Este documento describe la producción comercial de enzimas microbianas y sus aplicaciones industriales. Explica que las enzimas más importantes producidas son las proteasas bacterianas y las amilasas, usadas en la industria alimentaria, de detergentes y del almidón. También cubre las extremoenzimas producidas por microorganismos que viven en ambientes extremos y su potencial para aplicaciones industriales que requieren condiciones extremas.
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Este documento describe la producción comercial de enzimas microbianas y sus aplicaciones industriales. Explica que las enzimas más importantes producidas son las proteasas bacterianas y las amilasas, usadas en la industria alimentaria, de detergentes y del almidón. También cubre las extremoenzimas producidas por microorganismos que viven en ambientes extremos y su potencial para aplicaciones industriales que requieren condiciones extremas.
Este documento describe la producción comercial de enzimas microbianas y sus aplicaciones industriales. Explica que las enzimas más importantes producidas son las proteasas bacterianas y las amilasas, usadas en la industria alimentaria, de detergentes y del almidón. También cubre las extremoenzimas producidas por microorganismos que viven en ambientes extremos y su potencial para aplicaciones industriales que requieren condiciones extremas.
Este documento describe la producción comercial de enzimas microbianas y sus aplicaciones industriales. Explica que las enzimas más importantes producidas son las proteasas bacterianas y las amilasas, usadas en la industria alimentaria, de detergentes y del almidón. También cubre las extremoenzimas producidas por microorganismos que viven en ambientes extremos y su potencial para aplicaciones industriales que requieren condiciones extremas.
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ENZIMAS
INTRODUCCION
• Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, la
mayoría de las cuales sólo se fabrican en pequeñas cantidades y están implicadas en procesos celulares.
• Sin embargo, algunos microorganisos producen ciertas enzimas en
cantidades mucho más grandes y en lugar de mantenerlas dentro de las célula, las excretan al medio. Habitualmente, las enzimas extracelulares son capaces de digerir materiales insolubles tales como celulosa, proteína y almidón.
• Algunas de estas enzimas extracelulares se utilizan en las industrias
alimentaria, farmacéutica y textil y se producen gran cantidad, por síntesis microbiana. INTRODUCCION
• Comercialmente, se producen enzimas, procedentes tanto de
bacterias como de hongos. El proceso de producción es usualmente aeróbico, y los medios de cultivo similares a los empleados en las fermentaciones para producir antibióticos. • Generalmente la enzima se forma en pequeñas cantidades durante la fase activa de crecimiento, pero se acumula en grandes cantidades durante la fase estacionaria del crecimiento. • Las enzimas inducidas se producen solamente cuando en el medio está presente un inductor adecuado. El potencial para la producción industrial de enzimas ha aumentado notablemente en los últimos años dada la facilidad con que se pueden manipular los genes. PRODUCCIÓN COMERCIAL DE ENZIMAS
Las ventas mundiales globales para enzimas fueron de 450
millones de dolares. En la actualidad se roducen comercialmente las siguientes enzimas:
• Enzimas utilizadas en la industria, como amilasas, proteasas,
catalasas, isomerasas y penicilina acilasas. • Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa oxidasa, la alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muramidasa y colesterol oxidasa. • .Enzimas utilizadas en medicina, como la asparagina, proteasas, lipasas y estreptoquinadas.
Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de
cualidad y cantidad. PRODUCCIÓN COMERCIAL DE ENZIMAS
• En base a toneladas las más importantes son las enzimas
comerciales (1,200 toneladas de proteína pura/año). En USA y Europa Occidental producen aproximadamente 40-45% del mercado mundial.
• Las enzimas industriales son producidas en fermentadores de
120m3, mientras que las enzimas con propósitos analíticos o médicos pueden ser producidas frecuEntemente en fermentadores mas pequeños. PRODUCCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES • Enzima Preparación de enzima Ventas (toneladas/año) (%del total)
• Proteasas de bacilos 6,200 45
• Glucoamilasas 4,500 13 • Amilasas de bacilos 4,200 5 • Glucosa isomerasa 1,900 6 • Renina (microbiana) 1,500 10 • Amilasa (fúngica) 800 4 • Pectinasas 100 3 • Proteasas (fungicas) 100 2 • Otros --- 12 PORCENTAJE DE LAS ENZIMAS INDUSTRIALES QUE SE UTILIZAN EN VARIOS MERCADOS • El mayor porcentaje de las enzimas industriales esta dado por las industrias del detergente y la industria del almidón con más de un 30%; siguiendoles en 2do lugar las industrias lácteas, de destilación y la de frutas y zumos con un 10%; por último con un 8% la de cerveceria y panaderia. PROTEASAS Y AMILASAS
• Las enzimas microbianas que se
producen en mayor cantidad Bacillus industrialmente son las proteasas bacterianas, utilizadas como ADITIVOS EN LOS DETERGENTES para lavar la ropa. • La mayoría de estos detergentes para la ropa contienen hoy día enzimas, especialmente proteasas, pero también amilasas, lipasas, reductasas y otras. Muchas de estas bacterias se aislan de bacterias alcalófilas, principalmente especies de Bacillus como Bacillus licheniformis. Estas enzimas que tienen el pH óptimo entre 9 y 10, permanecen activas al pH alcalino de las soluciones de los detergentes para la colada. MEJORAMIENTO DE CEPAS
• Las perspectivas para la aplicación de las enzimas han
mejorado debido a la mejora en las siguienes áreas:
• 1.Genética microbiana • Pueden obtenerse altos rendimientos mediante manipulación genética.
• 2.La optimización de las condiciones de fermentación
• Mediante inducción de la producción de enzimas, uso de nutrientes de coste inferior, utilización óptima de los componentes en la solución nutritiva e introducción de fermentación discontinua alimentada.
• 3.Liberación de las enzimas
• A partir de células mediante nuevos métodos de ruptura celular. MEJORAMIENTO DE CEPAS
4.Procesos modernos de purificación
• Como distribución en contracorriente, cromatografía de intercambio iónico, cromatrografía de filtración, cromatografía de afinidad y precipitación.
5.El desarrollo de procesos para la inmovilización de las enzimas y su
reciclamiento. • La cantidad de enzima que se necesita por cantidad de substrato convertido aumenta considerablemente de esta forma. La proproción del coste de la enzima en algunos procesos ha llegado a ser solamente un bajo porcentaje.
6.La producción continua de enzima en reactores especiales
• Los costes de inversión para un sistema nuevo pueden ser minimizadas en una operación continua, ya que se utiliza un equipo de tamaño menor. PROTEASAS Y AMILASAS
• Otras enzimas importantes fabricadas
comercialmente son las amilasas y glucoamilasas que se usan para la producción de glucosa a partir del almidón. • La glucosa así producida puede ser atacada luego por la glucosa isomerasa para producir fructuosa (que es más dulce que la glucosa o que la sacarosa) dando como resultado final un edulcorante rico en fructuosa, procedente de almidón de maíz, trigo o patata. • La utilización de este proceso en la industria alimentaria ha ido aumentando, especialmente para la producción de BEBIDAS REFRESCANTES. PROTEASAS Y AMILASAS En la conversión de almidón de cereales en el producto final llamado JARABE DE CEREALES RICO EN FRUCTUOSA, tienen lugar tres reacciones sucesivas, cada una de ellas catalizada por una enzima. • .La enzima -amilasa lleva a cabo el ataque inicial del polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la viscocidad el polímero. Esto se llama reacción de clarificación. • .La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de los polímeros acortados, proceso llamado sacarificación. • .La enzima llamada glucosa isomerasa realiza la conversión final de la glucosa en fructuosa, proceso llamado isomerización.
Las tres enzimas se producen industrialmente por fermentación mcirobiana. El
producto final de esta serie de reacciones es un jarabe que aproximadamente contiene partes iguales de glucosa y de fructuosa, el cual puede añadirse directamente a las bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios como .EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE PROCARIOTAS QUE HABITAN EN AMBIENTES EXTREMOS
• El término extremozima ha sido acuñado para referirse a enzimas que
funcionan a temperaturas extremadamente altas o enzimas que funcionan de forma óptima bajo cualquier condición ambiental extrema; por ejemplo en el frío, a elevada concentración salina, o a pH muy ácido o muy alcalino y a los organismos que las producen se les denomina extremófilos, .EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE PROCARIOTAS QUE HABITAN EN AMBIENTES EXTREMOS • Debido a que muchos procesos industriales funcionan mejor a temperaturas elevada, las extremozimas procedentes de termófilos están haciéndose cada vez más atractivas como biocatalizadores para las aplicaciones industriales y para muchas aplicaciones en investigación, que requieren enzimas.
• En los hipertermófilos se han aislado y
caracterizado proteasas, celulasas, pululanasas y xilanasas extremadamente termoestables. La pululunasa del hipertermófilo Thermococcus litoralis es catalíticamente más activa a una temperatura de 118ºC y la ferredoxina (una proteína ferro-sulfurada implicada en reacciones de transferencia de electrones) de Pyrococcus furiosus es activa a temperaturas similares y no se desnaturaliza hasta los 140ºC. .EXTREMOENZIMAS: ENZIMAS DE PROCARIOTAS QUE HABITAN EN AMBIENTES EXTREMOS • Estos biocatalizadores resistentes a la temperatura así como las extremoenzimas que son activas en frío de Psicrófilos. Activas en presencia de elevadas concentraciones salinas de halófilos. Activas a pH muy alto o muy bajo de alcalófilos y acidófilos respectivamente. • Estos encontrarán sin duda más aplicaciones industriales en los años venideros, en situaciones que requieren biocatálisis bajo condiciones extremas. Ciertamente, la gran especificidad de las enzimas y su capacidad para distinguir entre isómeros quirales, permite que éstos funcionen también en condiciones ambientales extremas, particularmente importantes en la industria química. ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES
ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA
• Amilasa Hongos Pan Panadería Bacterias Revestimientos amiláceos Papelera Hongos Fabricación de jarabe y glucosa Alimentaria Bacterias Almidonado en frío de la ropa Almidón Hongos Ayuda digestiva Farmacéutica Bacterias Eliminación de revestimientos Textil Bacterias Eliminación de manchas, detergentes Lavandería ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES
ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA
• Proteasa Hongos Pan Panadera Bacterias Eliminación de manchas Limpieza en seco Bacterias Ablandador de la carne Cárnica Bacterias Limpieza de las heridas Medicina Bacterias Eliminación de revestimientos Textil Bacterias Detergente doméstico Lavandería • Invertasa Levadura Relleno blando de caramelos Confitería ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES
ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA
• Glucosa Hongos Eliminación de glucosa, Alimentaria Oxidasa Papeles para la prueba de diabetes Farmacéutica • Glucosa Bacterias Jarabe de cereales rico en glucosa isomerasa Bebidas refrescante
• Pectinasa Hongos Prensado, clarificación vino
Zumos de fruta • Renina Hongos Coagulación de la leche Quesera ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES
ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA
• Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador de tejidos; Lavandería detergente • Lipasa Hongos Degradar la grasa Lechera, lavandería • Lactasa Hongos Degradar la lactosa a glucosa y galactosa Lechera, alimentos
• DNA Bacterias Replicación del DNA en la
polimerasa Investigación LAS ALFA-AMILASAS
• Son enzimas extracelulares que hidrolizan enlaces alfa-1,4 glicosidicos.
Estas enzimas son endoenzimas, que cortan los substratos en el interior de la molécula. • Las alfa-amilasas son formadas por muchas bacterias y hongos. Se clasifican de acuerdo con sus efectos de licuefacción del almidón o sacarógenicos, su pH óptimo, rango de temperatura y estabilidad.
• Las bacterias que producen alfa-amilasas: Bacillus subtilis, B. Cereus, B.
Coagulans, B. Polymyxa, B. Acidocaldarius, B. Licheniformis, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Proteus, Thermomonospora y Serratia.
• Algunos hongos que producen alfa-amilasas: Aspergillus, Penicillium,
Cephalosporium, Mucor, Candida, Neurospora, Rhizopus. APLICACIONES IMPORTANTES DE LAS ALFA-AMILASAS
• Industria Origen Aplicación
Bacillus Aspergillus Del almidón + Licuefacción del almidón para producir glucosa, fructuosa, maltosa • Harinera + Modificación de harina deficiente en alfa- amilasa • Del alcohol + + Licuefacción del almidón previa a la adición de malta para sacarificación • De panadería + Aumento en la proporción de azúcares fermentables • De cervecería + Preparación de la cebada, licuefacción de aditivos • Mejora de la fermentabilidad del mosto, modificación de las características de la cerveza. • Del papel + Licuefacción del almidón sin producción de azúcar para el acabado del papel APLICACIONES IMPORTANTES DE LAS ALFA-AMILASAS
• Industria Origen Aplicación
Bacillus Aspergillus • De piensos + Mejora de la cebada tratada enzimáticamente para su utilización en la producción de aves para carne y la cría de terneras. • Azúcar + Mejora de la filtrabilidad de las melazas de azúcar por degradación de las partículas de almidón contenido en las mismas. • Lavandería y detergentes+ Aumento de la capacidad de limpieza de las prendas manchadas con almidón, adición a los detergentes de las maquinas lavadoras. ENZIMAS INMOVILIZADAS • Es un proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas por su unión a un soporte. • Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar 3: • 1. El aumento de la estabilidad de la enzima; • 2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. • 3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.
• Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de
cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza. ENZIMAS INMOVILIZADAS
• La inmovilización no sólo hace más fácil realizar la reacción
en condiciones a gran escala, sino que además, generalmente estabiliza la enzima frente a la desnaturalización. • Existen tres formas fundamentales de abordar la inmovilización. 1.Formación de enlaces transversales con glutaraldehido (polimerización) de las moléculas de la enzima. 2.Unión de la enzima a un soporte (portador). 3.Inclusión de la enzima A. Encapsulación en gel B. Microcápsulas C.Inmovilización en polímeros fibrosos 1.FORMACIÓN DE ENLACES TRANSVERSALES (POLIMERIZACIÓN) DE LAS MOLÉCULAS DE LA ENZIMA. • La unión de las moléculas de enzima entre sí se suele hacer mediante reacción química con un agente bifuncional formador de enlaces transversales, tal como el glutaraldehido.
• Si la reacción se lleva a cabo
adecuadamente, las moléculas de enzima pueden unirse de tal manera que se mantiene la mayor parte de la actividad enzimática.
Procedimientos de los enlaces
transversales con glutaraldehido 2.UNIÓN DE LA ENZIMA A UN SOPORTE (PORTADOR)
• Entre los soportes utilizados figuran
celulosas modificadas, carbón activado, minerales de la arcilla, óxido de aluminio y perlas de vidrio. La estructura del portador, el tipo de sitio de unión funcional, la relación de grupos hidrofílicos a hidrofóbicos, el tamaño de la partícula y la relación superficie/volumen deben ser adecuados para cada enzima individual y para su uso comercial final. 3.INCLUSIÓN DE LA ENZIMA
• Que implica la incorporación de la enzima a
una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en microcápsulas, geles, membranas de polímeros semipermeables o polímeros fibrosos como el acetato de celulosa. • Deben existir poros que sean lo suficientemente pequeños para que las moléculas de enzima no sean arrastradas, pero lo suficientemente grandes para permitir la difusión libre de substratos y productos de bajo peso molecular a través de la barrera. • Desafortunadamente pueden existir pérdidas considerables en el rendimiento durante la producción de una enzima encapsulada pero los productos terminados son muy estables. A. ENCAPSULACIÓN EN GEL • Para rodear a la enzima pueden ser utilizados polímeros entrecruzados, insolubles en agua, como la poliacrilamida, el alcohol polivinílico o el almidón. • El método utilizado más frecuentemente implica la incorporación de poliacrilamida en el gel. La acrilamida y la enzima se polimerizan en minutos a temperatura ambiente en un gel mediante un compuesto que facilita el entrecruzamienteo (ej: N-N-metilen-bisacrilamida), un iniciador (persulfato sódico) y un catalizador (- dimetilaminopropiónico). El gel puede entonces ser cortado y utilizado en un proceso discontinuo o en un proceso en columna. B.MICROCÁPSULAS • La ventaja de la inmovilización de las enzimas utilizando preparaciones de microcápsulas es que la enzima libre o las células pueden ser rodeadas por una membrana semipermeable del polímero. La producción tiene lugar mediante una reacción de polimerización en la superficie de gotitas acuosas de la enzima que están suspendidas en una fase orgánica no soluble en agua. Las enzimas microcápsuldas no han encontrado todavía aplicación comercial, pero parecen ser prometedoras para futuros usos analíticos y clínicos. C.INMOVILIZACIÓN EN POLÍMEROS FIBROSOS • Este método de inmovilización es similar al método utilizado en las microcápsulas. Una emulsión de enzima en solución acuosa y solventes inmiscibles en agua se extruyen en un baño de precipitación en el que se forma un polímero fibroso que rodea a la enzima. El triacetato de celulosa y otros derivados de celulosa actúan como polímeros adecuados. CELULAS INMOVILIZADAS
• En algunos casos no es necesario usar
la enzima purificada. Por el contrario, las propias células ricas en enzima pueden ser inmovilizadas y el proceso industrial funcionar de forma continua. Un ejemplo es la inmovilización de las células de Bacillus coagulans que contienen glucosa isomerasa, para la producción del jarabe de cereales rico en fructuosa. El jarabe de glucosa se pasa a través de columnas que contienen las céluls inmovilizadas y se produce el jarabe de fructuosa. Para estos procesos de flujo continuo, generalmente se necesitan instalaciones mucho más pequeñas. UTILIZACIÓN DE CÉLULAS INMOVILIZADAS Y ENZIMAS PARA BIOQUÍMICA ANALÍTICA • Puede utilizarse un sistema inmovilizado para el desarrollo de un enzayo bioquímico preciso y sensible. El principio básico consiste en que la enzima actúa sobre el substrato y el descenso en la concentración del substrato, el aumento en la concentración de producto o cambios en la concentración de cofactor pueden ser seguidos utilizando muchos métodos de ensayo. • La reacción puede ser seguida espectrofotométricamente, polarimétricamente, fotométricamente, polarimétricamente, fotométricamente o mediante espectroscopía de masas. La reacción puede ser seguida calorimétricamente midiendo la producción de calor con un termistor, o midiendo la diferencia de potencial con un electrodo. ENSAYOS BIOQUÍMICOS MEDIANTE UN MÉTODO ENZIMA/TERMISTOR
• Sacarosa Invertasa/Mutarotasa/Glucosa-oxidasa Aumento de Oxígeno • Monoamina Monoamina oxidasa Disminución de Oxígeno • Colesterol Colesterol oxidasa Disminución de Oxígeno • Acido acético Trichosporon brassica Disminución de Oxígeno • Etanol Trichosporon brassica Disminución de Oxígeno • Nistatina Levaduras Aumento Oxígeno como resultado de la muerte celular • Cefalosporina Citrobacter con cefalosporina Medida de pH