INMUNOHISTOQUIMICA

CONTENIDO
• GENERALIDAD EN INMUNOHISTOQUIMICA
• ANTICUERPOS
• COMPLEJO ANTIGENO ANTICUERPO
• GENERALIDADES PROCESO
INMUNOHISTOQUIMICO
• ESTANDARIZACION
 Inmunohistoquimica
• Inmunohistoquímica (IHC), o inmunocitoquímica, es
un método para localizar antígenos específicos en tejidos o
células basadas en el reconocimiento antígeno-anticuerpo;
busca explotar la especificidad proporcionada por la unión de
un anticuerpo con su antígeno en un nivel de microscopía de
luz
 EVOLUCION
• IHC se ha adaptado a la identificación, demostración Y
pronóstico, brindando carácter determinante con valor
diagnostico y predictivo , con los requisitos correspondientes
para informes semicuantitativos de los resultados
• Se basa en los fundamentos de la histoquímica pero amplía
enormemente la variedad de componentes de tejido
• Requiere control de calidad y estandarización

• Otro cambio dramático en los últimos años es la creciente

adopción de instrumentos de tinción automatizados, con
importantes implicaciones con respecto a la elección de
reactivos, protocolos y controles
• El desarrollo de la técnica conocida como hybridoma, facilitó el
desarrollo de IHC
 Ensayo ideal
• La IHC es un estudio que debe ser adecuado,
orientado y controlado en todos los aspectos de
su desempeño, para así proporcionar un
inmunoensayo basado en tejido; reproducible y
dey características cuantitativas de un prueba de
enzimoinmunoanálisis (ELISA),que no solo
detecte proteínas o antígenos, en relación con la
arquitectura de tejidos y células, sino que
también proporciona una información precisa y
confiable medida den su cantidad relativa o real
UTILIDAD
Antígenos anticuerpos
 Anticuerpos específicos como
reactivos en una tinción
Especifidad
-Cuan selectivo es el anticuerpo
en adherirse a un antígeno

Sensibilidad
- Cuanto antígeno es capaz el
anticuerpo de detectar. Ej. Una
técnica más sensitiva es capaz de
detectar menos antígeno y
viceversa…

Principio antígeno- anticuerpo

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Consideraciones
• El desarrollo de la técnica de hibridoma proporciona una casi
ilimitada fuente de anticuerpos altamente específicos. Sin
embargo, los anticuerpos monoclonales no garantizan
especificidad para un antígeno especifico, porque diferentes
antígenos pueden compartir similares epítopos y presentar
reactividad cruzada.

• Como resultado, los anticuerpos policlonales a menudo dan más

tinción de fondo no específica en portaobjetos que se encuentra
bajo estudios con anticuerpos monoclonales.

• Comparación de sensibilidad y especificidad entreanticuerpos

policlonales y monoclonales indican queel anticuerpo policlonal
puede ser más sensible pero a menudomenos específico que el
anticuerpo monoclonal
 HIBRIDOMA

(1) Inmunización de un ratón

(2) Aislamiento de linfocitos B del bazo
(3) Cultivo de células de mieloma
(4) Fusión de mieloma y células B
(5) Separación de las líneas celulares
(6) Screening de las líneas celulares que
producen el anticuerpo adecuado (a) y
desecho del resto (b)
(7) Proliferación in vitro (a)or in vivo (b)
(8) Harvesting
DETERMINANTES DE LA TECNICA
• ANTICUERPO A UTILIZAR:MONOCLONAL O
POLICLONAL
• MATERIAL DISPONIBLE: FRESCO, CONGELADO
O FIJADO EN FORMALINA
• ANTIGENOS A ESTUDIAR: SUPERFICIE,
MEMBRANA O NUCLEARES
 MUESTRAS

TEJIDOS PROCEDENTES DE BIOPSIAS, AUTOPSIAS Y MATERIAL CITOLOGICO

CONSIDERACIONES
 Técnica de IHQ – técnica general
1. Corte 6. Sistema de
2. Deparafinar e hidratar detección o
3. Recuperación de visualización
antígeno o antigen  Cromógeno para AP
o para HRP
retrieval
7. Contraste
4. Bloqueo de actividad o
afinidad endógena 8. Montaje: base
acuosa o resina
5. Anticuerpo primario
 FIJACION
• Fijación por precipitación de proteínas brinda mejores resultados
que la fijación por reticulacion
• El exceso de fijación reduce la inmunorreactividad
• El efecto de cada fijador sobre un antígeno puede ser diferente en
función de la localización histológica y anatómica de dicho antígeno
• Las muestras de gran volumen fijadas por inmersión proporciona
resultados variables en cuanto a positividad, evidenciando mayor
tinción en áreas mejor fijadas
• Existen antígenos de superficie o nucleares que no deben fijarse en
formalina ya que alteran la muestra, se recurre a congelación o
fijación breve en acetona, cloroformo o una mezcla de ellos.
• Parta acortar el tiempo de fijación puede utilizarse la fijación por
microondas
FIJACION
ESTANDARIZACION DE LA FIJACION?
 Descalcificación
• Eliminación completa de las sales de calcio
• Ausencia de defectos deletéreos de las células, tejido
conectivo y sustancia fundamental.
• Que no se inhiban procesos como los de fijación y tinción
No se recomienda la utilización de acido nítrico
Se recomienda la utilización de EDTA A 0,5M
Acido acético acuoso al 10%
Acido fórmico al 5%
INCLUSION
 INCLUSION
• CAMBIAR ETANOL POR ACETONA
• CAMBIAR XILENO O TOLUENO POR
CLOROFORMO O BENZOATO DE METILO

• ESTOS CAMBIOS MEJORAN LA

INMUNOTINCION, AUMENTA LA TINCION
ESPECIFICA Y DISMINUYE LA TINCION DE
FONDO
CORTE
 Corte
Tejido congelado: criostato.
Se seca al aire a temperatura ambiente 2 horas, se aplica
acetona absoluta a una temperatura de 4°c durante 5
minutos y luego se mantiene al aire 30 minutos.
• Se guardan? Envueltas en papel de aluminio a -20°c.
• Se descongela? Se repiten los pasos y se llevan a una
solución de cloroformo 20 minutos

Cortes en parafina:
se obtienen los cortes de 3 a 5um y se deja secar toda la
noche en estufa a 37°C, des parafinar e hidratar
• Corte
– Agua destilada
– Laminillas cargadas
• Deparafinar e hidratar
– Temperatura NO >60° C
– Nuevas soluciones permiten que se lleve a
cabo en el mismo paso de recuperación de
antígeno
 EXTENSION
• PORTAOBJETOS POLARIZADOS
• PORTAOBJETOS RANURADOS
• ADHESIVOS:
1. ALBUMINA DE HUEVO
2. GELATINA
3. POLI-L-LISINA

AUMENTO DE TINCION INESPECIFICA DE FONDO

 Objetivos de la recuperación
antigénica
• Exponer los epitopos
• Romper los enlaces cruzados
• Restaurar la conformación epitope antígeno
• Remover iones clásicos como citrato
DESENMASCARAMIENTO ANTIGENICO
 RESCATE ANTIGENICO O
RECUPERACION ANTIGENICA
Recuperación de antígeno: el proceso de
fijar los tejidos puede ocultar o alterar
los epítopes de las moleculas
Técnicas: químicas, fisicas o enzimáticas
1. Químicas:
1. Depende de amortiguador
1. pH bajo: citrato pH 6.0
2. alto pH: EDTA pH 9.0
2. Técnica fisicas: incubación, olla de presión,
vapor…
2. Enzimaticas: tripsina, proteinasa K…
Bloqueo de la actividad enzimática
• Método por el que se consigue inhibir la
actividad enzimática de la enzima que se va a
utilizar como marcador con el fin de que no
reaccione con el sustrato por afinidad
• El método usado es la incubación de las
secciones antes del proceso inmunológico,
aplicando agentes bloqueantes específicos.
Tinción de fondo
 Tinción de fondo
• El bloqueo de tinción de fondo se realiza
incubando los cortes con un anticuerpo que
no interfiera con el anticuerpo primario, o
usando un anticuerpo primario a altas
diluciones y añadiendo bloqueantes proteicos
de la tinción a utilizar, evitando la unión no
inmune a moléculas que poseen los
anticuerpos.
 Penetración de los reactivos
META: alcanzar a los antígenos
• El uso cotidiano de detergentes puede brindar
buenos resultados
• Células intactas de frotis
• Improntas
• Monocapas de cultivos celulares
• Cortes gruesos en congelación
• Inclusiones en parafina
 MARCAJE INMUNOHISTOQUIMICO
• Unión antígeno anticuerpo ”trazador o marcador”

• TRAZADOR O MARCADOR:
1. FLUOROCROMOS: FLUORESCENCIA
2. TECNICAS INMUNOENZIMATICAS: ENZIMA/ SUSTRATO/ PRODUCTO
3. IONES METALICOS EN FORMA COLOIDAL
4. ISOTOPOS RADIOACTIVOS
 FLUORESCENCIA
• FLUORESENCIA PRIMARIA O
AUTOFLUORESCENCIA
• FLUORESCENCIA SECUNDARIA
1. USO DE COLORANTES FLUOROCROMOS
2. ANTIGENOS/ANTICUERPOS MARCADOS CON
FLUOROCROMOS
• FOSFORESCENCIA
FLUORESCEINA
RODAMINA
ALEXA FLUOR
DYLIGTH FLUOR
MARCADOR
 ENZAYOS INMUNOENZIMATICOS
• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas
ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las
que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con
anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la
solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que
serán muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...),
pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones
donde se encuentra el antígeno buscado).2
• ANTIGENO O ANTICUERPO UNIDO A UNA ENZIMA, INSOLUBILIZADO SOBRE UN
SOPORTE INMUNOABSORBENTE(INMOVILIZADO). SE AÑADE UN SUSTRATO UNIDO
A UN CROMOGENO, EL SUSTRATO ES RECONOCIDO POR LA ENZIMA, GENERANDO
UN RESULTADO INSOLUBLE COLOREADO Y CUANTIFICABLE
 ENSAYO INMUNOENZIMATICO.
AMPLIFICACION?
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el
primario.

• La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal

debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el
ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo
secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran
variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se
pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo.
La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero
sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición
de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la
titulación de anticuerpos es muy baja.
• }
• ANTICUERPO PRIMARIO, ANTIGENO ESPECIFICO
• ANTICUERPO SECUNDARIO O ANTICUERPO
PUENTE
 TIPOS DE ELISA
• ANTICUERPOS MARCADOS
– ELISA DIRECTO
– ELISA INDIRECTO
– ELISA SANDWICH:
1. HETEROLOGO (HADAS)
2. DOBLE) DAS
• ANTIGENO MARCADO
– ELISA COMPETITIVO
 ENSAYO INMUNOENZIMATICO
• ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado
en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la
muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será
retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.

• Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido,

se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno
marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un
anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo..
• ELISPot. ELISpot es un método altamente sensible en la inmunología para
enumerar las células que producen una citoquina dada. Las células se
estimularon en una placa de microtitulación per-recubierta con un
anticuerpo específico anti-analito. En respuesta a la estimulación, las
células liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Después
de una etapa de lavado, que elimina las células de los pozos, la ubicación
de citoquinas secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de detección
marcado con enzima y su sustrato cromogénico correspondiente.

• El resultado final es un conjunto de manchas de color, cada uno de los

cuales representa un área donde se había localizado una célula que
secreta la citoquina. Existe un método de ELISpot estándar y una variación
denominada de células dendríticas DC-ELISpot para la detección de las
células tras la estimulación con oligopéptidos y antígenos de proteína,
respectivamente
 COMPARACION ELISA
• Facilidad de realización: en la directa es necesario un antígeno especifico, la
indirecta es mas sencilla.

• Rapidez: la directa es mas rápida, solo utiliza un anticuerpo primario, las otras
requieren incubación.

• Sensibilidad: la directa es menos sensible, el anticuerpo primario se etiqueta y esta

intervencion reduce la inmunorreactividad algo que no ocurre en la indirecta. En la
indirecta el anticuerpo secundario presenta mayor cantidad de
epitopes(amplificacion), excepto en reacción cruzada, el elisa directo no presenta
este inconveniente .
 Técnica de IHQ
Métodos de detección o visualización
• Directo
• Indirecto
• APA APAP
• Avidina-Biotina
• Dextran
 Peroxidasa
• Puede estara unidad a un
anticuerpo primario, como
a un anticuerpo
secundario(complejos pap,
peroxidasa_ anticuerpo
antiperoxidasa) que se
unen a anticuerpos puente
• Se revela con H202,
liberando oxidgeno lo cual
oxida al cromogeno,
produciendo el revelado
 Método avidina-biotina
• Presenta 4 regiones para union a la biotina
 METODO INMUNO-ORO
• BAJA PENETRACION PUEDE ENMASCARAR
ANTICUERPOS
• SE BASA EN LA UNION DE ORO A MOLECULAS
PROTEICAS EN SOLUCIONES ACUOSAS
• . REQUIERE METODOS ADECUADOS DE FIJACION
Y PENETRACION PARA ALCANZAR LOS
ANTIGENOS
• LA PLATA PUEDE AMPLIFICAR LAS UNIONES DE
ORO
• SE USA PARA MICROCORTES
 MARCAJE CON ISOTOPOS
RADIOACTIVOS

• SE BASA EN LA COMPETENCIA ESTABLECIDA

ENTRE LA SUSTANCIA A CUANTIFICAR Y LAS
CANTIDADES CONOCIDAS DE MISMA
SUSTANCIA MARCADA CON ISOTOPOS, PARA
UNIRSE A ANTICUERPOS ESPECIFICOS

• A MAYOR SUSTANCIA A CUANTIFICAR MENOR

SERA LA CANTIDAD DE SUSTANCIA
RADIOACTIVA QUE SE UNE AL ANTICUERPO Y
VICEVERSA
VISUALIZACION
 Variables que afectan el proceso de
inmunohistoquímica
• Analítica
– Manual
– Automatizado
– Sistema de detección o visualización
– Efecto de orilla
– Efecto de secado
– Efecto de lavado incompleto
ESTANDARIZACION U OPTIMIZACION
 FALSOS POSITIVOS
• Presencia de peroxidasa endógena, por uNa
mala inhibición de la misma(bloqueo
enzimático inadecuado)
• Reacciones cruzadas inespecíficas, entre
antígenos/anticuerpos, de forma que algunos
anticuerpos interactúen con antígenos
similares a los estudiados, sobretodo ante
una fijación química no inmune entre los ACy
la colágena del tejido conectivo.
 FALSOS NEGATIVOS
• ENMASCARAMIENTO DE ANTIGENOS
• DESNATURALIZACION DE LOS ANTIGENOS POR
EL CALOR, EVITANDO EL RECONOCIMIENTO
POR EL ANTICUERPO
• ERRORES EN EL PROCESAMIENTO TECNICO