SECUENCIACIÓN DE

ADN -ESPECTROMETRÍA
DE MASAS

FARMACOGENÓMICA
DEIVY MARTIN MONCAYO LEGARDA
SECUENCIACIÓN ADN
Con este conocimiento podemos:

 Localizar secuencias reguladoras y genéticas.

 Hacer comparaciones entre genes homólogos entre especies.
 Identificar mutaciones.
DESARROLLO DE LA
SECUENCIACIÓN
En 1974, dos métodos fueron desarrollados de forma independiente por un
equipo estadounidense y un equipo de inglés.

1) Los americanos, liderado por Maxam y Gilbert, usó un "protocolo de escisión química“.

2) El inglés, Sanger, diseñó un procedimiento similar al proceso natural de replicación del

ADN.

A pesar de que ambos equipos compartieron El Premio Nobel de 1980, el método de Frederick
Sanger se convirtió en el estándar debido a su practicidad en cuanto a Velocidad.
MÉTODO
SANGER
 MÉTODO SANGER
SECUENCIACIÓN DIDEOXI O DE LOS TERMINADORES DE CADENA

DIDEOXINUCLEÓTIDOS (ddNTP)
Evitan la adición de nucleótidos adicionales. Esto ocurre porque no se puede
formar un enlace fosfodiéster entre el dideoxinucleótido y el siguiente
nucleótido entrante, y así termina la cadena de ADN.
EL MÉTODO SANGER
NECESITA
 ADN de cadena simple (molde)

 Iniciador-Cebador-Primer :
complementario de una región del ADN molde

 ADN polimeraza 1 :
que utiliza como sustrato al cebador, y va a extender
la cadena de forma complementaria el molde de ADN
PROCEDIMIENTO MÉTODO
SANGER
PASOS:
1-) Desnaturalizar en hebras simples utilizando calor.
2-) Unión del cebador a una de las hebras de la plantilla:
*Su extremo 3 'se ubique al lado de la secuencia de ADN de interés
*Este cebador o uno de los nucleótidos debe ser etiquetados de forma radiactiva o fluorescente para que el
producto final pueda detectarse en un gel

3-) La solución se divide en cuatro tubos etiquetados "G", "A", "T" y "C". Luego los
reactivos se agregan a estas muestras de la siguiente manera:
TRANSCURSO DE LA
REACCIÓN
A medida que se sintetiza el ADN, los nucleótidos se agregan a la cadena en crecimiento
mediante la ADN polimerasa. Sin embargo, en ocasiones un Dideoxinucleótido se incorpora a la
cadena en lugar de un nucleótido normal, lo que resulta en una evento de terminación de
cadena.

TUBO G:
ELECTROFORÉSIS
Una vez que se completan estas reaccione:
4-) El ADN se desnaturaliza una vez más en
preparación para Electroforesis.

 El contenido de cada uno de los cuatro tubos se ejecuta en carriles

separados en un gel de poliacrilamida para separar las bandas de
diferentes tamaños entre sí.

 Después de que los contenidos se han ejecutado a través del gel, el gel se
expone a la luz UV o rayos X, dependiendo del método utilizado.
GEL DE POLIACRILAMIDA -
REACCIONES EN EL TUBO
“G”
Los fragmentos más largos de ADN
viajaron distancias más cortas que
los fragmentos más pequeños
debido a su peso molecular que es
mayor.

El color rojo denota un ddGTP, que

terminó la cadena
GEL DE SECUENCIACIÓN
DIDEOXI
Las letras sobre los
carriles indican cuál
fue el nucleótido
dideoxi utilizado en
la muestra que está
representada por
ese carril.
SECUENCIACIÓN
AUTOMÁTICA
SECUENCIACIÓN
AUTOMÁTICA
La secuenciación automatizada ha sido desarrollada para que más ADN puede
ser secuenciado en un período de tiempo más corto.
 Se realizan en un solo tubo que contiene los cuatro ddNTP. Cada cebador
puede ser etiquetado al final con un tinte de color diferente para cada ddNTP.
 GEL – SECUENCIACIÓN DE ADN
AUTOMATIZADA

Dado que los cuatro tintes emiten fluorescencia a diferentes longitudes de

onda, un láser lee el gel para determinar la identidad de cada banda de
acuerdo con las longitudes de onda a las que emite fluorescencia.
RESULTADOS SECUENCIACIÓN
AUTOMATIZADA -
CROMATOGRAMA Los colores
representan las
cuatro bases:
azul es C, verde es A,
negro es G y rojo es
T.
ESPECTROMETRÍA
DE MASAS
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
La espectrometría de masas es una técnica analítica
en la que los átomos o moléculas de una muestra son
ionizados, separados por su relación masa/carga (m/z)
y posteriormente detectados y registrados.

 Proporciona una insuperable especificidad en la determinación

del peso molecular debido a la posibilidad de medir exactamente
su masa molecular.
 Es aplicable a todo tipo de muestras, volátiles, no volátiles,
polares y apolares, sólidos, líquidos y gases.
 1. Introducción de la muestra.

ETAPAS 2. Ionización de la muestra

3. Separación y el análisis de los
iones moleculares
4. Espectro de masas

 La señal correspondiente a un ión

aparece en forma de varios picos que
corresponden a la distribución
estadística de los distintos isótopos del
ión.
 La información obtenida por
espectrometría de masas es
esencialmente cualitativa.
 Las características de los espectros de
masas dependen del tipo de
instrumento, del método de ionización.
 INTRODUCCION DE LA MUESTRA
Pueden ser:
 Sistemas de entrada indirectos= en los cuales la muestra se volatiliza externamente y
se introduce en la región de ionización.
 Sistemas por sonda directa= utilizados para la introducción directa de líquidos y sólidos
no volátiles.

SISTEMAS DE IONIZACIÓN
La elección del tipo de ionización viene determinada por la naturaleza de la muestra y la clase de información
que se desea obtener.

De Ionización en fase gaseosa= la muestra se volatiliza y posteriormente se ioniza, para

compuestos térmicamente estables.
De ionización por desorción= la muestra se transforma directamente en iones
gaseosos, para muestras no volátiles y térmicamente inestables.
 IONIZACIÓN POR
DESORCIÓN
MALDI: Ionización por desorción con láser asistida por una
matriz
Se opera:
mezclando una disolución de la
muestra con una sustancia matriz
que se encuentra en mucha mayor
proporción que la muestra
(10.000:1); la mezcla se deposita
en un dispositivo portamuestras.
Tras la evaporación del disolvente,
los cristales de la mezcla muestra-
matriz se irradian con un haz láser
de elevada potencia (106 Wcm–2)
que desorben e ionizan las
moléculas de la muestra y la
matriz, manteniéndolas en fase
ANALIZADORES
El analizador tiene dos misiones
fundamentales:

 Separar los iones en función de su relación

m/z

 Enfocar los iones separados hacia un

determinado punto.
 TOF : ANALIZADOR DE TIEMPO DE
VUELO
 Se basa en la relación entre la masa y la velocidad de los
iones.

 Se mide el tiempo que necesitan los iones acelerados para

recorrer una distancia (L), sin que los iones estén sometidos a
un campo eléctrico y/o magnético
DETECTORES
Los detectores proporcionan información sobre el flujo de
iones o la abundancia de iones que salen del analizador de
masas. Convierten el chorro de iones en una señal eléctrica
que puede ser amplificada, almacenada y presentada
mediante el sistema de tratamiento de datos de forma que
se pueda interpretar.
SECUENCIACIÓN DEL
ADN
(MALDI-TOF MS)
ESPECTROMETRÍA DE
MASAS (MALDI-TOF)
 Se han empleado en el Análisis de ácidos nucleicos.

 Se basan en el análisis de fragmentos de productos

de reacción de secuenciación por Sanger.

 Se han desarrollado ensayos MALDI-TOF MS que

van desde una secuenciación corta (hasta 100
bases) a genotipado completo.
ESQUEMA DE LA ESPECTROMETRÍA DE
MASAS MALDI-TOF PARA SECUENCIACIÓN
DE ADN Las muestras de ácido nucleico
que se han co-cristalizado con
una matriz son Ionizado con un
láser de nitrógeno y
posteriormente viajan hacia un
detector
 Los iones más ligeros golpean
primero el detector, mientras
que los iones más pesados
que viajan más lentamente
golpean el detector más tarde.

Se mide el tiempo de vuelo.

Y un factor de calibración se
utiliza para convertir este valor
en la relación masa-carga.
 PROBLEMAS MÉTODO SANGER
PARA ANÁLISIS POR (MS)
1- CREACION DE PICOS POR EXCESO DE CEBADORES:
Normalmente se usan en exceso para impulsar la reacción, existiendo un alto número
de cebadores sin reaccionar, por lo que se pueden crear picos en el espectro de masas,
que pueden interferir directamente con la interpretación de los datos de MS
2- FALSAS PARADAS:
Falsas paradas se producen durante una reacción de extensión del ADN cuando la
enzima cae prematuramente de la plantilla de ADN, lo que termina un fragmento de
ADN con un dNTP en lugar de un ddNTP.
Las paradas falsas generan fragmentos de extensión con una diferencia de masa de 16
Da menos que el fragmento terminado correctamente. Si tal evento ocurre, puede
llevar a dificultades con los datos subsiguientes; ya que el pico resultante puede estar
en una posición de masa distinta confundiendo la identificación del pico esperado.
 USO DE DIDEOXINUCLEÓTIDOS
CAPTURABLES EN FASE SÓLIDA (SPC
DDNTPS)

Solo los fragmentos de secuenciación de ADN que

terminan con dideoxinucleótidos biotinilados en el
extremo 3 se capturan en la fase sólida.

• Cebadores en exceso
• Fragmentos de ADN falsamente terminados
 Estos fragmentos luego se mezclan con la
matriz y se cargan en un Espectrómetro de
masas para producir espectros de masas
precisos de los fragmentos de secuenciación
del ADN.
ESPECTRO DE MASAS DE LA SECUENCIACIÓN DE ADN POR SPC

Dado que cada uno de los cuatro

nucleótidos (A, C, G, T) tiene una masa
molecular única, la diferencia de masa
entre los picos adyacentes del espectro de
masas = da la identidad de secuencia de
los nucleótidos.
El primer pico en el espectro corresponde
a la extensión del cebador por el primer
nucleótido que es complementario al
nucleótido correspondiente en la plantilla
de ADN.
USOS DE LA
SECUENCIACIÓN POR MS
 Determinar variaciones genéticas causadas por
enfermedades.
 Secuenciación de ADN de nuevos Organismos para
determinar qué los hacen diferentes y/o únicas a esas
especies.
 Detección de fragmentos mutados.
 Identificación de proteínas implicadas en procesos
biológicos.
GRACIAS
BIBLIOGRAFÍA
- M.ª CARMEN MARTÍN GÓMEZ, MILAGROS BALLESTEROS GONZÁLEZ. Espectrometría de masas y análisis
de biomarcadores. Sección Departamental de Química Analítica. Facultad de Farmacia. Universidad
Complutense. Madrid.
- AYALA BRETÓN CAMILO, REGIL HERNÁNDEZ RUBÉN. Secuenciación de proteínas por espectrometría de
masas. Instituto de Biotecnología, UNAM. 2004.
-James M. Heather1, Benjamin Chain. The Sequence of Sequencers: The History of
Sequencing DNA. Division of Infection & Immunity, UCL Cruciform Building, Gower Street, London. 2016,
Pages 1-8.
-Matthias Wjst, Dirk van den Boom. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Time-of-Flight Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, vol. 311: Pharmacogenomics: Methods
and Protocols.
- Sarah Obenrader, Davidson College. The Sanger Method.
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenrader/sanger_method_page
.htm
-Edwards, J. R., Ruparel, H. Mass-spectrometry DNA sequencing. Mutation Research/Fundamental and
Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2005.