Amplificación Isotérmica

Integrantes:
Kattleen Collazos, Jessica Bermúdez, Anggy Lizcano, Ana Herrera
Biotecnología II
2019 – II
 Generalidades

La amplificación isotérmica permite una amplificación rápida y específica de ADN a

temperaturas constantes (60°C – 65°C) evitando el requisito de ciclos térmicos.

Es más resistente a los inhibidores en muestras complejas (por ejemplo, sangre, tejido
vegetal) en comparación con la PCR debido al uso de la polimerasa Bst en lugar de Taq. Esto
permite la detección rápida de un gen objetivo a partir de muestras mínimamente procesadas
y lo convierte en el método de elección para una detección rápida de muestras de ADN
individuales.
 Tipos de Amplificación Isotérmica

 Amplificación isotérmica mediada por  Amplificación de desplazamiento de

bucle (LAMP): utiliza 4-6 cebadores que cadena (SDA): se basa en una ADN
reconocen 6-8 regiones distintas de ADN polimerasa de desplazamiento de cadena,
objetivo. típicamente ADN polimerasa Bst,
fragmento grande o fragmento Klenow.

 Amplificación dependiente de helicasa (HDA): se basa en la obtención de copias de

moléculas de ADN similar a la PCR tradicional, pero que usa una temperatura constante, en
lugar de efectuar ciclos repetidos de desnaturalización e hibridación/elongación. En lugar de
la desnaturalización térmica, se utiliza ADN helicasa, una enzima que desespiraliza el ADN.
 Tipos de Amplificación Isotérmica

 Reacción de amplificación de la enzima de  Reacción de amplificación del ADN

corte (NEAR): emplea una ADN polimerasa mediante amplificación por círculo rodante
de desplazamiento de cadena que se inicia en (RCA): emplea la ADN polimerasa del
un corte creado por una enzima de corte, bacteriófago φ29 originando moléculas de
que produce rápidamente muchos ácidos ADNmc de gran longitud y que contienen
nucleicos cortos a partir de la secuencia más de 10 copias del molde circular.
diana.

 Amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA): se da mediante la adición de una transcriptasa

inversa de la enzima a una reacción RPA puede detectar ARN , así como de ADN , sin la necesidad
de una etapa separada para producir cDNA, el proceso RPA emplea tres enzimas centrales : una
recombinasa , una proteína de unión a ADN monocatenaria (SSB) y polimerasa de desplazamiento
de cadena.
Amplificación Isotérmica mediada por
bucle (LAMP)
 Generalidades

La técnica de amplificación isotérmica medida por bucle o LAMP destaca por ser eficaz y fácil
de realizar a pesar de que el principio y mecanismo de acción es complejo.

Ha sido utilizada con éxito para detectar enfermedades virales así como de agentes
bacterianos.

 Al igual que PCR tiene la capacidad de amplificar fragmentos específicos de ADN lo que
permite la detección altamente sensible de patógenos.

 La efectividad de LAMP se basa en el diseño de primers que deben ser muy específicos. A
diferencia de PCR, LAMP requiere de 4 a 6 primers.
 Generalidades

 El método utiliza una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. Esta
propiedad de amplificación por desplazamiento no requiere el paso de PCR para
desnaturalizar (90°C).

 Es isotérmica, es decir la reacción ocurre a una misma temperatura 60°C en forma continua,
lo que es una importante ventaja sobre PCR tradicional.

 Alta eficiencia de amplificación: ADN se amplifica 109 – 1010 veces en 15 a 75 minutos.

 Una de las grandes ventajas está relacionado con la mayor tolerancia a inhibidores.
Law, J. W.-F., Ab Mutalib, N.-S., Chan, K.-G., & Lee, L.-H. (2015).
 ¿Cómo Funciona?
(Fig. 2A) La amplificación basada en LAMP
requiere 4 cebadores complementarios a 6
regiones diferentes del núcleo blanco ácido
(F1, F2, F3, B1, B2 y B3).
Los "cebadores internos" FIP y BIP contienen
cada uno dos regiones complementarias a la
secuencia objetivo; uno recoce a la cadena
de plantilla (F2 y B2), y uno se recorta con la
cadena complementaria (F1c y B1c).
Fig. 2. Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Los "cebadores externos" (F3 y B3) son
complementarios de una sola secuencia
aguas arriba de FIP y BIP, respectivamente.
 ¿Cómo Funciona?

(Fig. 2B) La replicación se inicia con el

recocido y la extensión de los "cebadores
internos" FIP y BIP.
F3 y B3 se recogen aguas arriba de FIP y BIP
y se extienden, lo que desplaza las hebras
iniciadas por los cebadores internos FIP y
BIP.
Las hebras desplazadas se forman 5
estructuras de bucle a través de la unión
complementaria, lo que da como resultado
una estructura de "mancuernas" de cadena
Fig. 2. Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). sencilla.
 ¿Cómo Funciona?
(Fig. 2C) La “pesa de gimnasia” de un solo
filamento sirve como plantilla para rondas
posteriores de amplificación utilizando los
cebadores FIP y BIP para iniciar el
alargamiento.
La plantilla monocatenaria se mantiene
mediante la formación de una estructuras
(bucle) que pueden extenderse para
desplazar el producto de doble cadena
recién sintetizado (C5 a C8).

Fig. 2. Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).

 Ejemplo De Como Funciona LAMP En Obtención de Bioluminiscencia

Veronica Yáñez. (2015).

 Vídeo

https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw
 Artículo

Kim, D. W., Kilgore, P. E., Kim, E. J., Kim, S. A., Anh, D. D., Dong, B. Q., Seki, M. (2012).
 Antecedentes
Se asocia con enfermedades:
INVASIVAS Y NO INVASIVAS
Como meningitis, bacteriemia, septicemia, neumonía adquirida en la
comunidad y otitis media.
MORTALIDAD: Cada año, aproximadamente 875,000 niños mueren
como resultado de la enfermedad neumocócica.
Streptococcus pneumoniae

 Estudiamos la TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR BUCLE (LAMP)

Para evaluar su idoneidad para detectar el ácido nucleico de S. pneumoniae
en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
TRADICIONALMENTE:
El diagnóstico de infección neumocócica:
Cultivo Bacteriano Y Los Métodos De Identificación.
El aislamiento y la identificación del neumococo se complican por la
contaminación con estreptococos alfa-hemolíticos (S. mitis y S. oralis) que
pertenecen a la flora humana normal.
 Objetivo del estudio
 Se estableció un ensayo LAMP mejorado al agregar un cebador de bucle dirigido al gen lytA (Sp LAMP);
mediante el uso de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con sospecha de
meningitis en Corea, China y Vietnam.
Primer informe sobre el uso de un ensayo LAMP para detectar S. pneumoniae en muestras clínicas de LCR.

 Se comparo el rendimiento de detección del ensayo:

Sp LAMP VS Sp PCR
 Metodología / Resultados principales
1. SE ESTABLECIÓ UN ENSAYO LAMP MEJORADO DIRIGIDO AL GEN LYTA (STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE [SP] LAMP).

(10 Streptococcus y siete especies no Streptococcus)

ESPECIFICIDAD Cepas de Se VALIDO con:

analítica de referencia 25 cepas clínicas de estreptococos alfa-hemolíticos,
los cebadores Albergan genes que
incluidas cuatro cepas de S. pneumoniae
21 cepas (3 S. oralis , 17 S. mitis y una especie de codifican el factor de
Streptococcus) virulencia (lytA).

En 30 minutos, el ensayo pudo detectar tan solo 10 copias de muestras de ADN purificado y CSF enriquecido con mayor
sensibilidad que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional.
El rango de determinación lineal para este ensayo es de 10 a 1,000,000 de microorganismos por mezcla de reacción
usando turbidimetría en tiempo real.
2. SE EVALUÓ LA SENSIBILIDAD CLÍNICA Y LA ESPECIFICIDAD DEL ENSAYO SP LAMP
Usando 106 muestras de LCR seleccionadas al azar de niños con sospecha de meningitis en Corea, China y Vietnam.
A modo de comparación:
LA SENSIBILIDAD CLÍNICA DE LAS PRUEBAS DE PCR 54.5% Y CULTIVO FUE DE 33.3%.
Metodología / Resultados principales

Figura 1. Secuencia de nucleótidos

del gen lytA utilizado para diseñar el
cebador Sp LAMP.

Las secuencias utilizadas para los cebadores

Sp LAMP se indican mediante flechas
(A). Estructura y secuencia de los cebadores
utilizados en la reacción de Sp LAMP (B).
Metodología / Resultados principales

Figura 2. Sensibilidad en tiempo real de Sp

LAMP, monitoreada por la medición de
turbidez.

En la figura, de izquierda a derecha, se

muestran las curvas de concentración
decreciente (1,000,000 a 1) de bacterias. El
límite de detección fue de 10 copias (A). La
relación entre el tiempo umbral (Tt) de cada
muestra y el registro de la cantidad de plantilla
inicial de ADN (B).
Metodología / Resultados principales

Figura 3. Análisis electroforético de productos

amplificados con Sp LAMP.

Carril M, escalera de 100 pb (New England Biolabs,

Beverly, MA, EE. UU.) Utilizado como marcador de
tamaño; Carril 1, producto Sp LAMP del Carril 2
después de la digestión con TasI (Fermentas,
Inc.). Los fragmentos digeridos fueron 107 y 108
pb; carril 2, 106 copias del ADN genómico de S.
pneumoniae ATCC 6305; Carril 3, sin plantilla.
 Metodología / Resultados principales

Tabla 1. Detección de S. pneumoniae en 25 aislamientos clínicos de estreptococos orales

por métodos de PCR y LAMP.
 Metodología / Resultados principales

Tabla 2. Límites de detección de los ensayos LAMP y PCR para Streptococcus pneumoniae.
 Metodología / Resultados principales

Tabla 3. Límite de detección de los ensayos LAMP y PCR utilizando muestras de líquido
cefalorraquídeo con S. pneumoniae (ATCC 6305).
 Metodología / Resultados principales

Tabla 4. Detección de S. pneumoniae por PCR y cultivo en comparación con la detección por
LAMP en 106 muestras de líquido cefalorraquídeo.
 conclusión

El ensayo Sp LAMP establecido en este estudio tiene un límite de

detección más sensible que los descritos previamente para los
métodos de PCR Sp, utilizando tanto ADN purificado como
CSF ​enriquecido con ADN. El límite inferior de detección del ensayo Sp
LAMP produjo una tasa de detección más alta para las muestras de LCR
en comparación con el ensayo Sp PCR. Se está realizando una
evaluación adicional de Sp LAMP en estudios prospectivos para
confirmar las características de la prueba de Sp LAMP, incluida la
sensibilidad clínica, la especificidad clínica, los valores predictivos y las
razones de probabilidad en comparación con el cultivo bacteriano, la
detección de antígeno y la PCR.
 Bibliografía

Buchan, B. W., & Ledeboer, N. A. (2014). Emerging Technologies for the Clinical Microbiology
Laboratory. Clinical Microbiology Reviews, 27(4), 787–788. doi:10.1128/cmr.00003-14. Obtenido de:
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Craw, P., & Balachandran, W. (2012). Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-
care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip, 12(14), 2469. doi:10.1039/c2lc40100b. Obtenido
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 Kim, D. W., Kilgore, P. E., Kim, E. J., Kim, S. A., Anh, D. D., Dong, B. Q., Seki, M. (2012). The Enhanced
Pneumococcal LAMP Assay: A Clinical Tool for the Diagnosis of Meningitis Due to Streptococcus pneumoniae.
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 Bibliografía

Law, J. W.-F., Ab Mutalib, N.-S., Chan, K.-G., & Lee, L.-H. (2015). An insight into the isolation,
enumeration, and molecular detection of Listeria monocytogenes in food. Frontiers in Microbiology,
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https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2015.01227/full

Veronica Yáñez. (2015). Uso y ventajas de amplificación isotérmica en la detección de

microorganismos patógenos en alimentos y control ambiental. 3M Health Care Academy. Obtenido
de: https://www.achipia.gob.cl/wp-content/uploads/2018/08/1-3M-Uso-y-ventajas-de-
amplificacion-isot--rmica-en-la-deteccion-microorganismos-004.pdf

Zanoli, L., & Spoto, G. (2012). Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in
Microfluidic Devices. Biosensors, 3(1), 18–43. doi:10.3390/bios3010018. Obtenido de:
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Gracias