9.
Espectrofotome
tra
de
fluorescencia
LUMINISCENCIA MOLECULAR
I. Fluorescencia
Foton
II. Fosforescencia es
III. Quimioluminiscencia
Rx.
Fluorescencia
Excitado
1
Fundame
ntal
1 2
=
Fluorescen
cia de
resonancia
Fluorescencia
Excitado
1
Fundame
ntal
1 2
<
Desplazami
ento de
Stokes
Estados singulete y triplete
Singulete
Fundame
ntal
Singul
ete
Excita
do
Triplet
e
Excita
do
FOSFORESCENC
FLUORESCEN
CIA
IA
Absorcin y emisin energa
radiante
Procesos de desactivacin
Relajacin vibracional
D
q
D
q
D
A
q
D
D
D
Absorcin y emisin energa
radiante
Procesos de desactivacin
Conversin interna
Excitado
2
-E
Excitado
1
Niveles
energticos
prximos
Solapamiento
niveles
vibracionales
Procesos de desactivacin
Conversin interna
Conversin interna
predisociacin
Excitado
2
Energa
equivalente a
enlace dbil
Excitado
1
Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional
Relajacin
Excitado
2
Excitado
1
Fundame
ntal
Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional
Relajacin
Espectros de excitacin y emisin de una
disolucin de quinina
Absorcin y emisin energa
radiante
Procesos de desactivacin
Cruce entre sistemas
Singulete
*
Triplete*
Br, I, O 2
lo
favorecen
Factores que afectan la
fluorescencia
Rendimiento (o eficiencia)
cuntico(a) =
fotones
= fluorescentes
fotones totales
absorbidos
Estructur
Ambient
a
TRANSICIONES
ELECTRNICAS
E
Singulete*/Trip
lete*
kces- * < kcesn*
ces = cruce entre
sistemas
1000
100 X
*
t1/2 10-9 10-7 s
X*
t1/2 10-7 10-5
s
ESTRUCTURA,
condensacin anillos
Piridina
Furano
Quinolina
Indol
Tiofeno
ESTRUCTURA, sustituyentes
n - * < *
Tomado de Skoog y
ESTRUCTURA, rigidez
1.0
0.2
Conversi
n
interna
DISOLVENT
E
CH3CH2 - I
pH,
resonancia
Sustituyentes cidos (o
bsicos), estado inico =
CONCENTRACI
N
A
q
A
q
A
A
A
A
q
A
q
autoamortigua
CONCENTRACI
N
A
autoabsorcin
emis =
cte.
RFU
Intensidad
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
exc
Grfica A. Espectro
de excitacin
exc =
cte.
emi
Grfica B. Espectro
de emisin s
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN
Grfica C. Espectro de excitacin-emisin
del complejo DNA-verde SYBR
Instrumentaci
n fluorometra
INSTRUMENTOS DE DOBLE HAZ
Tomado de Skoog y cols (5
ESPECTROFLUORMETRO
Monocroma
dor de
excitacin
Arco Xe, arco
Hg,
Xe-Hg;
lser
Fotomultiplicad
ores
(alta
sensibilidad)
Monocroma
dor de
emisin
aplicacion
es
ANLISIS CUANTITATIVO
OH
OH
N=N
Al, F-
Zr y Sn
SO3N
a
Granate de alizarina R
Riboflavina (vit
B2)
ANLISIS CUANTITATIVO
ADRENALIN
A
ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo: 1 muestra de 1 g de cereal se trat
con cido y una pequea cantidad de KMnO4
para oxidar la riboflavina (Rb) presente. El
exceso de KMnO4 fue eliminado con H2O2.
La disolucin anterior se transfiri a un
matraz de 50 mL y se diluy hasta la marca.
Una alcuota de 25 mL de esta disolucin se
transfiri a una celda, se agreg una pequea
cantidad de ditionita de sodio para convertir
la Rb-oxidada a Rb y se ley la fluorescencia
relativa, en un equipo previamente ajustado
La lectura de intensidad de emisin relativa,
registrada como RFU en el equipo fue de 6
unidades para el blanco y 65 unidades
para la muestra.
Una segunda de 24 mL tomada a partir de la
disolucin de la muestra oxidada, se adicion
con 1 mL de una disolucin estndar de Rb de
0.5 g/mL.
Esta alcuota se transfiri a una celda
equivalente a la empleada para el blanco y la
muestra sin adicin de estndar, y fue tratada
con ditionita de sodio para obtener Rb. La
lectura de esta fue de 95 unidades.
ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo 2: una pastilla antimalaria es
analizada
para
determinar
la
concentracin
de
quinina.
Para
tal
propsito una tableta de 1.644 g se
disuelve en HCl 0.1 M en un matraz
volumtrico de 500 mL.
Con una pipeta se transfieren 15 mL de la
disolucin anterior a un matraz aforado de
100 mL, y se diluyen con cido hasta la
marca.
Posteriormente, una disolucin patrn de
quinina de concentracin equivalente a
100 ppm proporciona una lectura de 180
unidades, cuando es tratada y leda bajo
las mismas condiciones que la muestra
problema.
Calcular la masa, en mg, de quinina
presente en la tableta farmacutica.
ANLISIS CUALITATIVO
Fluorocromo: marcador colorante
con capacidad de fluorescer al ser
excitado a una en particular.
Fluorforo:
grupo funcional de
una molcula (fluorocromo) que le
imparte
la
propiedad
de
fluorescencia.
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6
ANLISIS CUALITATIVO
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6
ANLISIS CUALITATIVO
Fig. I. Espectros excitacin emisin:
Espectro excitacin (lnea continua) y espectro de
emisin (lnea punteada) de fluorescena y
rodamina.
Microscopia de fluorescencia
DAPI: azul
GFP: verde
RODAMINA:
rojoII.
Fig.
Clula en
Procesos celulares
Fig. III. [Ca2+]. Gradientes de Ca2+ en un leucocito,
monitorizados con Fura 2 (izquierda). Modificacin gradiente de
Ca2+ por quimiotaxis (derecha)
Tomado de Lodish y cols. Biol. Celular y
Molecular (5 edic)
Expresin gnica
cDNA =
Texas-red
Genoma =
FITC
Fig. IV. Perfil de expresin gnica, anlisis
Tomado de Corvaln A.tumoral
(2006). Perfiles de expres. gnica en decisiones
FOSFORESCEN
CIA
FOSFORESCENCIA
Procesos de desactivacin. Cruce
entre sistemas
Fosforescencia, caractersticas
Probabilid
ad
Singulet
e*
Triplete*
t1/2 10-4
10s
Requiere
:
T
viscosidad
Quimioluminiscencia
Luminol
(qumica
forense)
Deteccin de
restos de
sangre
Quimioluminiscencia
Rx
qumic
a
energa
luz
Analito
Quimioluminiscencia
Determinacin N
orgnico:
1100 C
muestra
NO +
O3
LUZ
+
NO2
Quimioluminiscencia
+
NO
CO2
-
CO2
-
catalizad
or
N2
+
luz
