9 Enzimas

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ENZIMAS

INTRODUCCION

• Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, la


mayoría de las cuales sólo se fabrican en pequeñas cantidades y
están implicadas en procesos celulares.

• Sin embargo, algunos microorganisos producen ciertas enzimas en


cantidades mucho más grandes y en lugar de mantenerlas dentro
de las célula, las excretan al medio. Habitualmente, las enzimas
extracelulares son capaces de digerir materiales insolubles tales
como celulosa, proteína y almidón.

• Algunas de estas enzimas extracelulares se utilizan en las industrias


alimentaria, farmacéutica y textil y se producen gran cantidad,
por síntesis microbiana.
INTRODUCCION

• Comercialmente, se producen enzimas, procedentes tanto de


bacterias como de hongos. El proceso de producción es
usualmente aeróbico, y los medios de cultivo similares a los
empleados en las fermentaciones para producir antibióticos.
• Generalmente la enzima se forma en pequeñas cantidades
durante la fase activa de crecimiento, pero se acumula en
grandes cantidades durante la fase estacionaria del crecimiento.
• Las enzimas inducidas se producen solamente cuando en el
medio está presente un inductor adecuado. El potencial para la
producción industrial de enzimas ha aumentado notablemente en
los últimos años dada la facilidad con que se pueden manipular
los genes.
PRODUCCIÓN COMERCIAL DE
ENZIMAS

Las ventas mundiales globales para enzimas fueron de 450


millones de dolares. En la actualidad se roducen comercialmente
las siguientes enzimas:

• Enzimas utilizadas en la industria, como amilasas, proteasas,


catalasas, isomerasas y penicilina acilasas.
• Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa
oxidasa, la alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muramidasa y
colesterol oxidasa.
• .Enzimas utilizadas en medicina, como la asparagina, proteasas,
lipasas y estreptoquinadas.

Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de


cualidad y cantidad.
PRODUCCIÓN COMERCIAL DE
ENZIMAS

• En base a toneladas las más importantes son las enzimas


comerciales (1,200 toneladas de proteína pura/año). En USA y
Europa Occidental producen aproximadamente 40-45% del
mercado mundial.

• Las enzimas industriales son producidas en fermentadores de


120m3, mientras que las enzimas con propósitos analíticos o
médicos pueden ser producidas frecuEntemente en
fermentadores mas pequeños.
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
INDUSTRIALES
• Enzima Preparación de enzima Ventas
(toneladas/año) (%del total)

• Proteasas de bacilos 6,200 45


• Glucoamilasas 4,500 13
• Amilasas de bacilos 4,200 5
• Glucosa isomerasa 1,900 6
• Renina (microbiana) 1,500 10
• Amilasa (fúngica) 800 4
• Pectinasas 100 3
• Proteasas (fungicas) 100 2
• Otros --- 12
PORCENTAJE DE LAS ENZIMAS
INDUSTRIALES QUE SE UTILIZAN EN
VARIOS MERCADOS
• El mayor porcentaje de
las enzimas industriales
esta dado por las
industrias del detergente
y la industria del
almidón con más de un
30%; siguiendoles en
2do lugar las industrias
lácteas, de destilación y
la de frutas y zumos con
un 10%; por último con
un 8% la de cerveceria y
panaderia.
PROTEASAS Y AMILASAS

• Las enzimas microbianas que se


producen en mayor cantidad Bacillus
industrialmente son las proteasas
bacterianas, utilizadas como
ADITIVOS EN LOS DETERGENTES para
lavar la ropa.
• La mayoría de estos detergentes
para la ropa contienen hoy día
enzimas, especialmente proteasas,
pero también amilasas, lipasas,
reductasas y otras. Muchas de estas
bacterias se aislan de bacterias
alcalófilas, principalmente especies
de Bacillus como Bacillus
licheniformis. Estas enzimas que
tienen el pH óptimo entre 9 y 10,
permanecen activas al pH alcalino
de las soluciones de los detergentes
para la colada.
MEJORAMIENTO DE CEPAS

• Las perspectivas para la aplicación de las enzimas han


mejorado debido a la mejora en las siguienes áreas:

• 1.Genética microbiana
• Pueden obtenerse altos rendimientos mediante
manipulación genética.

• 2.La optimización de las condiciones de fermentación


• Mediante inducción de la producción de enzimas, uso de
nutrientes de coste inferior, utilización óptima de los
componentes en la solución nutritiva e introducción de
fermentación discontinua alimentada.

• 3.Liberación de las enzimas


• A partir de células mediante nuevos métodos de ruptura
celular.
MEJORAMIENTO DE CEPAS

4.Procesos modernos de purificación


• Como distribución en contracorriente, cromatografía de
intercambio iónico, cromatrografía de filtración, cromatografía de
afinidad y precipitación.

5.El desarrollo de procesos para la inmovilización de las enzimas y su


reciclamiento.
• La cantidad de enzima que se necesita por cantidad de substrato
convertido aumenta considerablemente de esta forma. La
proproción del coste de la enzima en algunos procesos ha llegado
a ser solamente un bajo porcentaje.

6.La producción continua de enzima en reactores especiales


• Los costes de inversión para un sistema nuevo pueden ser
minimizadas en una operación continua, ya que se utiliza un equipo
de tamaño menor.
PROTEASAS Y AMILASAS

• Otras enzimas importantes fabricadas


comercialmente son las amilasas y
glucoamilasas que se usan para la
producción de glucosa a partir del almidón.
• La glucosa así producida puede ser
atacada luego por la glucosa isomerasa
para producir fructuosa (que es más dulce
que la glucosa o que la sacarosa) dando
como resultado final un edulcorante rico en
fructuosa, procedente de almidón de maíz,
trigo o patata.
• La utilización de este proceso en la industria
alimentaria ha ido aumentando,
especialmente para la producción de
BEBIDAS REFRESCANTES.
PROTEASAS Y AMILASAS
En la conversión de almidón de cereales en el producto final llamado JARABE
DE CEREALES RICO EN FRUCTUOSA, tienen lugar tres reacciones
sucesivas, cada una de ellas catalizada por una enzima.
• .La enzima -amilasa lleva a cabo el
ataque inicial del polisacárido almidón,
acortando la cadena y reduciendo la
viscocidad el polímero. Esto se llama
reacción de clarificación.
• .La enzima glucoamilasa produce
monómeros de glucosa a partir de los
polímeros acortados, proceso llamado
sacarificación.
• .La enzima llamada glucosa isomerasa
realiza la conversión final de la glucosa
en fructuosa, proceso llamado
isomerización.

Las tres enzimas se producen industrialmente por fermentación mcirobiana. El


producto final de esta serie de reacciones es un jarabe que aproximadamente
contiene partes iguales de glucosa y de fructuosa, el cual puede añadirse
directamente a las bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios como
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS

• El término extremozima ha sido acuñado para referirse a enzimas que


funcionan a temperaturas extremadamente altas o enzimas que
funcionan de forma óptima bajo cualquier condición ambiental
extrema; por ejemplo en el frío, a elevada concentración salina, o a pH
muy ácido o muy alcalino y a los organismos que las producen se les
denomina extremófilos,
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS
• Debido a que muchos procesos industriales
funcionan mejor a temperaturas elevada, las
extremozimas procedentes de termófilos
están haciéndose cada vez más atractivas
como biocatalizadores para las aplicaciones
industriales y para muchas aplicaciones en
investigación, que requieren enzimas.

• En los hipertermófilos se han aislado y


caracterizado proteasas, celulasas,
pululanasas y xilanasas extremadamente
termoestables. La pululunasa del
hipertermófilo Thermococcus litoralis es
catalíticamente más activa a una
temperatura de 118ºC y la ferredoxina (una
proteína ferro-sulfurada implicada en
reacciones de transferencia de electrones)
de Pyrococcus furiosus es activa a
temperaturas similares y no se desnaturaliza
hasta los 140ºC.
.EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE
PROCARIOTAS QUE HABITAN EN
AMBIENTES EXTREMOS
• Estos biocatalizadores resistentes a la
temperatura así como las extremoenzimas
que son activas en frío de Psicrófilos.
Activas en presencia de elevadas
concentraciones salinas de halófilos.
Activas a pH muy alto o muy bajo de
alcalófilos y acidófilos respectivamente.
• Estos encontrarán sin duda más
aplicaciones industriales en los años
venideros, en situaciones que requieren
biocatálisis bajo condiciones extremas.
Ciertamente, la gran especificidad de las
enzimas y su capacidad para distinguir
entre isómeros quirales, permite que éstos
funcionen también en condiciones
ambientales extremas, particularmente
importantes en la industria química.
ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS
APLICACIONES

ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA


• Amilasa Hongos Pan Panadería
Bacterias Revestimientos amiláceos
Papelera
Hongos Fabricación de jarabe y glucosa
Alimentaria
Bacterias Almidonado en frío de la ropa
Almidón
Hongos Ayuda digestiva
Farmacéutica
Bacterias Eliminación de revestimientos
Textil
Bacterias Eliminación de manchas, detergentes
Lavandería
ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS
APLICACIONES

ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA


• Proteasa Hongos Pan Panadera
Bacterias Eliminación de manchas
Limpieza en seco
Bacterias Ablandador de la carne
Cárnica
Bacterias Limpieza de las heridas
Medicina
Bacterias Eliminación de revestimientos
Textil
Bacterias Detergente doméstico
Lavandería
• Invertasa Levadura Relleno blando de caramelos
Confitería
ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS
APLICACIONES

ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA


• Glucosa Hongos Eliminación de glucosa, Alimentaria
Oxidasa Papeles para la prueba de diabetes
Farmacéutica
• Glucosa Bacterias Jarabe de cereales rico en glucosa
isomerasa Bebidas refrescante

• Pectinasa Hongos Prensado, clarificación vino


Zumos de fruta
• Renina Hongos Coagulación de la leche
Quesera
ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS
APLICACIONES

ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA


• Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador de tejidos;
Lavandería
detergente
• Lipasa Hongos Degradar la grasa
Lechera, lavandería
• Lactasa Hongos Degradar la lactosa a glucosa y
galactosa Lechera, alimentos

• DNA Bacterias Replicación del DNA en la


polimerasa Investigación
LAS ALFA-AMILASAS

• Son enzimas extracelulares que hidrolizan enlaces alfa-1,4 glicosidicos.


Estas enzimas son endoenzimas, que cortan los substratos en el interior
de la molécula.
• Las alfa-amilasas son formadas por muchas bacterias y hongos. Se
clasifican de acuerdo con sus efectos de licuefacción del almidón o
sacarógenicos, su pH óptimo, rango de temperatura y estabilidad.

• Las bacterias que producen alfa-amilasas: Bacillus subtilis, B. Cereus, B.


Coagulans, B. Polymyxa, B. Acidocaldarius, B. Licheniformis,
Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia,
Proteus, Thermomonospora y Serratia.

• Algunos hongos que producen alfa-amilasas: Aspergillus, Penicillium,


Cephalosporium, Mucor, Candida, Neurospora, Rhizopus.
APLICACIONES IMPORTANTES DE LAS
ALFA-AMILASAS

• Industria Origen Aplicación


Bacillus Aspergillus
Del almidón + Licuefacción del almidón para producir
glucosa, fructuosa, maltosa
• Harinera + Modificación de harina deficiente en alfa-
amilasa
• Del alcohol + + Licuefacción del almidón previa a la
adición de malta para sacarificación
• De panadería + Aumento en la proporción de azúcares
fermentables
• De cervecería + Preparación de la cebada, licuefacción de
aditivos
• Mejora de la fermentabilidad del mosto,
modificación de las características de la
cerveza.
• Del papel + Licuefacción del almidón sin producción
de
azúcar para el acabado del papel
APLICACIONES IMPORTANTES DE LAS
ALFA-AMILASAS

• Industria Origen Aplicación


Bacillus Aspergillus
• De piensos + Mejora de la cebada tratada enzimáticamente
para
su utilización en la producción de aves para
carne
y la cría de terneras.
• Azúcar + Mejora de la filtrabilidad de las melazas de
azúcar
por degradación de las partículas de almidón
contenido en las mismas.
• Lavandería y detergentes+ Aumento de la capacidad de limpieza de las
prendas manchadas con almidón, adición a los
detergentes de las maquinas lavadoras.
ENZIMAS INMOVILIZADAS
• Es un proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente,
los grados de libertad de movimiento de enzimas por su unión a
un soporte.
• Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos
destacar 3:
• 1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
• 2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los
costes del proceso.
• 3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo
y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.

• Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de


cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad
durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo
que permite la obtención de productos con mayor pureza.
ENZIMAS INMOVILIZADAS

• La inmovilización no sólo hace más fácil realizar la reacción


en condiciones a gran escala, sino que además,
generalmente estabiliza la enzima frente a la
desnaturalización.
• Existen tres formas fundamentales de abordar la
inmovilización.
1.Formación de enlaces transversales con glutaraldehido
(polimerización) de las moléculas de la enzima.
2.Unión de la enzima a un soporte (portador).
3.Inclusión de la enzima
A. Encapsulación en gel
B. Microcápsulas
C.Inmovilización en polímeros fibrosos
1.FORMACIÓN DE ENLACES TRANSVERSALES
(POLIMERIZACIÓN) DE LAS MOLÉCULAS DE LA
ENZIMA.
• La unión de las moléculas de enzima
entre sí se suele hacer mediante
reacción química con un agente
bifuncional formador de enlaces
transversales, tal como el
glutaraldehido.

• Si la reacción se lleva a cabo


adecuadamente, las moléculas de
enzima pueden unirse de tal manera
que se mantiene la mayor parte de
la actividad enzimática.

Procedimientos de los enlaces


transversales con glutaraldehido
2.UNIÓN DE LA ENZIMA A UN
SOPORTE (PORTADOR)

• Entre los soportes utilizados figuran


celulosas modificadas, carbón
activado, minerales de la arcilla,
óxido de aluminio y perlas de
vidrio. La estructura del portador,
el tipo de sitio de unión funcional,
la relación de grupos hidrofílicos a
hidrofóbicos, el tamaño de la
partícula y la relación
superficie/volumen deben ser
adecuados para cada enzima
individual y para su uso comercial
final.
3.INCLUSIÓN DE LA ENZIMA

• Que implica la incorporación de la enzima a


una membrana semipermeable. Las enzimas
pueden encerrarse en microcápsulas, geles,
membranas de polímeros semipermeables o
polímeros fibrosos como el acetato de celulosa.
• Deben existir poros que sean lo suficientemente
pequeños para que las moléculas de enzima
no sean arrastradas, pero lo suficientemente
grandes para permitir la difusión libre de
substratos y productos de bajo peso molecular
a través de la barrera.
• Desafortunadamente pueden existir pérdidas
considerables en el rendimiento durante la
producción de una enzima encapsulada pero
los productos terminados son muy estables.
A. ENCAPSULACIÓN EN GEL
• Para rodear a la enzima pueden ser utilizados polímeros
entrecruzados, insolubles en agua, como la poliacrilamida,
el alcohol polivinílico o el almidón.
• El método utilizado más frecuentemente implica la
incorporación de poliacrilamida en el gel. La acrilamida y la
enzima se polimerizan en minutos a temperatura ambiente
en un gel mediante un compuesto que facilita el
entrecruzamienteo (ej: N-N-metilen-bisacrilamida), un
iniciador (persulfato sódico) y un catalizador (-
dimetilaminopropiónico). El gel puede entonces ser cortado
y utilizado en un proceso discontinuo o en un proceso en
columna.
B.MICROCÁPSULAS
• La ventaja de la inmovilización de las
enzimas utilizando preparaciones de
microcápsulas es que la enzima libre
o las células pueden ser rodeadas
por una membrana semipermeable
del polímero. La producción tiene
lugar mediante una reacción de
polimerización en la superficie de
gotitas acuosas de la enzima que
están suspendidas en una fase
orgánica no soluble en agua. Las
enzimas microcápsuldas no han
encontrado todavía aplicación
comercial, pero parecen ser
prometedoras para futuros usos
analíticos y clínicos.
C.INMOVILIZACIÓN EN POLÍMEROS
FIBROSOS
• Este método de inmovilización es similar al método utilizado
en las microcápsulas. Una emulsión de enzima en solución
acuosa y solventes inmiscibles en agua se extruyen en un
baño de precipitación en el que se forma un polímero
fibroso que rodea a la enzima. El triacetato de celulosa y
otros derivados de celulosa actúan como polímeros
adecuados.
CELULAS INMOVILIZADAS

• En algunos casos no es necesario usar


la enzima purificada. Por el contrario,
las propias células ricas en enzima
pueden ser inmovilizadas y el proceso
industrial funcionar de forma
continua. Un ejemplo es la
inmovilización de las células de
Bacillus coagulans que contienen
glucosa isomerasa, para la
producción del jarabe de cereales
rico en fructuosa. El jarabe de
glucosa se pasa a través de columnas
que contienen las céluls inmovilizadas
y se produce el jarabe de fructuosa.
Para estos procesos de flujo continuo,
generalmente se necesitan
instalaciones mucho más pequeñas.
UTILIZACIÓN DE CÉLULAS
INMOVILIZADAS Y ENZIMAS PARA
BIOQUÍMICA ANALÍTICA
• Puede utilizarse un sistema inmovilizado para el desarrollo de
un enzayo bioquímico preciso y sensible. El principio básico
consiste en que la enzima actúa sobre el substrato y el
descenso en la concentración del substrato, el aumento en la
concentración de producto o cambios en la concentración
de cofactor pueden ser seguidos utilizando muchos métodos
de ensayo.
• La reacción puede ser seguida espectrofotométricamente,
polarimétricamente, fotométricamente, polarimétricamente,
fotométricamente o mediante espectroscopía de masas. La
reacción puede ser seguida calorimétricamente midiendo la
producción de calor con un termistor, o midiendo la
diferencia de potencial con un electrodo.
ENSAYOS BIOQUÍMICOS MEDIANTE UN
MÉTODO ENZIMA/TERMISTOR

• SUBSTRATO ENZIMA CONCENTRACION


(mMol/l)
• Acido ascórbico Acido ascórbico-oxidasa 0.05-
0.06
• ATP Hexoquinasa 1-8
• Colesterol Colesterol oxidasa 0.03-0.15
• Cefalosporina Cefalosporinasa 0.005-10
• Etanol Alcohol oxidasa 0.01-1
• Galactosa Galactosa oxidasa 0.01-1
• Glucosa Hexoquinasa 0.5-25
• Lactosa Lactasa/Glucosa oxidasa/catalasa 0.05-
10
ELECTRODOS SENSORES QUE UTILIZAN
ENZIMAS O CÉLULAS INMOVILIZADAS

• SUBSTRATO CEPA/ENZIMA BASES DE LA MEDIDA


• Sacarosa Invertasa/Mutarotasa/Glucosa-oxidasa Aumento de
Oxígeno
• Monoamina Monoamina oxidasa Disminución de
Oxígeno
• Colesterol Colesterol oxidasa Disminución de
Oxígeno
• Acido acético Trichosporon brassica Disminución de
Oxígeno
• Etanol Trichosporon brassica Disminución de
Oxígeno
• Nistatina Levaduras Aumento Oxígeno
como resultado de
la muerte celular
• Cefalosporina Citrobacter con cefalosporina Medida de pH

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