tasas de flujo de 0.1 a10mL/min
• 4) reproducibilidad del flujo de 0.5% relativo o mejor
• 5) componentes resistentes a la corrosión a causa de la diversidad de
solventes.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
• Debe subrayarse que las presiones elevadas que generan las bombas de
cromatografía de líquidos no constituyen un riesgo de explosión,
porque los líquidos no son muy compresibles. Por tanto, la rotura de un
componente del sistema sólo supone una pérdida de solvente. Lo que sí
es evidente es que ésta puede representar un riesgo de incendio o de
contaminación del ambiente.
• En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos de bombas, a saber, la
del tipo jeringa accionada por tornillo y la del tipo reciprocante. Este
último tipo de bombas se usa en casi todos los cromatógrafos
comerciales modernos.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

• Bombas reciprocantes • El solvente está en contacto

• Por lo regular, este tipo de directo con el pistón. También se
bombas consiste en una puede comunicar la presión al
pequeña cámara en la que el solvente mediante un diafragma
solvente es impulsado por el flexible, el cual a su vez es
movimiento de vaivén de un bombeado hidráulicamente por
pistón accionado mediante un un émbolo de vaivén. Las
motor (véase figura 28.5). Dos bombas reciprocantes tienen la
válvulas de globo desventaja de producir un flujo
unidireccionales, que se abren y pulsado que se tiene que
cierran de manera alternada, amortiguar porque los pulsos se
controlan el flujo del solvente manifiestan como ruido en la
hacia dentro y hacia afuera de línea base del cromatograma
un cilindro.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

• Bombas de desplazamiento
• Por lo general, las bombas de
desplazamiento consisten en
unas grandes cámaras similares
a las de una jeringa, equipadas
con un émbolo que se activa por
medio de un mecanismo de
tornillo accionado mediante un
motor de etapas. Estas bombas
también producen un flujo que
tiende a ser independiente de la
viscosidad y de la contrapresión.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
• Control de flujo y sistemas de programación
• Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos
comerciales están equipados con dispositivos controlados por
computadora que permiten medir la tasa de flujo mediante la
determinación de la caída de presión a través de un constrictor
colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y
un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad
del motor de la bomba. Asimismo, la mayor parte de los instrumentos
puede variar la composición del solvente sea de manera continua o en
forma escalonada
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
• Sistemas de inyección de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisión de las mediciones en cromatografía de
líquidos es la reproductibilidad con que se pueden introducir las muestras en el
relleno de la columna. El problema se acentúa por el ensanchamiento de banda que
acompaña al tapón o sobrecarga de inyección. Por consiguiente, los volúmenes de
muestra que se emplean tienen que ser muy pequeños, de unas pocas décimas de
microlitro hasta quizá unos 500 μL. Además, lo apropiado es introducir la muestra
sin despresurizar el sistema.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
El medio que más se usa para la introducción
de las muestras en la cromatografía de líquidos
se basa en los rizos de muestreo, como el que
se ilustra en las figuras 28.6 y 27.5. Con
frecuencia, estos dispositivos forman parte del
equipo cromatográfico y hay rizos
intercambiables que permiten la elección de
tamaños de muestra desde 1 hasta 100 μL o
más. Con rizos de este tipo se puede introducir
la muestra a presiones de hasta 7000 psi con
una desviación estándar relativa de unas
décimas porcentuales.
Columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución

• Columnas analíticas • Las columnas que más se

La mayoría de las columnas para utilizan miden de 10 a 15 cm de
cromatografía de líquidos miden de longitud y 4.6 mm de diámetro
5 a 25 cm de largo. Invariablemente interior y están rellenas con
se usan columnas rectas. A veces se partículas de 5 μm. Este tipo de
pueden alargar acoplando dos o columnas generan de 40 000 a
más de ellas. El diámetro interior de 70 000 platos/metro (por lo
las columnas analíticas es a menudo regular, alrededor de 10 000
de 3 a 5 mm; los tamaños de las platos/columna
partículas de los rellenos más
comunes son 3 o5μm.
Columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución

• En los años ochenta se fabricaron • La última propiedad es de

microcolumnas cuyos diámetros considerable importancia,
interiores oscilaban entre 1 y 4.6 puesto que los solventes de alta
mm y sus longitudes iban de 3 a 7.5
pureza que se requieren en
cm. Estas columnas, que se rellenan
con partículas de tamaño de 3 a 5 cromatografía de líquidos son
μm alcanzan hasta 100 000 muy caros y se desechan
platos/metro y presentan la ventaja después del us
de la rapidez y del mínimo consumo
de solvente.
Columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución

• Precolumnas • La composición del relleno de la

precolumna debería ser
Por lo regular, para aumentar la
semejante al de la columna
vida de la columna analítica, se
analítica, pero el tamaño de
coloca una precolumna que elimina
partícula es mayor para
no sólo la materia en suspensión y
minimizar la caída de presión.
los contaminantes de los solventes,
Cuando la precolumna ya se
sino también los componentes de la
contaminó, se vacía y se rellena
muestra que se unen de manera
de nuevo o se reemplaza por
irreversible a la fase estacionaria.
una nueva del mismo tipo. Por
tanto, se le sacrifica para
proteger a la columna analítica
que es más cara.
Columnas para cromatografía de líquidos de
alta resolución
• Control de la temperatura de la columna
En muchas aplicaciones no se necesita un control riguroso de la temperatura, por
esa razón las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas
veces se obtienen mejores cromatogramas, más reproducibles, cuando la
temperatura de la columna se mantiene constante. La mayoría de los instrumentos
comerciales modernos están equipados con calentadores que controlan la
temperatura de la columna con décimas de grado, desde la ambiental hasta 150C.
Para poder controlar con precisión la temperatura, las columnas también se
pueden colocar en camisas con agua que provenga de un baño a temperatura
constante.
Muchos operadores de cromatógrafos consideran que el control de la temperatura
es esencial para lograr separaciones reproducibles.
Detectores
• No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universalmente
aplicables como los detectores de ionización por llama y de
conductividad térmica para cromatografía de gases que se describieron
en la sección 27B.4. Los detectores de cromatografía de gases fueron
específicamente perfeccionados para medir pequeñas concentraciones
de analitos en flujos de gas. Por otro lado, los detectores de
cromatografía de líquidos han sido instrumentos analíticos tradicionales
adaptados con celdas de flujo para medir concentraciones bajas de
solutos en flujos de líquidos. El problema principal en el mejoramiento
de la cromatografía de líquidos es la adaptación y perfeccionamiento de
dichos dispositivos.
Detectores
• Detectores de absorción UV-visible
Muchos detectores de absorción son dispositivos de doble haz, en los que
uno de ellos atraviesa la celda del eluyente y el otro es de referencia. Para
comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores
fotoeléctricos contrastados en combinación con un solo fototransductor.
En cualquier caso, el cromatograma consiste en una gráfica de la
absorbancia (logaritmo del cociente de las dos señales transducidas) en
función del tiempo. También se utilizan instrumentos de un solo haz. En
este caso las mediciones de intensidad del solvente se almacenan en la
memoria de una computadora y al final se recuperan para calcular la
absorbancia.
Detectores
• Detectores de absorción ultravioleta con filtros.
Los primeros detectores de absorción fueron los fotómetros de filtro con
una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común era aislar la línea
intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se
podían utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm con otros filtros. Resulta
obvio que este tipo de detector se utiliza sólo para aquellos solutos que
absorben alguna de estas longitudes de onda.
Detectores
• Como se señala en la sección 14B, varios grupos funcionales
orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben bandas de
absorción anchas a una o más de esas longitudes de onda del
ultravioleta. Las fuentes de deuterio o de filamento de tungsteno
con filtros de interferencia también proporcionan una forma sencilla
de detectar las especies absorbentes que salen de una columna.
Algunos instrumentos estaban equipados con dispositivos duales de
longitud de onda o con discos que contenían varios filtros que se
podían intercambiar con rapidez a fin de detectar distintas especies
a medida que salían
Detectores
• Detectores de absorción en el infrarrojo
• Se ofrecen comercialmente dos tipos de detectores en el infrarrojo. El
primero es un instrumento con filtro similar en cuanto a diseño al que se
muestra en la figura 16.13. El segundo, mucho más complejo, es un tipo
que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier y es similar
a los descritos en la sección 16B.1. Varios fabricantes de instrumentos IR
con transformada de Fourier ofrecen accesorios que permiten usarlos
como detectores en HPLC. Las celdas de los detectores del infrarrojo
son semejantes a las de radiación ultravioleta, excepto que las ventanas
se construyen con cloruro de sodio o fluoruro de calcio. Las longitudes
de la trayectoria de la celda oscilan de 0.2 a 1.0 mm y los volúmenes de
1.5 a10μL.
Detectores
• Detectores de absorción con capacidad de barrido.
• La mayoría de los fabricantes de instrumentos para cromatografía de
líquidos de alta resolución ofrecen detectores que consisten en un
espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes
ópticos. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta y otros abarcan la
radiación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos de
operación. Por ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a
una sola longitud de onda o también, cuando los picos del eluyente
están suficientemente separados en el tiempo, se puede elegir distinta
longitud de onda para cada pico.
Detectores
• En este caso debe emplearse el control por computadora para
seleccionar la mejor longitud de onda para cada eluyente.
Cuando se desean los espectros completos con fines de
identificación, se puede detener el flujo del eluyente durante un
tiempo suficiente que permita el barrido de longitudes de onda
de la región de interés.
Detectores
• Detectores de fluorescencia
• Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a
los fluorómetros y espectrofluorómetros descritos en la sección 15B.2.
En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un
transductor fotoeléctrico colocado a 90respecto al haz de excitación.
Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de
mercurio y uno o más filtros para aislar una banda de la radiación
emitida. Los instrumentos más complejos consisten en una fuente de
xenón y emplean un monocromador de red para aislar la radiación
fluorescente. La fluorescencia inducida por rayo láser también se utiliza
debido a su sensibilidad y selectividad.
Detectores
• Detectores electroquímicos
• En la actualidad los fabricantes de instrumentos ofrecen detectores
electroquímicos de varios tipos. Estos dispositivos se basan en la
amperometría, la voltametría, la coulombimetría y la conductimetría..
Aunque los procedimientos electroanalíticos no se han explotado
todavía tanto como los detectores ópticos, en muchos casos parecen
ofrecer las ventajas de una elevada sensibilidad, sencillez, conveniencia
y una
Detectores
• extensa aplicabilidad. Esta última propiedad se ilustra en la figura
28.11, en la que se muestran los intervalos de potencial en los que
puede tener lugar la oxidación o reducción de 16 grupos
funcionales orgánicos. En principio, las especies que contienen
alguno de esos grupos podrían detectarse mediante
procedimientos amperométricos, voltamétricos o
coulombimétricos. Sin embargo, la principal limitación de los
detectores electroquímicos es que no son compatibles con la
elución con gradiente.
Detectores
Detectores
• Detectores espectrométricos de masas
• La combinación de la cromatografía de líquidos con la espectrometría
de masas parecería ser una fusión ideal de separación y
detección.8Como en la cromatografía de gases, un espectrómetro de
masas puede ser de gran ayuda en la identificación de especies a
medida que salen de la columna cromatográfica. Sin embargo, existen
problemas mayores en el acoplamiento de las dos técnicas
Detectores
• En el caso de la espectrometría de masas se requiere una
muestra en fase gaseosa, y la salida de la columna de
cromatografía de líquidos es un soluto disuelto en un solvente.
Como primer paso, el solvente se tiene que convertir en vapor.
Cuando está vaporizado, el solvente de cromatografía de líquidos
produce un volumen de gas que es de 10 a 1000 veces mayor que
el gas portador en cromatografía de gases. Por consiguiente, la
mayor parte del solvente se tiene que eliminar
Detectores
MUCHAS GRACIAS POR SU
ATENCIÓN